CN115109770B - 苯甲醛裂解酶突变体及在制备1，4-二羟基-2-丁酮中的应用 - Google Patents

苯甲醛裂解酶突变体及在制备1，4-二羟基-2-丁酮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种苯甲醛裂解酶突变体及其在1，4‑二羟基‑2‑丁酮合成中的应用，具体地，所述苯甲醛裂解酶的野生型来源于Herbiconiux sp.SALV‑R1，经定点突变获得与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变的突变蛋白，其具有显著提高催化3‑羟基丙醛和甲醛的活性，转化底物的浓度可以到达700 mM。

Description

苯甲醛裂解酶突变体及在制备1，4-二羟基-2-丁酮中的应用
技术领域
本发明涉及酶工程和生物技术领域，具体涉及苯甲醛裂解酶突变体及其在制备1，4-二羟基-2-丁酮中的应用。
背景技术
1，4-二羟基-2-丁酮是一种重要的天然产物和药物分子中间体，利用该化合物可以获得手性氨基醇和多羟基醇等，它们在功能性食品、医药、药物和合成化学方面都具有巨大的应用潜力。目前该化合物主要是利用化学法合成，但是化学催化合成不仅产率不高，而且金属催化剂的价格昂贵，难以工业化生产，此外，化学合成反应条件苛刻(Chung,K.etal.Chemoselective Pd-catalyzed oxidation of polyols:synthetic scope andmechanistic studies.JAm Chem Soc 135,7593-7602；De Crisci,A.G.,Chung,K.,Oliver,A.G.,Solis-Ibarra,D.&Waymouth,R.M.Chemoselective Oxidation of Polyolswith Chiral Palladium Catalysts.Organometallics 32,2257-2266)。
而生物催化不仅价格低廉，可重复使用，还具有环境友好的特性。Christine Guérard-Hélaine等人利用醛缩酶实现了丙酮醇和甲醛的缩合反应，获得目标产物1，4-二羟基-2-丁酮，但是该方法所需底物丙酮醇的合成比较困难，而且产物浓度较低难以工业化利用(Guérard-Hélaine,C.et al.Genome Mining for Innovative Biocatalysts:NewDihydroxyacetone Aldolases for the Chemist’s Toolbox.ChemCatChem 7,1871-1879)。因此寻找高效合成1，4-二羟基-2-丁酮的生物催化酶试剂十分必要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种通过基因工程手段改造后的苯甲醛裂解酶突变体，具体地，改造后的苯甲醛裂解酶突变体合成1，4-二羟基-2-丁酮的活力显著提高。
首先，本发明提供一种苯甲醛裂解酶突变体，所述的苯甲醛裂解酶突变蛋白与SEQID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，且所述突变蛋白具有合成1，4-二羟基-2-丁酮的活力显著提高。
优选地，本发明提供的苯甲醛裂解酶突变体是在对应于SEQ ID NO.1的第1-558位点氨基酸中的位点27，29，417和476在内的一个或多个位点突变的苯甲醛裂解酶突变体：
在另一优选例中，所述的第27位丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)，优选异亮氨酸(I)。
在另一优选例中，所述的第29位缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)、组氨酸(H)，优选异亮氨酸(I)。
在另一优选例中，第417位甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)，优选丝氨酸(S)。
在另一优选例中，第476位丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)、亮氨酸(L)和酪氨酸(Y)，优选亮氨酸(L)。
更具体的是下述组合突变：第27位突变为异亮氨酸(I)且第29位突变为异亮氨酸(I)；第417位突变为丝氨酸(S)且第476位突变为亮氨酸(L)。
本发明还提供上述突变体的编码基因。进一步提供含所述基因的表达载体、重组细胞。
本发明还提供苯甲醛裂解酶突变体或其编码基因在制备1，4-二羟基-2-丁酮中的应用。
本发明由此提供一种制备1，4-二羟基-2-丁酮化合物的方法，其特征在于，以表达所述苯甲醛裂解酶突变体为催化剂，以3-羟基丙醛和甲醛为底物，进行催化反应得到(反应式1)：
在一个具体实施方式中，所述催化反应以表达所述苯甲醛裂解酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以3-羟基丙醛和甲醛为底物，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在25℃-50℃条件下进行反应。
在更优选的实施方式中，所述反应中，反应体系中的催化底物浓度为50-800mM，更佳地，底物浓度为200-700mM；反应体系含有菌体量为10-150g/L，更佳地，30-70g/L；反应体系的pH为6.0-9.0，最佳为7.0；反应温度为25℃-50℃，最佳为30℃。
具体的反应体中加入焦磷酸硫胺素(ThDP)，MgSO4，且在150rpm-250rpm的条件下反应，反应时间为5-25小时。更优选地，加入0.1mMThDP，2.5mM MgSO4，于30℃，200rpm的摇床上反应，反应12h。
本发明的苯甲醛裂解酶突变体，催化获得的1，4-二羟基-2-丁酮的转化率≥70％，较佳地，≥90％，更佳地，≥96％；远高于野生型苯甲醛裂解酶的转化率。
附图说明
图1突变体M4转化3-羟基丙醛和甲醛缩合后反应衍生后的液相谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。其中，如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“A27I”表示第27位的丙氨酸A突变为异亮氨酸I，以此类推。
在本发明的优选实施方式中，本发明的苯甲醛裂解酶突变体的制备方法如下：大肠杆菌为表达宿主。
具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)苯甲醛裂解酶相应突变位点的基因构建到pET-21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。(3)将工程菌株接种至LB培养基中，37℃培养6h，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，25℃培养6-12h。(4)离心收集菌体。
实施例1:苯甲醛裂解酶突变体的构建和培养
将苯甲醛裂解酶的野生型来源于Herbiconiux sp.SALV-R1，如SEQ ID NO.1所示为其氨基酸序列，对应的核苷酸序列SEQ ID NO.2。将所述核苷酸序列进行全合成并克隆到pET-21a载体的限制性内切酶位点NdeI和XhoI间，得到重组质粒pET-21a-HeBAL，进一步转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coliBL21(DE3)/pET-21a-HeBAL。
以与HeBAL序列同源性为56％的蛋白(PDB ID：2AG0)为模板，通过同源建模获得HeBAL的模拟蛋白结构，选择其底物结合口袋内非保守残基分别进行饱和突变，采用简并密码子NNK设计突变引物，以pET21a-HeBAL作为模板。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量活力筛选，筛选方法为红四氮唑显色法。
建库突变的位点分别为G26，A27和H28，设计引物(引物序列见表1)，采用两步PCR的方法构建突变体，高保真聚合酶FastPfu-DNA进行PCR。PCR反应条件如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入5μL 10×Pfubuffer，5μLdNTP(2mM)，2μLMgSO4(25mM)，模板20～100ng，一对突变引物各1μL(10μM)，1μLPfu聚合酶，加灭菌蒸馏水至50μL。小片段PCR反应程序：(1)95℃预变性2min，(2)95℃变性20sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸12sec，(5)72℃终延伸5min,步骤(2)～(4)共进行20～30个循环。大片段PCR反应程序：(1)95℃预变性2min，(2)95℃变性20sec，(3)60℃退火50sec，(4)72℃延伸4min，(5)72℃终延伸5min,步骤(2)～(4)共进行20～30个循环。之后4℃保存PCR产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后，加入限制性内切酶DpnI在37℃消化2h。将消化产物转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有氨苄抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。挑取单克隆进行测序，测序正确即获得相应突变体。利用红四氮唑显色法进行突变体库的筛选，具体方法如下：在50mg/mL湿菌体中添加含20mM 3-HPA，60mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP的100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，反应体积为400μL，反应体系于30℃反应20min。之后菌体离心取上清液100μL添加40μL红四氮唑(0.2％溶于甲醇)和20μL NaOH(3M)，利用酶标仪检测485nm处的吸光值，若酶活相对较高，则吸光值较大。通过筛选获得酶活力提高的有益突变位点为27，突变体M1(A27I)，蛋白序列如SEQ ID NO.3所示；以M1为模板，建立多个饱和突变位点分别为I24,N25,G26,H28,V29,D30,L71,T72,A73,G74,G76,L111,Q112,D390,G391,A392,L393,T394,Y395,L396,L416,G417,S418,M419,G420,A473,W474,G475,A476,T477,L478,H479和A480，通过筛选获得活力进一步提高的突变位点29，417和476，其中活性最高的是417位突变体M2(A27I/G417S)，蛋白序列如SEQ ID NO.4示；然后以M2为模板，选取位点29构建三点的组合突变体库，获得活力进一步提升的突变体M3(A27I/V29I/G417S)，蛋白序列如SEQ ID NO.5所示；最后以M3为模板，选取476位点构建四点的组合突变体库，获得活力进一步提升的突变体M4(A27I/V29I/G417S/A476L)，蛋白序列如SEQ ID NO.6所示(具体数据如表2所示)。
表1突变位点的引物序列
表2相关突变体筛选结果
实施例2：苯甲醛裂解酶突变体的诱导表达
将上述突变体的基因工程菌的单菌落分别接入4mL含有氨苄抗生素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中，于37℃，200rpm摇床中培养过夜，即为种子液。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到50mL含有氨苄抗生素的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-1.0左右，加入0.5mM的IPTG，并置于25℃，200rpm诱导8～12h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体。用磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)重悬菌体，并用超声或者高压匀浆机破碎，4℃，12000rpm条件下离心留取上清液(粗酶液)，进行后续的SDS-PAGE及酶活检测。
实施例3：苯甲醛裂解酶酶活检测
测定反应的具体方法是：3-HPA浓度20mM，甲醛浓度60mM，2.5mM MgSO4，0.1mMThDP，粗酶液20μL，100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)补齐至200μL，反应体系于30℃反应20min。之后添加40μL红四氮唑(0.2％溶于甲醇)和20μL NaOH(3M)，利用酶标仪检测485nm处的吸光值。若酶活相对较高，则吸光值较大。1U表示每分钟内催化1微摩尔(μmol)底物转化为产物所需的酶量。
表3突变体动力学参数测定
实施例4：苯甲醛裂解酶反应条件优化
苯甲醛裂解酶及其突变体M4(50mg/mL)，将300mM 3-HPA，300mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0，100mM)，总反应体积为1mL。分别于25℃，30℃,37℃，45℃，200rpm的摇床上反应24h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。
表4苯甲醛裂解酶最适反应温度情况
苯甲醛裂解酶及其突变体M4(50mg/mL)，将300mM 3-HPA，300mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入不同磷酸钾缓冲溶液中(pH 6.5，pH7.0，pH7.5，pH 8.5，100mM)，总反应体积为1mL。分别于30℃，200rpm的摇床上反应24h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。
表5苯甲醛裂解酶最适反应pH情况
实施例5：苯甲醛酶突变体催化合成1，4-二羟基-2-丁酮
将活力较高的突变体M1,M2,M3,M4氨基酸序列为SEQ ID NO.3-6，分别按照实施例2培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以菌体作为生物催化剂。
利用苯甲醛裂解酶突变体M1(100mg/mL)，将50mM 3-HPA，50mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0，100mM)，总反应体积为200mL于30℃,200rpm的摇床上反应24h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯甲醛裂解酶突变体M1催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为85.2％。
利用苯甲醛裂解酶突变体M2(100mg/mL)，将100mM 3-HPA，100mM甲醛，2.5mMMgSO4和0.1mM ThDP加入磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0，100mM)，总反应体积为200mL于30℃，200rpm的摇床上反应24h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯甲醛裂解酶突变体M1催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为89.8％。
利用苯甲醛裂解酶突变体M3(50mg/mL)，将200mM 3-HPA，200mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0，100mM)，总反应体积为200mL于30℃,200rpm的摇床上反应12h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯甲醛裂解酶突变体M1催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为76.4％。
利用苯甲醛裂解酶突变体M3(100mg/mL)，将200mM 3-HPA，200mM甲醛，2.5mMMgSO4和0.1mM ThDP加入磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0，100mM)，总反应体积为200mL于30℃,200rpm的摇床上反应24h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯甲醛裂解酶突变体M1催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为91.7％。
利用苯甲醛裂解酶突变体M4(50mg/mL)，将300mM 3-HPA，300mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0，100mM)，总反应体积为200mL于30℃,200rpm的摇床上反应12h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯甲醛裂解酶突变体M1催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为93.4％。
利用苯甲醛裂解酶突变体M4(50mg/mL)，将400mM 3-HPA，400mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0，100mM)，总反应体积为200mL于30℃，200rpm的摇床上反应24h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯甲醛裂解酶突变体M1催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为96.7％。
利用苯甲醛裂解酶突变体M4(100mg/mL)，将700mM 3-HPA，700mM甲醛，2.5mMMgSO4和0.1mM ThDP加入磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0，100mM)，总反应体积为200mL于30℃,200rpm的摇床上反应24h。将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯甲醛裂解酶突变体M1催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为91.7％。
综上所示，苯甲醛裂解酶突变体(100mg/mL)M1，M2和M3分别可以反应50mM，100mM和200mM的3-HPA,转化率可达85％以上；苯甲醛裂解酶突变体(100mg/mL)M4最高可以反应700mM 3-HPA，转化率为91.7％。
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<213>放线菌（Herbiconiux sp.）
<400> 2
ATGACCGCCACCGGTGGTGAACTGGTTATTCGTACCCTGGAACGCGCAAGCGTTGATGTTGCATTTGGCATTAATGGTGCCCATGTGGATAGTATCTATCAGGCAGCCCTGGATCGCAGCTTTCGTATTGTTGATACCCGCAATGAAATGAATGCAGGCCATGCAGCCGAAGGTTATGCACGTGCAGGTCATCGCCTGGGCGTGGCCCTGCTGACCGCAGGTGGTGGTTTTACCAATGCCGTTACCAGTATTGCAAATGCACATCTGGATCGCACCCCGGTTCTGTATATTGCAGCAAGTGGTCCGCTGGGCGTTGATGAAACCAATACCCTGCAGGCAGGTATTGATCAGGTGGCAATTGCCACCCCGATTACCAAATGGGCACATCGCGTGACCCGCGTGGAACTGCTGCCGCGTCTGATTGCCCAGGCAATTCGTATTGCAACCCATGGCCCGCGTGGTCCGGTGCTGCTGGATATTCCGTGGGATGTTCTGACCGCCACCGTTGATGATGCACTGGCAGATGGTGTGGAAGAACTGGGTGCACATGCCCTGACCGCAGCCCTGGGCGCTGATGCAGTTGAACGTATTCTGGATGGTCTGGCAGGTGCAGAACGCCCGGTGTTTATTGCCGGTAGTGAACTGACCCGCGGTGACGGCGGTGCCGCATTACGTCGCCTGGCAGAAATTACCGGCACCCCGCTGTTTAGTGATACCGAAGCCCTGGGCGCCATTCGCGAAAGCCCGCTGAGTTTTGGCCTGCTGCAGGGTCTGTTTGGTCTGGATGAAGCCGAACGTCCGGATCGCGTGGTGCTGTTTGGTTTACGTTTTGGCCTGGCCACCGCACATGGCAGTGGTATTCTGATTCCGCGTGATGCAGCAGTGGTTCAGATTGATAGTGATGCCCGCGAACTGGGTCGTCTGCAGCCGATTGAACTGGGTGCCGTTGGCGATCCGGCAGCCGCTGCTGAAGAACTGGCACGTGCAGCACTGACCTGGGCAGCAGGCTGGCCGGATCGTAGCCGCTGGCAGGAACGTCTGCGCGAACTGGTGGATGGTCGCTTTGAAAGTGTTACCGCACAGGCAGTGCGTGATGATCGTATTCATCCGATGGATGCAGTGACCGCAATTGCCGAAACCGTTCCGGCAGGCAGTGTTGTTGTGGCCGATGGTGCACTGACCTATCTGTGGCTGAGCGAAACCATTAGCCGCGCACCGGTTGCAGATTATCTGTGTCATGGTTATCTGGGCAGTATGGGCGTTGGCGTTGGTACCGCACTGGGTGCCCAGGCAGCAGATGTGACCCGCCCGGTTGTTCTGGTGACCGGTGACGGTGCCGTTGGTTATAGTCTGGGCGAATTTGATAGCATGGTTCGTGCAGGTCTGCCGGTTGTGGTTGTGGTTCTGAATAATCGTGCATGGGGCGCCACCCTGCATGCCCAGGAACTGATTCTGGGTCCGGATCGCGTTGTTAATAATCGCCTGGAAAATGGCAGTTATAGTGGTGTTGCCCGCGCCCTGGGCGCAGATAGTATTGATGTTAGCGATATTGCAGATCTGGCCCCGACCCTGCGCGAAGCACTGGCAAGCGGCCGTCCGACCTGCATTGAAGTTCATGTGAGTCTGGCACCGGTTCCGCCGGAAGAAAATGTTATTATGGGTGGTAAACCGTTT 1674
<210> 3
<211>558
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
MTATGGELVIRTLERASVDVAFGINGIHVDSIYQAALDRSFRIVDTRNEMNAGHAAEGYARAGHRLGVALLTAGGGFTNAVTSIANAHLDRTPVLYIAASGPLGVDETNTLQAGIDQVAIATPITKWAHRVTRVELLPRLIAQAIRIATHGPRGPVLLDIPWDVLTATVDDALADGVEELGAHALTAALGADAVERILDGLAGAERPVFIAGSELTRGDGGAALRRLAEITGTPLFSDTEALGAIRESPLSFGLLQGLFGLDEAERPDRVVLFGLRFGLATAHGSGILIPRDAAVVQIDSDARELGRLQPIELGAVGDPAAAAEELARAALTWAAGWPDRSRWQERLRELVDGRFESVTAQAVRDDRIHPMDAVTAIAETVPAGSVVVADGALTYLWLSETISRAPVADYLCHGYLGSMGVGVGTALGAQAADVTRPVVLVTGDGAVGYSLGEFDSMVRAGLPVVVVVLNNRAWGATLHAQELILGPDRVVNNRLENGSYSGVARALGADSIDVSDIADLAPTLREALASGRPTCIEVHVSLAPVPPEENVIMGGKPF 558
<210> 4
<211>558
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 4
MTATGGELVIRTLERASVDVAFGINGIHVDSIYQAALDRSFRIVDTRNEMNAGHAAEGYARAGHRLGVALLTAGGGFTNAVTSIANAHLDRTPVLYIAASGPLGVDETNTLQAGIDQVAIATPITKWAHRVTRVELLPRLIAQAIRIATHGPRGPVLLDIPWDVLTATVDDALADGVEELGAHALTAALGADAVERILDGLAGAERPVFIAGSELTRGDGGAALRRLAEITGTPLFSDTEALGAIRESPLSFGLLQGLFGLDEAERPDRVVLFGLRFGLATAHGSGILIPRDAAVVQIDSDARELGRLQPIELGAVGDPAAAAEELARAALTWAAGWPDRSRWQERLRELVDGRFESVTAQAVRDDRIHPMDAVTAIAETVPAGSVVVADGALTYLWLSETISRAPVADYLCHGYLSSMGVGVGTALGAQAADVTRPVVLVTGDGAVGYSLGEFDSMVRAGLPVVVVVLNNRAWGATLHAQELILGPDRVVNNRLENGSYSGVARALGADSIDVSDIADLAPTLREALASGRPTCIEVHVSLAPVPPEENVIMGGKPF 558
<210> 5
<211>558
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 5
MTATGGELVIRTLERASVDVAFGINGIHIDSIYQAALDRSFRIVDTRNEMNAGHAAEGYARAGHRLGVALLTAGGGFTNAVTSIANAHLDRTPVLYIAASGPLGVDETNTLQAGIDQVAIATPITKWAHRVTRVELLPRLIAQAIRIATHGPRGPVLLDIPWDVLTATVDDALADGVEELGAHALTAALGADAVERILDGLAGAERPVFIAGSELTRGDGGAALRRLAEITGTPLFSDTEALGAIRESPLSFGLLQGLFGLDEAERPDRVVLFGLRFGLATAHGSGILIPRDAAVVQIDSDARELGRLQPIELGAVGDPAAAAEELARAALTWAAGWPDRSRWQERLRELVDGRFESVTAQAVRDDRIHPMDAVTAIAETVPAGSVVVADGALTYLWLSETISRAPVADYLCHGYLSSMGVGVGTALGAQAADVTRPVVLVTGDGAVGYSLGEFDSMVRAGLPVVVVVLNNRAWGATLHAQELILGPDRVVNNRLENGSYSGVARALGADSIDVSDIADLAPTLREALASGRPTCIEVHVSLAPVPPEENVIMGGKPF 558
<210> 6
<211>558
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 6
MTATGGELVIRTLERASVDVAFGINGIHIDSIYQAALDRSFRIVDTRNEMNAGHAAEGYARAGHRLGVALLTAGGGFTNAVTSIANAHLDRTPVLYIAASGPLGVDETNTLQAGIDQVAIATPITKWAHRVTRVELLPRLIAQAIRIATHGPRGPVLLDIPWDVLTATVDDALADGVEELGAHALTAALGADAVERILDGLAGAERPVFIAGSELTRGDGGAALRRLAEITGTPLFSDTEALGAIRESPLSFGLLQGLFGLDEAERPDRVVLFGLRFGLATAHGSGILIPRDAAVVQIDSDARELGRLQPIELGAVGDPAAAAEELARAALTWAAGWPDRSRWQERLRELVDGRFESVTAQAVRDDRIHPMDAVTAIAETVPAGSVVVADGALTYLWLSETISRAPVADYLCHGYLSSMGVGVGTALGAQAADVTRPVVLVTGDGAVGYSLGEFDSMVRAGLPVVVVVLNNRAWGLTLHAQELILGPDRVVNNRLENGSYSGVARALGADSIDVSDIADLAPTLREALASGRPTCIEVHVSLAPVPPEENVIMGGKPF 558

Claims (11)

1.苯甲醛裂解酶突变体，其特征在于，是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，存在下述突变：A27I、A27I/Y395S、A27I/G417V、A27I/G417L、A27I/G417S、A27I/V29H、A27I /A476Y、A27I/ A476L、A27I/G417S/V29I、A27I/G417S/Y395P、A27I/G417S/Y395K、A27I/G417S/Y395T、A27I/G417S/Y395F、A27I/G417S/Y395A、A27I/G417S/Y395S、A27I/G417S/V29I/A476L。
2.如权利要求1所述的苯甲醛裂解酶突变体的编码基因。
3.含有如权利要求1所述的苯甲醛裂解酶突变体的编码基因的表达载体。
4.含有如权利要求1所述的苯甲醛裂解酶突变体的编码基因的重组细胞。
5.如权利要求1所述的苯甲醛裂解酶突变体，或如权利要求2所述的苯甲醛裂解酶突变体的编码基因在制备1，4-二羟基-2-丁酮化合物中的应用。
6.一种制备1，4-二羟基-2-丁酮化合物的方法，其特征在于，以如权利要求1所述苯甲醛裂解酶突变体为催化剂，以3-羟基丙醛和甲醛为底物，进行催化反应得到。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，以表达如权利要求2所述苯甲醛裂解酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以3-羟基丙醛和甲醛为底物，以pH为7.0-7.5的缓冲液作为反应介质，在25℃-37℃条件下进行催化反应。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述催化反应中，反应体系中的催化底物浓度为50-800 mM；反应体系含有菌体量为10-150 g/L；反应体系的pH为7.0-7.5；反应温度为25℃-37℃。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述催化反应中，反应体系中的催化底物浓度为200-700 mM；反应体系含有菌体量为30-70 g/L；反应体系的pH为7.0；反应温度为30℃。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在反应体系中加入ThDP，MgSO4，且在150 rpm-250 rpm的条件下反应，反应时间为5-25h。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在反应体系中加入0.1 mM ThDP，2.5 mMMgSO4，于30℃，200 rpm的摇床上反应12h。
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