CN113416761B

CN113416761B - 一种利用发酵培养法制备nmn的方法

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Publication number: CN113416761B
Application number: CN202110815270.8A
Authority: CN
Inventors: 王康林; 汪晓东; 金永红; 林子荣
Original assignee: Hefei Kangnuo Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Kangnuo Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2041-07-19
Also published as: CN113416761A

Abstract

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种利用一步发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸的方法。所述方法应用培养基培养酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸，所述方法还包括在发酵过程中采用两阶段变温，所述两阶段变温包括在20‑40h前采用32‑42℃发酵温度，在20‑40h后采用25‑31℃的发酵温度。所述方法中培养酿酒酵母KH09的培养基包括碳源和氮源，所述碳源包括葡萄糖，所述氮源包括酪蛋白水解物，所述葡萄糖的浓度为30‑70g/L，所述酪蛋白水解物的浓度为10‑50g/L。本发明所述方法的原料成本低，操作简单，反应彻底，转化率、生产效率高，易实现产业化、规模化生产。

Description

一种利用发酵培养法制备NMN的方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及利用发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononucleotide，简称β-NMN或者NMN)是人体中的一种内源性物质，参与细胞内烟酰胺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成，是其重要并且最直接的前提物质。在人体内，NMN通过转化为NAD+发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等，但它会随年龄增长而逐渐减少。由于NAD+分子量过大，很难被人体吸收，NAD+的补充只有通过摄取分子量较小的NMN等前体物质来实现。NMN也存在于日常饮食的多种蔬菜和水果中，但含量极其微量，摄入的量远远不足，所以需要额外补充。近年研究发现，人为补充NMN可以明显提高体内的NAD+水平，抑制衰老引起的认知能力下降，保护心脑血管功能，提升体能，延长寿命，还可以调节内分泌，防治糖尿病等代谢性疾病，保护视力和听力等。

目前制备NMN的方法主要有化学合成法和体外酶转化法。化学法工艺复杂，成本高，收率低，并可能产生许多顺式异构体及大量的有毒副产物，造成环境污染，限制了其应用。体外酶转化法虽具有污染小、反应简便等特点，但其需先提取具有活性的酶，增加工艺成本，且酶在提取过程中及体外易失活，导致NMN酶转化存在耗时长和收率低等问题，周期长、生产效率低难以实现较大规模生产。微生物发酵是一个极为复杂的生化反应过程，基质、温度、pH等种种因素都对微生物的生长和产物的形成分泌都会产生影响。一步发酵法为由糖质原料经利用直接生成产物的过程，培养基成分简单、成本低、方法简单实用、易于操作、前景广阔，是一种绿色、高效的生产方法。

发明内容

本发明的目的一方面是填补现有制备烟酰胺单核苷酸技术空白，另一方面是克服现有的烟酰胺单核苷酸制备工艺的缺陷，在实验室现有菌种的基础上，通过发酵工艺优化及过程控制利用微生物一步发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸，其原料成本低，操作简单，反应彻底，转化率、生产效率高，易实现产业化、规模化生产。

本发明的目的是这样实现的：

在一个实施例中，本发明提供一种利用发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸的方法，所述方法应用培养基培养酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸，所述酿酒酵母KH09是以保藏菌株KH08为出发菌株，经简单酶切制备得出，KH08的保藏编号：CGMCC No.19048；所述方法还包括在发酵过程中采用两阶段变温，所述两阶段变温包括在20-40h前采用32-42℃发酵温度，在20-40h后采用25-35℃的发酵温度，其中需保证后一阶段的温度低于前一阶段的温度。优选地，所述两阶段变温包括在25-35h前采用34-40℃发酵温度，在25-35h后采用27-33℃的发酵温度。

所述以保藏菌株KH08为出发菌株，经酶切制备得到酿酒酵母KH09，具体包括：(1)合成NMA1基因敲除片段；(2)应用酿酒酵母KH08制备酿酒酵母感受态细胞；(3)取步骤(1)得到的NMA1基因敲除片段加入至步骤(2)得到的酿酒酵母感受态细胞中，进行电转化，应用培养基培养得到转化液，对上述转化液进行培养得到转化子，挑取转化子划线纯化，用酵母基因组提取试剂盒提取基因组，用引物对NMA1-F1/NMA1-R1进行PCR验证敲除正确，得到酿酒酵母KH09。

优选地，合成的NMA1基因敲除片段为(双链片段，以下展示为单义链)：

GAATAAACACACATAAACAAACAAAATGGATCCCACAAGAGCTCCGTTAAGCAAGTTCTTGGAAACAAAGAATGAACCCGGGGCGAATTTC TTATGATTT；

优选地，所述引物对NMA1-F1/NMA1-R1的序列为：

NMA1-F1：

GAATAAACACACATAAACAAACAAAATGGATCCCACAAGAGCTCC；

NMA1-R1：AAATCATAAGAAATTCGCCCCGGGTTCATTCTTTGTTTCCAAGAACTTGCTTA AC。

所述方法还包括在发酵的不同阶段采用不同的溶氧水平培养，发酵培养的前30-50h控制最低溶氧水平为20-40％；发酵培养的后30-50h控制最低溶氧水平为2-8％。

优选地，所述两阶段变温包括在30h前采用37℃发酵温度，在30h后采用30℃的发酵温度。

优选地，在发酵培养的前40h控制最低溶氧水平为30％；发酵培养的后40h控制最低溶氧水平为5％。

优选地，所述发酵过程中的搅拌转速为150-500r/min，和/或罐压控制在0.02-0.1MPa，和/或通气量为0.5-2vvm；优选地，搅拌转速为200-300r/min，和/或罐压控制在0.06-0.08MPa，和/或通气量为0.8-1.5vvm。

优选地，在发酵培养30-50h后，在上述培养基中加入Triton X-100；优选地，Triton X-100添加量分别为0.2％-1.0％；优选地，所述Triton X-100添加量为0.3-0.7％；优选地，Triton X-100添加量分别为0.5％(所述百分比为培养基的质量百分比)。

在另一个实施例中，本发明提供上述任一项方法中培养酿酒酵母KH09的培养基，所述培养基包括碳源和氮源，所述碳源包括葡萄糖，所述氮源包括酪蛋白水解物，所述葡萄糖的浓度为30-70g/L，所述酪蛋白水解物的浓度为10-50g/L。

优选地，所述葡萄糖的浓度为50g/L，所述酪蛋白水解物的浓度为30g/L。

优选地，所述培养基还包括KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、尿素、ZnCl₂、柠檬酸铁以及烟酰胺。优选地，所述培养基中，KH₂PO₄的浓度为21.17g/L、MgSO₄·7H₂O的浓度为10g/L、尿素的浓度为10g/L、ZnCl₂的浓度为0.01g/L、柠檬酸铁的浓度0.05g/L为以及烟酰胺的浓度为24g/L。

优选地，所述培养基还包括Triton X-100；优选地，所述Triton X-100添加量为0.3-0.7％；优选地，所述Triton X-100添加量为0.5％。

本发明在实验室已有菌株的基础上，通过优化该菌株的发酵条件，大大提高了该菌株发酵产烟酰胺单核苷酸的浓度。同时其原料成本低，操作简单，反应彻底，转化率、生产效率高，易实现产业化、规模化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些图获得其他的附图。

图1不同葡萄糖浓度对产烟酰胺单核苷酸的影响；

图2不同酪蛋白水解物浓度对产烟酰胺单核苷酸的影响；

图3不同培养温度对产烟酰胺单核苷酸的影响；

图4两阶段变温培养对产烟酰胺单核苷酸的影响；

图5分阶段溶氧控制水平对产烟酰胺单核苷酸的影响；

图6不同Triton X-100浓度对产烟酰胺单核苷酸的影响；

图7发酵产烟酰胺单核苷酸曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的技术方案：

一种微生物利用糖质原料一步发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸的方法，对实验室可产烟酰胺单核苷酸的酿酒酵母KH09(所述酿酒酵母KH09是以本公司保藏菌株KH08为出发菌株，经简单酶切制备得出)，(KH08已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC19048)进行培养基成分、发酵条件及过程控制优化，获得高产烟酰胺单核苷酸的发酵方法。关于培养基成分及发酵条件优化：具体通过单因素实验考察了碳源、氮源、培养温度等对发酵产烟酰胺单核苷酸的影响。关于发酵过程控制优化：具体在培养基成分及发酵条件优化的基础上，发酵过程中采用两阶段变温、溶氧控制和菌体通透性改变培养。

实施例1

本实施例说明以保藏菌株KH08为出发菌株，经简单酶切制备得出KH09菌株，具体工艺如下：

1、合成NMA1基因敲除片段(双链片段，以下展示为单义链)：GAATAAACACACATAAACAAACAAAATGGATCCCACAAGAGCTCCGTTAAGC AAGTTCTTGGAAACAAAGAATGAACCCGGGGCGAATTTCTTATGATTT；

2、制备酿酒酵母感受态细胞：

从酿酒酵母KH08(保藏编号为CGMCC No.19048)甘油冻存管中取一环菌液，在YPD平板(YPD培养基的成分为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)划线活化，置于30℃培养箱，培养3天；然后从YPD平板上挑取单菌落接种到4mL YPD试管，30℃、250rpm条件下培养16h，将试管菌液按2％的接种量转接至30mL YPD摇瓶中，30℃、250rpm条件下培养至OD600＝0.8-1.2，收集菌体，用冷的无菌水洗涤两次，再用冷的1M山梨醇洗涤两次后，最后用1M山梨醇将菌体重悬至300μL的体系，得到酿酒酵母感受态细胞，按100μL分装成三份后，放置冰中，备用；

3、电转化：

取NMA1基因敲除片段1μg加入至100μL酿酒酵母感受态细胞中，冰中放置片刻，转移至冰浴的2mm电转杯中，1.5KV电击后，用1mL YPD培养基重悬后转移至EP管中，于30℃摇床温育1-3h得到转化液，分别取200μL、300μL转化液涂布于含500mg/L G418抗生素的YPD平板上，置于30℃培养箱中培养3-5天得到转化子，挑取转化子划线纯化，用酵母基因组提取试剂盒提取基因组，用引物对NMA1-F1/NMA1-R1进行PCR验证敲除正确，将此转化子菌株命名为酿酒酵母KH09(含有G418抗性)。

NMA1-F1：

GAATAAACACACATAAACAAACAAAATGGATCCCACAAGAGCTCC；

NMA1-R1：

AAATCATAAGAAATTCGCCCCGGGTTCATTCTTTGTTTCCAAGAACTTGCTTAAC。

实施例2

本实施例说明碳源添加浓度对发酵产烟酰胺单核苷酸的影响，应用培养基培养实施例1制得的酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸。在发酵培养基其他条件相同的情况下，具体设置其他条件如下：酪蛋白水解物20g/L，KH₂PO₄ 21.17g/L，MgSO₄·7H₂O 10g/L，尿素10g/L，ZnCl₂ 0.01g/L,柠檬酸铁0.05g/L，烟酰胺24g/L；培养温度30℃，pH值6，接种量4％，装液量50mL/250mL，往复式摇床225r/min，培养50小时。

将葡萄糖分别按30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L添加至培养基中。在不同的葡萄糖浓度下，产烟酰胺单核苷酸的浓度见图1。实验结果表明，添加量为50g/L时，烟酰胺单核苷酸浓度最高。

实施例3

本实施例说明氮源添加浓度对发酵产烟酰胺单核苷酸的影响，与实施例2类似，在发酵培养基其他条件相同的情况下，将酪蛋白水解物分别按10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L添加至培养基中。在不同的酪蛋白水解物浓度下，产烟酰胺单核苷酸的浓度见图2。实验结果表明，添加量为30g/L时，烟酰胺单核苷酸浓度最高。

实施例4

本实施例说明温度对发酵产烟酰胺单核苷酸的影响，与实施例2类似，在发酵培养基其他条件相同的情况下，将温度控制在24℃、27℃、30℃、33℃、37℃。在不同的培养温度下，产烟酰胺单核苷酸的浓度见图3。实验结果表明，一步发酵法将温度控制在33℃时，烟酰胺单核苷酸浓度最高。

实施例5

本实施例说明两阶段变温培养相对单一温度培养对发酵产烟酰胺单核苷酸的影响，与实施例2类似，在发酵培养基其他条件相同的情况下，分阶段控制温度，培养30h前控制温度为37℃，30h后为30℃。在不同的变温培养策略下，产烟酰胺单核苷酸的浓度见图4。实验结果表明，两阶段变温培养相对单一温度培养时，烟酰胺单核苷酸浓度提高了2.5倍。

实施例6

本实施例说明不同阶段溶氧控制水平相对单一溶氧控制水平培养对发酵产烟酰胺单核苷酸的影响，与实施例2类似，在发酵培养基其他条件相同的情况下，分阶段控制溶氧水平，培养40h前控制最低溶氧水平为30％，且和转速耦联；40h后控制最低溶氧水平为5％。在不同的溶氧水平培养控制下，产烟酰胺单核苷酸的浓度见图5。实验结果表明，分阶段溶氧水平控制培养相对单一溶氧水平培养时，烟酰胺单核苷酸浓度提高了1.2倍。

实施例7

本实施例说明不同活性剂添加浓度对发酵产烟酰胺单核苷酸的影响，与实施例2类似，在发酵培养基其他条件相同的情况下，发酵培养40h后，Triton X-100添加量分别为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％。在不同的Triton X-100添加量下，产烟酰胺单核苷酸的浓度见图6。实验结果表明，添加0.5％的Triton X-100，烟酰胺单核苷酸浓度最高。

实施例8

在上述最优的培养基成分、发酵条件、发酵过程控制策略下即酪蛋白水解物30g/L，KH₂PO₄ 21.17g/L，MgSO₄·7H₂O 10g/L，尿素10g/L，葡萄糖50g/L，ZnCl₂ 0.01g/L，柠檬酸铁0.05g/L，烟酰胺24g/L；初始pH为6，接种量4％，装液系数0.7，发酵温度(30h前37℃，30h后30℃)搅拌转速为250-500r/min，罐压控制在0.06-0.08MPa，通气量1.2vvm，溶氧控制(40h前控制最低溶氧水平为30％，且和转速耦联；所述转速和溶氧设置为耦联，指转速在溶氧水平及通气量固定下，在设定范围内进行自动调整；40h后控制最低溶氧水平为5％)，发酵培养40h后添加0.5％Triton X-100和2.4％烟酰胺继续培养。过程中取样检测绘制KH09发酵产烟酰胺单核苷酸过程曲线，结果见图7。从图7可以看出，最适发酵时间在45h左右，最终发酵液中烟酰胺单核苷酸浓度达到19g/L，是初始水平的15倍。

本发明通过单因素实验考察了碳源、氮源、培养温度等对发酵产烟酰胺单核苷酸的影响。得出的最佳条件为：酪蛋白水解物30g/L，KH₂PO₄ 21.17g/L，MgSO₄·7H₂O 10g/L,尿素10g/L，葡萄糖50g/L,ZnCl₂0.01g/L,柠檬酸铁0.05g/L,烟酰胺24g/L；培养温度33℃，pH值6，接种量4％，装液量50mL/250mL。往复式摇床225r/min，发酵50h条件下，酿酒酵母KH08产烟酰胺单核苷酸量为5.2g/L,是初始水平的4倍。

在培养基成分及发酵条件优化的基础上，发酵过程中采用两阶段变温、溶氧控制和菌体通透性改变培养。得出的最佳条件为：初始pH为6，接种量4％，装液系数0.7，发酵温度(30h前37℃，30h后30℃)搅拌转速为250-500r/min，罐压控制在0.06-0.08MPa，通气量1.2vvm，溶氧控制(40h前控制最低溶氧水平为30％，且和转速耦联；40h后控制最低溶氧水平为5％),发酵培养40h后添加0.5％Triton X-100和2.4％烟酰胺继续培养至45h左右下罐，发酵液中烟酰胺单核苷酸浓度达到19g/L,是初始水平的15倍。

在实验室已有菌株的基础上，通过优化该菌株的培养基成分、发酵条件及发酵过程控制后，该菌株发酵产烟酰胺单核苷酸的浓度达到19g/L，是初始水平的15倍，是目前文献报道的最高水平。同时其原料成本低，操作简单，反应彻底，转化率、生产效率高，易实现产业化、规模化生产。

本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims

1.一种利用发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述方法应用培养基培养酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸，所述酿酒酵母KH09是以KH08菌株为出发菌株，经NMA1基因敲除制备得到，所述KH08的保藏编号为：CGMCC No. 19048；所述方法还包括在发酵过程中采用两阶段变温，所述两阶段变温为在20-40h前采用32-42℃发酵温度，在20-40h后采用25-35℃的发酵温度，其中后一阶段的温度低于前一阶段的温度；

所述方法还包括在发酵的不同阶段采用不同的溶氧水平培养，发酵培养的30-50h前控制最低溶氧水平为20-40％；发酵培养的30-50h后控制最低溶氧水平为2-8％；

所述发酵过程中的搅拌转速为150-500r/min，罐压控制在0.02-0.1MPa，通气量为0.5-2vvm；

所述培养基包括碳源和氮源，所述碳源包括葡萄糖，所述氮源包括酪蛋白水解物，所述葡萄糖的浓度为30-70g/L，所述酪蛋白水解物的浓度为10-50g/L；

所述培养基还包括KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、尿素、ZnCl₂、柠檬酸铁以及烟酰胺；

所述培养基还包括Triton X-100，所述Triton X-100添加量为0.2-1.0％；

所述NMA1基因敲除的方法具体包括：(1)合成NMA1基因敲除片段；(2)应用酿酒酵母KH08制备酿酒酵母感受态细胞；(3)取步骤(1)得到的NMA1基因敲除片段加入至步骤(2)得到的酿酒酵母感受态细胞中，进行电转化，应用培养基培养得到转化液，对上述转化液进行培养得到转化子，挑取转化子划线纯化，用酵母基因组提取试剂盒提取基因组，用引物对NMA1-F1/NMA1-R1进行PCR验证敲除正确，得到酿酒酵母KH09；

所述NMA1基因敲除片段为：

GAATAAACACACATAAACAAACAAAATGGATCCCACAAGAGCTCCGTTAAGCAAGTTCTTGGAAACAAAGAATGAACCCGGGGCGAATTTCTTATGATTT；

所述引物对NMA1-F1/NMA1-R1的序列为：

NMA1-F1：GAATAAACACACATAAACAAACAAAATGGATCCCACAAGAGCTCC；

NMA1-R1：AAATCATAAGAAATTCGCCCCGGGTTCATTCTTTGTTTCCAAGAACTTGCTTAAC。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两阶段变温为在30h前采用37℃发酵温度，在30h后采用30℃的发酵温度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵培养的40h前控制最低溶氧水平为30％；发酵培养的40h后控制最低溶氧水平为5％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为50g/L，所述酪蛋白水解物的浓度为30g/L。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中，KH₂PO₄的浓度为21.17g/L、MgSO₄·7H₂O的浓度为10g/L、尿素的浓度为10g/L、ZnCl₂的浓度为0.01g/L、柠檬酸铁的浓度为0.05g/L以及烟酰胺的浓度为24g/L。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Triton X-100添加量为0.5％。