CN112662699A - 烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成nmn工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，涉及酶工程技术领域。该烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，包括以下步骤：S1、酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶重组展示表达载体的构建：根据NrK1突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)设计NrK1的编码DNA序列，密码子采用酿酒酵母的偏爱密码子，以全基因合成的方式合成NrK1的编码DNA(SEQ ID NO：2)。该烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，该烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，可将不同生物来源可催化NMN合成的高活性酶通过基因工程技术锚定表达于酿酒酵母的细胞壁表面，形成具有高效合成NMN的全酵母工程细胞酶。

Description

烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别的为烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺。

背景技术

NMN(烟酰胺单核苷酸)在人体细胞能量代谢中扮演着重要角色，它参与细胞内最重要的电子转移载体NAD+(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的合成，也是细胞NAD+补救合成的中间体，在哺乳动物体内，NMN由NMN由烟酰胺(Nicotinamide，Nam)在Nampt的催化下生成，随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide mononucleotideadenosinetransferase，Nmnat)的催化下生成NAD+，细胞外NMN需要去磷酸化为NR(烟酰胺核苷)才能进入肝细胞，在烟酰胺核苷激酶的作用下磷酸化重新生成NMN，随后NMN在Nmnat的作用下与ATP反应生成NAD+，NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等，

但是现有技术中，传统的NMN生产是一种化学合成的方式，即以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，生产率较低，产品纯度低，含有约50％的手性分子α-NMN，且有毒，难分离，故收率非常低，另外，在合成过程中需要使用大量的有机溶剂，对环境破坏严重，近年来，生物催化技术已用于NMN的生产，通过重组DNA技术生产的烟酰胺核苷激酶(NRK)可在体外高效转化烟酰胺糖苷(NR)生产NMN，这是一种绿色生物转换，对环境污染几乎为零，不产生手性分子α-NMN，产率高，成本低，是NMN生产技术的一次重大革命，但NRK几乎都是来自大肠杆菌表达的游离酶，需要对酶进行分离纯化，无法多次重复使用，而且大肠杆菌的脂多糖LPS一直是药品和保健食品生产上的一个安全威胁，使实际生产过程较为繁琐，资源重复利用率较低，使实际生产效果欠佳。

发明内容

本发明提供的发明目的在于提供一种烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，能够安全、高效的进行实际生产使用，且可多次重复进行生产原料的使用，进而有效减少实际成本的投入。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，包括有以下步骤：

S1、酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶重组展示表达载体的构建：根据NrK1突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)设计NrK1的编码DNA序列，密码子采用酿酒酵母的偏爱密码子，以全基因合成的方式合成NrK1的编码DNA(SEQ ID N0：2)，并克隆至载体pMD-18T，形成携带NrK1编码基因的重组载体pMD-18T/NrK1，该载体转化大肠杆菌Top10，进行质粒的扩增和保存，通过Genebank查阅酿酒酵母絮凝素锚定蛋白flo1编码DNA序列，全合成该基因并克隆至载体pMD-18T，形成携带flo1编码基因的重组载体pMD-18T/flo1，该载体转化大肠杆菌Top10，进行质粒的扩增和保存，并且设计引物P1、P2、P3、P4，其中P1、P2以载体pMD-18T/f1o1为模板扩增flol的编码基因，在P1上带有Not I的酶切位点，P2上则带有连接肽GGGGS五个氨基酸的编码序列，P3、P4以pMD-18T/NrK1扩增NrK1编码基因，P2和P3有18bp的重叠区，P4上带有组氨酸标签His-Tag的编码序列和Xba I酶切位点，通过PCR扩增，可分别获得flo1的编码DNA片段和NrK1编码DNA片段，由于P2和P3有18bp的重叠区，采用重叠PCR的方法可以将两个片段组装成一个基因片段，用Not I/Xba I双酶切将基因片段和载体pHBM368-pgk，DNA连接反应将flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA片段定向插入到该载体启动子pgk控制下的开放阅读框(ORF)中，构建成酿酒酵母NrK1重组展示表达载体NrK1/pHBM-368-pgk。

S2、酿酒酵母工程细胞酶的制备：将酿酒酵母絮凝素锚定蛋白flo1和烟酰胺核苷激酶(NRK)串联形成融合蛋白，合成该融合蛋白的编码基因，将该基因定向插入S1中酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk中以pgk为启动子的开放阅读框(ORF)中，经载体的线性化和电转化，将目的基因导入酿酒酵母INVSc，目的蛋白表达后并向酵母细胞外分泌，通过凝素锚定蛋白flo1成功展示于酿酒酵母细胞壁表面，形成具有催化功能的全酿酒酵母工程细胞酶。

S3、全细胞催化剂制备：以S1中备用的NrK1突变体中氨基酸序列(SEQ ID NO：1)为基础按照酿酒酵母偏爱密码子设计成为NrK1的编码DNA序列，将此DNA序列通过一段柔性连接肽(GGGGS)的编码DNA序列连接在酿酒酵母絮凝素flol锚定蛋白编码DNA的下游，形成flo1-NrK1的完整编码DNA序列，并在该基因下游添加组氨酸标签(His-Tag)编码序列，采取全基因合成的方式合成flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA，将目的编码DNA定向插入酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk中以pgk为启动子的开放阅读框(0RF)中，经载体的线性化和电转化，使目的基因导入酿酒酵母INVSc(His-、Leu-、Trp-、Ura-)，以Sc平板对重组转化子进行初筛，3-4天后可得到酿酒酵母的阳性转化子，转化子再经YPD平板活化，接种YPD液体培养基扩大培养，收集酵母细胞，用FITC标记的抗His-Tag抗体进行免疫荧光染色，通过荧光倒置显微镜观察细胞的荧光强度，进一步筛选出高效表面展示NrK1的重组酵母细胞，对高效表面展示NrK1的重组酵母细胞进行高密度发酵，收集发酵细胞，真空冷冻干燥，制备成全细胞催化剂。

S4、酵母转化和重组子的筛选：将S2中制得的展示表达载体NrK1/pHBM-368-pgk用Hpa I酶切线性化，电转化酿酒酵母INVSc(His-、Leu-、Trp-、Ura-)，转化后的酵母细胞铺于Sc平板，培养3-4天，因INVSc为营养缺陷型，在不含Ura的培养基上不能生长，但载体NrK1/pHBM-368-pgk带有Ura的合成基因，因而只有导入并稳定整合重组载体的酵母细胞才能在Sc培养基上生长，挑选Sc生长的单个菌落，用Sc液体培养基(0.67％YNB、2％葡萄糖、0.01％氨基酸(His，Trp，Leu))扩大培养，离心收集细胞，做进一步的鉴定和筛选。

S5、高效表面展示NrK1的酿酒酵母的筛选：将S1中制备的NrK1的羧基端带有组氨酸标签His-Tag，可采用免疫荧光方法进一步筛选高效表面展示NrK1的酿酒酵母细胞，收集上述扩大培养的酿酒酵母细胞，取106个细胞，重悬于200mL Buffer A，并搅拌混匀离心后，弃上清，再200mL Buffer B洗涤一次，离心后去上清，将细胞重悬于50μL含FITC标记抗His-Tag单抗(1∶1000稀释)的Buffer B中避光静置，然后转至室温内避光静置1h，再进行离心处理，弃上清后，1×PBS洗2次，重悬细胞于200μl1×PBS中，并且通过使用荧光倒置显微镜观察细胞荧光和流式细胞术挑选荧光强度最大的酿酒酵母菌株作为全酵母工程细胞酶备用。

S6、全酵母工程细胞酶的活力检测：将S6中筛选高效展示NrK1酶的酵母工程细胞接种200mL的YPD液体培养基，进行摇瓶发酵培养，收集细胞，1×PBS洗细胞3次，真空冷冻干燥保存，作为全酵母工程细胞酶，该酶可在Mg2+和ATP存在条件下，一步转化烟酰胺核苷(NR)为烟酰胺单核苷酸(NMN)，反应体系为：1×PBS(pH 7.4)、50mM ATP、10mM MgCl2、50mM烟酰胺核苷(NR)、20mg/ml全酵母工程细胞酶，于20、30、40、50、60℃，20rpm/min摇动反应4h，4000rpm/min离心5min，取上清进行HPLC分析，通过标准品对照，对生成的NMN进行定量和定性分析，按照国际酶单位(IU)定义，即1min催化形成1μmol NMN的酶量为一个国际单位(IU)，计算全酵母工程细胞酶的比活力，根据反应体系中NMN的生产量计算转化率。

S7、全酵母工程细胞酶的再使用：待S6中反应结束后，将整个反应体系置于离心管进行离心处理，收集酵母工程细胞，重新配制上述反应体系，将收获的酵母工程细胞加入体系中，于40℃、20rpm/min摇动反应4h，收集上清，HPLC检测NMN的生产量，计算酶的活力和转换率，按此方法再重复使用酶4次，分别计算出该酶每次重复使用时的活力和转化率。

作为本发明进一步的方案：根据Sl中操作步骤，所述NrK1即含有SEQ ID N0：1氨基酸序列的酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶，所述SEQ ID NO：1氨基酸序列通过酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶体外突变获得。

作为本发明进一步的方案：根据S1中操作步骤，所述基因片段即以flo1的编码DNA片段和NrK1编码DNA片段为模板，以P1和P4为扩增引物，PCR扩增可获得编码flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA片段。

作为本发明进一步的方案：根据S4中操作步骤，所述Sc平板由0.67％YNB、2％葡萄糖、0.01％氨基酸(His，Trp，Leu)和2％琼脂粉混合制得。

作为本发明进一步的方案：根据S5中操作步骤，所述Buffer A即1×PBS、0.5％BSA和1mmoL/L EDTA混合制得，所述Buffer B有1×PBS和0.5％BSA混合制得。

作为本发明进一步的方案：根据S5中操作步骤，所述离心时温度均控制为4℃，所述离心时使用离心机转速均为4000rpm/min，所述离心时间均为2min。

作为本发明进一步的方案：根据S5中操作步骤，所述避光静置时温度为4℃，所述避光静置时间为30min。

作为本发明进一步的方案：根据S6中操作步骤，所述摇瓶发酵培养温度为28℃，所述摇瓶发酵培养摇速为200rpm/min，所述摇瓶发酵培养时间为48h。

作为本发明进一步的方案：根据S7中操作步骤，所述离心管使用转速为4000rpm/min，所述离心管离心时间为5min。

本发明提供了烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺。具备以下有益效果：

该烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，可将不同生物来源可催化NMN合成的高活性酶通过基因工程技术锚定表达于酿酒酵母的细胞壁表面，形成具有高效合成NMN的全酵母工程细胞酶，通过酶蛋白编码基因的合成、展示表达载体的构建、转化和重组酵母细胞的筛选，获得高效展示表达上述合成NMN高活性酶的酵母工程细胞，同时该全酵母工程细胞酶通过高密度发酵，可有效转化烟酰胺核苷(NR)生成NMN，其最高活力可以达到65IU/g(酵母细胞干重)，达到工业生产的要求，且该酶具有固定化酶的特征，实际使用所需温度条件和有机溶剂条件稳定、可多次重复使用、活力高以及后续产品处理的简便性等，且无需额外的蛋白纯化和固定化的操作，有着良好的应用前景。

附图说明

图1为本法发明的高效展示酿酒酵母烟酰胺核苷激酶(NrK1)表达载体的构建过程简图；

图2为本法发明的免疫荧光筛选高效表面展示NrK1重组酵母菌株图；

图3为本法发明的体外建立的该酶的反应体系图；

图4为本法发明的全酵母工程细胞酶的活力和转化率测定图；

图5为本法发明的全酵母工程细胞酶的转化效率图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1、烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，包括以下步骤：步骤一、酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶重组展示表达载体的构建：根据NrK1突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)设计NrK1的编码DNA序列，密码子采用酿酒酵母的偏爱密码子，以全基因合成的方式合成NrK1的编码DNA(SEQ ID N0：2)，并克隆至载体pMD-18T，形成携带NrK1编码基因的重组载体pMD-18T/NrK1，该载体转化大肠杆菌Top10，进行质粒的扩增和保存，通过Genebank查阅酿酒酵母絮凝素锚定蛋白flo1编码DNA序列，全合成该基因并克隆至载体pMD-18T，形成携带flo1编码基因的重组载体pMD-18T/flo1，该载体转化大肠杆菌Top10，进行质粒的扩增和保存，并且设计引物P1、P2、P3、P4，其中P1、P2以载体pMD-18T/flo1为模板扩增flo1的编码基因，在P1上带有Not I的酶切位点，P2上则带有连接肽GGGGS五个氨基酸的编码序列，P3、P4以pMD-18T/NrK1扩增NrK1编码基因，P2和P3有18bp的重叠区，P4上带有组氨酸标签His-Tag的编码序列和Xba I酶切位点，通过PCR扩增，可分别获得flo1的编码DNA片段和NrK1编码DNA片段，由于P2和P3有18bp的重叠区，采用重叠PCR的方法可以将两个片段组装成一个基因片段，用Not I/Xba I双酶切将基因片段和载体pHBM368-pgk，DNA连接反应将flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA片段定向插入到该载体启动子pgk控制下的开放阅读框(ORF)中，构建成酿酒酵母NrK1重组展示表达载体NrK1/pHBM-368-pgk，NrK1即含有SEQID NO：1氨基酸序列的酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶，SEQ ID NO：1氨基酸序列通过酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶体外突变获得，基因片段即以flo1的编码DNA片段和NrK1编码DNA片段为模板，以P1和P4为扩增引物，PCR扩增可获得编码flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA片段，步骤二、酿酒酵母工程细胞酶的制备：将酿酒酵母絮凝素锚定蛋白flo1和烟酰胺核苷激酶(NRK)串联形成融合蛋白，合成该融合蛋白的编码基因，将该基因定向插入步骤一中酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk中以pgk为启动子的开放阅读框(ORF)中，经载体的线性化和电转化，将目的基因导入酿酒酵母INVSc，目的蛋白表达后并向酵母细胞外分泌，通过凝素锚定蛋白flo1成功展示于酿酒酵母细胞壁表面，形成具有催化功能的全酿酒酵母工程细胞酶，步骤三、全细胞催化剂制备：以步骤一中备用的NrK1突变体中氨基酸序列(SEQ ID N0：1)为基础按照酿酒酵母偏爱密码子设计成为NrK1的编码DNA序列，将此DNA序列通过一段柔性连接肽(GGGGS)的编码DNA序列连接在酿酒酵母絮凝素flo1锚定蛋白编码DNA的下游，形成flo1-NrK1的完整编码DNA序列，并在该基因下游添加组氨酸标签(His-Tag)编码序列，采取全基因合成的方式合成flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA，将目的编码DNA定向插入酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk中以pgk为启动子的开放阅读框(ORF)中，经载体的线性化和电转化，使目的基因导入酿酒酵母INVSc(His-、Leu-、Trp-、Ura-)，以Sc平板对重组转化子进行初筛，3-4天后可得到酿酒酵母的阳性转化子，转化子再经YPD平板活化，接种YPD液体培养基扩大培养，收集酵母细胞，用FITC标记的抗His-Tag抗体进行免疫荧光染色，通过荧光倒置显微镜观察细胞的荧光强度，进一步筛选出高效表面展示NrK1的重组酵母细胞，对高效表面展示NrK1的重组酵母细胞进行高密度发酵，收集发酵细胞，真空冷冻干燥，制备成全细胞催化剂，步骤四、酵母转化和重组子的筛选：将步骤二中制得的展示表达载体NrK1/pHBM-368-pgk用Hpa I酶切线性化，电转化酿酒酵母INVSc(His-、Leu-、Trp-、Ura-)，转化后的酵母细胞铺于Sc平板，培养3-4天，因INVSc为营养缺陷型，在不含Ura的培养基上不能生长，但载体NrK1/pHBM-368-pgk带有Ura的合成基因，因而只有导入并稳定整合重组载体的酵母细胞才能在Sc培养基上生长，挑选Sc生长的单个菌落，用Sc液体培养基(0.67％YNB、2％葡萄糖、0.01％氨基酸(His，Trp，Leu))扩大培养，离心收集细胞，做进一步的鉴定和筛选，Sc平板由0.67％YNB、2％葡萄糖、0.01％氨基酸(His，Trp，Leu)和2％琼脂粉混合制得，步骤五、高效表面展示NrK1的酿酒酵母的筛选：将步骤一中制备的NrK1的羧基端带有组氨酸标签His-Tag，可采用免疫荧光方法进一步筛选高效表面展示NrK1的酿酒酵母细胞，收集上述扩大培养的酿酒酵母细胞，取106个细胞，重悬于200mL Buffer A，并搅拌混匀离心后，弃上清，再200mL Buffer B洗涤一次，离心后去上清，将细胞重悬于50μL含FITC标记抗His-Tag单抗(1∶1000稀释)的Buffer B中避光静置，然后转至室温内避光静置1h，再进行离心处理，弃上清后，1×PBS洗2次，重悬细胞于200μl1×PBS中，并且通过使用荧光倒置显微镜观察细胞荧光和流式细胞术挑选荧光强度最大的酿酒酵母菌株作为全酵母工程细胞酶备用，Buffer A即l×PBS、0.5％BSA和1mmoL/L EDTA混合制得，Buffer B有1×PBS和0.5％BSA混合制得，离心时温度均控制为4℃，离心时使用离心机转速均为4000rpm/min，离心时间均为2min，避光静置时温度为4℃，避光静置时间为30min，步骤六、全酵母工程细胞酶的活力检测：将步骤六中筛选高效展示NrK1酶的酵母工程细胞接种200mL的YPD液体培养基，进行摇瓶发酵培养，收集细胞，1×PBS洗细胞3次，真空冷冻干燥保存，作为全酵母工程细胞酶，该酶可在Mg2+和ATP存在条件下，一步转化烟酰胺核苷(NR)为烟酰胺单核苷酸(NMN)，反应体系为：1×PBS(pH 7.4)、50mM ATP、10mM MgCl2、50mM烟酰胺核苷(NR)、20mg/ml全酵母工程细胞酶，于20、30、40、50、60℃，20rpm/min摇动反应4h，4000rpm/min离心5min，取上清进行HPLC分析，通过标准品对照，对生成的NMN进行定量和定性分析，按照国际酶单位(IU)定义，即1min催化形成1μmol NMN的酶量为一个国际单位(IU)，计算全酵母工程细胞酶的比活力，根据反应体系中NMN的生产量计算转化率，摇瓶发酵培养温度为28℃，摇瓶发酵培养摇速为200rpm/min，摇瓶发酵培养时间为48h，步骤七、全酵母工程细胞酶的再使用：待步骤六中反应结束后，将整个反应体系置于离心管进行离心处理，收集酵母工程细胞，重新配制上述反应体系，将收获的酵母工程细胞加入体系中，于40℃、20rpm/min摇动反应4h，收集上清，HPLC检测NMN的生产量，计算酶的活力和转换率，按此方法再重复使用酶4次，分别计算出该酶每次重复使用时的活力和转化率，离心管使用转速为4000rpm/min，离心管离心时间为5min。

具体的，烟酰胺核苷激酶全酵母细胞是内部含NrK1/pHBM-368-pgk表达载体和酿酒酵母菌株INVSc的酿酒酵母

本发明所述的全酵母工程细胞酶包含的酿酒酵母烟酰胺核苷激酶(NrK1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)如下：

本发明所述的全酵母工程细胞酶包含的酿酒酵母烟酰胺核苷激酶(NrK1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)如下：

本发明全酵母工程细胞酶的活力检测实验结果如图4所示，该酶在20、30、40、50、60℃的比活力分别为27IU/g、48IU/g、65IU/g、26IU/g(酵母细胞干重)，在60℃无法测得全细胞酶的活性，可能是温度过高出现酶蛋白的变性。反应4h可分别生成20.4mM、36.3mM、49.2mM、19.7mM的NMN，对应的转化率分别为40.7％、72.5％、98.3％、39.4％。说明该酶最适反应温度可能在40℃左右，在体外能够高效催化NR转变为NMN，适合工业化的生产。

本发明全酵母工程细胞酶的再使用结果如图5所示，该酶重复使用5次的比活力分别为：64IU/g、62IU/g、59IU/g、49IU/g、35IU/g，对应的转化率分别为96.7％、94.8％、92.2％、86.1％、59.2％，说明该酶在连续4次使用活力变化不大，使用4次后酶的活力才有显著的下降，但这种活力下降可以通过增加反应时间进行补偿。该酶这种特性明显优于游离酶，不需酶的分离纯化，便于与反应产物分离，可反复使用。

通过以上实验结果能够进一步说明本发明能够安全、高效的进行实际生产使用，且可多次重复进行生产原料的使用，进而有效减少实际成本的投入。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1、酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶重组展示表达载体的构建：根据NrK1突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)设计NrK1的编码DNA序列，密码子采用酿酒酵母的偏爱密码子，以全基因合成的方式合成NrK1的编码DNA(SEQ ID NO：2)，并克隆至载体pMD-18T，形成携带NrK1编码基因的重组载体pMD-18T/NrK1，该载体转化大肠杆菌Top10，进行质粒的扩增和保存，通过Genebank查阅酿酒酵母絮凝素锚定蛋白f1ol编码DNA序列，全合成该基因并克隆至载体pMD-18T，形成携带flol编码基因的重组载体pMD-18T/flol，该载体转化大肠杆菌Top10，进行质粒的扩增和保存，并且设计引物Pl、P2、P3、P4，其中P1、P2以载体pMD-18T/flol为模板扩增flol的编码基因，在Pl上带有Not I的酶切位点，P2上则带有连接肽GGGGS五个氨基酸的编码序列，P3、P4以pMD-18T/NrK1扩增NrK1编码基因，P2和P3有18bp的重叠区，P4上带有组氨酸标签His-Tag的编码序列和Xba I酶切位点，通过PCR扩增，可分别获得flol的编码DNA片段和NrK1编码DNA片段，由于P2和P3有18bp的重叠区，采用重叠PCR的方法可以将两个片段组装成一个基因片段，用Not I/Xba I双酶切将基因片段和载体pHBM368-pgk，DNA连接反应将flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA片段定向插入到该载体启动子pgk控制下的开放阅读框(ORF)中，构建成酿酒酵母NrK1重组展示表达载体NrK1/pHBM-368-pgk；

S2、酿酒酵母工程细胞酶的制备：将酿酒酵母絮凝素锚定蛋白flo1和烟酰胺核苷激酶(NRK)串联形成融合蛋白，合成该融合蛋白的编码基因，将该基因定向插入S1中酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk中以pgk为启动子的开放阅读框(ORF)中，经载体的线性化和电转化，将目的基因导入酿酒酵母INVSc，目的蛋白表达后并向酵母细胞外分泌，通过凝素锚定蛋白flo1成功展示于酿酒酵母细胞壁表面，形成具有催化功能的全酿酒酵母工程细胞酶；

S3、全细胞催化剂制备：以S1中备用的NrK1突变体中氨基酸序列(SEQ ID N0：1)为基础按照酿酒酵母偏爱密码子设计成为NrK1的编码DNA序列，将此DNA序列通过一段柔性连接肽(GGGGS)的编码DNA序列连接在酿酒酵母絮凝素flol锚定蛋白编码DNA的下游，形成flo1-NrK1的完整编码DNA序列，并在该基因下游添加组氨酸标签(His-Tag)编码序列，采取全基因合成的方式合成flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA，将目的编码DNA定向插入酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk中以pgk为启动子的开放阅读框(0RF)中，经载体的线性化和电转化，使目的基因导入酿酒酵母INVSc(His-、Leu-、Trp-、Ura-)，以Sc平板对重组转化子进行初筛，3-4天后可得到酿酒酵母的阳性转化子，转化子再经YPD平板活化，接种YPD液体培养基扩大培养，收集酵母细胞，用FITC标记的抗His-Tag抗体进行免疫荧光染色，通过荧光倒置显微镜观察细胞的荧光强度，进一步筛选出高效表面展示NrK1的重组酵母细胞，对高效表面展示NrK1的重组酵母细胞进行高密度发酵，收集发酵细胞，真空冷冻干燥，制备成全细胞催化剂；

S4、酵母转化和重组子的筛选：将S2中制得的展示表达载体NrK1/pHBM-368-pgk用HpaI酶切线性化，电转化酿酒酵母INVSc(His-、Leu-、Trp-、Ura-)，转化后的酵母细胞铺于Sc平板，培养3-4天，因INVSc为营养缺陷型，在不含Ura的培养基上不能生长，但载体NrK1/pHBM-368-pgk带有Ura的合成基因，因而只有导入并稳定整合重组载体的酵母细胞才能在Sc培养基上生长，挑选Sc生长的单个菌落，用Sc液体培养基(0.67％YNB、2％葡萄糖、0.01％氨基酸(His，Trp，Leu))扩大培养，离心收集细胞，做进一步的鉴定和筛选；

S5、高效表面展示NrK1的酿酒酵母的筛选：将S1中制备的NrK1的羧基端带有组氨酸标签His-Tag，可采用免疫荧光方法进一步筛选高效表面展示NrK1的酿酒酵母细胞，收集上述扩大培养的酿酒酵母细胞，取106个细胞，重悬于200mL Buffer A，并搅拌混匀离心后，弃上清，再200mL Buffer B洗涤一次，离心后去上清，将细胞重悬于50μL含FITC标记抗His-Tag单抗(1∶1000稀释)的Buffer B中避光静置，然后转至室温内避光静置1h，再进行离心处理，弃上清后，1×PBS洗2次，重悬细胞于200μl1×PBS中，并且通过使用荧光倒置显微镜观察细胞荧光和流式细胞术挑选荧光强度最大的酿酒酵母菌株作为全酵母工程细胞酶备用；

S6、全酵母工程细胞酶的活力检测：将S6中筛选高效展示NrK1酶的酵母工程细胞接种200mL的YPD液体培养基，进行摇瓶发酵培养，收集细胞，1×PBS洗细胞3次，真空冷冻干燥保存，作为全酵母工程细胞酶，该酶可在Mg2+和ATP存在条件下，一步转化烟酰胺核苷(NR)为烟酰胺单核苷酸(NMN)，反应体系为：1×PBS(pH 7.4)、50mM ATP、10mM MgCl2、50mM烟酰胺核苷(NR)、20mg/ml全酵母工程细胞酶，于20、30、40、50、60℃，20rpm/min摇动反应4h，4000rpm/min离心5min，取上清进行HPLC分析，通过标准品对照，对生成的NMN进行定量和定性分析，按照国际酶单位(IU)定义，即1min催化形成1μmol NMN的酶量为一个国际单位(IU)，计算全酵母工程细胞酶的比活力，根据反应体系中NMN的生产量计算转化率；

S7、全酵母工程细胞酶的再使用：待S6中反应结束后，将整个反应体系置于离心管进行离心处理，收集酵母工程细胞，重新配制上述反应体系，将收获的酵母工程细胞加入体系中，于40℃、20rpm/min摇动反应4h，收集上清，HPLC检测NMN的生产量，计算酶的活力和转换率，按此方法再重复使用酶4次，分别计算出该酶每次重复使用时的活力和转化率。

2.根据权利要求1所述的烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，根据S1中操作步骤，所述NrK1即含有SEQ ID NO：1氨基酸序列的酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶，所述SEQ ID NO：1氨基酸序列通过酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶体外突变获得。

3.根据权利要求1所述的烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，根据S1中操作步骤，所述基因片段即以f1o1的编码DNA片段和NrK1编码DNA片段为模板，以P1和P4为扩增引物，PCR扩增可获得编码flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA片段。

4.根据权利要求1所述的烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，根据S4中操作步骤，所述Sc平板由0.67％YNB、2％葡萄糖、0.01％氨基酸(His，Trp，Leu)和2％琼脂粉混合制得。

5.根据权利要求1所述的一种烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，根据S5中操作步骤，所述Buffer A即1×PBS、0.5％BSA和1mmoL/L EDTA混合制得，所述Buffer B有1×PBS和0.5％BSA混合制得。

6.根据权利要求1所述的烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，根据S5中操作步骤，所述离心时温度均控制为4℃，所述离心时使用离心机转速均为4000rpm/min，所述离心时间均为2min。

7.根据权利要求1所述的烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，根据S5中操作步骤，所述避光静置时温度为4℃，所述避光静置时间为30min。

8.根据权利要求1所述的烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，根据S6中操作步骤，所述摇瓶发酵培养温度为28℃，所述摇瓶发酵培养摇速为200rpm/min，所述摇瓶发酵培养时间为48h。

9.根据权利要求1所述的烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，根据S7中操作步骤，所述离心管使用转速为4000rpm/min，所述离心管离心时间为5min。

10.烟酰胺核苷激酶全酵母细胞，其特征在于，使用了根据权利要求1-9中任意一项所述的烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，包括烟酰胺核苷激酶全酵母细胞。

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