CN112794885A

CN112794885A - 微生物纳米线连接的细胞生物膜及其应用

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Publication number: CN112794885A
Application number: CN202011632647.8A
Authority: CN
Inventors: 郗丽君; 王明; 刘建国; 刘德建
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-05-14

Abstract

本发明公开了微生物纳米线连接的细胞生物膜及其应用。本发明提供的微生物纳米线，来源于细菌Starkeya novella，是一种导电的蛋白质纳米线，命名为SN_MNWs，由单体分子量约为33kD的蛋白质组成，具有连接细菌细胞和微藻细胞形成生物膜的能力，其在形成生物膜结构后能够促进细胞的生长、光和固碳和产氢。本发明专利保护因SN_MNWs的导电性、蛋白质特性、形成生物膜的性质等产生的应用。本发明专利保护藉由SN_MNWs形成的导电菌体生物膜及其应用。含有所述纳米线的导电材料属于本发明的保护范围。本发明专利在导电生物纳米材料、生物电化学、固碳减排及清洁能源生产中均具有重要实际意义。

Description

微生物纳米线连接的细胞生物膜及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及由微生物纳米线连接的细胞生物膜及其应用。

背景技术

自从2005年Reguera等人发现厌氧硫还原地杆菌能在细胞外产生天然导电的蛋白纳米丝，并称之为微生物纳米线(Microbial nanowires,MNWs)之后，这种导电性能堪比金属电线的MNWs，在生物能源、生物地球化学和生物修复等领域具有重要的作用。从而开辟了许多新的纳米技术和微生物学的研究领域。

厌氧硫还原地杆菌产生的MNWs具有良好的导电性能，其导电机理是由一个个紧密排列的血红素分子介导的。在整个蛋白纳米线内，血红素之间的距离是

这个距离可以非常高效地传递电子(参考文献1：Power generation from ambient humidityusing protein nanowires.Nature.(2020)7796,550-554)。从而为设计合成基于蛋白质的“绿色”电子器件提供了新理念。MNWs不仅能在营厌氧胞外呼吸的金属还原菌中发现，在硫酸根还原细菌—脱硫弧菌、铁氧化细菌—嗜酸氧化亚铁硫杆菌、光合细菌和蓝细菌中也有发现。因此，从厌氧、金属还原菌、光合到蓝细菌等多种微生物中均发现了MNWs，强调了它们可能在环境中普遍存在的观点。虽然MNWs产生菌具有较高的多样性，但针对其应用的研究却非常滞后。

虽然MNWs产生菌具有较高的多样性，但针对其机理的研究则主要集中在了厌氧硫还原地杆菌和兼性厌氧奥奈达希瓦氏菌。对于好氧菌产生MNWs机理研究还未见报道。而且对于MNWs形成生物膜的研究也主要集中在厌氧微生物上，而且很难确定是群体中的那种微生物在产生MNWs。鉴于MNWs介导了细菌的胞外电子传递，而MNWs的生产能极大提高微生物的长距离电子传递能力，因此，能否产生MNWs被认为是解决微生物燃料电池/电解池产能低，构建高效微生物燃料电池/电解池的关键。在生物光伏(biophotovoltaics,BPV)领域，报道了利用光合蓝细菌-细长聚球藻(阴极)与奥奈达希瓦氏菌(阳极)构建了高效的生物光电池(参考文献2：Development of a longevous two-species biophotovoltaicswith constrained electron flow. Nature Communications.(2019)10(1))。展示了MNWs产生菌在生物光伏领域的巨大潜力。

国家能源结构调整将发展清洁能源作为重点支持的研究方向。氢气作为一种绿色高效的可再生能源，在未来的能源经济中将担任重要角色。然而，长期以来，在生物制氢领域，一直存在产能低下的问题，急需寻求新的解决方案。微藻可以利用太阳能、 CO₂、或者废水、废渣等通过其生理代谢产生H₂，实现了在环境友好的基础上能源的最大输出。因此，微藻光合制H₂法可望成为解决当今世界能源危机和环境危机的有效途径。微藻，是一种光合生物，其能够在净化污水的同时吸收CO₂进行光合作用产生O₂、积累生物量和代谢产物，是一种生长迅速的绿色固碳生物。有很多细菌能吸收利用CO₂，并将其矿化为碳酸盐或有机物。有些细菌还最终能将CO₂固定成生物量。例如：严格好氧兼养菌Starkeya novella，能在营养(例如：糖醇、氨基酸、羧酸和脂肪酸等) 充足的情况下(异养型)，高效率地利用组成型表达的固碳酶系吸收CO₂(甲基营养型) (参考文献3：Metabolic adaptation andtrophic strategies of soil bacteria- C1-metabolism and sulfurchemolithotrophy in Starkeya novella.Frontiers in Microbiology.(2013)4)。据报道，S.novella还能利用单质硫、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、四硫代酸盐、二甲基硫醚和二甲基亚砜等作为能源生存(化能自养型)。并发现，S.novella与其他类型的自养菌和硫氧化菌的固定CO₂能力具有较大差别。CO₂在水中的扩散和平衡速度很慢。而藻类被限制在水环境中，这对它们的光合固碳能力有很大影响。前期研究发现，S.novella具有快速将空气中CO₂溶入水中的多个高效固碳酶系。因此，可以将S.novella严格好O₂的生长习性和多样化的生存能力与微藻光合作用相结合，增加微藻的固碳量从而提高其产能。因此，本发明专利还对于固碳减排及清洁能源生产中均具有重要实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供由微生物纳米线连接的细胞生物膜及其应用。

本发明提供的微生物纳米线，来源于细菌Starkeya novella，是一种导电的蛋白质纳米线，命名为SN_MNWs。

SN_MNWs的特征为：由单体分子量约为33kD的蛋白质组成，具有连接细菌细胞和微藻细胞形成生物膜的能力，其在形成生物膜结构后能够促进细胞的生长、光和固碳和产氢。

本发明专利保护因SN_MNWs的导电性、蛋白质特性、形成生物膜的性质等产生的应用。

本发明专利保护藉由SN_MNWs形成的导电菌体生物膜及其应用。

含有所述纳米线的导电材料属于本发明的保护范围。

作为优选，本发明专利提供了来源于细菌Starkeya novella的微生物纳米线 SN_MNWs的制备方法。

作为优选，本发明专利提供了来源于细菌Starkeya novella的微生物纳米线 SN_MNWs的表征方法。

作为优选，本发明专利提供了一种由微生物纳米线SN_MNWs链接的导电细菌生物膜的构建方法。

作为优选，本发明专利提供了一种由微生物纳米线SN_MNWs链接的导电细菌生物电池的构建方法。

作为优选，本发明专利提供了一种由微生物纳米线SN_MNWs链接的细菌-微藻(小球藻/莱茵衣藻)共生生物膜的构建方法。

作为优选，本发明专利提供了一种由微生物纳米线SN_MNWs链接的细菌-微藻(小球藻)共生生物膜在固碳方面的应用。

作为优选，本发明专利提供了一种由微生物纳米线SN_MNWs链接的细菌-微藻(莱茵衣藻)共生生物膜在产氢方面的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明通过对细菌Starkeya novella产生的导电的蛋白质纳米线的产生、性质和应用研究。发明了：(1)一种利用细菌细胞产生蛋白纳米线的方法，并提供了制备和表征方法；(2)利用细菌细胞产生的纳米线SN_MNWs构建导电生物膜的方法；(3) SN_MNWs链接的导电细菌生物电池的构建方法；(4)SN_MNWs链接的细菌-微藻(小球藻/莱茵衣藻)共生生物膜的构建方法。提供了：(5)SN_MNWs链接的细菌-微藻(小球藻)共生生物膜在固碳方面的应用；(6)SN_MNWs链接的细菌-微藻(莱茵衣藻)共生生物膜在产氢方面的应用。

本发明专利在导电生物纳米材料、生物电化学、固碳减排及清洁能源生产均具有重要实际意义。

附图说明

图1为纳米线的蛋白质电泳图。

图2为细菌形成纳米线生物膜的形态和光学显微镜照片。

图3为细菌形成纳米线生物膜的透射电子显微镜照片。

图4为纳米线生物膜的导电率和电流密度。

图5为构建的微生物电池。

图6为构建的藻菌共生生物膜的形态和光学显微镜照片。

图7为藻菌共生生物膜的变化过程光学显微镜照片。

图8为细菌、微藻和藻菌共生生物膜的透射电子显微镜照片。

图9为细菌、微藻和藻菌共生生物膜超薄切片的透射电子显微镜照片和淀粉含量。

图10为细菌、微藻和藻菌共生固碳生长的生物量。

图11为不同藻菌比例共生体系叶绿素含量和产氢量。

图12为最佳藻菌比例下共生体系叶绿素含量和产氢量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例选用莱茵衣藻和小球藻为例对其进行进一步的验证。

本发明所采用的试验材料如下：

细菌Starkeya novella购自生物资源保存及研究中心，编号：BCRC13031；莱茵衣藻来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所，本实施例选用CC-503；小球藻来源于中国石油大学(华东)生物工程与技术中心。

实施例1生物材料的培养方法

一、细菌Starkeya novella的培养

A、选取细菌Starkeya novella，购自生物资源保存及研究中心，编号：BCRC13031，以下简称13031。

B、培养细菌的菌种：

(a)13031的液体培养：将活化后的菌种，接种于pH为7.0的Medium 3培养基中 (配方：Beef extract 3g；Peptone 5g)，放置于25℃下，摇床转速为150rpm，每隔 5天传代一次。

(b)13031的固体培养：在Medium 3培养基中添加1.5％的琼脂，倒平板后通过平板划线培养，每隔5天传代一次。

二、莱茵衣藻的培养

A、选取莱茵衣藻藻种，来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所。

B、培养莱茵衣藻的藻种：

(a)莱茵衣藻液体培养条件：采用Tris-Acetate-Phosphate培养基(以下简称为TAP，配方如表1所示)，初始pH7.2，光照强度为四级,培养温度为25±1℃，当液体培养时，可以静置培养或放置在水平振荡摇床100～120rpm，每5天传代一次。

(b)莱茵衣藻固体TAP培养基：将含1.5％～2％的琼脂粉的TAP培养基倒平板，用接种针平板划线进行培养，每隔2周传代一次。

C、莱茵衣藻产氢培养基：莱茵衣藻产氢的培养基采用TAP-S(简称TAP缺硫培养基)，所谓缺硫培养基即是将培养基中所含有的硫元素全部替换成等摩尔比的氯元素，即把正常TAP培养基内的硫酸铁、硫酸锌、硫酸铜和硫酸镁分别换成等摩尔的氯化铁、氯化锌、氯化铁和氯化镁。

表1TAP培养基配方

(说明：培养基总体积定容到1000mL，固体培养基需要在添加1.5％的琼脂，121℃高压灭菌20min)

三、小球藻的培养

A、选取小球藻，来源于中国石油大学(华东)生物工程与技术中心

B、培养小球藻的藻种：

(a)小球藻液体培养条件：采用BG11(配方如表2所示)，调整pH7.1，光照强度为四级，培养温度为25±1℃，当液体培养时，可以静置培养或放置在水平振荡摇床100～120rpm，每10天传代一次。

(b)小球藻固体培养条件：将液体的BG11按照1.5％的比例加入琼脂，灭菌后倒平板，平板划线培养，每隔1月传代一次。

C、小球藻产氢培养基：小球藻产氢的培养基采用BG11-S(BG11缺硫培养基)，所谓缺硫培养基即是将培养基中所含有的硫元素全部替换成等摩尔比的氯元素。

表2BG11培养基配方

四、13031与莱茵衣藻共生培养

包括以下三种共生培养方法：

A、TAP培养基中共生培养的方法

首先莱茵衣藻(CC-503)在TAP培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的13031，首先用TAP 培养基清洗三次，去掉原Miderum 3培养基，后重悬浮于TAP培养基中调整OD₆₀₀＝1.0。莱茵衣藻(叶绿素＝0.5)与13031按照20:1、40:1、60:1、80:1、100:1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外13031与莱茵衣藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O2耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h:8h，，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。

B、TAP-S培养基中共生培养的方法

首先莱茵衣藻在TAP培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的细菌13031，首先用TAP-S培养基清洗三次，去掉原培养基Miderum 3，后重悬浮于TAP-S培养基中调整OD₆₀₀＝1.0。莱茵衣藻(叶绿素＝0.5)与细菌13031按照20:1、40:1、60:1、80:1、100:1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另13031与莱茵衣藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O₂耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h:8h，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。

C、TAP培养基中通入CO₂共生培养的方法

首先莱茵衣藻(CC-503)在TAP培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的13031，首先用TAP 培养基清洗三次，去掉原Miderum 3培养基，后重悬浮于TAP培养基中调整OD₆₀₀＝1.0。莱茵衣藻(叶绿素＝0.5)与13031按照60:1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外13031与莱茵衣藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，通入含5％ CO₂的洁净空气，将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h:8h，定期取样测量生理生化分析。

五、13031与小球藻共生培养

包括以下三种共生培养方法：

A、BG11培养基中共生培养的方法

首先小球藻在BG11培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的13031，首先用BG11培养基清洗三次，去掉原Miderum 3培养基，后重悬浮于TAP培养基中调整OD₆₀₀＝1.0。小球藻(叶绿素＝0.5)与13031按照20:1、40:1、60:1、80:1、100:1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外13031与小球藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O₂耗尽，将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h:8h，，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。

B、BG11-S培养基中共生培养的方法

首先小球藻在BG11-S培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的13031，首先用BG11- S培养基清洗三次，去掉原培养基Miderum 3，后重悬浮于BG11-S培养基中调整OD₆₀₀＝1.0。小球藻(叶绿素＝0.5)与13031按照20:1、40:1、60:1、80:1、100:1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另13031与小球藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O₂耗尽，将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h:8h，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。

C、BG11培养基中通入CO₂共生培养的方法

首先小球藻在BG11培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的13031，首先用BG11培养基清洗三次，去掉原Miderum 3培养基，后重悬浮于TAP培养基中调整OD₆₀₀＝1.0。小球藻(叶绿素＝0.5)与13031按照20:1、40:1、60:1、80:1、100:1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外13031与小球藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，通入含5％CO₂的洁净空气，将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h:8h，，定期取样测量生理生化分析。

实施例2 13031产纳米线SN_MNWs的获得和表征

一、13031产纳米线SN_MNWs的培养方法

包括以下两种共培养方法：

A、TAP(或BG11)培养基培养方法

将生长至对数期的13031，首先用TAP(或BG11)培养基清洗三次，去掉原Miderum 3培养基，后重悬浮于TAP(或BG11)培养基中调整OD₆₀₀＝1.0,接种到产氢培养瓶中培养。培养温度25±1℃，时间为1-24天。

B、TAP-S(或BG11-S)培养基培养方法

将生长至对数期的13031，首先用TAP-S(或BG11-S)培养基清洗三次，去掉原培养基Miderum 3，后重悬浮于TAP-S(或BG11-S)培养基中调整OD₆₀₀＝1.0，接种到产氢培养瓶中培养。培养温度25±1℃，时间为1-24天。

二、SN_MNWs的提取

将上述一中制备的50mL含MNWs的细菌发酵液6000rpm离心15min，去上清，将沉淀用25mL 150mM的乙醇胺溶液(HCl调pH至10.5)悬浮。利用手握式组织匀浆机中速搅拌2min，目的是将MNWs从菌体上机械剪切下来。然后13000g离心40min去除菌体，上清用10％硫酸铵过夜沉淀MNWs，再一次13000g离心30min，去上清，沉淀中MNWs用25mL乙醇胺溶液悬浮，23000g离心40min清洗，以去除碎片。接着进行第二次10％硫酸铵过夜沉淀和13000g离心40min。最后收集的MNWs沉淀用1mL乙醇胺溶液悬浮，4℃保存，备用。

三、SN_MNWs的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)测定MNWs中蛋白亚基的分子量，首先将提取的细菌MNWs 在4℃、18000g离心1h，去上清，将沉淀悬浮在100μL 2.5％十二烷基硫酸钠(SDS)中，将MNWs分解成其组成单体，室温下孵育过夜。取75μL处理完成的样品与25μL蛋白电泳上样缓冲液混合加入到1.5mL离心管中，沸水浴10min，处理完毕后，将电泳胶放入电泳槽中，向电泳槽中倒入适量蛋白电泳缓冲液，取上样样品和Maker分别进行上样，上样量为30μL，设置电压为120V开始电泳。电泳结束后，取出电泳胶，去离子水清洗，清洗完成后的电泳胶放到盛有适量的考马斯亮蓝染色液的容器中，混匀器振荡染色2h，染色后加入脱色液脱色，1h后更换一次脱色液，振荡过夜直至蛋白胶中染色液褪去。利用凝胶成像系统对电泳胶片进行拍照记录，得到SDS-PAGE电泳图(附图1)。可以发现，13031MNWs仅在33kDa出现了一个条带。由此可推断，13031产生的MNWs是由分子量为33kDa的蛋白质亚基组成。这与之前的报道有较大差异，推测是一种新颖的MNWs。

四、SN_MNWs的性质表征

按照上述一中的方法制备由MNWs连接的菌膜。并进行以下性质表征：

A、观察和分析

相机拍照记录每个体系在不同培养时间段产氢瓶中的状态，分析变化情况。

在纯菌体系的培养前期，细菌在产氢瓶底部聚集，并逐渐形成一个表面粗糙的网状生物团聚物薄膜。生物团聚物形成后，随着培养时间的延长，产氢瓶底部生物膜逐渐增厚。相反，培养基中浮游细菌减少，培养基也逐渐变透明。当培养至中期时，生物团聚物基本生长到成熟阶段，薄膜处于相对稳定的状态，厚度基本不变，但团聚物表面逐渐变得致密、光滑、透明并逐渐向上移动。到培养后期，团聚物形态变化不大，但会趋向气-液界面扩展生长，最终一直处于气-液界面位置，如附图(2)右所示。

使用光学显微镜(10×100倍)观察每个体系中细菌的形态及分布，并且记录了菌培养体系在不同时间段中形态与分布变化情况。使用手握式组织匀浆机分别将三个体系在产氢瓶中混合均匀后，移液枪吸取适量的样品滴至载玻片中央，用镊子缓慢从一侧盖上盖玻片，将多余的液体吸干、晾干，使用明场观察。

菌早期(附图(2)左)在显微镜下可以发现细菌呈短杆状，大小为1-2μm，可以游动，分布比较集中，呈条形聚集分布；后期形成的菌膜在显微镜下显示非常致密(附图(2)右)。

B、透射电子显微镜观察和分析

取适量生长到对数生长期的样品，将样本用磷酸盐缓冲溶液(100mmol/L，pH值7.0)洗涤三次，用适量2.5％戊二醛固定，铜网沾取3-5min(可适当延长)后，晾干2- 3min，用磷钨酸(1％)染色3-5min晾干，再用磷酸盐缓冲液清洗掉残留的染色液，吸水纸吸干铜网边缘残留的液体，等完全晾干后用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)进行形态及分布情况观察。

发现细菌周围会产生很多纳米级的细丝，MNWs之间相互交错形成一种网状结构，这种网状结构使13031之间相互连接，进行物质与信息交流，从而适应缺氧及物质匮乏的生存环境，最终形成团聚物(如附图3所示)。为了更清晰准确地观察13031合成的 MNWs宽度、长度以及形成的网状结构，将大视野下的TEM图部分放大(如附图3右所示)，可以观察到13031合成的MNWs长度不一，但可达微米级别，宽度是纳米级别，并且形成的细丝大部分是由几条甚至十几条MNWs缠绕组成。细菌13031会生成一种丝状物，这种结构使细菌之间相互聚集，最终形成一种比较致密的细菌团聚物薄膜。

五、SN_MNWs的导电性测量

将在实施例1中Medium 3培养基培养至对数生长期的细菌(CK)与按照上述一中的方法制备由MNWs连接的菌膜(BM)进行干燥处理。为了不破坏BM结构，将产氢瓶中液体培养基倾倒后，沿瓶壁缓缓加入生理盐水清洗3次，清洗后的BM放入到干净培养皿中，滤纸尽量将液体吸干。由于CK未形成网状结构，所以取50mL菌液6000rpm离心 10min，去除去原来培养基，生理盐水清洗3次后，6000rpm离心10min，去上清。取一个厚度为0.2mm的绝缘片，在中间剪开一个边长为0.5cm的正方形边框，将处理好的BM 和CK沉淀放置于自制的绝缘框中。吹风机吹干，轻轻压实后去除周边多余的菌体，再将样品放置于45℃的烘箱中烘干，直至完全干燥。将处理好的样品使用太阳能微电极电化学系统测其导电性，给样品恒定电压(0.1V、0.5V、1V、1.5V、2V、2.5V、3V、 3.5V、4V)，分别记录在不同电压下稳定电流的数值。

使用太阳能微电极电化学系统测其导电性，分别给这两个样品不同的恒定电压，结果如附图4所示，可以看出CK样品基本不导电，电流密度无变化。BM样品电流密度随恒定电压的增大而增大，具有良好的导电性能。综上可以得出13031产生的MNWs菌膜具有良好的导电性能。

实施例3 13031生物燃料电池的构建

构建双室微生物电化学系统：电池由有机玻璃制成，使用质子交换膜将两极室隔开。使用碳毡作为阳极，碳布作为阴极。阴阳两极间通过导线相连，之间有1000Ω外电阻(附图5左)。

基础无机盐培养基：NaCl 5.0g/L,MgS0₄·7H₂O 0.25g/L,(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L,NaNO₃2.0g/L,K₂HPO₄·3H₂O 10.0g/L,KH₂PO₄ 4g/L,pH 7.0-7.5。

电极溶液：MgSO₄·7H₂O 0.25g/L,(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L,NaNO₃ 10.0g/L,K₂HPO₄10.0g/L， KH₂PO₄·3H₂O 4.0g/L。

在基础培养基添加不同浓度(0.1％、0.5％、1.0％)的葡萄糖作为碳源，接种13031作为阳极。

在电极溶液加入乳酸钠等作为电子供体、延胡索酸、硝酸盐、二甲基亚矾或氧化三甲胺等作为电子受体作为阴极。

运行3天后，13031即可在此双室微生物电池阳极碳毡上产生厚厚的菌膜(附图 5右)，并使用电流表测得电流的产生。

实施例4菌藻生物膜的构建和形态

一、按照实施例1中的方法构建藻菌共生培养体系。

二、按照实施例2中的方法进行观察。

藻与细菌13031共培养体系在产氢瓶中的状态如图6所示。在培养前期，可以发现与纯藻体系前期培养状态一致，但藻菌共培养体系培养基相比纯藻体系培养基更浑浊，说明藻菌共培养的培养基中仍然有浮游的细菌存在。当培养到中期，藻菌团聚物形成，培养基逐渐变透明，并且团聚物开始向气-液界面移动。随着培养时间的延长至共培养的后期，藻菌团聚物逐渐移动至气-液界面，并一直处于气-液界面位置。相应的产氢瓶底部衣藻和细菌的生物量减少。但是培养后期的产氢瓶中气-液界面处气泡比中期少，因为衣藻与细菌产生的气体可以直接释放到空气中。

藻菌共培养体系中的细菌基本与纯菌体系中的细菌形状大小一致，也是呈条形聚集分布。而体系中衣藻细胞与纯藻体系相比，颜色为深绿色，叶绿素含量较多，说明藻菌团聚物能够进行充分的光合作用，与趋氧性现象特性相符合。并且在这个阶段藻细胞已与细菌相互作用，藻细胞在细菌生成的团聚物周围聚集，并且游离的细菌与衣藻细胞会向团聚物逐渐移动，数量逐渐增多，生成的团聚物薄膜逐渐增大增厚。藻菌共培养体系在大视野下的状态，藻细胞大部分都在细菌形成的菌膜上聚集，相互关联和相互依存关系较为密切，形成一个致密的网状藻菌团聚物。

当藻菌共培养至第5d，细菌的分布比较分散，部分细菌与藻细胞开始相互聚集，两者相互作用还没有形成。这个时期细菌与藻生物量增加较快，也是衣藻产氢速率迅速增加的高峰阶段。当藻菌共培养至第10d，细菌与藻基本形成了条状团聚物，两者开始相互作用，藻菌团聚物初步形成。细菌与藻细胞数量明显增多，藻细胞体积也略有增大。当藻菌共培养至第15d，藻与细菌细胞数量达到最大值，并且藻菌团聚物基本形成，细菌团聚的部分比较致密，藻细胞的颜色也由亮绿色变为深绿色，生长状态较好，也是产氢量较高的时期。当藻菌共培养至第20d，藻菌团聚物中衣藻的颜色变深，基本所有藻都与细菌形成共生关系，但少量藻细胞出现破裂现象，开始凋亡，大部分细胞还是维持完整的细胞形态，产氢效果略有下降。当藻菌共培养至第25d，衣藻细胞大部分出现破裂现象，内容物溢出，细胞颜色明显变为淡绿色。培养至第30d 时，藻细胞完全破裂，无细胞结构。藻在正常条件下培养，当培养至第15d左右，基本无细胞形态。(附图7)所以，当藻菌共培养时，细菌极大地延长了衣藻的生长周期。

三、培养体系在透射电镜下的形貌表征

按照实施例3中的方法使用透射电镜(TEM)从两者的相对位置以及物理接触分析两者相互作用、相互影响情况。图8中A、B、C分别显示了纯菌、纯藻以及藻菌共培养体系中的衣藻与细菌的细胞微观形态。在纯菌体系中，细菌的形态大小与光学显微镜下的结果一致，但是在TEM下可以观察到细菌会生成一种丝状物，这种结构使细菌之间相互聚集，最终形成一种比较致密的细菌团聚物薄膜。TEM下的纯藻体系显示出五个结构完整的衣藻细胞，都呈规则的圆形，大小为5-7μm，衣藻细胞之间只是物理性堆积在一起。在藻菌共培养体系中，细菌基本分布在衣藻细胞的周围，与衣藻细胞直接接触的细菌形状较为饱满，相对较大，生长状态较好；未与衣藻细胞直接接触的细菌也都通过自身合成的丝状结构相互连接。衣藻细胞之间不仅仅是简单的物理性堆积，部分未直接接触的衣藻细胞也是通过细菌产生的丝状物相互连接。将网状结构放大观察发现，在衣藻细胞周围聚集着很多细菌，细菌分泌的丝状物相互交织成为一个致密的网状结构，特别是在衣藻与细菌细胞周围形成的网状结构更加致密。这种网状结构将衣藻细胞与细菌相互连接，形成一个致密的网状藻菌团聚物。

四、超薄切片样品的制备与观察

将样品固定在2.5％戊二醛2h后，再用1％(w/v)锇酸后固定2h，固定好的样品放置于磷酸盐缓冲液中，然后乙醇逐级梯度脱水，将脱水后的样品包埋在环氧树脂中进行切片处理，再用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色剂染色，然后固定在铜网上用TEM观察样品内部的形态与生物细胞器的变化。

将培养至同一时间段的纯菌、纯藻以及藻菌共培养体系中的衣藻与细菌超薄切片后的图像如图9(A、B、C)所示，纯菌体系中，通过细菌横截面与纵切面分析可得13031 这株细菌呈短杆状，与之前分析的细菌形状大小一致。纯菌体系中细菌生长状况较差，细胞轮廓不清晰，不饱满。纯藻体系中衣藻生长状况较好，无裂解现象，由于没有细胞壁，机械强度较弱，细胞略有变形。藻菌共培养体系中细菌分布在衣藻细胞周围，相比纯菌体系中的细菌生长状态较好，细胞轮廓清晰饱满。同时共培养体系中衣藻细胞也比较饱满，细胞器清晰可见，与纯藻体系中的衣藻细胞相比，淀粉粒数量明显增多，在细胞中呈分散状态的短椭圆形，接触性聚集，数量较多时，相互粘连。

实施例5 13031和微藻共培养固碳

一、淀粉含量的测定

将实施例4中获得的藻液全部转移到离心管中，5000rpm离心10min，去上清液，向沉淀中加10mL 95％乙醇，用移液枪吹吸均匀，置于高速离心机中12000rpm离心5min，去上清液，可重复一次，以彻底去除叶绿素。向沉淀中加2mL 100μmol/L乙酸钠溶液 (pH4.5)，重悬，12000rpm离心5min去上清，后加入1.5mL 100μmol/L的乙酸钠 (pH4.5)，超声破碎15min，然后将破碎的样品置于121℃下反应10min，加入5U的淀粉转葡萄糖苷酶，55℃加热反应14h，将淀粉充分转化为葡萄糖，定容至mL，离心后取上清液，采用生物传感分析仪测定葡萄糖含量，并将其换算为淀粉含量。

如图9D所示，测得实施例4中的纯菌、纯藻以及藻菌膜体系中细胞内淀粉含量分别为2.5μg/mL、15μg/mL、25μg/mL，共培养体系中淀粉含量最高，与实施例4中超薄切片显示结果一致。淀粉粒是藻类贮藏淀粉的细胞器，淀粉是藻进行光合作用的最终产物。藻菌共生菌膜体系中藻细胞淀粉粒较多，说明共生菌膜体系中藻能更好的进行光合作用并固碳。

二、通入CO₂共培养并测定生物量

按照实施例1中通入CO₂共生培养的方法进行培养。

细菌生长状况的测定：用紫外分光光度计测定菌液在600nm下吸光值OD₆₀₀来表示细菌的生物量。纯菌样品可以通过直接取样的方式进行测量，但是藻菌共培养体系中，藻体与菌体分离比较困难，所以共培养体系中菌体生物量计算公式如下：

OD_{600(共培养中的菌体)}＝OD_{600(共培养体系)－}OD_{600(纯藻体系)}

藻生长状况的测定：用藻中叶绿素含量和藻生物量来表示，藻生物量用藻细胞在750nm处的吸光值来确定。用紫外分光光度计测定藻液在750nm下吸光值OD₇₅₀来表示藻的生物量，并做出其随时间变化曲线，分析生物量变化情况。

将产氢瓶中的样品摇晃均匀取样，使藻细胞在溶液中分散均匀，可适当稀释，尽量减小误差。从产氢瓶中用移液枪吸取2mL藻液，12000rpm离心2min后，去掉上清，加入相同体积的95％乙醇，用移液枪将沉淀吹吸均匀，12000rpm离心2min后，将上清转移到新的离心管中。选用紫外分光光度计测定上清液在665nm处和649nm处的吸光值，根据以下公式算出叶绿素的浓度：

Chl(mg/L)＝Cha+Chb＝20.04×OD₆₄₉+6.10×OD₆₆₅

培养3d后观察生物量。发现，S.novella能够以CO₂为唯一碳源进行生长，和文献报道一致。微藻以及菌藻共培养体系通入CO₂气体后也会促进微藻的生长，但S. novella+微藻的共培养体系中，微藻的生物量提高较多。显示菌藻共培养体系在固碳方面具有较为明显的优势。藻和菌共培养中藻的生长量是纯藻生长量的2.3倍(图10)。

实施例6 13031和微藻共生产氢

一、按照实施例1中的共生培养的方法进行培养，并获得和实施例4中相同的共生菌膜/藻菌膜体系。在培养的不同阶段取气体样品进行检测。

二、氢气产量的测定：使用气相微量进样器从产氢瓶液面上方缓慢抽取1mL气体并快速注入高效气相色谱仪，气相色谱仪参数：色谱柱为5A分子筛，柱长为2m，柱内径为3mm，载气为氩气，后检测器为TCD，温度为300℃，柱温设为50℃，前进样口温度为 200℃。采用外标法计算出样品中氢气的含量。

外标法公式如下：

H₂production＝(1mL·35％·A_sample·0.0899)/(A_standard·2·Chl·10^-6)

(说明：A_standard＝3005.9)

三、不同体积比例藻菌共培养产氢量变化

藻菌共培养时衣藻的产氢效果相比纯藻培养体系产氢效果均有提高，纯藻体系中产氢量呈先增加后缓慢减少的趋势，培养到第12d产氢量达到最大值46.98μmol·mg^-1Chl，纯菌培养体系无氢气产生。当藻菌体积比例为30:1时，氢气产量呈现先上升后下降的趋势，在第18d氢气产量达到最大值，是纯藻培养体系的2.17倍，说明共培养体系中细菌相对较多，衣藻生长受到限制。当藻菌体积比例为60:1时，氢气产量呈现先上升后稳定的趋势，在第18d氢气产量达到最大值，最大的产氢量为119.19 μmol·mg^-1Chl，是纯藻培养体系最大产氢量的2.54倍，是最佳的藻菌共培养混合比例。当藻菌体积比例为90:1和120:1时，氢气产量呈现先上升后下降的趋势，在第 12d氢气产量达到最大值，分别是纯藻培养体系的2.12倍、1.83倍，第12d后，由于藻菌共培养体系中衣藻占比较大，衣藻生长受到限制，开始凋亡，产氢量相应减少。综上可知，衣藻与细菌13031以不同的藻菌体积比例共培养产氢时，最优的藻菌混合比例为60:1(图11)。

四、最优产氢条件下衣藻产氢量分析

在最优产氢条件下，体系中衣藻的生长状况仍分别用衣藻的生物量(OD₇₅₀)和衣藻的叶绿素含量来表示。纯藻体系与藻菌共培养体系中衣藻OD₇₅₀数据分析曲线如图12 所示，纯藻体系和藻菌共培养体系中衣藻的OD₇₅₀数值变化趋势基本一致，呈现先快速上升后下降的趋势，但藻菌共培养体系衣藻的生长状况明显高于纯藻体系，当培养到第15d共培养体系OD₇₅₀达到最大值1.61，是纯藻体系最大值1.10的1.46倍。每个培养体系中衣藻的叶绿素含量结果显示与衣藻生物量(OD₇₅₀)变化相似，藻菌共培养体系中衣藻的叶绿素含量最大值为8.34mg/L，是纯藻体系中衣藻叶绿素含量最大值5.84mg/L的1.43倍。所以，加入细菌13031，不仅可以提高衣藻的氢气产量，而且还可以促进衣藻的生长，为衣藻高效持续产氢提供了充足的物质基础。

纯菌体系中无氢气产生，说明硫氧化菌13031不产生氢气。纯藻体系与藻菌共培养体系都有氢气产生，在整个产氢培养过程中，共培养体系中衣藻的产氢量都明显高于纯藻体系。纯藻体系中衣藻的产氢量变化曲线呈先上升后下降的趋势，当培养到第 12d衣藻产氢量达到最大值47.01μmol·mg^-1Chl。而藻菌共培养体系中衣藻的产氢量变化曲线呈先快速上升后缓慢下降的趋势，培养到第18d衣藻产氢量达到最大值 124.28μmol·mg^-1Chl，是对照组纯藻体系最大值的2.64倍。由结果分析可知，藻菌共培养体系中细菌的加入不仅提高了衣藻的产氢量，而且延长了衣藻的产氢时间，为衣藻高效持续产氢研究提供了实验基础。

Claims

1.本发明提供的微生物纳米线，是一种导电的蛋白质纳米线，命名为SN_MNWs，其特征为：由单体分子量约为33kD的蛋白质组成，来源于细菌Starkeya novella，购自生物资源保存及研究中心，编号：BCRC13031，以下简称13031。

2.权利要求1所述的微生物纳米线SN_MNWs的制备方法，其特征在于：

(1)菌种制备方法：将活化后的菌种，接种于pH为7.0的Medium 3培养基中(配方：Beefextract 3g；Peptone 5g)，放置于25℃下，摇床转速为150rpm，每隔5天传代一次。

(2)纳米线生长方法：将上述(1)中生长至对数期的菌种，首先用TAP(或BG11或TAP-S或BG11-S)培养基清洗三次，去掉原Miderum 3培养基，后重悬浮于TAP(或BG11或TAP-S或BG11-S)培养基中调整OD600＝1.0,接种到产氢培养瓶中培养。培养温度25±1℃，时间为1-24天。

(3)纳米线的提取方法：将上述(2)中制备的50mL含MNWs的细菌发酵液6000rpm离心15min，去上清，将沉淀用25mL 150mM的乙醇胺溶液(HCl调pH至10.5)悬浮。利用手握式组织匀浆机中速搅拌2min，目的是将MNWs从菌体上机械剪切下来。然后13000g离心40min去除菌体，上清用10％硫酸铵过夜沉淀MNWs，再一次13000g离心30min，去上清，沉淀中MNWs用25mL乙醇胺溶液悬浮，23000g离心40min清洗，以去除碎片。接着进行第二次10％硫酸铵过夜沉淀和13000g离心40min。最后收集的MNWs沉淀用1mL乙醇胺溶液悬浮，4℃保存。

3.权利要求1中的微生物纳米线SN_MNWs按照权利要求2(2)纳米线生长方法构建的菌体生物膜，其特征为，由SN_MNWs连接细菌细胞形成菌膜，且具有导电性。

4.权利要求1中纳米线产生菌形成的生物膜燃料电池的构建方法：其特征在于，能够形成权利要求3中的导电菌膜，并产生电流，具体方法为，电池由有机玻璃制成，使用质子交换膜将两极室隔开。使用碳毡作为阳极，碳布作为阴极。阴阳两极间通过导线相连，之间有1000Ω外电阻。基础无机盐培养基：NaCl 5.0g/L,MgS0₄·7H₂O 0.25g/L,(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L,NaNO₃ 2.0g/L,K₂HPO₄·3H₂O 10.0g/L,KH₂PO₄ 4g/L,pH 7.0-7.5。电极溶液：MgSO₄·7H₂O0.25g/L,(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L,NaNO₃ 10.0g/L,K₂HPO₄ 10.0g/L，KH₂PO₄·3H₂O 4.0g/L。在基础培养基添加不同浓度(0.1％、0.5％、1.0％)的葡萄糖作为碳源，接种权利要求2中制备的菌种作为阳极。在电极溶液加入乳酸钠等作为电子供体、延胡索酸、硝酸盐、二甲基亚矾或氧化三甲胺等作为电子受体作为阴极。

5.利用权利要求1中的微生物纳米线SN_MNWs构建的藻菌生物膜的方法，其特征在于，由SN_MNWs和细菌连接微藻细胞形成的生物膜，能够促进微藻细胞的生长，延长生长期。将权利要求2(1)制备的菌种和莱茵衣藻或小球藻细胞接种到权利要求2(2)TAP(或BG11或TAP-S或BG11-S)培养基，藻菌细胞的接种比例为：莱茵衣藻或小球藻(叶绿素＝0.5)与13031按照20:1、40:1、60:1、80:1、100:1转移至产氢培养瓶中。将产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O₂耗尽，将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h:8h，培养温度25±1℃，时间为1-24天。

6.权利要求5中构建的藻菌生物膜固碳的方法，其特征在于：能够促进微藻细胞固碳反应，具体方法为，按照权利要求5的方法进行藻菌共培养，向权利要求5中的培养体系通入含5％CO₂的洁净空气，培养1-7天。

7.权利要求5中构建的藻菌生物膜产氢的方法，其特征在于：能够促进微藻细胞产生氢气，具体方法为，按照权利要求5的方法进行藻菌共培养，最优的藻菌混合比例为60:1，培养时间为1-24天。