KR101536152B1 - 반투과막을 이용한 고농도 광합성 미생물 배양 및 지방산 생산방법 - Google Patents

Abstract

본원은 반투과막이 구비된 생물반응기(bioreactor) 중에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하며, 상기 막은 상기 미생물은 통과시키지 못하지만, 상기 반응기 중의 배양액은 통과시킬 수 있으며, 상기 배양액 중의 기질의 농도는 상기 반응기 중의 상기 미생물의 농도에 맞추어 조절되는 것인, 반투과막을 이용한 미생물 배양방법을 개시한다. 본원에 따른 반투과막을 이용한 미생물 배양방법은 고농도 배양 및 최적 운전을 통한 연속적 바이오매스의 획득이 가능하여, 미생물을 이용한 유용물질의 생산 예를 들면 박테리아의 지방산 생산 성능을 획기적으로 증가시킬 수 있다.

Description

반투과막을 이용한 고농도 광합성 미생물 배양 및 지방산 생산방법 {Method for cultivating photosynthetic microorganism in high concentration using semipermeable membrane and method for producing fatty acid using the same}

본원은 반투과막을 이용한 미생물 배양 기술에 관한 것이다.

지방산 에스테르를 주성분으로 하는 바이오오일은 식물 또는 동물 유래의 지질을 일컫는 것으로, 이로부터 유래된 화합물을 올레오케미칼이라고 한다. 바이오오일은 그 자체로 영양보충제, 화장품, 및 식품 등을 포함하는 생활과 밀접한 물질의 제조에 널리 사용된다. 나아가 바이오오일 유래의 올레오케미칼 또한 다양한 용도로 사용되며, 크게 바이오디젤을 포함한 에너지, 특수화학품, 세제와 같은 생활용품과 의약 및 건강식품의 원료로서, 그 수요가 점차 증가하는 추세이다.

이와 같이 우리 생활에 널리 쓰이는 바이오오일의 수요는 점점 늘어나고 있는 반면 그 공급량은 한정되어 있어 수요를 따라가지 못하는 추세이며, 또한 미국, 유럽, 중국, 및 인도를 중심으로 그 수요가 확대됨에 따라 천연 유래 지방산의 가격이 매년 증가하고 있다. 따라서 천연지방산 공급량을 증가시키기 위한 새로운 방법이 필요하다.

현재까지 바이오오일의 생산은 동남아시아를 중심으로 한 지역에서 야자수와 같은 식물자원에 주로 의존하였다. 하지만 원료물질로서 식물자원은 성장 속도가 늦고 지리적 영향을 받으며 대규모 생산을 위해 넓은 재배면적이 필요할 뿐 아니라 환경파괴의 우려 및 식량 자원을 겸한다는 문제를 지니고 있다.

따라서 최근 들어 미생물을 이용한 바이오오일의 생산이 시도되고 있다. 즉 지방을 함유하고 있는 미생물인 미세조류, 효모, 곰팡이, 세균 등을 이용한 바이오오일의 생산으로, 이는 식물자원과 달리 기후 및 지형에 따른 제약이 없으며 성장속도가 빨라서 적합한 생산기술을 적용한다면 오일 생산 속도를 높일 수 있다. 또한 식량 감소를 우려하지 않아도 되고, 표준화된 배양 공정을 통해 용이하게 바이오오일 생산 규모를 대형화할 수 있다는 장점이 있다.

이러한 지방을 함유하고 있는 미생물 중 바이오오일 생산을 위해 많이 연구된 것은 미세조류로, 이는 식물자원에 비해서는 성장 속도가 빠르고 오일 함량이 높지만, 진핵세포로서 성장속도가 원핵세포와 비교해서 느릴뿐 아니라 빛의 투과율이 낮을 경우, 생육속도가 더욱 지연되는 단점이 있다. 반면 원핵세포인 세균의 경우 성장속도가 빠르고, 세포막에 존재하는 인지질의 균체 중량의 30% 이상을 세균과 비교할 때는 상대적으로 넓은 재배면적과 긴 발효시간을 요구한다. 한편, 일부 광합성세균은 미세조류와 달리 지방을 축적하는 세포 내 기관은 없지만 광합성 세포막에 존재하는 인지질이 균체 중량의 약 30% 이상을 차지하고 있기 때문에 바이오오일 생산에 주목을 받고 있다.

대한민국 공개특허 제2011-0122424호는 신규 유지성 미세조류 KRS101 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법에 관한 것으로, 미세조류를 회분식으로 배양하여 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 공정을 제시하고 있다. 그러나 상기 방법은 여전히 저성장 속도, 저농도 배양 및 복잡한 추출 등의 공정의 문제점을 수반하며, 이러한 문제점을 해결할 수 있는 원핵세포를 이용한 새로운 배양 시스템 및 지방산 생산에 대한 필요가 제기되고 있다.

본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 박센산 같은 고부가가치의 지방산 합성능이 뛰어난 광합성 세균의 고농도 배양 및 최적 운전을 통한 연속적 바이오매스를 획득하는 기술을 제공하고자 한다.

본원은 한 양태에서 반투과막이 구비된 생물반응기(bioreactor) 중에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하며, 상기 막은 상기 미생물은 통과시키지 못하지만, 상기 반응기 중의 배양액은 통과시킬 수 있으며, 상기 배양액 중의 기질의 농도는 상기 반응기 중의 상기 미생물의 농도에 맞추어 조절되는 것인, 반투과막을 이용한 미생물 배양방법을 제공한다. 본원에 따른 배양 방법은 연속, 반연속 및 회분식 배양에 모두 적용할 수 있으며, 배양액 중의 기질의 농도는 유용물질의 생성을 위한 최적의 조건에 맞추어 조절되며, 한 구현예에서는 HRT (Hydraulic Retention Time) 및 SRT (Solids Retention Time) 조절에 의해 수행된다. 본원에 따른 다른 구현예에서, 본원의 방법은 HRT 및 SRT의 조절을 통한 고속 증식 및 고농도 배양이 가능하며, 상기 HRT, 상기 SRT, 속도 및 농도의 관계는 하기 식으로 결정된다: 성장속도 = 세균 농도 x (HRT/SRT). 본원에 따른 일 구현예에서 로도박터 스페로이즈의 배양 조건은, 수리학적 체류시간(HRT) 1.5일, 미생물 체류시간(SRT) 7.5일이다.

본원에 따른 배양방법에서 반투과막은 관형상으로 하나 이상이 포함될 수 있으며, 한 구현예에서 상기 관형상 반투과막은 공칭공경(pore diameter)이 약 0.3 내지 0.5 ㎛, 외경이 약 600 내지 700 ㎛, 내경이 약 390 내지 430 ㎛, 막두께가 약 100 내지 140 ㎛이고, 상기 반투과막의 최대 여과압력은 약 20 kPa일 수 있다.

본원의 방법은 다양한 미생물의 배양에 사용될 수 있으며, 박테리아, 미세조류, 이스트 또는 진균을 포함한다. 일 구현예에서, 본원의 방법에 사용되는 박테리아는 광합성 박테리아 예를 들면 시아노박테리아 또는 로도박터, 특히 로도박터 스페로이즈, 특히 로도박터 스페로이즈,KD131 KCTC 12085이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 배양방법에서 일 구현예에서 로도박터 스페로이즈가 사용되며, 상기 균체는 광의 존재하에 준호기 상태에서 배양되며, 상기 배양액은 탄소원으로 락트산, 아세트산, 부티르산, 말레산 또는 숙신산 중 하나 이상; 및 질소원으로 황산암모늄을 포함하며, 광도 54 W/m², 온도 30 ℃, pH 6 내지 7에서 수행될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 미생물 배양 방법을 이용한 바이오 오일 또는 지방산 생산 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 반투과막을 이용한 미생물 배양 방법은 고농도 배양 및 최적 운전을 통한 연속적, 반연속적 또는 회분식 바이오매스의 획득이 가능하여, 미생물을 이용한 유용물질의 생산 예를 들면 박테리아의 지방산 생산 성능을 획기적으로 증가시킬 수 있다.

도 1은 반투과막을 설치하지 않은 생물반응기의 기질농도에 따른 균체농도와 균체생산속도 및 기질분해율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일구현예에 따른, 반투과막을 설치한 생물반응기의 모식도이다.
도 3은 반투과막을 설치한 배양기의 기질농도에 따른 균체농도와 균체생산속도, 및 기질분해율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 기질농도에 따른 로도박터 스페로이즈 KD 131의 지방산 조성과 균체내 지방산 함량을 나타내는 그래프이다.

본원은 내부 배양액에 잠기는 반투과막을 구비한 생물반응기를 이용하여 미생물의 고속, 고농도 배양이 가능함을 발견하여 완성된 것으로, 미생물을 고농도 및 고속으로 배양하여 넓은 재배면적을 사용하지 않고도 지방산과 같은 유용물질의 생산효율을 극대화 할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 반투과막이 구비된 생물반응기(bioreactor) 중에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하며, 상기 막은 상기 미생물은 통과시키지 못하지만, 상기 반응기 중의 배양액은 통과시킬 수 있으며, 상기 배양액 중의 기질의 농도는 상기 반응기 중의 상기 미생물의 농도에 맞추어 조절되는 것인, 반투과막을 이용한 연속적, 반연속적 (semi continuous) 또는 회분식의 미생물 배양방법에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 막은 미생물이 성장함에 따라, 배양기내 보충되는 새로운 기질의 양만큼 미생물에 의해 분해된 기질을 제거하기 위한 것이다. 따라서 미생물의 성장을 방해하지 않는 상기와 같은 기능을 할 수 있는 다양한 막이 본원에 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 “반투과막”은 유기 또는 무기성 물질로 제조된 다공성 막을 일컫는 것으로, 용매는 투과할 수 있지만, 용질(입자 또는 물질)의 경우는 크기, 전하량, 용해도, 화학적 특징 등에 의해 결정되는 요소에 의해 일부만이 통과할 수 있으며, 일부 용질은 통과할 수 없는 막을 의미한다.

본원의 한 구현예에서는 미생물 배양에 사용되는 막은 미생물은 통과시키지 못하지만 배양액 중 미생물의 성장에 따른 분해산물 예를 들면 잔류 용해성 영양염류, 잔류 기질, SMP(soluble microbial products)는 통과시킬 수 있는 반투과막이 사용된다. 이러한 기능을 하는 다양한 종류의 반투과막이 공지되어 있으며 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 막의 예로는 폴리에틸린, 폴리프로필렌, 폴리올레핀, 폴리비닐클로라이드, 폴리에틸렌프탈레이트, 폴리오레핀공중합체, 폴리(에테르에테르케톤)형의 중합체 또는 표면 개질 예를 들면 친수성으로의 개질을 위해 표면처리된 것을 포함하는 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 폴리에틸렌으로 제조된 ECONITY사의 hollow fiber 막이 사용된다.

본원에 따른 방법에서 고농도의 성장을 위해, 미생물의 농도에 맞추어 배양액 중 기질의 농도가 조절되며, 이러한 기질의 농도는 HRT (Hydraulic Retention Time) 및 SRT (Solids Retention Time) 조절에 의해 수행된다. 즉 본원에 따른 방법은 HRT 및 SRT의 조절을 통한 고속 증식 및 고농도 배양이 가능하며, 상기 HRT, 상기 SRT, 속도 및 농도의 관계는 하기 식으로 결정된다.

성장속도 = 미생물 농도 x (HRT/SRT)

구체적으로, 고농도 배양을 위해 기질은 계속 보충해주고 분해된 기질은 막을 통과해 배출되어, 배양기 안에 남아있는 미생물은 고농도로 자라고, 그 농도가 높아질수록 기질 중 하나의 성분인 탄소원 (lactate)의 농도를 높이고, HRT와 SRT를 낮추어 배양한다.

HRT는 일정한 용기에 일정 유량의 유체가 체류할 수 있는 시간을 나타내는 것으로, 배양기의 체적과 유량에 의해 계산할 수 있으며, SRT는 고형물 (미생물 또는 슬러지) 체류시간으로 단위는 일(day)이다. 본원에 따른 일구현예에서 수리학적 체류시간은 약 1 내지 4일, 미생물 체류시간은 약 5 내지 20일이다.

미생물의 성장 속도가 높아지면 하루에 들어가는 기질의 양(HRT)과 제거해주는 미생물의 양(SRT)이 많아져도 회복될 수 있으며, 이렇게 회수한 미생물은 지방산 등의 추출에 사용된다. 상술한 본원에 따른 배양 방법은 연속적, 반연속적 또는 회분식 배양에 적합하다. 본원에 따른 일 구현예에서는 연속적 배양에 사용된다.

본원에 따른 막은 통과시키고자 하는 물질의 종류에 따라 다양한 공칭공경(Nominal pore size)을 가질 수 있다. 공칭공경이란 정밀여과막의 공경을 직접 측정하는 것이 곤란하여 버블포인트법, 수은압입법, 지표균 등을 이용한 간접법으로 분리성능을 마이크로미터(㎛) 단위로 나타낸 것을 말한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 미생물은 통과시키지 못하지만 기질의 분해산물은 통과시킬 수 있는 크기의 공칭공경 예를 들면 약 0.3 내지 0.5 ㎛ 공칭공경을 갖는 막이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서는 관형막이 사용되며, 관형막의 공칭공경은 약 0.3 내지 0.5 ㎛, 외경이 약 600 내지 700 ㎛, 내경이 약 390 내지 430 ㎛, 막두께가 약 100 내지 140 ㎛이고, 최대 여과압력은 약 20 kPa인 막이 사용될 수 있다. 또한 일정 압력과 일정 막투과유속을 유지하기 위해 압력이 증가할 경우 물세척 및 5 mM 과초산(peracetic acid)을 이용한 화학적 멸균법이 실시될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 공지된 막생물반응기가 사용될 수 있으며, 기존의 폐수처리 등에 사용되는 분리막에서 운전조건 예를 들면 역세척은 수행하지 않고, 여과/연조의 주기를 균체의 종류, 목적하는 성장 속도, 농도에 맞추어 적절하게 조절하여 사용할 수 있다.

본원은 다양한 미생물의 배양에 사용될 수 있다. 미생물은 미세조류, 광합성 또는 비광합성 박테리아, 이스트 및 진균류를 포함한다. 한 양태에서 본 발명은 박테리아 특히 광합성 박테리아 예를 들면 시아노박테리아 또는 로도박터 속 미생물, 특히 로도박터 스페로이즈(Rhodobacter sphaeroides)가 사용되나 이로 제한되는 것은 아니다. 특히 본원에 따른 일 구현예에서는 국내 토착환경에서 분리한 로도박터 스페로이즈 KD131을 본원에 따른 연속배양공정에 사용하며, 상기 균주는 본 참조에 의해 본 발명에 그 내용이 포함되는 대한민국 등록특허 제0680624호에 기재되어 있다.

본원에서 기질이란 배양액 중에 첨가되는 것으로 미생물의 성장에 필요한 성분을 의미한다. 이러한 기질의 예로는 탄소원, 질소원 등을 포함하며, 배양하는 미생물의 종류 및/또는 목적하는 최종 유용물질의 종류에 따라 달라지면 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 지방산 생산을 위해 고농도의 배양을 위해서는 특히 일정 배지에서 단위 시간, 배지의 부피에서 최대의 균체 성장은 물론, 균체에 포함된 지방산의 함량을 최대로 할 수 있는 조건을 확립하는 것이 대량 생산에 중요하다.

본원에 따른 일 구현예에서는 로도박터 스페로이즈가 사용되며, 이 경우, 탄소원으로서, 아세트산, 부티르산, 락트산, 말레산, 및 숙신산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상; 및 질소원으로 황화암모늄을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 한 구현예에서는 락트산이 약 30 내지 100 mM의 농도로 공급되며, 질소원으로서 황화암모늄이 약 3 내지 10 mM 공급된다.

본원에 따른 배양방법에 있어서, 미생물의 구체적 배양 조건도 사용되는 미생물의 종류 및 상기 미생물에서 생산하고자 하는 최종 유용물질 예를 들면 지방산과 같은 물질의 종류에 따라 달라질 것이다.

예를 들면 본 발명에 사용되는 로도박터 스페로이즈는 광합성 조건에서 배양되며, 광합성이 가능한 조건이란, 광합성이 일어날 수 있는 빛이 있는 조건을 의미한다. 빛의 강도는 광합성세균의 균체 성장보다는 지방산 축적량 및 인지질의 구성에 영향을 주는 것으로 나타나며, 빛의 조사량에 따라 지질을 포함하고 있는 세포막 합성이 영향을 받는 것으로 판단된다. 광도의 세기는 예를 들면 약 50 내지 600 W/m²이고, 본 발명의 일 구현예에서는 약 54 W/m²이다.

로도박터 스페로이즈는 일반적으로 혐기, 호기 또는 준호기 조건에서 배양될 수 있다. 본 발명의 로도박터 스페로이즈를 사용한 지방산의 생산방법에서, 빛/호기 조건에서는 산소 분압이 높아 로도박터 스페로이즈가 광합성을 하지 못해 균체 성장이 억제되며, 빛/준호기 조건에서는 산소 분압이 광기구 형성에 저해를 주지 않을 만큼 낮아서 균체 성장이 활발하게 이뤄진다. 또한, 광합성조건에서 산소의 공급 양에 따라 배양액 내의 산소 분압에 영향을 주어서 과다한 산소의 공급은 균체 성장뿐만 아니라 지방산 축적에도 영향을 줄 수 있다. 하지만 낮은 분압으로 존재하는 산소는 로도박터 스페로이즈 KD131의 균체 성장 및 지방산 함량에 부정적인 영향을 끼치지 않는다. 따라서 본 발명의 한 구현예에서는 빛/준호기 조건이 사용된다. 배양온도는 로도박터 스페로이즈 배양에 최적의 온도를 사용할 수 있으며, 예를 들면 섭씨 약 30도에서 배양될 수 있다.

본원에 따른 배양방법은 미생물을 이용한 유용물질의 생산에 최적인 조건을 확립할 수 있다. 최적이란, 고속의 고농도 배양이 가능한 것으로 예를 들면 탄소원, 배양시간, 빛 세기 조절을 통해 균체 성장을 최대화할 수 있는 조건, 빛 세기, 산소 조절에 따른 균주의 양질의 최대 지방산 축적을 위한 최적 배양조건을 수립하는 것을 들 수 있다.

이하 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 균주 및 배양방법

국내 토착 환경에서 분리된 홍색비유황 광합성세균인 로도박터 스페로이즈 KD131(대한민국 등록특허 제 0680624호 참조)를 사용하여, 1.2 L 유리 반응기를 이용하여 수리학적 체류시간(Hydraulic Retention Time, HRT)을 4일로 설정해 연속 배양하였다. 균 배양시 배지조성은(1 L기준) KH₂PO₄ 2.72 g, L-Asparticacid 0.04 g, Nitrilotriaceticacid 0.2 g, MgCl₂6H₂O 0.244 g, NaCl 0.5 g이고, Trace elements(EDTA 1.765 mg, ZnSO₄7H₂O 10.95 mg, MnSO₄H₂O 1.54 mg, CuSO₄5H₂O 0.392 mg, Co(NO₃)₂6H₂O 0.248 mg, H₃BO₃ 0.114 mg, Na₂MoO₄2H₂O 0.75 mg, FeSO₄7H₂O 0.5 mg), 비타민(nicotinicacid1 mg, thiamimne HCl 0.5 mg, Biotin 0.01 mg)이었다.

탄소원으로는 락트산 30-100 mM, 질소원으로 황화암모늄 3-10 mM를 첨가하여 준호기 상태로 배양하였다. 빛은 할로겐램프와 광도계(lightmeter)(LI-250A, sensor: pyranometer, Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, USA)를 이용해 연속적으로 54 W/m²세기로 맞춰주었다. 배양온도는 30 ℃이며, 자기 자력 교반기(magnetic stirrer)를 이용하여 80-100 rpm으로 교반하였다. 또한 램프와 교반기(stirrer)에서 발생되어 배양기에 전달되는 열을 최소화하기 위해 상부에 팬을 설치하였다.

실시예 2. 지방산 추출 및 분석 방법

R. sphaeroides KD131의 균체농도는 휘발성부유물질(VSS)의 SS를 측정한 여과지를 550 ℃에서 회화한 후 무게를 측정하여 부유물질과의 차로부터 계산하였다. 유기산분석은 세포잔해물(cell waste)을 취하여 1,000 rpm에서 1분간 원심분리 한 후 상등액을 0.2 ㎛ 주사기 필터로 여과하여 이용하였다. 시료 20 ㎕를 주입하고, 0.01 M H₂SO₄를 이동상으로 하여 0.6 mL/min 유속으로 흘려주었다. 유기산 분석은 Aminex HPX-B7H(300 mm x 7.8 mm, Bio-Rad Laboratories, CA, USA)를 장착한 HPLC(10AT, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 35 ℃에서 분석하였으며 UV-detector를 이용하여 210 nm에서 측정하였다.

지방산 분석은 고농도 연속 배양한 로도박터 스페로이즈 KD131의 지방산을 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol)로 추출 후 에스테르화(esterification)하여 기체 크로마토그래프(gas chromatograph, GC)로 분석하였다. 균체 농도를 0.5 g dcw/L로 균일하게 맞춰준 후, 8,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 세포 펠릿(Cell pellet)에 클로로포름과 메탄올을 2:1 비율로 첨가하여 1시간 동안 지방산을 추출하고, 지방산이 추출된 클로로포름 층을 취한 후, 같은 방법으로 추출을 한 회 더 실시하였다. 추출된 지방산에 methanolic HCl과 internal standard(C17)을 첨가하여 79 ℃ 수조에서 에스테르화(esterification)하였다. 에스테르화시킨 지방산 시료 1 ㎕를 취하여 capillary column(ENSGW, 30 m × 0.3 mm i.d., film thickness 0.50 ㎛, SGE, Melbourne, Victoria, Australia)을 장착한 GC(GC-2010 plus, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 flame ionized detector(FID)로 분석하였다. GC 조건은 column의 초기온도 50 ℃에서 시작하여 15 ℃/min의 속도로 200 ℃까지 온도를 9분간 유지하고, 2 ℃/min의 속도로 250 ℃까지 온도를 2분 동안 유지하였다. Injector와 detector 온도는 각각 250 ℃와 275 ℃이며 캐리어가스로 헬륨을 이용해 유속 25 mL/min을 유지하였다.

실시예 3. 균체 성장 최적화

3-1. 로도박터 스페로이즈 배양

최적화 조건에 따라 1 L 배양기 운전 조건은 준호기(semi-aerobic), 광도(light intensity) 54 W/m²(halogen lamp), pH 6-7, 30 ℃로 하였고, 유기산은 락트산을 이용하였다. 기질의 농도는 초기 30 mM 락트산, 3 mM 황화 암모늄을 공급하였고, 균체농도가 안정화 되었을 때 락트산의 농도를 증가시켜 최대 70 mM 락트산, 7 mM 황화암모늄까지 실험을 진행하였다. 연속배양 동안 HRT는 4일로 유지하였다.

3-2. 로도박터 스페로이즈 의 락트산 농도변화에 따른 균체성장 비교

유기산의 농도를 락트산 30 mM-70 mM로 점차 증가시켜 공급하였을 때, 균체 성장과 기질 분해력을 분석한 결과 락트산의 농도가 증가함에 따라 균체 농도가 높아졌다(도 1).

락트산 30 mM에서 균체 농도는 0.97 g dcw/L로 가장 낮았고, 40, 50, 60 mM 각각 1.39, 1.70, 2.05 g dcw/L로 나타났다. 락트산 70 mM에서 2.88 g dcw/L 가장 높은 균체농도를 보였지만, 락트산 60 mM 까지 99.9%로 유지되던 기질 분해율이 락트산 70 mM에서 급격히 떨어지면서 균체농도 역시 낮아지기 시작했다. 따라서 1 L 배양기를 이용하여 로도박터 스페로이즈(R. sphaeroides)를 배양할 때 락트산의 농도는 60 mM이 최대였다.

균체농도와 마찬가지로 기질전환율과 균체 생산속도 역시 락트산의 농도가 높아짐에 따라 증가하였다. 락트산 30 mM일 때, 0.24 g/L/d으로 낮은 수치를 보였지만 락트산 60 mM에서 0.54 g/L/d로 약 2배 빨라졌다.

3-3. 로도박터 스페로이즈 의 락트산 농도에 따른 지방산 조성

락트산 농도에 따른 지방산 함량을 분석한 결과 배양액 부피기준으로 환산할 경우 락트산의 농도가 30 mM에서 60 mM로 증가할수록 지방산 역시 30 mM에서 344 mg fatty acid/L-broth, 60 mM에서 728 mg fatty acid/L-broth로 증가하였다. 반면, 지방산 함량은 355±12.8 mg fatty acid/g dcw로 락트산의 농도와 관계없이 일정하게 나타났다. 따라서 유기산의 농도가 균체의 지방산 함량에 영향을 미치지 않으며, 배양액 부피가 1 L로 유지될 때 균체농도가 높아질수록 얻을 수 있는 오일의 양이 많아졌다.

1 L 배양기에서 배양한 로도박터 스페로이즈의 지방산 조성은 C18:1이 65.0%로 가장 많았고, C16, C18, C16:1이 각각 16.4%, 16.3%, 2.3% 순으로 높게 나타났다.

실시예 4. 반투과막 설치 조건에서 균체성장 최적화

4-1. 반투과막 설치

로도박터 스페로이즈 균체를 고농도로 배양하기 위해 본 발명에서는 배양액에 잠긴(submerged) 상태의 생물막을 사용하였다. 실험에 사용한 생물막은 폴리에틸렌(polyethylene) 재질이며, ECONITY MF Hollow Fiber Membrane으로 공칭공경(pore diameter) 0.4 ㎛, 막 면적은 60 ㎠ , 외경과 내경, 막두께는 각각 650, 410, 120 ㎛ 이다. 고농도 균체배양을 위한 1 L 배양기에는 막을 설치함으로써 HRT와 내부 반송에 의한 로도박터 스페로이즈의 배양기 내 체류 시간인 SRT가 나뉜다. 생물막을 설치한 생물반응기(bio reactor)의 모식도를 도 2에 나타냈다.

최적조건에 따라 1 L 배양기 운전 조건은 준호기, 광도 54 W/m²(할로겐 램프), pH 6-7, 배양 온도는 30 ℃로 하였고, 기질의 농도는 초기 락트산 40 mM, 황화암모늄 4 mM를 공급하였고, 최대 락트산 120 mM, 황화 암모늄 12 mM 까지 농도를 높였다. 연속배양 동안 HRT는 1.5-4일, SRT는 7.5-20일로 변경하며 조건을 최적화하였다.

4-2. 락트산 농도변화에 따른 균체성장 비교(HRT, SRT 유지)

고농도 균체 배양을 위해 반투과막을 설치한 배양기를 HRT 4일, SRT 20일로 유지하면서 기질 농도를 변화시켰다. 락트산 120 mM에서 균체농도와 기질분해율의 불안정화가 일어나기 전까지 락트산 40 mM 내지 100 mM 동안 균체농도와 균체생산속도가 40 mM에서 5.77 g dcw/L, 0.29 g/L/d, 60 mM에서 8.74 g dcw/L, 0.44 g/L/d로 나타났고, 80 mM에서는 11.38 g dcw/L, 0.57 g/L/d로 락트산 농도에 따라 꾸준히 증가하였다(도 3). 특히, 락트산 100 mM에서 균체농도 14.38 g dcw/L, 균체생산속도 0.72 g/L/d로 가장 높게 나타났다.

4-3. HRT , SRT 변화에 따른 균체성장 비교

락트산 100 mM이 막설치 배양기의 최적 농도로 하고, HRT 1-4일, SRT 5-20일에서 균체농도와 균체생산속도를 비교한 결과를 도 3에 나타냈다.

HRT 4일, SRT 20일에서 균체농도 14.38 g dcw/L, 균체생산속도는 0.72 g/L/d로 가장 낮았고, HRT 3일, SRT 15일에서 균체농도와 균체생산속도는 각각 15.14 g dcw/L, 1.01 g/L/d로 나타났다. HRT 2일, SRT 10일에서 균체농도 16.20 g dcw/L, 균체생산속도 1.62 g/L/d로 높게 나타났다. 따라서 HRT와 SRT가 감소할수록 균체농도와 생산속도가 증가하였다. HRT 1.5일, SRT 7.5일에는 균체농도는 낮아져 14.29 g dcw/L로 나타났지만 균체생산속도는 1.90 g/L/d로 가장 높은 생산속도를 보였다. HRT 1일, SRT 5일에는 불안정한 양상을 보이며 막의 부착물(fouling)이 일어났다. 따라서 HRT와 SRT는 각각 1.5일, 7.5일이 최적이었다. 비교한 결과를 도3에 나타내었다.

4-4. 고농도 배양한 로도박터 스페로이즈의 기질농도에 따른 지방산 조성

막 설치 배양기의 락트산 농도에 따른 지방산 함량을 분석한 결과를 도 4에 나타냈다. 지방산 함량은 353±13.2 mg fatty acid/g dcw로 락트산의 농도와 관계없이 일정하게 나타났다. 또한, 락트산의 농도가 40 mM 내지100 mM로 증가할수록 배양액 부피기준으로 환산한 지방산 역시 락트산의 농도가 40 mM일 때 2,037 mg fatty acid/L-broth에서 락트산의 농도가 100 mM일 때 5,076 mg fatty acid/L-broth로 증가하였다. 이 값은 반투과막을 설치하지 않았을 경우와 비교해 부피기준으로 약 7배 증가한 수치이다.

HRT와 SRT가 감소할수록 균체농도가 증가함에 따라 각각 HRT 3일, SRT 15일 일 때와 HRT 2일, HRT 10일 일 때는 지방산 함량이 5,344 mg fatty acid/L-broth, 5,719 mg fatty acid/L-broth의 높은 값을 보였다.

지방산 추출 결과, 고농도 배양한 로도박터 스페로이즈의 지방산 조성 역시 반투과막을 사용하지 않은 로도박터 스페로이즈와 마찬가지로 박신산(C18:1)이 59.8%로 가장 많았고, 팔미트산(C16), 스테아르산(C18), 팔미톨레산(C16:1)이 각각 20.7%, 17.0%, 2.5% 순으로 높게 나타났다. 따라서 반투과막을 설치하는 배양기에서도 반투과막을 설치하지 않은 배양기와 동일한 조성의 지방산을 얻었다.

4-5. 로도박터 스페로이즈와 미세조류 비교

1L 반투과막 광합성배양기를 사용하여 3개월 이상의 연속 운전을 실시하였으며, 운전의 결과로 도출된 1.9 g/L/d 의 바이오매스 생산량 및 670 mg/L/d의 지방산 생산량은 광독립영양생물(photoautotroph)을 이용한 미세조류 배양 및 지방산 생산량에 비하여 높은 성능을 나타냈다.

미세조류(microalgae)의 경우, 반투과막은 배양 후 농축보다는 고농도 배양 및 최적 운전을 통한 연속적 바이오매스 획득에 응용가능하다.

상기 고농도 배양된 로도박터 스페로이즈로부터 추출된 지방산을 에스테르화하여 바아오오일을 생산하고, 상기 바이오 오일은 영양 보충제, 화장품, 식품생산은 물론, 바이오 디젤을 생산하는데 활용될 수 있다.

본 실시예의 결과를 요약하면 다음과 같다:

R. sphaeroides 최적 배양 조건은 유기산 30 mM lactic acid, 질소원 4mM (NH₄)₂SO₄, pH 6-7, 할로겐램프로 빛 세기 54 W/m²에서 30℃이었다. 빛 세기 54, 108 W/m²일 때 축적하는 지방산양은 빛을 주지 않거나 높은 조도(500 W/m2 이상)를 유지할 때 보다 높았다.

최적화 조건에서 배양한 로도박터 스페로이즈 균체의 지방산을 클로로포름, 메탄올로 추출 후 에스테르화하여 분석했고, palmitic acid(C16), stearic acid(C18), vaccenic acid(C18:1)가 95-100%인 것으로 나타났다.

광합성 배양기(column type, 1 L): 로도박터 스페로이즈를 60mM lactate, 6mM (NH₄)₂SO₄을 공급했을 때, 균체농도(2.05 g dcw/L)와 균체 생산속도(0.54 g/L/d) 이었고, 균체 지방산은 약 355 mg fatty acid/g dcw, 최대 728 mg fatty acid/L-broth를 생산하였다

고농도 배양용 1 L 반투과막 광합성 배양기는 유기산 100 mM lactate, 질소원 10 mM (NH₄)₂SO₄ 을 공급했을 때, HRT 1.5일, SRT 7.5일에서 균체농도(14.29 g dcw/L)와 균체 생산 속도(1.90 g/L/d)로 최적화 되었으며, 균체의 지방산은 평균적으로 353 mg fatty acid/g dcw을 보였고, 배양액 부피기준 최대 5,044 mg fatty acid/L-broth로 막을 설치하지 않았을 때에 비해 약 7배 증가하였다.

1 L 반투과막 광합성 배양기를 사용하여 로도박터 스페로이즈 KD131을 100 mM 락트산으로 공급하면서 반호기 조건으로 6개월 이상 연속 운전을 실시하였을 때, 1.90 g/L/d를 축적하고, 671 mg fatty acid/L/d 생산하였다.

Claims (12)

1. 반투과막이 구비된 생물반응기(bioreactor) 중에서 광합성 박테리아를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 반투과막은 상기 박테리아는 통과시키지 못하지만, 상기 반응기 중의 배양액은 통과시킬 수 있으며, 상기 배양액 중의 기질의 농도는 상기 반응기 중의 상기 박테리아의 농도에 맞추어 조절되며, 상기 기질의 농도는 HRT (Hydraulic Retention Time) 및 SRT (Solids Retention Time) 조절에 의해 수행되는 것인, 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 HRT 및 SRT의 조절을 통한 고속 증식 및 고농도 배양이 가능하며, 상기 HRT, 상기 SRT, 속도 및 농도의 관계는 하기 식으로 결정되는 것인, 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법:
   성장속도 = 세균 농도 x (HRT/SRT)
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 반투과막은 관형상인, 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서, 상기 광합성 박테리아는 시아노박테리아 또는 로도박터인, 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 로도박터는 로도박터 스페로이즈이고, 상기 로도박터 스페로이즈는 광의 존재하에 준호기 상태에서 배양되며,
   상기 배양액은 탄소원으로 락트산, 아세트산, 부티르산, 말레산 또는 숙신산 중 하나 이상; 및 질소원으로 황산암모늄을 포함하는. 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 로도박터 스페로이즈는 광도 54 W/m², 온도 30 ℃, pH 6 내지 7에서 수행되는 것인, 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법.
   
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 로도박터 스페로이즈의 배양 조건은, 수리학적 체류시간(HRT) 1.5일, 미생물 체류시간(SRT) 7.5일인, 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법.
    
11. 제 8 항에 있어서,
    상기 로도박터 스페로이즈는 로도박터 스페로이즈 KD131 KCTC 12085인, 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법.
    
12. 제 1 항. 제 3 항, 제 4 항, 또는 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 반투과막을 이용한 광합성 박테리아 배양방법을 이용한 지방산 생산 방법.

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