CN111088166A

CN111088166A - 一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法

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Publication number: CN111088166A
Application number: CN201911369892.1A
Authority: CN
Inventors: 周文广; 徐品品; 陈甫风; 钟凤; 陈思华; 戈成祥; 李晶晶
Original assignee: Lattice Power Jiangxi Corp
Current assignee: Lattice Power Jiangxi Corp; Nanchang University
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-05-01

Abstract

本发明一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，包括将微藻与脲酶细菌在添加一定浓度葡萄糖条件下进行共培养，通过测定共培养体系中叶绿素反映微藻的生长情况；将藻菌共培养体系在摇床培养后与钙化液进行混合达到藻菌共同诱导碳酸钙沉淀的目的。本发明通过人为构建微藻与脲酶细菌共培养体系不仅可以提高微藻的生物量，又可以促进微生物诱导碳酸钙沉淀过程，为微生物矿化提供了一种新颖、独特的诱导沉淀方法。

Description

一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法

技术领域

本发明一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，具体属于微生物和微生物诱导方解石沉淀技术领域。

背景技术

众所周知，微藻和细菌在生态系统中长期共存，从共生到寄生之间存在着许多复杂的关系。已经有研究（周文礼，等. 不同海洋饵料微藻对抗生素的敏感性差异分析[J].武汉大学学报(理学版), 2007(02):128-133.）表明某些细菌可以将水体的有机质分解成小分子的有机酸、氨基酸及氨，为单细胞的藻类提供营养从而促进藻类的生长。并且许多微藻与细菌共培养，在废水处理、促进微藻产量以及生物燃料生产等方面发挥了积极作用。如王文国等人构建藻菌体高效处理沼液（专利号：CN106630483.A，一种基于藻菌共生的高效净化沼液的方法）；张继彪等人（专利号：CN107129950.A，一种用于净化生活污水的活性藻菌共同体和制备方法）利用铜绿微囊藻、小球藻和地衣芽孢杆菌组成藻菌共同体可以高效净化普通生活污水。如赵艳等人（专利号：CN 10569554.A，一种通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法）发明了一种利用藻菌共培养提高微藻生产叶黄素产量的方法以及利用藻菌共培养提高小球藻的油脂产率（专利号：CN 105755091.A，一种利用水稻内生泛菌和小球藻共培养提高小球藻油脂产率的方法）。葛保胜等人（专利号：CN 109609382.A，一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法）发明了一种利用小球藻与固氮菌共培养促进藻细胞生长及产油效率，又发明了绿藻与一株硫氧化细菌按照一定比例进行混合培养提高微藻产氢量的方法（专利号：CN107663529.A，一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法）。

然而，微藻与细菌混合培养诱导沉淀的研究很少，已知微生物诱导碳酸盐沉淀(Microbially induced calcium carbonate precipitation, MICP) 即微生物进行生理代谢活动时产生的碳酸氢盐与水溶液中的钙离子反应生成碳酸钙沉淀的生物过程，是一种新型的、可替代建筑材料的绿色环保微生物技术。常见的微生物主要有细菌、藻类和真菌等，其中细菌主要为自然界广泛存在的产脲酶菌如芽孢杆菌中的sporosaricinapasteurii诱导碳酸钙沉淀被众多国内外学者研究及应用，如东南大学钱春香等人（专利号：CN200510094744.5，利用微生物沉积制备碳酸钙的方法）利用经过含尿素底物的培养基培养后的巴氏芽孢杆菌与CaCl₂溶液混合在一定条件下反应生成碳酸钙沉淀。实验室研究较多的是纯培养微生物诱导碳酸钙沉淀，迄今为止国内外未见通过人工构建微藻与细菌共培养体系在微生物诱导碳酸钙方面上的技术研究及应用。已知脲酶细菌是一种分泌脲酶分解尿素的菌株，当有水体环境有尿素存在时，其分泌会脲酶对尿素进行分解生成HCO₃ ^-和氨气。而小球藻作为一种光合自养绿藻，在进行同化作用时能够利用水体中的HCO₃ ^-，以致胞外CO₃ ^2-浓度升高

。当小球藻和脲酶细菌共培养时，理论上其脲酶细菌不仅可以水解尿素生成HCO₃ ^-,还通过呼吸作用提供CO₂参与到小球藻的光合作用，当水体环境Ca²⁺浓度足够时，将主动促进碳酸根生成促进碳酸钙的生成。因此本发明通过人工构建小球藻与脲酶细菌共培养体系进行诱导碳酸钙沉淀，提供一种新颖、独特的方法并在微生物矿化方面具有有益的指导意义。

发明内容

本发明的目的提供一种新型基于微藻与脲酶菌共培养体系促进微藻的生长，又进行诱导生成碳酸钙沉积的生产方法。利用淡水小球藻与脲酶细菌构建共培养，不仅可以提高小球藻细胞的生长速率和生物量，用时又可以促进诱导沉淀过程。

本发明一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法包括以下步骤：

步骤1：将处于对数增长期的微藻和脲酶细菌分开预处理后，得到的藻细胞悬浮液与菌细胞悬液按1∶1000～1000∶1的体积比例细混合共培养，通过测定共培养体系中叶绿素a的含量反映共培养过程中微藻的生长情况，确藻细胞悬浮液与菌细胞悬液适宜的混合体积比例；

所述的预处理为：原藻液或原菌液经过离心后，藻或菌细胞沉淀物质经过无菌水2～3次洗涤，加入与原藻液或原菌液等体积的无菌改良BBM培养基，制备相应的藻细胞悬浮液或菌细胞悬浮液；其中离心转速为2000～20000rpm，温度为0～50℃，离心时间1～100min；共培养的条件：培养温度为0～60℃，光强度为0～100000 Lux，转速0～300rpm，培养周期为1～30d；

步骤2：将步骤1藻细胞悬浮液与菌细胞悬浮液按1∶1000～1000∶1的体积比例进行混合，进行第二轮共培养，待共培养体系中的微藻增长至对数增长期时，取适量藻菌共培养液与等体积的钙化液进行微生物诱导碳酸钙沉淀，其条件为：静置培养，温度0～60℃，光照强度0～3000Lux，每天摇动培养瓶0～10次直至周期结束，培养周期为0～60d；

所述的第二轮共培养的体系中，微藻的叶绿素a浓度应达到16～20mg/L；钙化液为钙盐与尿素等质量浓度混合配制的溶液，其中Ca²⁺浓度为0.01～40g/L。

所述的微藻为小球藻，螺旋藻或集胞藻。

所述的脲酶细菌为芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或巴氏芽孢杆菌。

所述的改良BBM培养基是在BBM培养基的基础上，再添加质量浓度分别为0.01g/L～20g/L的葡萄糖和0.01g/L～50g/L的Tris盐；

所述的BBM培养基的配方为：硝酸钠0.25g/L，磷酸氢二钾0.075g/L，硫酸镁0.015g/L，氯化钙0.025g/L，硫酸二氢钾0.175g/L，氯化钠0.025g/L，微生素B₁ 0.001 g/L，微量元素H0.25μg/L，维生素B₁₂ 0.15μg/L，乙二胺四乙酸二钠 0.75g/L，氯化锰0.041g/L，氯化锌0.005g/L，钼酸钠0.004g/L，氯化铁0.097g/L，氯化钴0.002g/L。

所述的钙盐为可溶性钙盐氯化钙、硝酸钙或乙酸钙。

本发明的有益效果：

本发明有以下两大优势：

1、本发明是利用微藻与脲酶细菌进行共培养，一方面利用细菌促进微藻的生产量，另一方面利用微藻的光合作用进行陈代谢或脲酶细菌分解尿素生成碳酸根与可溶性钙离子反应，生成一种生物岩石材料。与纯培养微藻相比，可以显著提高微藻的生物量。

2、与纯培养微生物诱导碳酸钙沉淀方法相比，可以综合微藻与脲酶细菌自身的优势，在藻菌共培养体系中，微藻可以利用细菌的呼吸作用产生CO₂进行光合作用，脲酶细菌又可以利用微藻生成的O₂进行代谢活动分解尿素产生HCO₃ ^-和氨气造成液体环境pH上升，当液体环境Ca²⁺充足，将主动促进诱导沉淀过程。该发明是一种新颖，独特的微生物诱导碳酸钙沉淀的方式，为微生物沉积岩石方面形成机理提供理论的可行性。

附图说明

图1为藻菌共培养液的光学显微镜图;

图2为纯培养小球藻液的光学显微镜图;

图3为藻菌共培养体系中小球藻叶绿素a（mg/L）含量图;

图4为藻菌共培养体系诱导过程的流程图;

图5为诱导过程溶液钙离子浓度（g/L）变化图;

图6为不同培养体系诱导生成的矿物颗粒的XRD图;

图7为纯小球藻培养体系诱导生成的矿物颗粒的SEM图;

图8为藻菌共培养体系诱导生成的矿物颗粒的SEM图;

图9为纯脲酶细菌体系诱导生成的矿物颗粒的SEM图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细说明.

实施例1

小球藻与巴氏芽孢杆菌共培养对小球藻生长的影响

（1）巴氏芽孢杆菌菌液制备：将超低温保藏的巴氏芽孢杆菌ATCC 6453（Sporosarcina Pasteurii购于美国微生物保藏中心）按常规的活化方法活化，具体操作如下：将巴氏芽孢杆菌接种于灭菌后NH₄-YE固体培养中并置于30℃恒温培养箱中静止培养24～72h后，在无菌工作台，利用接种环挑取适量菌落接种至10mL的NH₄-YE液体培养基进行第一次扩培养，将扩增培养24h后处于对数增长期的菌液按10%（v/v）接种至100mLNH₄-YE液体培养基进行第二次扩增培养，如此共扩培养3次。培养条件为在恒温振荡培养箱里温度30℃，转速120rpm，培养时间为培养24～48h。采用光密度法确定生长曲线，测菌液在光波长在600nm的吸光值。当菌液处于对数增长期，细菌细胞浓度为OD₆₀₀=0.8~1.2。取适量体积的对数增长期的菌液在4℃，8000rpm离心20min，所得的细胞沉淀用3倍体积的无菌水洗涤两次，再离心10min收集菌体细胞，加入与原藻液和原菌液等体积的灭菌后的改良BBM培养基（在BBM培养基中添加1g/L的葡萄糖与0.5g/L的Tris盐）制备成藻细胞和菌细胞悬浮液待用。

NH4-YE培养基配制：称取15.75gTris盐，用去离子水稀释至1L，用1+9HCl调节pH至9.0，加入酵母提取物20g，硫酸铵10g，搅拌均匀，可得NH₄-YE培养液；当加入15g琼脂即可得NH4-YE固体培养基。

BBM培养基配方：硝酸钠0.25g/L，磷酸氢二钾0.075g/L，硫酸镁0.015g/L，氯化钙0.025g/L，硫酸二氢钾 0.175g/L，氯化钠0.025g/L，微生素B₁0.001 g/L，微量元素H 0.25μg/L，维生素B₁₂0.15μg/L，乙二胺四乙酸二钠 0.75g/L，氯化锰0.041g/L，氯化锌0.005g/L，钼酸钠0.004g/L，氯化铁0.097g/L，氯化钴0.002g/L。

（2）小球藻藻液的制备：采用的小球藻藻种为从垃圾渗滤液中筛出的蛋白核小球藻，编号为NCU1，用小球藻原藻液，按10^-2，10^-3,10^-4的浓度梯度稀释原藻液，取100µL在BG-11固体培养基划线，置于恒温光照培养中有一周后，取深绿色的藻落至10mL无菌BG-11液体培养基进行第一次扩大培养，将生长到第5天处于对数增长期的小球藻按20%接种值100mL的无菌BG-11液体培养基进行第二次扩增培养。如此共扩培养3次。培养条件为温度30℃，转速120rpm，光照强度2000Lux。根据光密度法确定小球藻的生长曲线，即以空白培养液为参比，藻液在波长680nm的吸光值，当小球藻在对数增长期时，小球藻的光密度范围为1.0～2.0。取适量处于对数增长期的小球藻在4℃，8000rpm离心20min离心，所得的藻细胞沉淀用3倍体积的无菌水洗涤两次，再离心10min收集藻细胞，加入与取量等体积的灭菌后的改良BBM培养基悬浮待用。

（3）按不同的藻菌体积比例4:1（v/v）、3:2（v/v）、2:3（v/v）、1:4（v/v）混合步骤1与步骤2获取的巴氏芽孢杆菌悬浮液与小球藻藻悬液接种至200mL无菌改良BBM培养基，接种量为藻菌体积和为总培养液的10%。设定藻菌共培养组与纯培养对照组，其中纯培养组为仅接种步骤2）的小球藻的种子细胞，其他条件与共培养组一致。每组三次共三瓶，培养条件为恒温光照培养箱温度30℃，转速120rpm，光照强度2000Lux。培养周期为7d。在培养过程取适量培养液在光学显微镜初步观察藻菌共培养组与纯培养组的培养的差别，结果如图1与图2所示。可明显看出纯培养小球藻体系中小球藻是单独独立的，而藻菌共培养体系中的小球藻数量多且成团，初步判断与加入细菌有关。

（4）通过测藻菌共培养体系中小球藻叶绿素a的含量来间接反映藻菌体系小球藻的生长情况。每天用无菌枪嘴取5ml培养液，经过4℃，4000rpm离心20min后，底部沉底物质在弱光条件下加入3～5mL无水乙醇，充分振荡5min。再离心20min，取上层提取液，在波长666nm、653nm下的吸光值。通过公式计算出共培养组与纯培养组的叶绿素a含量。结果如图3所示。可以看出无论小球藻与巴氏芽孢杆菌接种比例如何，共培养体系中小球的生物量均高于纯培养组，且不同藻菌体积比例4:1（v/v）、3:2（v/v）、2:3（v/v）、1:4（v/v）条件下共培养体系中小球藻能达到最大的叶绿素a含量分别为20.43±0.88mg/L 、20.73±0.35mg/L、18.96±2.18mg/L、20.78±0.23mg/L均远远高于未加巴氏芽孢杆菌的小球藻的叶绿素a浓度的11.87±0.58mg/L。表明了当小球藻与巴氏芽孢杆菌进行共培养可以显著提高小球藻的生物量，且与纯小球藻体系相比，藻菌体积接种比例为3:2时，小球藻的生物量能达到最大，提高了37.74%。

实施例2

利用藻菌共培养体系进行诱导碳酸钙沉淀过程

（1）如图3所示的流程图所示，小球藻与巴氏芽孢杆菌经活化、扩增培养后，制备小球藻与巴氏芽孢杆菌的细胞悬浮液，按藻和菌悬浮液体积比例为3:2（v/v）接种至100mL无菌的改良BBM培养基，培养3～5d，待藻菌共培养体系中小球藻的叶绿素浓度为16～20mg/L。

（2）钙化液的制备：准备称取11.1g无水氯化钙和6g尿素溶于1L水中配制成Ca²⁺浓度为4g/L的钙化液。通过抽滤灭菌的方式对该溶液进行灭菌处理。

（3）诱导过程如图4所示，在无菌工作台中，分别移取步骤（1）制备出的藻菌液与步骤（2）的钙化液各50mL混合置于恒温光照培养箱中，温度为30℃，光照强度2000Lux。同时设定藻菌共培养组和纯培养对照组以及空白对照组。纯培养对照组分别为仅小球藻藻液与仅巴氏芽孢杆菌菌液，空白对照组为空白培养基与钙化液等体积混合。其他条件与共培养组一致。每组实验各平行三次。取适量样品进行离心，取上层清夜经过0.45µm的滤头过滤，然后利用ICP测定钙离子浓度，每隔四天取一次样，实验周期为20天，每隔4天取一次，共五次。结果如图5所示。实验周期结束后藻菌共培养中溶液中钙离子最大下降率为60.40%均高于纯藻组(47.78%)和细菌组(41.26%)，反映了藻菌共培养诱导沉淀量大于纯培养小球藻与纯细菌的诱导的沉淀量，结果表明了藻菌共培养体系诱导沉积效果要好于纯培养体系。

（4）实验周期结束后，倒去上层清液，收集沉淀并用蒸馏水洗清两遍，进行冷冻干燥。分别利用XRD衍射仪进和场发射扫描电镜SEM测定样品，纯小球藻培养组、藻菌共培养组以及纯细菌组XRD结果分别如图6（a）、（b）以及（c）所示，各组诱导的矿物颗粒为均为碳酸钙方解石。另外纯小球藻培养组的SEM结果如图7所示；藻菌共培养组的结果如图8所示；纯细菌培养组的结果如图9所示。可以清楚地观察到，这三种矿物颗粒的矿物形态不同。且在放大50倍条件下，图7和图8所形成的矿物颗粒尺寸远大于图9的，且纯细菌体系形成的矿物颗粒大多为棱柱状时，而其他两组其大部分为方型。另外在放大5000倍时，可以清晰观察到无菌小球藻组和藻菌共培养体系组的矿物颗粒表面均有大小不等的椭圆形小孔（图7），推测为小球藻细胞或细菌细胞的成核位点。但是图8中的矿物颗粒堆积在一起，无法直接观察具体的晶体结构，可而其他两组的晶体结构是完整独立的。这可能是由藻菌共生系统分泌某些黏性物质（如EPS等），使晶体堆积在一起。

Claims

1.一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，其特征在于：所述的微藻为小球藻，螺旋藻或集胞藻。

3.根据权利要求1所述的一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，其特征在于：所述的脲酶细菌为芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或巴氏芽孢杆菌。

4.根据权利要求1所述的一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，其特征在于：所述的改良BBM培养基是在BBM培养基的基础上，再添加质量浓度分别为0.01g/L～20g/L的葡萄糖和0.01g/L～50g/L的Tris盐；

5.根据权利要求1所述的一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，其特征在于：所述的钙盐为可溶性钙盐氯化钙、硝酸钙或乙酸钙。