CN109609382B - 一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，具体是将小球藻与一种固氮菌(Mesorhizobium sp.)按照一定比例进行共培养，小球藻在生长过程中释放的氧气和胞外代谢物可以被细菌生长所消耗，细菌则可以代谢生成二氧化碳供藻细胞光合利用，同时释放维生素、糖肽类等生长刺激因子促进小球藻生长。另外，利用固氮菌对氮元素的固定能力，可以实现氮元素的限制性供给，这样既可以保证小球藻的正常生长，又可以实现藻细胞的高效产油。
Description
技术领域
本发明涉及生物能源及微藻油脂技术领域，具体涉及一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法。
背景技术
能源与环境是人们共同关心的重要领域。随着化石燃料的大量使用，能源危机和温室效应问题日益突出，因此开发可再生、无污染的新型能源越来越受到人们的关注。生物能源又称绿色能源，是指从秸秆、大豆、玉米和微藻等生物质原料中获取的能源，主要包括沼气，生物氢气和生物柴油等。发展清洁高效的生物能源技术，对于改善能源消费结构、解决能源与环境的突出问题具有重要意义。
目前生物能源已经发展到第三代，而第三代生物能源的原料之一就是微藻。微藻由于生长周期短、光合效率高、油脂含量高及不占用农业耕地等特点被视为新型生物柴油的首选原料之一。高含油量,特别是高中性脂含量是微藻作为生物柴油原料来源的重要优势。微藻细胞通过光合作用吸收CO2的同时可以生成不饱和脂肪酸、蛋白质和天然色素等物质，同时藻细胞内积累的甘油三酯(TAG)与甲醇等经过转酯化反应可以转化成含硫量低、安全性好、燃烧性能高的生物柴油,剩余的甘油骨架则可以通过加氢转化形成生物乙醇，因此微藻被认为是生产生物柴油和生物产品最有希望的原料之一。
然而目前微藻产油还存在几个严重的限制因素，其中问题之一是微藻含油藻株的生长缓慢性质及其生物量和油脂积累模式的相互不协调性。在大多数微藻中，高脂质含量通常以营养缺失条件下细胞的生物量停止生长为代价。缺氮胁迫培养是目前诱导微藻油脂积累最有效也是最常见的方式，但是氮元素对藻细胞的生长必不可少，在缺氮环境中藻细胞的生长会受到很大影响，这就造成了“缺氮产油”及“生长需氮”之间的矛盾。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过藻菌共培养提高小球藻生物量和油脂含量的方法，该方法将小球藻与固氮菌B2.3按照一定比例进行共培养，藻菌共培养能够在BG11缺氮培养基中实现小球藻正常生长和高效产油，显著提高了藻细胞的生物量和微藻油脂质量，为微藻生物柴油的规模化生产提供理论基础。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
将小球藻(Chlorella vulgaris)与固氮菌B2.3(Mesorhizobium sp.)按照一定初始比例进行共培养。在藻菌共培养体系中，微藻能够为微生物的生长提供所需氧气和养分，而微生物可以消耗藻类光合作用释放的氧气并产生CO2供微藻利用，同时能够消耗胞外多聚物中的多糖等物质来减少其对藻细胞生长的抑制作用。另外，固氮菌B2.3可以固定环境中的氮元素供小球藻生长利用，这样既可以保证小球藻的正常生长，还可以实现藻细胞的高效产油，具体培养方法如下：
(1)首先将小球藻在BG11培养基中培养至对数生长期，随后藻细胞用离心机8000×g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量BG11缺氮培养基进行悬浮以去除培养基中的氮源且将OD750调至为1；
(2)取40mL小球藻藻液接种至500mL锥形瓶中，同时将培养至对数期的B2.3菌株(OD600调至为1)分别按照藻菌初始比例10:1、40:1、70:1、100:1和300:1的体积比例接种至已有小球藻的培养基中，用BG11缺氮培养基定容至200mL；
(3)最后将藻细胞放入光照培养箱进行培养，培养温度25±1℃，光照周期14h：10h，光照强度9600lx，通过CO2气瓶及空气压缩机以0.05L/min和0.95L/min的速度通入CO2和空气，以纯小球藻的缺氮培养体系作为对照。
本发明方法具有如下优点：
本发明在缺氮培养条件下将小球藻与一种固氮菌按照一定比例进行共培养，在实现氮元素限制性供给的前提下，利用固氮菌对共培养体系中营养物质的调控及氮元素的固定特性，使得小球藻既可以正常生长，又可以实现藻细胞的高效产油，从而解决了微藻“缺氮产油”及“生长需氮”之间的矛盾。
附图说明
图1是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后小球藻生物量和比生长速率的变化；
图2是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后小球藻总脂含量及产率的变化；
图3是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后小球藻中性脂含量及产率的变化；
图4是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后小球藻脂肪酸比例的变化；
图5是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后胞外多聚物中蛋白质浓度的变化；
图6是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后胞外多聚物中多糖浓度的变化；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例
一、小球藻的培养
A、小球藻的选取：藻种购于中国科学院淡水藻种库(FACHB)；
B、小球藻的纯化：无菌小球藻经含有抗生素的BG11平板(配方如表1所示)筛选获得。先将50μL小球藻藻液均匀涂布至含有100mg/L氨苄青霉素、50mg/L壮观霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的BG11固体平板上，平板放入光照培养箱中培养，培养7d后挑取小球藻单藻落，划线至新鲜的含有抗生素的BG11平板上，重复三次并通过显微镜鉴定以获得无菌小球藻；
C、小球藻的培养：采用BG11液体培养基进行培养，培养温度25±1℃，光照周期14h：10h，光照强度9600lx。
表1 BG11培养基配方
(说明：培养基总体积为1000mL，固体培养基添加1.5％的琼脂)
二、固氮菌的培养
A、固氮菌的选取：中慢生根瘤菌B2.3(Mesorhizobium sp.)由中国石油大学(华东)生物工程与技术中心分离保存；
B、固氮菌的培养：菌株培养所用GYM培养基组成如下：葡萄糖，4g/L；酵母粉：4g/L；麦芽糖：10g/L，pH值为7.0。培养基121℃高温高压灭菌20min使用，菌株在摇床中培养，培养条件：30℃，200rpm。
三、构建小球藻与菌株的共培养体系
将小球藻培养至对数生长期，8000×g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量BG11缺氮培养基进行悬浮以去除培养基中的氮源且将OD750调至为1。取40mL小球藻藻液接种到500mL锥形瓶中，同时将培养至对数期的菌株(OD600调至为1)分别按照藻菌初始比例10:1、40:1、70:1、100:1和300:1的体积比例接种至已有小球藻的培养基中，用BG11缺氮培养基定容至200mL。以纯小球藻的缺氮培养体系作为对照，在光照培养箱中进行培养。
四、结果分析
A、藻菌初始接种比例对小球藻生物量积累的影响
通过测量纯藻培养和藻菌共培养体系中叶绿素的含量来表征小球藻生物量的变化。小球藻叶绿素含量采用96％甲醇提取法进行测定，步骤如下：取适量藻液8000×g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次后加入10mL96％甲醇，涡旋混匀3min后超声浸提40min，期间避光加冰防止叶绿素受热见光分解。待藻体颜色变白离心取上清液，测OD653。微藻的生物量和Chla浓度根据以下公式进行计算：Microalgae dry biomass(g/L)＝1.249×OD653,R2＝0.998；小球藻的比生长速率(μ)根据以下公式进行计算：μ＝(ln Nf–lnNi)/tf–ti，其中N是最终(f)或初始(i)时间(t)的干细胞重量(g/L)。
按照上述步骤得到的图1结果表明：培养10d后，小球藻与B2.3-70:1共培养体系中藻细胞的生物量积累最高，最大生物量浓度为1.68g/L，较纯藻培养体系的1.01g/L提高了66.3％；初始接种比例为40:1和100:1共培养体系的最大生物量浓度也分别提高了32.7％和33.7％，而10:1和300:1共培养体系则无显著变化。比生长速率反映单位时间藻细胞的积累速率。共培养过程中，藻菌初始比例为40:1、70:1和100:1共培养体系的最大比生长速率分别为0.028d-1、0.035d-1和0.031d-1，较对照的0.021d-1分别提高了33.3％、66.7％和47.6％，而10:1及300:1共培养体系则无明显变化。
以上结果表明，藻菌初始接种比例对微藻的生长具有重要影响，当初始接种比例为70:1时，B2.3菌株对小球藻生物量积累的促进效果最佳。
B、藻菌初始接种比例对小球藻总脂积累的影响
微藻通过光合作用可将光能和CO2等吸收并转化生成油脂，油脂与甲醇等物质进行转酯化反应最终可形成生物柴油，因此提高藻细胞内总脂含量对微藻生物柴油的制备具有重要意义。小球藻总脂含量采用氯仿-甲醇法进行测定。取藻粉(W1)于10mL离心管中，加入5mL氯仿-甲醇溶液(2:1，v/v)后涡旋并超声浸提30min，8000×g离心10min收集上清至已称重的玻璃试管(W2)，沉淀继续用氯仿-甲醇溶液萃取至无色，最后合并上清。用氮吹仪将玻璃试管中的有机溶剂吹干并置于70℃烘箱干燥6h，冷却后称量玻璃试管恒重(W3)。总脂含量根据以下公式进行计算：Total lipid content(％dcw)＝(W3-W2)×100/W1。
不同藻菌初始接种比例体系的小球藻培养10d后，检测藻细胞内总脂含量及产率的变化(图2)。在小球藻与B2.3共培养体系中，初始接种比例为40:1、70:1和100:1体系小球藻的总脂含量分别为35.1％、45.2％和40.9％，较纯培养体系的30.6％分别提高了14.7％、47.7％和33.7％，而初始接种比例为10:1和300:1共培养体系中藻细胞的总脂含量则无明显变化。总脂产率为单位时间总脂的产量，反映藻细胞油脂的积累速率。培养10d后，共培养体系中的总脂产率均有所提高。其中小球藻与B2.3-70:1共培养体系的总脂产率最高为75.94mg/L·d，较纯藻培养体系的30.91mg/L·d提高了145.7％；初始接种比例为40:1和100:1共培养体系的总脂产率也分别提高了52.2％和78.7％。
以上结果表明，藻菌共培养对缺氮条件下小球藻的总脂含量和产率有明显的促进作用，同时藻菌初始接种比例对小球藻油脂的积累有较大的影响。对于较高的藻菌初始接种比例，共培养体系中的菌株不能有效地消耗藻类光合作用释放的O2并产生CO2供微藻利用，同时消耗微藻胞外多聚物的能力也降低；而较低的藻菌初始比例则会导致藻类细胞密度下降，从而影响微藻生长和油脂积累。
C、藻菌初始接种比例对小球藻中性脂积累的影响
微藻生物柴油制备过程中的转酯化反应主要是藻细胞内甘油三酯(TAG)即中性脂与醇类物质反应。小球藻中性脂含量采用尼罗红荧光染色法进行测定。尼罗红(NR)是一种脂溶性荧光染料，与中性脂结合呈黄色荧光，与极性脂结合呈红色荧光，通过绘制已知浓度甘油三酯标准品与荧光强度的标准曲线，从而测定小球藻的中性脂含量。步骤如下：取适量藻液8000×g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀加入20％DMSO悬浮后用紫外分光光度计调节OD540至1，同时通过干重法测定该藻液的藻密度。取2mL调节好的藻液，40℃水浴30min后加入10μL 0.24mg/mL尼罗红染料，避光染色5min后用荧光光谱仪以520nm为激发波长，574nm为消散波长测定荧光强度，根据标准曲线换算成中性脂含量。
不同藻菌初始接种比例体系的小球藻培养10d后检测藻细胞内中性脂含量及产率的变化(图3)。小球藻与B2.3-70:1共培养体系中的中性脂含量及中性脂占总脂比例均为最高，分别为23.0％和50.9％，较纯藻培养体系分别提高了90.1％和28.2％；同时初始接种比例为40:1和100:1共培养体系中性脂的含量也分别提高了33.1％和60.3％，中性脂占总脂比例也有一定程度的提高。对于藻细胞的中性脂产率，初始接种比例为40:1、70:1和100:1共培养体系分别为21.54mg/L·d、38.65mg/L·d和26.23mg/L·d，较纯藻培养体系分别提高了75.6％、215.0％和113.8％，而10:1和300:1共培养体系中的中性脂产率则无明显变化。
以上结果表明：藻菌共培养体系的构建对小球藻中性脂的积累产生了明显的促进作用，同时保持共培养初始接种时微藻的数目优势是促进藻细胞生物量和油脂积累的一个重要因素。
D、藻菌初始接种比例对小球藻脂肪酸比例的影响
微藻油脂中含有多种形式的脂肪酸成分，包括饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)。其中MUFA中的十八烯酸C18:1为生物柴油的指标，PUFA中的EPA和DHA组分对人体具有很高的营养学和药学价值，因此提高微藻细胞内具有经济价值脂肪酸的含量对生产生物柴油及生物产品具有重要意义。取过程B中获得的总脂，加入0.4mL 50％硫酸和2mL无水甲醇，混匀封口，60℃水浴30min后加入1mL正己烷，混匀离心取上清。以正十九酸为内标，进行气相色谱分析脂肪酸组成。气相色谱条件：Agilent 7890B气相色谱仪和HP-5毛细色谱柱。分析条件:进样口温度280℃，检测器温度300℃，柱温50℃，保持2min，以10℃/min为梯度升温至280℃，然后保持10min，载气为氮气，流速2.3mL/min，分流比为3:1，进样量1μL。
培养10d后测定不同体系中小球藻脂肪酸比例的变化(图4)。气相色谱分析显示，不同培养体系中小球藻脂肪酸的主要成分是C16和C18脂肪酸(＞82％)，而这两种脂肪酸是生物柴油的主要组分。同时作为生物柴油指标的油酸C18:1，在小球藻与B2.3以40:1、70:1和100:1的共培养体系中的含量分别为36.62％、39.85％和37.14％，较纯藻培养体系的32.01％分别提高了14.4％、24.5％和16.0％。藻菌初始接种比例40:1、70:1和100:1共培养体系中MUFA的比例为52.37％-55.70％，PUFA的比例为10.76-12.43％，均高于纯藻培养体系的49.70％和9.89％，而SFA的比例则有一定程度的降低。
以上结果表明，在缺氮条件下，藻菌共培养体系的构建提高了藻细胞内不饱和脂肪酸的含量，降低了饱和脂肪酸的含量。同时细菌的加入促使小球藻积累更多的C18:1脂肪酸，这对于提高生物柴油的质量和产量均具有重要意义。
E、藻菌共培养对小球藻胞外多聚物中蛋白质浓度的影响
微藻胞外多聚物(EPS)分为上清液胞外多聚物和细胞周围胞外多聚物，主要包括蛋白质和多糖。由于氮元素的缺乏，纯藻培养体系中小球藻的生长较为缓慢，而共培养体系中藻细胞的生物量仍有一定程度的增加，因此推测在共培养体系中有部分含氮物质生成供小球藻生长利用。小球藻蛋白质含量采用Bradford法进行测定，以BSA为标样，通过绘制蛋白含量与OD595的标准曲线，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。步骤如下：取2mL微藻培养液，12000×g、4℃离心10min，得到的上清液经过0.45μm滤膜过滤以收集上清液中的可溶性胞外多聚物。藻细胞沉淀加入超纯水悬浮后放入60℃水浴锅中孵育30min以提取结合的部分，12000×g、4℃离心10min，得到的上清液经过0.45μm滤膜过滤以收集细胞周围的可溶性胞外多聚物。
图5为纯培养和共培养过程小球藻胞外多聚物中蛋白质浓度的变化，不同培养体系胞外多聚物中蛋白质浓度呈上升状态，在第8-10d时趋于稳定。小球藻与B2.3在70:1(v/v)共培养体系中细胞周围的蛋白质含量从第4d的10.77mg/L增加到第10d的22.37mg/L，低于纯藻培养体系的14.55mg/L-29.31mg/L；而共培养体系上清液中的蛋白质含量从第4d的4.02mg/L增加到第10d的15.29mg/L，高于纯藻培养体系的3.32mg/L-12.22mg/L。
以上结果表明，B2.3菌株能够分解藻细胞周围的蛋白质并释放到上清液中供藻细胞生长利用，从而使得共培养体系中的小球藻在缺氮条件下生物量还有所增加。
F、藻菌共培养对小球藻胞外多聚物中多糖浓度的影响
胞外多聚物为共培养体系中细菌生长利用的主要原料。小球藻多糖含量采用硫酸-苯酚法进行测定，以葡萄糖为标品，通过绘制葡萄糖浓度与OD490的标准曲线，测定490nm处吸光度的增加即可进行多糖定量，步骤如E。
图6为培养过程小球藻胞外多聚物中多糖浓度的变化。对于细胞周围的多糖浓度，不同体系在培养过程中均呈上升状态，在第8-10d时趋于稳定。小球藻与B2.3在70:1共培养体系中细胞周围的多糖含量从第4d的29.49mg/L增加到第8d的44.44mg/L，高于纯藻培养体系的24.72mg/L-35.48mg/L。培养10d后，纯藻培养体系上清液中的多糖浓度从3.21mg/L增加到21.33mg/L，并趋于稳定；而小球藻与B2.3在70:1共培养体系上清液中多糖的浓度增长较为缓慢且始终低于纯藻培养的浓度。
以上结果表明，上清液中的多糖被共培养体系中的细菌消耗利用，同时消耗的这部分物质会减少其对藻细胞生长的抑制作用，而细胞周围多糖含量的提高会增强藻细胞和细菌之间的联系，有利于共培养体系的稳定。
五、实验总结
A、藻菌初始接种比例对共培养体系中小球藻的生长和油脂积累有显著影响。在小球藻与B2.3-70:1共培养体系中，小球藻的生物量(1.68g/L)、总脂含量(45.2％)、总脂产率(75.94mg/L·d)、中性脂含量(23.0％)及中性脂产率(38.65mg/L·d)均为最高，其中生物量、总脂产率和中性脂产率较纯藻培养体系分别提高了66.3％、145.7％和215.0％；
B、藻菌共培养体系对缺氮胁迫条件下藻细胞内各脂肪酸的比例有较大影响。固氮菌B2.3促使共培养体系中小球藻积累更多的C16和C18脂肪酸，作为生物柴油指标的C18:1脂肪酸也有所增加。同时细菌的加入提高了藻细胞内不饱和脂肪酸的含量，降低了饱和脂肪酸的含量，这对于提高微藻生物柴油的质量及产量均具有重要意义；
C、B2.3菌株通过调节共培养体系中小球藻胞外多聚物(EPS)来对藻细胞的生长和油脂积累产生影响。在缺氮条件下，B2.3菌株分解藻细胞周围的蛋白质并释放到上清液中供藻细胞生长利用，从而使得小球藻的生物量在缺氮培养时仍有一定程度的增加；而藻细胞上清液中的多糖被细菌消耗利用，细菌则可以为藻细胞光合作用提供所需的CO2和生长刺激因子；同时细菌的加入使藻细胞周围的多糖含量增高，有利于维持共培养体系的稳定。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，将小球藻与固氮菌按照体积比10:1～300:1的比例在BG11缺氮培养基中共培养，从而实现藻细胞的正常生长和高效产油，
包括以下步骤：(1)首先将小球藻在BG11培养基中培养至对数生长期，随后藻细胞用离心机8000×g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量BG11缺氮培养基进行悬浮以去除培养基中的氮源且将OD750调至为1；
(2)其次取40mL小球藻藻液接种至500mL锥形瓶中，同时将培养至对数期的中慢生根瘤菌B2.3菌株OD600调整为1，分别按照藻菌初始比例10:1、40:1、70:1、100:1和300:1的体积比例接种至已有小球藻的培养基中，用BG11缺氮培养基定容至200mL；
(3)最后将藻细胞放入光照培养箱进行培养，培养温度25±1℃，光照周期14h：10h，光照强度9600lx，通过CO2气瓶及空气压缩机以0.05L/min和0.95L/min的速度通入CO2和空气，以纯小球藻的缺氮培养体系作为对照。
2.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，所述小球藻经含有100mg/L氨苄青霉素、50mg/L壮观霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的BG11平板筛选获得。
3.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，所述小球藻与固氮菌的最优藻菌体积比为70︰1。
4.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，所述藻菌共培养对小球藻生长、油脂积累和脂肪酸种类等方面都有促进作用。
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2018
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