CN107663529B - 一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法 - Google Patents
一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107663529B CN107663529B CN201711139565.8A CN201711139565A CN107663529B CN 107663529 B CN107663529 B CN 107663529B CN 201711139565 A CN201711139565 A CN 201711139565A CN 107663529 B CN107663529 B CN 107663529B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- hydrogen production
- medium
- tap
- sulfur
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
Abstract
本发明公开了一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，具体是将绿藻与一种兼性厌氧/兼性化能自养的硫氧化细菌(Thiomonas intermedia)按照一定比例进行混合培养，绿藻光合放出的氧气可以被细菌呼吸作用所消耗，细菌呼吸作用放出的二氧化碳还可以供给绿藻更好地进行光合作用，从而很好的维持了整个培养环境的厌氧特性。另外，利用硫氧化细菌对硫元素的平衡催化能力，可以实现硫元素的限制性供给，这样既可以保证绿藻的正常生长，又可以实现高效可持续性产氢。
Description
技术领域
本发明涉及新能源及生物制氢技术领域，具体涉及一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法。
背景技术
能源一直都是人类繁衍生息、从事工业或农业生产等社会生活中不可缺少的部分，值得强调的是储量有限且不可再生的煤炭、石油、天然气等在内的化石能源在现阶段仍然是人们使用的主要部分，化石能源的不合理的开采以及使用导致了温室效应、酸雨等环境问题。氢气是一种清洁、燃烧值高、利用形式多样的可再生的生物能源，就目前初步统计来说，有95％～96％的氢能来源于化石能源的二次转化，而剩余的4％～5％则来源于水的裂解而产生，上述制氢过程中也需要较多的化石能源，因此整体的经济效益差，就氢气的特点来说，生物制氢成为制氢领域的研究热点。其中光合微藻制氢技术是生物制氢法的重要组成部分。
微藻因为氢化酶活性高、生长速度快、适应力强、培养成本低、遗传背景清晰和分子操作系统成熟，成为研究微藻光合制氢的模式物种。但微藻氢化酶对氧气极其敏感导致其产氢效率极低是制约微藻产氢技术应用的瓶颈问题之一。在自然条件下，微藻产氢是从黑暗到接受光照之间一个极其短暂的过程。直到2000年，Melis提出了使用缺硫培养基的“两步法制氢”，将氧气的产生和氢气的产生在时间上分开，使得产氢效率大大提高，并通过调控使之成为一个可持续几天的过程，具体方法是：第一步，生物量的积累，微藻进行正常的光合作用，CO2的固定，水的光裂解释放出氧气，以保证微藻的生长。第二步，将微藻转入缺硫的培养基中，将会导致蛋白质的合成和细胞的生长受到抑制，最重要的是，缺硫将会引起PSII D1蛋白的修复受阻，导致光氧化时PSII的修复受阻，从而抑制微藻生长。因此，该方法只能实现半连续产氢，且操作过程繁琐，所需设备成本较高，导致无法实现大规模工业产氢过程。也就是两步法绿藻产氢工艺中，将绿藻培养分为“正常培养”和“缺硫产氢培养”两步，操作步骤繁琐，所需设备多，产氢不可持续，培养成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，该方法将绿藻与硫氧化细菌BCRC 17547按照一定比例进行混合培养，能够在含硫培养基中实现绿藻产氢的高效可持续培养，步骤简单，显著提高了制氢效率，延长了制氢时间。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
将绿藻与硫氧化细菌(Thiomonas intermedia)按照一定比例进行混合培养，绿藻光合放出的氧气可以被细菌呼吸作用所消耗，细菌呼吸作用放出的二氧化碳还可以供给绿藻更好地进行光合作用，从而很好的维持了整个培养环境的厌氧特性。另外，利用硫氧化细菌对硫元素的平衡催化能力，可以实现硫元素的限制性供给，这样既可以保证绿藻的正常生长，还可以实现高效可持续性产氢，具体培养方法如下：
将绿藻(包括莱茵衣藻、小球藻，但不限于此)与硫氧化细菌BCRC 17547按照体积比20︰1～500︰1的比例在TAP-S+Na2S2O3培养基中混合培养，从而实现可持续性产氢。
并且，除了上述含硫培养基可以实现可持续性产氢外，绿藻与硫氧化细菌BCRC17547共培养同样可以在TAP培养基或TAP-S培养基中正常生长并实现可持续性产氢。
优选地，所述硫氧化细菌(Thiomonas intermedia)为中间硫单胞菌BCRC 17547。
具体培养时，所述Na2S2O3的浓度为2～6g/L，所述绿藻的叶绿素初始浓度是0.2～3.0mg/L，硫氧化细菌的初始OD600＝0.5～3。
本发明还经过试验筛选，得出优选方案，也就是所述绿藻与硫氧化细菌BCRC17547的体积比为60︰1时效果最佳。
另外，所述TAP-S+Na2S2O3培养基还可以用F/2-S+Na2S2O3培养基代替，这种情况下，所述绿藻为扁藻，更具体为亚心型青岛大扁藻。
同样的，扁藻和硫氧化细菌除了在含硫培养中能够可持续性产氢外，同样还可以在F/2培养基或F/2-S培养基中正常生长并实现可持续性产氢。
更具体地，藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，这种情况下，绿藻包括莱茵衣藻CC-503、小球藻，其中所述莱茵衣藻CC-503是缺壁型绿藻，相较于莱茵衣藻CC-125等完壁型绿藻而言，CC-503无细胞壁因此更容易溶解和促进与共培养的菌类共生。
所述方法具体为：
(1)首先绿藻在TAP-S+Na2S2O3培养基中培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的TAP-S+Na2S2O3培养基清洗3次；
(2)将生长至对数期的硫氧化细菌，首先用TAP-S+Na2S2O3培养基清洗三次，去掉原688培养基，后重悬浮于TAP培养基中调整OD600＝1.0，绿藻与硫氧化细菌按照体积比20︰1～500︰1的比例转移至产氢培养瓶中；
(3)最后将产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O2耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃条件下培养。
同样的，上述培养方法中，所述TAP-S+Na2S2O3培养基还可以用TAP培养基或TAP-S培养基替代，在TAP培养基或TAP-S培养基中的培养方法和培养条件均相同。
另外，本发明还公开了扁藻与硫氧化细菌BCRC 17547共培养的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)首先扁藻在F/2-S+Na2S2O3培养基中培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的F/2-S+Na2S2O3培养基清洗3次；
(2)将生长至对数期的硫氧化细菌BCRC 17547，首先用F/2-S+Na2S2O3培养基清洗三次，去掉原培养基688，后重悬浮于TAP培养基中调整OD600＝1.0，绿藻与硫氧化细菌BCRC17547按照体积比20︰1～500︰1的比例转移至产氢培养瓶中；
(3)最后将产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O2耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃条件下培养。
同样的，所述F/2-S+Na2S2O3还可以用F/2培养基或F/2-S培养基替代，同样可以正常生长并实现可持续性产氢。
本发明方法具有如下优点：
本发明利用一株硫氧化细菌BCRC 17547化能自养异养特征以及硫元素催化平衡能力，解决了(1)利用硫氧化细菌厌氧好氧兼性生长特征，解决衣藻“光合产氧”和“厌氧产氢”之间的矛盾；(2)利用硫氧化细菌化能自养异养特征以及硫元素催化平衡能力，解决“两步法制氢”中衣藻“缺硫产氢”(缺硫促进产氢效率)和“生长需硫”(缺硫抑制生长)之间的矛盾。采用莱茵衣藻、小球藻或扁藻与硫氧化细菌共培养，在硫元素存在情况下也可以提高不同微藻的生长以及其产氢量的方法。
单独莱茵衣藻缺硫产氢约在第7天产氢达到最大值，约为43μmol/mg·chl；而通过本发明所述方法将莱茵衣藻和硫氧化细菌BCRC 17547共培养(藻菌比例60︰1，Na2S2O3 2～6g/L时)，连续培养到第15天时达到最高产氢效率255μmol/mg·chl，约为单纯绿藻最大产氢量的5.9倍(7天，43μmol/mg·chl),不仅显著提高了制氢效率，还大大延长了制氢时间(21天时的产氢量，仍高于纯藻培养的最大产氢量)。通过连续补加Na2S2O3可以使绿藻产氢和生产持续到43天。此外，藻菌共培养还可以促进微藻生物量的大幅提高，以莱茵衣藻为例，叶绿素含量由纯藻培养最高的1mg/L，提高到4.2mg/L。
附图说明
图1-A是不同比例的莱茵衣藻CC-503与硫氧化细菌BCRC 17547共培养的产氢量；
图1-B是莱茵衣藻CC-503在不同Na2S2O3含量下藻菌共培养的产氢量；
图2是莱茵衣藻CC-503在三种不同培养类型的OD生长曲线；
图3是莱茵衣藻CC-503在三种不同培养类型的叶绿素变化曲线；
图4莱茵衣藻CC-503在四种不同培养类型体内氢酶活性的变化；
图5是莱茵衣藻CC-503在四种不同培养类型的呼吸速率变化；
图6是莱茵衣藻CC-503在四种不同培养类型的淀粉含量的变化；
图7是莱茵衣藻CC-503的最佳培养类型产氢速率与OD生长曲线关系图；
图8是微观显微镜下藻菌共生生态生理图；
图9是小球藻在三种不同培养基中的生长量变化曲线；
图10是小球藻在三种不同培养基中的叶绿素含量变化曲线；
图11是小球藻在三种不同培养基中产氢峰面积；
图12是小球藻在三种不同培养基中产氢速率变化曲线；
图13是本发明的总体设计路线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下试验所用的原料均能通过购买的手段获得，实施例选用莱茵衣藻和小球藻为例对其进行进一步的验证。
本发明所采用的试验材料如下：
莱茵衣藻来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所，本实施例选用CC-503；小球藻来源于中国石油大学(华东)生物工程与技术中心；硫氧化细菌(Thiomonasintermedia)购自生物资源保存及研究中心，编号：BCRC 17547。
实施例1
一、莱茵衣藻的培养
A、选取莱茵衣藻藻种，来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所；
B、培养莱茵衣藻的藻种：
(a)莱茵衣藻液体培养条件：采用Tris-Acetate-Phosphate培养基(以下简称为TAP，配方如表1所示)，初始pH 7.2，光照强度为四级,培养温度为25±1℃，当液体培养时，可以静置培养或放置在水平振荡摇床100～120rpm，每5天传代一次。
(b)莱茵衣藻固体TAP培养基：将含1.5％～2％的琼脂粉的TAP培养基倒平板，用接种针平板划线进行培养，每隔2周传代一次；
C、莱茵衣藻产氢培养基：莱茵衣藻产氢的培养基采用TAP-S(简称TAP缺硫培养基)，所谓缺硫培养基即是将培养基中所含有的硫元素全部替换成等摩尔比的氯元素，即把正常TAP培养基内的硫酸铁、硫酸锌、硫酸铜和硫酸镁分别换成等摩尔的氯化铁、氯化锌、氯化铁和氯化镁。
表1 TAP培养基配方
(说明：培养基总体积定容到1000mL，固体培养基需要在添加1.5％的琼脂，121℃高压灭菌20min)
二、小球藻的培养
A、选取小球藻，来源于中国石油大学(华东)生物工程与技术中心
B、培养小球藻的藻种：
(a)小球藻液体培养条件：采用BG11(配方如表2所示)，调整pH 7.1，光照强度为四级，培养温度为25±1℃，当液体培养时，可以静置培养或放置在水平振荡摇床100～120rpm，每10天传代一次。
(b)小球藻固体培养条件：将液体的BG11按照1.5％的比例加入琼脂，灭菌后倒平板，平板划线培养，每隔1月传代一次。
C、小球藻产氢培养基：小球藻产氢的培养基采用TAP-S(TAP缺硫培养基)，所谓缺硫培养基即是将培养基中所含有的硫元素全部替换成等摩尔比的氯元素。
表2 BG11培养基配方
(说明：培养基总体积定容到1000mL，固体培养基需要在添加1.5％的琼脂，121℃高压灭菌20min)
三、硫氧化细菌的培养
A、选取硫氧化细菌，购自生物资源保存及研究中心，编号：BCRC 17547；
B、培养细菌的菌种：
(a)BCRC 17547的液体培养：将活化后的菌种，接种于pH为6.0的688培养基中(培养见表3)，放置于30℃下，摇床转速为150rpm，每隔15天传代一次。
(b)BCRC 17547的固体培养：在688培养基中添加1.5％的琼脂，倒平板后通过平板划线培养，每隔15天传代一次。
表3 688培养基配方
(说明：培养基的pH＝6.0，固体培养基需要添加1.5％的琼脂，于121℃下高压灭菌20min。)
四、硫氧化细菌与莱茵衣藻共培养
包括以下三种共培养方法：
A、TAP培养基中共培养的方法
首先莱茵衣藻(本实验选用CC-503)在TAP培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的硫氧化细菌，首先用TAP培养基清洗三次，去掉原688培养基，后重悬浮于TAP培养基中调整OD600＝1.0。莱茵衣藻(叶绿素＝0.5)与硫氧化细菌按照20︰1、40︰1、60︰1、80︰1、100︰1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外硫氧化细菌与莱茵衣藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的硫元素耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。
B、TAP-S培养基中共培养的方法
首先莱茵衣藻在TAP培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的硫氧化细菌，首先用TAP-S培养基清洗三次，去掉原培养基688，后重悬浮于TAP-S培养基中调整OD600＝1.0。莱茵衣藻(叶绿素＝0.5)与硫氧化细菌按照20︰1、40︰1、60︰1、80︰1、100︰1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外硫氧化细菌与莱茵衣藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O2耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。
C、TAP-S+Na2S2O3培养基中共培养的方法
首先莱茵衣藻在TAP培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的TAP-S+Na2S2O3培养基清洗3次。将生长至对数期的硫氧化细菌，首先用TAP-S+Na2S2O3培养基清洗三次，去掉原培养基688，后重悬浮于TAP-S+Na2S2O3培养基中调整OD600＝1.0。莱茵衣藻(叶绿素浓度＝0.5mg/L)与硫氧化细菌按照60︰1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外硫氧化细菌与莱茵衣藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的硫元素耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。
五、结果分析
(a)、硫氧化细菌与莱茵衣藻比例筛选及生长量的测定
选取莱茵衣藻与硫氧化细菌BCRC17547按照40︰1、60︰1、80︰1、100︰1、300︰1、500︰1，从以上比例根据产氢量的大小，选取合适的比例(如图1-A所示)，可以从图中看出无论是何种比例，都呈现先上升后下降的趋势，在第17天时，达到产氢的最高值，从选取的比例来看，对于藻菌比例为60︰1为较合适值，故选取60︰1为合适的比例后；再探讨Na2S2O3含量与藻菌共培养的比例，根据产氢量选取合适的Na2S2O3含量，(结果如图1-B所示)从数据图中可以看出，相对于莱茵衣藻的单独培养，在加入BCRC 17547菌种后，产氢量明显增高，在对比加入Na2S2O3后，产氢量至少提高2倍，在Na2S2O3为2～6g/L的条件下，产氢量最高可以达到255μmol/mg·chl，故选择Na2S2O3为2～6g/L继续进行下述试验；
确定好上述因素后，分别将莱茵衣藻CC-503单独培养、CC-503+BCRC 17547混合培养、CC-503+BCRC 17547+Na2S2O3三种情况在相同的环境下培养后，观察期生长情况，来分析菌以及Na2S2O3是否对莱茵衣藻CC-503的生长有促进作用，结果如图2所示，从图中可以看出，对于莱茵衣藻CC-503单独生长的话，在第9天后，其逐渐降低，而对藻菌共培养后，第9天前可能会比单独培养的藻生长较低，但是后期则明显优于藻的单独培养，随后在加入Na2S2O3后，可以看出其OD750则远远的优于其他两种。
(b)、叶绿素含量的测定
叶绿素在整个实验过程中起着重要的作用，其主要原理如下：光合作用包括光反应和暗反应两个阶段，光反应阶段包括水的裂解，水被分解释放出氧气并且产生电子，暗反应即卡尔文循环，这个过程利用光反应产生的能量和电子进行的固定。衣藻的氢化酶是一种可逆氢酶，在缺氧的条件下由核基因被诱导表达合成、再运输到叶绿体的类囊体膜上，通过铁氧还蛋白与光合电子传递链相连接，从而可以调配绿藻在缺氧胁迫条件下光合电子传递链的电子流，当电子过剩时，多余的电子传递到可逆氢酶，催化产生氢气，消除多余的电子对机体造成的损伤；而当细胞的代谢需要较多的能量时可逆氢酶分解产生电子，将电子传递给，进入光合电子传递链，这样为细胞提供能量并且进行的固定。目前国内外的研究都认为产氢中氢化酶的电子来源主要有两个途径：一条是上述介绍的接收电子的电子传递链，另一条途径是依赖于无氧条件下细胞内糖酵解和三羧酸循环产生的还原剂，在NADPH氧化还原脱氢酶的作用下将叶绿体细胞中的NADPH脱氢为NADP+，释放出的电子经过PQ库(醌分子、也就是质体醌)，同样经过电子传递链，最后由铁氧还蛋白传递到氢化酶。后一条代谢途径中叶绿素对产氢起着至关重要的作用，这两条电子传递过程都可以产生光合磷酸化作用，为衣藻细胞的生存及产氢提供能量。简单讲就是叶绿体和PSI和PSII的光合作用有关，光合作用和电子传递链有关；同时叶绿体又和发酵途径的三羧酸循环有关；而绿藻产氢中氢化酶的电子来源主要有电子传递链和三羧酸发酵这两个代谢途径，因此测定绿藻中的叶绿素和产氢的关系非常必要。
测定方法为：取1mL藻(3天以后的藻需要进行稀释，稀释方法为：取200μL藻后用培养基补齐至1mL)，测量OD649、OD665，根据公式计算相应的叶绿素含量，按照同样的取样原则取样，用12000rpm离心1min后去上清，加入95％的乙醇，用移液器吹吸均匀，12000rpm离心1min，取上清与新的EP管中，测定处理好的样品的665nm和649nm的吸光度，根据公式算出叶绿素的浓度:公式为：Chl(mg/L)＝OD665*6.1+OD649*20.04。将三种形式的藻菌在相同的培养环境下培养，按照上述的步骤进行叶绿素的测量提取得到如图3所示的结果，图3所示的3种培养形式如下所示：培养形式1为CC-503的单独培养，在培养的21天内，其叶绿素含量最高在第7-9天左右，叶绿素含量在1mg/L左右，随后其叶绿素含量逐渐降低；培养形式2为CC-503与菌种BCRC 17547的共培养，从图3中可以看出CC-503在加入菌种后，其生长较好，叶绿素含量在前17天一直持续上升，在17天达到最高值1.9mg/L左右；培养形式3为CC-503加入BCRC 17547以及Na2S2O3后，在第二天左右其叶绿素含量骤升为3mg/L左右，随后一直持续上升至17天左右，达到4mg/L左右，对比3种培养形式的叶绿素含量可以看出，选取的各种比例对于产氢量均是有促进作用的，培养形式3的叶绿素含量远远高于其他两种形式，侧面反映出培养形式3相较于其他两种对于产氢有良好的促进作用。
(c)、莱茵衣藻藻体内氢酶活性测定
氢酶活性测定方法具体为：
(a)、将产氢培养所用的60mL的玻璃管冲入氢气5min，迅速用橡胶塞塞住瓶口，以去除玻璃管中的氧气。
(b)、将产氢样品冲入氢气5min以除去培养系统内的氧气，用取样器取5mL藻样，快速注入冲氢厌氧处理过的产氢玻璃管中，用蜡封住针口。
(c)、将玻璃管放置在摇床上，25℃，100μE·m-2·s-1光照下，160r/min的转速震荡反应1h。
(d)、用气密性较好的进样器从玻璃管中的藻液上方抽取1mL气体打入气相色谱中，进行气体成分及含量测定。
(e)、计算每小时每毫克叶绿素的衣藻的氢气产量，即为体内氢化酶的活性。
为了进一步确定莱茵衣藻CC-503与硫氧化细菌共培养后产氢量增加的原因，我们分别检测了三种形态共培养产氛过程中不同衣藻藻种的体内氢酶活性，分别取纯藻第5天，共培养藻菌第17天和加S第15天，在厌氧工作站里用吸光度值来与时间的速率来体现体内氢酶的活性。测定结果如图4所示。
从图中可以看出单纯莱茵衣藻CC-503培养其体内酶活为0.042，莱茵衣藻CC-503+BCRC 17547体内酶活为0.045，CC-503+BCRC 17547+Na2S2O3培养基在加硫元素调控下体内酶活为0.064，三种形式和调控下的藻菌共培养类型相对于纯藻单独培养来说，分别是纯藻单独培养体内氢酶活性的1.07倍，1.3倍，1.5倍.
由以上结果可知，加入BCRC 17547菌后，莱茵衣藻CC-503的体内氢化酶活性都比未加入硫氧化细菌的莱茵衣藻CC-503增加，这可能是加入BCRC 17547菌促进莱茵衣藻CC-503产氢增加的直接原因。
(d)、呼吸率测定
在28℃下用Clark型氧电极(Hanstech，DW/1，Lab-2)测量呼吸速率。将2mL细胞样品从生长培养物的中间对数期取出，置于O2电极室中，用空气平衡，然后暗适应2min。加入20μL的1M NaHCO3至终浓度为10mM后，将样品保持在黑暗中5min。观察到的O2进化速率被校正为黑暗呼吸频率。呼吸频率根据以下公式计算：
V＝S*K*60*1000/P(V：放氧速率，单位为mmol O2/(mgChl·h)；S：测量时间点曲线的斜率，单位是min-1；k：常数，25℃下水中的氧气含量，单位为μmol O2/mL；P：叶绿素浓度，单位为mgChl/mL；60：min和h的换算；1000：记录纸的总量程)。
为了探究衣藻与BCRC 17547共培养后，培养液中溶氧含量加速降低的原因，按照上述方法我们进一步测定了纯衣藻系统及藻菌共培养时衣藻的呼吸速率。结果如图5所示结果表明，正常的TAP培养基和光照的条件下，按照上述的方法测量4种形式的呼吸耗氧速率，在6天连续培养中4种培养形式的呼吸耗氧速率呈现逐渐降低的趋势，纯净的CC-503与BCRC 17547的呼吸速率始终低于其他两种培养体系，尤其是CC-503与BCRC 17547以及Na2S2O3其呼吸速率显著的高，最高可以达到21μmol O2mg-1Chl·h-1，对比与纯净的藻和菌分别提高了3倍、2倍，对于CC-503与BCRC 17547的共培养体系其最高可以达到18.25μmolO2mg-1Chl·h-1，此结果表明菌藻共培养后，显著的加速了培养体系内的呼吸耗氧速率。
在正常培养基中，无论是最佳比例下的BCRC 17547+CC-503藻菌共培养系统,还是加入Na2S2O3的共培养系统其呼吸速率都随着培养时间逐渐降低，其中加入S元素的藻菌共培养系统中衣藻的呼吸速率都大于纯衣藻培养系统中衣藻的呼吸速率，这意味着Na2S2O3对H2生产的影响主要是通过减少O2的含量来调节的，Na2S2O3的添加降低了O2的含量，同时也可以理解为Na2S2O3抑制光系统II的活动，增加呼吸率能力从而消耗氧气，可以作为一个电子供体。该实验证明加入BCRC 17547菌共培养后，体系内衣藻的呼吸速率增加，导致共培养体系培养液中溶解氧的快速消耗。
(e)、淀粉含量的测定
测定方法为：将细胞沉淀重新悬浮在1mL 95％乙醇中2次，然后在1.7mL 100mM乙酸钠(pH 4.5)(Sigma-Aldrich，Germany)中重新悬浮于1.5mL乙酸缓冲液中。然后将样品超声处理10秒。在121℃反应10分钟后，加入2.2单位的淀粉葡糖苷酶(Sigma-Aldrich，Germany)，将样品在55℃的水浴中孵育14h，然后离心得到澄清的上清液部分，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(Sigma GAHK-20)测定葡萄糖。
按照上述方法进行四种培养形式的淀粉含量的测定，其实验结果如图6所示，从图6可以看出，BCRC 17547及CC-503单独培养时，其淀粉含量都呈现先上升后下降的趋势，其两者都在15天左右达到最高值，分别为4mg/ml、9.689mg/ml左右，对于将BCRC 17547于CC-503共培养后其淀粉的含量一直持续上升，在此基础上在加入Na2S2O3后，又在一定程度上优于前一种培养体系，而且高的淀粉含量可以使得藻在缺氧的状态下水解成葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解后会产生更多的电子来产氢，最后，淀粉含量的增加，也会促进藻的生长，这也是共培养后产氢增加以及促进藻生长的一个原因。
(f)、氢气产量
Angilent 7890A，毛细管柱分子筛5*1/8(OD)，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气。进样体积0.5～1mL，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃，用外标法计算氢气体积。将纯的氢气和氧气分别注入气相色谱仪，得到H2的出峰时间为1.1min左右，O2出峰时间为3.1min左右，其测量结果如图7所示，从图中可以看出，随着藻类的生长，其产氢量也是随之增高的，产氢量在培养到17天左右后，最高可以达到250μmol/mg·Chl，随后出现下降的趋势。
E、光学显微镜拍照
A、藻菌的形态观察
用移液器吸取10μL样品滴到载坡片的中央，将盖玻片的一侧先接触载玻片上的样品，然后缓慢放下盖玻片，使盖玻片完全盖在载玻片上，将做好的水封片拿到显微镜下观察，先用低倍镜观察然后再用高倍镜观察。
B、藻菌的分布格局
用移液器吸取10μL样品滴到载坡片的中央，将盖玻片的一侧先接触载玻片上的样品，然后缓慢放下盖玻片，使盖玻片完全盖在载玻片上，将做好的水封片拿到显微镜下观察，先用低倍镜观察然后再用高倍镜观察。
用显微镜观察藻菌共生的形式，得到的结果如图8所示。从图中可以看出，藻菌可以较好的共同生长，没有很明显的生长抑制作用。
实施例2
硫氧化细菌与小球藻共培养的方法
A、TAP培养基中共培养的方法
首先小球藻在TAP培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的硫氧化细菌，首先用TAP培养基清洗三次，去掉原培养基688，后重悬浮于TAP培养基中调整OD600＝1.0。小球藻(叶绿素＝0.5mg/L)与硫氧化细菌按照20︰1、40︰1、60︰1、80︰1、100︰1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外硫氧化细菌与小球藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的硫元素耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。
B、TAP-S培养基中共培养的方法
首先小球藻在TAP-S培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的硫氧化细菌，首先用TAP-S培养基清洗三次，去掉原688培养基，后重悬浮于TAP-S培养基中调整OD600＝1.0。小球藻(叶绿素＝0.5mg/L)与硫氧化细菌按照20︰1、40︰1、60︰1、80︰1、100︰1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外硫氧化细菌与小球藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的硫元素耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。
C、TAP-S+Na2S2O3培养基中共培养的方法
首先小球藻在TAP-S+Na2S2O3培养基中的培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000rpm离心5min，用新鲜的培养基清洗3次。将生长至对数期的硫氧化细菌，首先用TAP-S+Na2S2O3培养基清洗三次，去掉原培养基688，后重悬浮于TAP-S+Na2S2O3培养基中调整OD600＝1.0。小球藻(叶绿素＝0.5mg/L)与硫氧化细菌按照20︰1、40︰1、60︰1、80︰1、100︰1转移至产氢培养瓶中，每组设置3个对照，另外硫氧化细菌与小球藻分别单独设置对照。最后将所有产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O2耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃，定期取样测量生理生化分析，并进行气相分析。
D、硫氧化细菌与小球藻生理生化分析
(a)、硫氧化细菌与小球藻比例的初定及生长量的测定
对于小球藻初始设计藻菌的比例为20︰1、40︰1、60︰1、100︰1，通过OD680衡量其生长量，得到如图9所示，图中分为3中培养模式，分别为：TAP(A)、TAP-S(L)、TAP-S+Na2S2O3(LS)，从图中可以看出在缺硫培养基中藻菌生长状态较差，随着接入比例的增加其OD680也随之增加，而其他两种形式则影响不大，OD680的值一直差距不大。
(b)、叶绿素含量的测定
对于叶绿素含量的测定亦按照上述提到的方法，得到如图10所示，从图中可以看出小球藻在缺硫元素的情况下其生长情况较差，故而叶绿素含量较低，而在TAP或者TAP-S+Na2S2O3情况下其生长较好。
(c)、氢气产量
对于氢气的测量按照上述方法测定，得到如图11所示，计算其氢气产生速率如图12所示，综合两个图表所示可以看出在缺硫情况下，藻菌比例为20︰1的产氢量较好。
从以上的试验可以得出，如图13所示，将绿藻与硫氧化细菌按照一定比例进行混合培养，绿藻光合放出的氧气可以被细菌呼吸作用所消耗，细菌呼吸作用放出的二氧化碳还可以供给绿藻更好地进行光合作用，从而很好的维持了整个培养环境的厌氧特性。另外，利用硫氧化细菌对硫元素的平衡催化能力，可以实现硫元素的限制性供给，这样既可以保证绿藻的正常生长，还可以实现高效可持续性产氢。
从这幅藻菌共生机理关系图中可以看出：1：绿藻green alga利用太阳能，通过光合作用不断繁殖，并释放氧气；2：当绿藻和细菌共培养后，细菌生长的同时可以吸收氧气，使得藻细胞内的产氢酶免受氧气的“毒害”，从而长时间保持产氢活性；3：藻菌共培养提高藻产氢率的细菌主要包括发酵细菌fermentation bacteria和光合细菌photosyntheticbacteria，细菌在C(碳)、N(氮)、P(磷)这些微量元素的作用下进行生长代谢(呼吸作用)，产生CO2,同时藻类又可以帮助菌将CO2固定下来，就是固碳作用(C-fixed)；4：硫氧化细菌和藻共培养，其中，硫氧化细菌在利用S元素兼性化能自养、固碳或兼性厌氧生长的过程中参与了电子传递等一系列反应，从而对藻进行了S元素的限制供给，使藻在缺S或者不缺S的转态下不断循环作用，从而补充完善了藻的“两步法”缺硫培养产氢的缺陷，极大的延长和提高了藻菌共培养产氢的时间和产量。最终我们通过试验验证了微藻和细菌在一个合适的比例下，可以不断相互作用促进藻类产生氢气，不断循环生成生物质能或生物燃料。
并且还通过实验得出，单独莱茵衣藻缺硫产氢约在第7天产氢达到最大值，约为43μmol/mg·Chl；而通过本发明所述方法将莱茵衣藻和硫氧化细菌共培养(藻菌比例60︰1，Na2S2O3 3.0g/L时)，连续培养到第15天时达到最高产氢效率255μmol/mg·Chl，约为单纯绿藻最大产氢量的5.9倍(7天，43μmol/mg·Chl),不仅显著提高了制氢效率，还大大延长了制氢时间(21天时的产氢量，仍高于纯藻培养的最大产氢量)。通过连续补加Na2S2O3可以使绿藻产氢和生产持续到43天。此外，藻菌共培养还可以促进微藻生物量的大幅提高，以莱茵衣藻为例，叶绿素含量由纯藻培养最高的1mg/L，提高到4.2mg/L。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，其特征在于，将绿藻与硫氧化细菌按照体积比20︰1～500︰1的比例在培养基中混合培养，从而实现持续性产氢；所述硫氧化细菌为中间硫氧化菌BCRC 17547；所述培养基为TAP-S+Na2S2O3培养基或TAP培养基或TAP-S培养基；所述TAP-S培养基是将TAP培养基中所含有的硫元素全部替换成等摩尔比的氯元素。
2.根据权利要求1所述的藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，其特征在于，所述Na2S2O3的浓度为2～6g/L，所述绿藻的叶绿素初始浓度是0.2～3.0mg/L，硫氧化细菌的初始OD600＝0.5～3.0。
3.根据权利要求1所述的藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，其特征在于，所述绿藻为莱茵衣藻CC-503或小球藻。
4.根据权利要求1所述的藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，其特征在于，所述绿藻与硫氧化细菌的体积比为60︰1。
5.根据权利要求1所述的藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，其特征在于，所述方法具体为：
(1)首先绿藻在TAP培养基中培养至对数期中后期，随后藻体用离心机5000-8000rpm离心5～10min，用新鲜的TAP-S+Na2S2O3培养基清洗3次；
(2)将生长至对数期的硫氧化细菌BCRC 17547，首先用TAP-S+Na2S2O3培养基清洗三次，去掉原688培养基，后重悬浮于TAP培养基中调整OD600＝0.5～3.0，绿藻与硫氧化细菌BCRC17547按照体积比20︰1～500︰1的比例转移至产氢培养瓶中；所述688培养基的pH值为6.0，其组成为：酵母提取物5g/L、Na2HPO4 4.5g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、NH4Cl 0.3g/L、Na2S2O3·5H2O g/L、KH2PO4 1.5g/L；
(3)最后将产氢瓶置于25±1℃，黑暗处理24h将原有的O2耗尽，黑暗处理后将光照培养箱设置为光照：黑暗＝16h︰8h，温度为25±1℃条件下培养。
6.根据权利要求5所述的藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法，其特征在于，所述TAP-S+Na2S2O3培养基还可以用TAP培养基或TAP-S培养基替代。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711139565.8A CN107663529B (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711139565.8A CN107663529B (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107663529A CN107663529A (zh) | 2018-02-06 |
| CN107663529B true CN107663529B (zh) | 2020-05-08 |
Family
ID=61144102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711139565.8A Active CN107663529B (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107663529B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107937327B (zh) * | 2018-01-28 | 2021-05-04 | 杭州富阳优信科技有限公司 | 一种菌藻复合制剂及其在制备氢气中的用途 |
| CN109609382B (zh) * | 2018-12-07 | 2022-03-22 | 中国石油大学(华东) | 一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法 |
| CN110628862A (zh) * | 2019-09-24 | 2019-12-31 | 哈尔滨工业大学 | 一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法 |
| CN111269946B (zh) * | 2020-02-20 | 2022-04-19 | 上海交通大学 | 一种光生物学制氢体系及其制备方法以及应用 |
| CN112794885A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-14 | 中国石油大学(华东) | 微生物纳米线连接的细胞生物膜及其应用 |
| CN114058514B (zh) * | 2021-11-29 | 2023-07-25 | 华东理工大学 | 一种利用海洋绿藻青岛大扁藻积累淀粉的方法 |
| CN114377540B (zh) * | 2021-12-21 | 2023-08-18 | 国家电投集团科学技术研究院有限公司 | 固碳单元气体循环交换系统 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520897A (zh) * | 2017-01-10 | 2017-03-22 | 上海师范大学 | 一种提高衣藻产氢量的方法 |
-
2017
- 2017-11-16 CN CN201711139565.8A patent/CN107663529B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520897A (zh) * | 2017-01-10 | 2017-03-22 | 上海师范大学 | 一种提高衣藻产氢量的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Bio-hydrogen production enhancement by co-cultivating Rhodopseudomonas palustris WP3-5 and Anabaena sp. CH3;Siang Chen Wu et al;《International journal of hydrogen energy》;20111112;第27卷;第2231-2238页 * |
| Improvement of hydrogen production of Chlamydomonas reinhardtii by co-cultivation with isolated bacteria;Xiaoxu Li et al;《International journal of hydrogen energy》;20130402;第38卷;第10799-10787页 * |
| 硫细菌的分离、鉴定与应用;竹婧;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20170215(第2期);摘要，第24， 48-53页 * |
| 莱茵衣藻和根瘤菌共培养提高产氢条件的优化;徐丽丽等;《太阳能学报》;20151031;第36卷(第10期);第2565-2570页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107663529A (zh) | 2018-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107663529B (zh) | 一种藻菌共培养提高光合微藻产氢量的方法 | |
| Eroglu et al. | Microalgal hydrogen production research | |
| Ono et al. | Carbon dioxide mitigation using thermophilic cyanobacteria | |
| McKinlay et al. | Photobiological production of hydrogen gas as a biofuel | |
| KR102015829B1 (ko) | 온라인 산소 소비율과 전도율의 통합 제어를 기반으로 한 코엔자임 q10 발효 생산 공정 | |
| Avcioglu et al. | Biohydrogen production in an outdoor panel photobioreactor on dark fermentation effluent of molasses | |
| Liu et al. | Photo-fermentation hydrogen production by Rhodopseudomonas sp. nov. strain A7 isolated from the sludge in a bioreactor | |
| Laocharoen et al. | Isolation, characterization and optimization of photo-hydrogen production conditions by newly isolated Rhodobacter sphaeroides KKU-PS5 | |
| Xie et al. | The kinetic characterization of photofermentative bacterium Rhodopseudomonas faecalis RLD-53 and its application for enhancing continuous hydrogen production | |
| KR102229628B1 (ko) | 바이오연료 생산시스템 및 이를 이용한 바이오연료 생산방법 | |
| Xu et al. | Effect of co-cultivation of Chlamydomonas reinhardtii with Azotobacter chroococcum on hydrogen production | |
| CN106520897B (zh) | 一种提高衣藻产氢量的方法 | |
| CN113388649A (zh) | 发酵方法 | |
| Vargas et al. | Influence of culture age, ammonium and organic carbon in hydrogen production and nutrient removal by Anabaena sp. in nitrogen-limited cultures | |
| Liu et al. | Experimental study on optimization of initial pH for photo-fermentation bio-hydrogen under different enzymatic hydrolysis of chlorella vulgaris | |
| Chen et al. | Characterization of cell growth and photobiological H2 production of Chlamydomonas reinhardtii in ASSF industry wastewater | |
| El-Rab et al. | Costless and huge hydrogen yield by manipulation of iron concentrations in the new bacterial strain Brevibacillus invocatus SAR grown on algal biomass | |
| CN113416761B (zh) | 一种利用发酵培养法制备nmn的方法 | |
| CN107699519B (zh) | 一株硫酸盐还原菌，分离鉴定方法及其应用 | |
| Chen et al. | A novel native bioenergy green alga can stably grow on waste molasses under variable temperature conditions | |
| Poudyal et al. | Current insights to enhance hydrogen production by photosynthetic organisms | |
| US9303274B2 (en) | Microorganism, and hydrogen production process, 1,3-propanediol production process and biodiesel liquid waste treatment method each using the microorganism | |
| Wang et al. | Characteristics of mixotrophic growth of Synechocystis sp. in an enclosed photobioreactor | |
| CN102732563B (zh) | 慢生大豆根瘤菌提高莱茵衣藻产氢量的方法 | |
| Tiwari et al. | Algal photobiohydrogen production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |