CN110438169A - 一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种全细胞催化合成1‑羟基‑2‑丁酮的方法,属于生物工程技术领域。本发明通过对甲醛裂合482氨基酸的定点饱和突变,构建突变库,筛选获得一株含甲醛裂合酶FLS的工程菌株。以该菌株为全细胞,以甲醛、正丙醛为原料,全细胞催化合成1‑羟基‑2‑丁酮。该菌株能够将1分子的甲醛和1分子的丙醛在甲醛裂合酶的作用下生成1‑羟基‑2‑丁酮。该方法只需一步即能完成1‑羟基‑2‑丁酮的合成,且反应条件温和原料广泛易得,成本低廉。

Description

一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法。
背景技术
1-羟基-2-丁酮(1-hydroxy-2-butanon) 作为一种药物中间体,用于合成抗结核药物乙胺丁醇。
目前文献报道的1-羟基-2-丁酮的合成方法主要是化学合成法。化学法制备是比较经典的方法。FASF公司曾以1,2-丁二醇为原料1,2-丁,在碳酸钙(CaCO3)存下,加2%氧化铬(CrO3)和1%碳酸镍(NiCO3)作催化剂条件下, 200℃高温在固定床反应器内制得1-羟基-2-丁酮,收率为40%。即使改变条件,采用CuO作催化剂,在180℃反应,收率为45%。杨志贤等报道了以1,2-丁二醇为底物,经氧化剂溴酸钾在溴氢酸催化作用下,在室温及较短时间的反应时间内,利用自然自然光源和人造光源照射,高选择性氧化制备1-羟基-2-丁酮,其转化率大于90%。
甲醛裂合酶(FLS)最初自华盛顿大学的研究人员通过改造苯甲醛烈合酶,使其具有甲醛催化能力而得,可将三分子甲醛催化生成一分子1,3-二羟基丙酮(DHA),研究者将其命名为FLS。
目前,1-羟基-2-丁酮的合成方法主要是化学合成法,还未有报道以甲醛、正丙醛为原料,利用含甲醛裂合酶的工程菌进行生物合成。本发明通过含甲醛裂合酶(FLS)的工程菌株利用甲醛、丙醛为原料生物合成1-羟基-2-丁酮。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法。该方法利用含甲醛裂合酶(FLS)的工程菌株,以甲醛、丙醛为原料生物合成1-羟基-2-丁酮。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法:利用含甲醛裂合酶(FLS)的工程菌株,以甲醛、丙醛为原料,全细胞催化生物合成1-羟基-2-丁酮。
一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法,具体包括以下步骤:
(1)突变位点的确定:在RCSB数据库中下载PDB号为4QPZ的甲醛裂合酶(FLS)蛋白结构pdb 文件,分析甲醛裂合酶氨基酸的保守性,预测“热点”氨基酸残基,找到其底物通道和活性中心周围热点突变位点,随后进行定点突变;确定突变位点为482氨基酸。
(2)定点饱和突变库的构建:在NCBI数据库中筛选得到野生型甲醛裂合酶基因(GenBank:AY007242.1),并委托通用(安徽)生物公司进行基因合成。合成野生型甲醛裂合酶(FLS)基因全长序列并将其克隆至大肠杆菌表达载体pET28a,重组质粒命名为pET28a-FLS;设计引物,以质粒pET28a-FLS为模板进行PCR扩增,获得突变热点的上下游片段;通过无缝拼接试剂盒将突变热点的上下游片段和线性化载体进行无缝拼接,得到的重组质粒转化至大肠杆菌中,得到克隆子,对其每个克隆进行筛选验证,即可得到有益突变克隆子,最终通过测序和酶活验证,最终确定有益突变菌株。
(3)筛选有益突变体:基于益突变菌株全细胞催化结合纳氏显色反应,建立高效灵敏的筛选催化效率提高的甲醛裂合酶的方法;
(4)全细胞催化合成1-羟基-2丁酮:步骤(3)筛选获得的益突变体,制备全细胞,以甲醛、正丙醛为底物,合成1-羟基-2丁酮。
上述步骤(2)中所述野生型甲醛裂合酶(FLS)基因全长序列,其核苷酸序列为:SEQID NO. 1。
上述步骤(2)中所述引物为: 根据同源重组的原则设计了以下28aFLS-F/FLS482-R及FLS482-F/28aFLS-R两对引物,其核苷酸序列为:
28aFLS-F:5’-GACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCGATGATTACAGGC-3’
FLS482-R:5’-CAATTGCTGGAAATGNNKTGTCCACCCCCAGCTTTGG-3’
FLS482-F:5’-CCAAAGCTGGGGGTGGACANNKCATTTCCAGCAATTG-3’
28aFLS-R:5’-TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATGCGAAGGGGTCCAT-3’
上述步骤(2)中以 28aFLS-F/FLS482-R用于扩增包括突变热点在内的目的基因上游片段SEQ ID NO. 2,以FLS482-F/28aFLS-R扩增目的基因下游片段SEQ ID NO. 3。
上述步骤(3)中基于益突变菌株全细胞催化结合纳氏显色反应,建立高效灵敏的筛选催化效率提高的甲醛裂合酶的方法具体为:
(1)有益突变菌株全细胞的制备方法为:挑取克隆至带有硫酸卡那霉素(Kan)的新鲜LB培养基中,37℃、180 rpm过夜培养后,按1% (v/v)的接种量转接至50mL带有硫酸卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中,置于37℃摇床,180 rpm培养至OD600为0.6~0.9,加入终浓度为0.5mmol/L 的IPTG,置于18℃、180 rpm摇床诱导表达24 h;诱导表达完成后,收集菌体,菌体离心(4℃,5000 rpm,5 min)、洗涤后(0.85%预冷的生理盐水重悬浮菌体2次)作为全细胞。
(2)有益突变菌株全细胞催化条件为:于1.5 mL离心管中配置1 mL的催化体系,100mM 磷酸钾缓冲液(pH=8),0.1mM TPP,0.1mM MgSO4,底物甲醛、正丙醛浓度各50mM,全细胞菌体40g/L,反应温度30℃,转速200 rpm,催化时间为6 h。催化结束后,取反应液,12000rpm,离心5min,取上清,利用纳氏反应测定反应液中剩余甲醛浓度,构建高产有益突变库。
上述步骤(4)中所述步骤(3)筛选获得的有益突变体,制备全细胞,以甲醛、正丙醛为底物,合成1-羟基-2丁酮的具体方法为:
(1)全细胞的制备方法为:将高产有益突变株接种至带有硫酸卡那霉素(Kan)的新鲜LB培养基中,37℃、180 rpm过夜培养后,按1% (v/v)的接种量转接至50mL带有硫酸卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中,置于37℃摇床,180 rpm培养至OD600为0.6~0.9,加入终浓度为0.5mmol/L 的IPTG,置于18℃、180 rpm摇床诱导表达24 h。诱导表达完成后,收集菌体,菌体离心(4℃,5000 rpm,5 min)、洗涤后(0.85%预冷的生理盐水重悬浮菌体2次)作为全细胞。
(2)全细胞催化条件为:于1.5 mL离心管中配置1 mL的催化体系,100mM 磷酸钾缓冲液(pH=8),0.1mM TPP,0.1mM MgSO4,底物甲醛、正丙醛各浓度50 mM,全细胞菌体40g/L,反应温度30℃,转速200 rpm,催化时间为6 h;催化结束后,取反应液,12000 rpm,离心5min,取上清,经过乙酸乙酯萃取后,用气相色谱法(GC)测定反应液中1-羟基-2丁酮的浓度。
一种上述方法制备获得的含甲醛裂合酶FLS的工程菌株,所述工程菌株其分类命名为:Escherichia coli BL21/pET28a-FLS-L482E,其甲醛裂合酶氨基酸序列482号位点由亮氨酸突变为谷氨酸,该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏时间为:2019年4月11日,保藏编为:CCTCC NO:M2019250,保藏地址为:中国.武汉.武汉大学。
上述含甲醛裂合酶FLS的工程菌株在以甲醛、正丙醛为原料,全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮中的应用。
本发明的优点在于:
提供了一种生物合成1-羟基2丁酮的方法。能够将1分子的甲醛和1分子的正丙醛在甲醛裂合酶(formolase,FLS)的作用下生成1-羟基-2-丁酮。该方法只需一步即可完成合成。该反应具有反应条件温和原料广泛易得且原料价格低。
附图说明:
图1预测“突变热点”氨基酸残基三维结构图。
图2 Bl21/pET28a-FLS全菌体催化气相色谱图。
图3气相色谱质谱联用(GC-MS)结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不仅限于此。
实施例1甲醛裂合酶饱和突变位点的确定
HotSpot Wizard 2.0分析FLS突变“热点”位点
首先在RCSB数据库中下载PDB号为4QPZ的甲醛裂合酶(FLS)蛋白结构 pdb 文件,利用HotSpot Wizard 2.0 服务器(http://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/) 分析氨基酸的保守性,预测“热点”氨基酸残基,找到其底物通道和活性中心周围热点突变位点,随后进行定点突变。 确定突变位点为482位氨基酸残基。预测“突变热点”氨基酸残基三维结构图见图1。
实施例2定点饱和突变库的构建
(1)基于PCR的定点饱和突变
基于PCR的定点饱和突变方法是在确定的突变位点处设计兼并引物对目的基因进行扩增以获取突变子。兼并引物对应的密码子设计成NNK。
具体步骤为:
(1)在NCBI数据库中筛选得到野生型甲醛裂合酶基因(GenBank:AY007242.1),并委托通用(安徽)生物公司进行基因合成,并将其克隆至大肠杆菌表达载体pET28a,重组质粒命名为pET28a-FLS。
(2)通过在引物的5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列,使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列的原则,设计28aFLS-F/FLS482-R及FLS482-F/28aFLS-R两对引物,以质粒pET28a-FLS为模板进行PCR扩增,扩增得到目的基因的上游半段和下游半段。
其中以28aFLS-F:5’-GACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCGATGATTACAGGC-3’,
FLS482-R:5’-CAATTGCTGGAAATGNNKTGTCCACCCCCAGCTTTGG-3’用于扩增包括突变热点在内的目的基因上游片段(SEQ ID NO. 2,1446bp),以FLS-R FLS482-F:5’-CCAAAGCTGGGGGTGGACANNKCATTTCCAGCAATTG-3’,28aFLS-R:5’-TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATGCGAAGGGGTCCAT-3’扩增目的基因下游片段(SEQ ID NO. 3,片段长246bp)。
因为引物FLS482-R和FLS482-F存在19bp完全互补的碱基序列,28aFLS-F/28aFLS-R引物两段存在15bp和pET28a载体完全互补,且引入中带有酶切位点,因此可通过HieffClone® Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆试剂盒将突变热点的上下游片段和线性化载体进行无缝拼接,得到的重组质粒转化至大肠杆菌中,得到若干克隆子(大于100个),对其每个克隆进行筛选验证,即可得到有益突变克隆子,最终通过测序和酶活验证,最终确定有益突变菌株。
基于上述PCR的定点饱和突变原理,构建482位点氨基酸饱和突变,构建饱和突变库。
(2)全细胞催化筛选有益突变体
基于全细胞催化结合纳氏显色反应,建立高效灵敏的筛选催化效率提高的甲醛裂合酶的方法。
益突变菌株全细胞的制备方法为:挑取克隆至带有相应抗生素的新鲜LB培养基中,37℃、180 rpm过夜培养后,按1% (v/v)的接种量转接至50mL带有硫酸卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中,置于37℃摇床,180 rpm培养至OD600为0.6~0.9,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,置于18℃、180 rpm摇床诱导表达24 h。诱导表达完成后,收集菌体,菌体离心(4℃,5000 rpm,5 min)、洗涤后(0.85%预冷的生理盐水重悬浮菌体2次)作为全细胞。
益突变菌株全细胞催化条件为:于1.5 mL离心管中配置1 mL的催化体系,100mM磷酸钾缓冲液(pH=8),0.1mM TPP,0.1mM MgSO4,底物甲醛、正丙醛各50mM,全细胞菌体40g/L,反应温度30℃,转速200 rpm,催化时间为6 h。催化结束后,取反应液,12000 rpm,离心5min,取上清,利用纳氏反应测定反应液中剩余甲醛浓度,构建高产有益突变库。
在以PCR定点饱和突变原理构建的氨基酸482位点饱和突变库中,基于全细胞催化结合纳氏显色反应,对高产菌株进行筛选。结果表明,在482位点突变位点中的突变库中,共有3个突变株的转化效率得到提高,相较于野生型菌株转化效率超过200%。最后通过测序,测定其突变结果,氨基酸序列第482位点从亮氨酸(L, Leu)突变为苏氨酸(T, Thr)、丝氨酸(S, Ser)、谷氨酸(E, Glu)。
实施例3全细胞催化合成1-羟基-2丁酮
全细胞的制备方法为:将高产有益突变菌株接种于带有硫酸卡那霉素(Kan)的新鲜LB培养基中,37℃、180 rpm过夜培养后,按1% (v/v)的接种量转接至50mL带有硫酸卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中,置于37℃摇床,180 rpm培养至OD600为0.6~0.9,加入终浓度为0.5mmol/L 的IPTG,置于18℃、180 rpm摇床诱导表达24 h。诱导表达完成后,收集菌体,菌体离心(4℃,5000 rpm,5 min)、洗涤后(0.85%预冷的生理盐水重悬浮菌体2次)作为全细胞。
全细胞催化条件为:于1.5 mL离心管中配置1 mL的催化体系,100mM 磷酸钾缓冲液(pH=8),0.1mM TPP,0.1mM MgSO4,底物甲醛、正丙醛各浓度50 mM,全细胞菌体40g/L, 反应温度30℃,转速200 rpm,催化时间为6 h;催化结束后,取反应液,12000 rpm,离心5min,取上清,经过乙酸乙酯萃取后,用气相色谱法(GC)测定反应液中1-羟基-2丁酮的浓度。
基于全细胞催化筛选得到的高转化率菌株,采用全菌体催化结合气相色谱检测,检测1-羟基-2-丁酮的产生情况。结果表明,在3株高产菌株中有三株具有催化甲醛、丙醛缩合生成1-羟基-2-丁酮的能力,气相结果图2所示,出现新的产物峰。通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS), 对标品(1-羟基-2-丁酮)和目标峰进行定性分析,结果见图2及表2。从结果中确认其为目标产物1-羟基-2-丁酮。
其中三株具有催化能力的菌株中,且FLS-L482E(氨基酸序列482号位点亮氨酸(L,Leu)突变为谷氨酸(E, Glu))菌株具有最高的转化效率,且转化率能够达到85%。
表1 BL21/pET28a-FLS-L482E催化结果表
该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,其分类命名为:Escherichia coli BL21/pET28a-FLS-L482E,保藏时间为:2019年4月11日,保藏编为:CCTCC NO:M2019250,保藏地址为:中国.武汉.武汉大学。
表2 FLS-L482E全菌体催化产物质谱表
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法
<130> 7
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1692
<212> DNA
<213> SEQ ID NO. 1
<400> 1
atggcgatga ttacaggcgg cgaactggtt gttcgcaccc taataaaggc tggggtcgaa 60
catctgttcg gcctgcacgg cattcatatc gatacgattt ttcaagcctg tctcgatcat 120
gatgtgccga tcatcgacac ccgccatgag gccgccgcag ggcatgcggc cgagggctat 180
gcccgcgctg gcgccaagct gggcgtggcg ctggtcacgg cgggcggggg atttaccaat 240
gcggtcacgc ccattgccaa cgctcgtacc gatcgcacgc cggtgctctt cctcaccgga 300
tcgggcgcgc tgcgtgatga tgaaaccaac acgttgcagg cggggattga tcaggtcgcc 360
atggcggcgc ccattaccaa atgggcgcat cgggtgatgg caaccgagca tatcccacgg 420
ctggtgatgc aggcgatccg cgccgcgttg agcgcgccac gcgggccggt gttgctggat 480
ctgccgtggg atattctgat gaaccagatt gatgaggata gcgtcattat ccccgatctg 540
gtcttgtccg cgcatggggc ccatcccgac cctgccgatc tggatcaggc tctcgcgctt 600
ttgcgcaagg cggagcggcc ggtcatcgtg ctcggctcag aagcctcgcg gacagcgcgc 660
aagacggcgc ttagcgcctt cgtggcggcg actggcgtgc cggtgtttgc cgattatgaa 720
gggctaagca tgctctcggg gctgcccgat gctatgcggg gcgggctggt gcaaaacctc 780
tattcttttg ccaaagccga tgccgcgcca gatctcgtgc tgatgctggg ggcgcgcttt 840
ggccttaaca ccgggcatgg atctgggcag ttgatccccc atagcgcgca ggtcattcag 900
gtcgaccctg atgcctgcga gctgggacgc ctgcagggca tcgctctggg cattgtggcc 960
gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020
gatcgcggcg actggtgcgc caaagtgacg gatctggcgc aagagcgcta tgccagcatc 1080
gctgcgaaat cgagcagcga gcatgcgctc cacccctttc acgcctcgca ggtcattgcc 1140
aaacacgtcg atgcaggggt gacggtggta gcggatggtg gcctgaccta tctctggctg 1200
tccgaagtga tgagccgcgt gaaacccggc ggttttctct gccacggcta tctaaactcg 1260
atgggcgtgg gcttcggcac ggcgctgggc gcgcaagtgg ccgatcttga agcaggccgc 1320
cgcacgatcc ttgtgaccgg cgatggctcg gtgggctata gcatcggtga atttgatacg 1380
ctggtgcgca aacaattgcc gctgatcgtc atcatcatga acaaccaaag ctgggggtgg 1440
acattgcatt tccagcaatt ggccgtcggc cccaatcgcg tgacgggcac ccgtttggaa 1500
aatggctcct atcacggggt ggccgccgcc tttggcgcgg atggctatca tgtcgacagt 1560
gtggagagct tttctgcggc tctggcccaa gcgctcgccc ataatcgccc cgcctgcatc 1620
aatgtcgcgg tcgcgctcga tccgatcccg cccgaagaac tcattctgat cggcatggac 1680
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<211> 1446
<212> DNA
<213> SEQ ID NO. 2
<400> 2
atggcgatga ttacaggcgg cgaactggtt gttcgcaccc taataaaggc tggggtcgaa 60
catctgttcg gcctgcacgg cattcatatc gatacgattt ttcaagcctg tctcgatcat 120
gatgtgccga tcatcgacac ccgccatgag gccgccgcag ggcatgcggc cgagggctat 180
gcccgcgctg gcgccaagct gggcgtggcg ctggtcacgg cgggcggggg atttaccaat 240
gcggtcacgc ccattgccaa cgctcgtacc gatcgcacgc cggtgctctt cctcaccgga 300
tcgggcgcgc tgcgtgatga tgaaaccaac acgttgcagg cggggattga tcaggtcgcc 360
atggcggcgc ccattaccaa atgggcgcat cgggtgatgg caaccgagca tatcccacgg 420
ctggtgatgc aggcgatccg cgccgcgttg agcgcgccac gcgggccggt gttgctggat 480
ctgccgtggg atattctgat gaaccagatt gatgaggata gcgtcattat ccccgatctg 540
gtcttgtccg cgcatggggc ccatcccgac cctgccgatc tggatcaggc tctcgcgctt 600
ttgcgcaagg cggagcggcc ggtcatcgtg ctcggctcag aagcctcgcg gacagcgcgc 660
aagacggcgc ttagcgcctt cgtggcggcg actggcgtgc cggtgtttgc cgattatgaa 720
gggctaagca tgctctcggg gctgcccgat gctatgcggg gcgggctggt gcaaaacctc 780
tattcttttg ccaaagccga tgccgcgcca gatctcgtgc tgatgctggg ggcgcgcttt 840
ggccttaaca ccgggcatgg atctgggcag ttgatccccc atagcgcgca ggtcattcag 900
gtcgaccctg atgcctgcga gctgggacgc ctgcagggca tcgctctggg cattgtggcc 960
gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020
gatcgcggcg actggtgcgc caaagtgacg gatctggcgc aagagcgcta tgccagcatc 1080
gctgcgaaat cgagcagcga gcatgcgctc cacccctttc acgcctcgca ggtcattgcc 1140
aaacacgtcg atgcaggggt gacggtggta gcggatggtg gcctgaccta tctctggctg 1200
tccgaagtga tgagccgcgt gaaacccggc ggttttctct gccacggcta tctaaactcg 1260
atgggcgtgg gcttcggcac ggcgctgggc gcgcaagtgg ccgatcttga agcaggccgc 1320
cgcacgatcc ttgtgaccgg cgatggctcg gtgggctata gcatcggtga atttgatacg 1380
ctggtgcgca aacaattgcc gctgatcgtc atcatcatga acaaccaaag ctgggggtgg 1440
acattg 1446
<210> 3
<211> 246
<212> DNA
<213> SEQ ID NO. 3
<400> 3
catttccagc aattggccgt cggccccaat cgcgtgacgg gcacccgttt ggaaaatggc 60
tcctatcacg gggtggccgc cgcctttggc gcggatggct atcatgtcga cagtgtggag 120
agcttttctg cggctctggc ccaagcgctc gcccataatc gccccgcctg catcaatgtc 180
gcggtcgcgc tcgatccgat cccgcccgaa gaactcattc tgatcggcat ggaccccttc 240
gcatga 246
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 28aFLS-F
<400> 4
gacagcaaat gggtcgcgga tccatggcga tgattacagg c 41
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> FLS482-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
caattgctgg aaatgnnktg tccaccccca gctttgg 37
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> FLS482-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
ccaaagctgg gggtggacan nkcatttcca gcaattg 37
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 28aFLS-R
<400> 7
tgctcgagtg cggccgcaag ctttcatgcg aaggggtcca t 41

Claims (8)

1.一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法,其特征在于:利用含甲醛裂合酶FLS的工程菌株,以甲醛、丙醛为原料,全细胞催化生物合成1-羟基-2-丁酮。
2.根据权利要求1所述的一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法,其特征在于,所述含甲醛裂合酶FLS的工程菌株的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)突变位点的确定:在RCSB数据库中下载PDB号为4QPZ的甲醛裂合酶蛋白结构 pdb文件,分析甲醛裂合酶氨基酸的保守性,预测“热点”氨基酸残基,找到其底物通道和活性中心周围热点突变位点,随后进行定点突变;确定突变位点为482氨基酸;
(2)定点饱和突变库的构建:在NCBI数据库中筛选得到野生型甲醛裂合酶基因,合成野生型甲醛裂合酶基因全长序列并将其克隆至大肠杆菌表达载体pET28a,重组质粒命名为pET28a-FLS;设计引物,以质粒pET28a-FLS为模板进行PCR扩增,获得突变热点的上下游片段;通过无缝拼接试剂盒将突变热点的上下游片段和线性化载体进行无缝拼接,得到的重组质粒转化至大肠杆菌中,得到克隆子,对其每个克隆进行筛选验证,即可得到有益突变克隆子,最终通过测序和酶活验证,最终确定有益突变菌株;
(3)筛选有益突变体:基于有益突变菌株全细胞催化结合纳氏显色反应,建立高效灵敏的筛选催化效率提高的甲醛裂合酶的方法。
3.根据权利要求2所述的一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法,其特征在于:步骤(2)中所述野生型甲醛裂合酶基因全长序列,其核苷酸序列为:SEQ ID NO. 1。
4.根据权利要求2所述的一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法,其特征在于:步骤(2)中所述引物为: 根据同源重组的原则设计了以下28aFLS-F/FLS482-R及FLS482-F/28aFLS-R两对引物,其核苷酸序列为:
28aFLS-F:5’-GACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCGATGATTACAGGC-3’
FLS482-R:5’-CAATTGCTGGAAATGNNKTGTCCACCCCCAGCTTTGG-3’
FLS482-F:5’-CCAAAGCTGGGGGTGGACANNKCATTTCCAGCAATTG-3’
28aFLS-R:5’-TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATGCGAAGGGGTCCAT-3’;
以 28aFLS-F/FLS482-R用于扩增包括突变热点在内的目的基因上游片段SEQ ID NO.2,以FLS482-F/28aFLS-R扩增目的基因下游片段SEQ ID NO. 3。
5.根据权利要求2所述的一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法,其特征在于:步骤(3)中基于有益突变菌株全细胞催化结合纳氏显色反应,建立高效灵敏的筛选催化效率提高的甲醛裂合酶的方法,具体包括以下步骤:
(1)有益突变菌株全细胞的制备方法为:挑取克隆至带有硫酸卡那霉素的新鲜LB培养基中,37℃、180 rpm过夜培养后,按1% (v/v)的接种量转接至50mL带有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中,置于37℃摇床,180 rpm培养至OD600为0.6~0.9,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,置于18℃、180 rpm摇床诱导表达24 h;诱导表达完成后,收集菌体,菌体4℃,5000rpm离心5 min、0.85%预冷的生理盐水重悬浮菌体2次后作为全细胞;
(2)有益突变菌株全细胞催化条件为:于1.5 mL离心管中配置1 mL的催化体系,100mM磷酸钾缓冲液,pH=8,0.1mM TPP,0.1mM MgSO4,底物甲醛、正丙醛各50mM,全细胞菌体40g/L,反应温度30℃,转速200 rpm,催化时间为6 h;催化结束后,取反应液,12000 rpm,离心5min,取上清,利用纳氏反应测定反应液中剩余甲醛浓度,构建高产有益突变库。
6.根据权利要求1所述的一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法,其特征在于:所述以甲醛、丙醛为底物,全细胞催化生物合成1-羟基-2-丁酮的具体方法为:
(1)全细胞的制备方法为:将高产有益突变株接种于带有硫酸卡那霉素的新鲜LB培养基中,37℃、180 rpm过夜培养后,按1% (v/v)的接种量转接至50mL带有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中,置于37℃摇床,180 rpm培养至OD600为0.6~0.9,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,置于18℃、180 rpm摇床诱导表达24 h;诱导表达完成后,收集菌体,菌体4℃,5000rpm离心5 min、0.85%预冷的生理盐水重悬浮菌体2次作为全细胞;
(2)全细胞催化条件为:于1.5 mL离心管中配置1 mL的催化体系,100mM 磷酸钾缓冲液,pH=8,0.1mM TPP,0.1mM MgSO4,底物甲醛、丙醛各50 mM,全细胞菌体40g/L, 反应温度30℃,转速200 rpm,催化时间为6 h;催化结束后,取反应液,12000 rpm,离心5min,取上清,经过乙酸乙酯萃取后,用气相色谱法测定反应液中1-羟基-2丁酮的浓度。
7.一种权利要求2所述方法制备获得的含甲醛裂合酶FLS的工程菌株,其特征在于:所述工程菌株为 Escherichia coli BL21/pET28a-FLS-L482E,其甲醛裂合酶氨基酸序列482号位点由亮氨酸突变为谷氨酸,该菌株于2019年4月11日,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编为:CCTCC NO:M2019250。
8.如权利要求7所述含甲醛裂合酶FLS的工程菌株在以甲醛、丙醛为原料,全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮中的应用。
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