CN115838714A - 一种乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
一种乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115838714A CN115838714A CN202211560186.7A CN202211560186A CN115838714A CN 115838714 A CN115838714 A CN 115838714A CN 202211560186 A CN202211560186 A CN 202211560186A CN 115838714 A CN115838714 A CN 115838714A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acetaldehyde
- lyase
- fusion protein
- als
- elp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Natural products CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 270
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 title claims abstract description 152
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 title claims abstract description 150
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 119
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 119
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 10
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 91
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Natural products O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims abstract 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 16
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 7
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 19
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 8
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 8
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 103
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 103
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 41
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- 102220164886 rs113754532 Human genes 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 5
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 5
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- -1 salt ion Chemical class 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical group CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000013494 PH determination Methods 0.000 description 1
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012905 visible particle Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用，乙醛裂合酶的氨基酸序列为：将如SEQ ID No.1所示的野生型甲醛裂合酶第28位异亮氨酸突变为缬氨酸，第482位亮氨酸突变为谷氨酸。本发明提供的乙醛裂合酶可转化两分子乙醛生成乙偶姻，在生物法合成乙偶姻中具有工业应用潜力。本发明还通过将编码乙醛裂合酶的基因和类弹性蛋白多肽(ELPs)融合，在E.coli中诱导表达有效地提高了融合蛋白的可溶性表达，且通过利用ELPs标签进行两次ITC循环可获得纯度较高的重组酶，重组酶在催化过程中展现出更好的底物乙醛耐受性和催化效率。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
乙偶姻又名甲基乙酰甲醇，是一种重要的香精香料物质，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后会有令人愉悦的奶香气。乙偶姻广泛应用于食品、烟草、化妆品、植物、医药和化工领域。乙偶姻可以通过从含乙偶姻的植物中提取以及化学合成法和酶转化法制得。
野生型的甲醛裂合酶FLS具有催化乙醛合成乙偶姻的能力，但FLS酶可溶性表达低，包涵体高，大量纯化难度大，酶的稳定性较差，耐乙醛浓度低，催化乙醛效率不高。因此，对FLS酶进行改造，提高其催化效率和底物耐受性具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用，以解决现有FLS酶催化效率低，底物耐受性差的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种乙醛裂合酶，该乙醛裂合酶的氨基酸序列为：将如SEQ ID No.1所示的野生型甲醛裂合酶第28位异亮氨酸突变为缬氨酸，第482位亮氨酸突变为谷氨酸，即突变位点为I28V/L482E，乙醛裂合酶的具体氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
采用上述技术方案的有益效果为：本发明对SEQ ID No.1所示的野生型甲醛裂合酶进行改造，即将第28位异亮氨酸突变为缬氨酸，第482位亮氨酸突变为谷氨酸，突变后可提高酶的催化效果和对乙酸底物的耐受性。
一种乙醛裂合酶融合蛋白，包括乙醛裂合酶和类弹性蛋白ELP，其氨基酸序列如SEQ ID No.2。
采用上述技术方案的有益效果为：将突变后的酶和类弹性蛋白ELP结合，用类弹性蛋白ELP可改善突变酶的可溶性表达、稳定性、底物耐受性，同时利用类弹性蛋白ELP相变可实现酶的大规模纯化。
本发明还提供了上述乙醛裂合酶融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计突变引物，以携带乙醛裂合酶编码基因的载体为模板进行PCR扩增，得到含有乙醛裂合酶的基因片段；
(2)将质粒pET22b-xyl-ELPs进行双酶切得到线性化载体，然后与含有乙醛裂合酶的基因片段进行连接构建重组质粒；
(3)将重组质粒转化到感受态细胞中，得到阳性转化子，对阳性转化子进行诱导表达，并采用ITC循环方法进行纯化，获得乙醛裂合酶融合蛋白。
上述乙醛裂合酶或乙醛裂合酶融合蛋白在催化乙醛制备乙偶姻方面的应用。
采用上述乙醛裂合酶或乙醛裂合酶融合蛋白催化乙醛制备乙偶姻的方法，包括以下步骤：
向乙醛中加入乙醛裂合酶或乙醛裂合酶融合蛋白以及缓冲液进行催化反应，制备乙偶姻。
进一步地，乙醛浓度为0.5-2.5M，优选2M；乙醛和乙醛裂合酶或乙醛裂合酶融合蛋白的摩尔比为1:3-8×10-6。
进一步地，当加入乙醛裂合酶融合蛋白时，反应过程中pH为6-8，温度为20-50℃，反应时间为1-3h；优选pH为7，温度为30℃，反应时间为1h。
进一步地，当加入乙醛裂合酶时，反应过程中反应过程中pH为6-8，温度为20-50℃，反应时间为1-3h；优选pH为8，温度为30℃，反应时间为1h。
进一步地，反应体系中还包括辅酶，浓度为0.08-0.12mM；优选辅酶为TPP，浓度为0.1mM。
进一步地，反应体系中还包括金属离子，金属离子浓度为0.8-1.2mM；优选金属离子为Mg2+，浓度为1mM。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的乙醛裂合酶可转化两分子乙醛生成乙偶姻，在生物法合成乙偶姻中具有工业应用潜力。
乙醛裂合酶在诱导表达过程中会形成大量包涵体，导致获得可溶性蛋白的量比较少，造成酶纯化成本大幅提高，同时该酶在高底物浓度下的耐受性和催化效率不是很高，因此，本发明中还提供了提高乙醛裂合酶可溶性表达。简单纯化的方法，以提高该酶在高底物浓度下的耐受性和催化效率。
本发明通过将编码乙醛裂合酶的基因和类弹性蛋白多肽(ELPs)融合，在E.coli中诱导表达有效地提高了融合蛋白的可溶性表达，且通过利用ELPs标签进行两次ITC循环可获得纯度较高的重组酶，重组酶在催化过程中展现出更好的底物乙醛耐受性和催化效率。
附图说明
图1为乙偶姻的测定结果图。
图2为乙偶姻标准曲线图。
图3为乙醛裂合酶基因片段的扩增结果。
图4为重组质粒pET22b-als(I28V/L482E)-ELPs双酶切结果。
图5为乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP表达结果。
图6为乙醛裂合酶ALS的纯化结果。
图7为ITC循环中融合蛋白ALS-ELP的相变过程。
图8为基于ITC循环的融合蛋白ALS-ELP的纯化结果。
图9为乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的最适温度和最适pH结果。
图10为乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP在4℃下保藏的热稳定性。
图11为乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的pH稳定性。
图12为融合蛋白ALS-ELP的酶动力学曲线图。
图13为乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的乙醛耐受度。
图14为不同浓度乙醛加入至不同反应体系的变化结果。
图15为分批补料反应结果图。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：制备乙醛裂合酶
1、重组质粒pET22b-als-ELPs的构建
将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的野生型甲醛裂合酶(FLS)第28位异亮氨酸突变为缬氨酸，第482位亮氨酸突变为谷氨酸，即突变位点为I28V/L482E，突变后的酶为本发明提供的乙醛裂合酶，记为ALS。
需要说明的是，FLS酶最初是用来催化甲醛，该酶缩写的第一个字母“F”是甲醛的英文第一个字母，这也是本领域常用的一种命名方式，而本发明中用突变后的酶来催化乙醛，因此将酶缩写为ALS，这里的“A”是乙醛的英文第一个字母。
野生型甲醛裂合酶(FLS)的氨基酸序列如下所示(SEQ ID No.1)：MAMITGGELVVRTLIKAGVEHLFGLHGIHIDTIFQACLDHDVPIIDTRHEAAAGHAAEGYARAGAKLGVALVTAGGGFTNAVTPIANARTDRTPVLFLTGSGALRDDETNTLQAGIDQVAMAAPITKWAHRVMATEHIPRLVMQAIRAALSAPRGPVLLDLPWDILMNQIDEDSVIIPDLVLSAHGAHPDPADLDQALALLRKAERPVIVLGSEASRTARKTALSAFVAATGVPVFADYEGLSMLSGLPDAMRGGLVQNLYSFAKADAAPDLVLMLGARFGLNTGHGSGQLIPHSAQVIQVDPDACELGRLQGIALGIVADVGGTIEALAQATAQDAAWPDRGDWCAKVTDLAQERYASIAAKSSSEHALHPFHASQVIAKHVDAGVTVVADGGLTYLWLSEVMSRVKPGGFLCHGYLNSMGVGFGTALGAQVADLEAGRRTILVTGDGSVGYSIGEFDTLVRKQLPLIVIIMNNQSWGWTLHFQQLAVGPNRVTGTRLENGSYHGVAAAFGADGYHVDSVESFSAALAQALAHNRPACINVAVALDPIPPEELILIGMDPFA。
突变后形成的乙醛裂合酶的氨基酸序列如下所示(SEQ ID No.3)：
MAMITGGELVVRTLIKAGVEHLFGLHGVHIDTIFQACLDHDVPIIDTRHEAAAGHAAEGYARAGAKLGVALVTAGGGFTNAVTPIANARTDRTPVLFLTGSGALRDDETNTLQAGIDQVAMAAPITKWAHRVMATEHIPRLVMQAIRAALSAPRGPVLLDLPWDILMNQIDEDSVIIPDLVLSAHGAHPDPADLDQALALLRKAERPVIVLGSEASRTARKTALSAFVAATGVPVFADYEGLSMLSGLPDAMRGGLVQNLYSFAKADAAPDLVLMLGARFGLNTGHGSGQLIPHSAQVIQVDPDACELGRLQGIALGIVADVGGTIEALAQATAQDAAWPDRGDWCAKVTDLAQERYASIAAKSSSEHALHPFHASQVIAKHVDAGVTVVADGGLTYLWLSEVMSRVKPGGFLCHGYLNSMGVGFGTALGAQVADLEAGRRTILVTGDGSVGYSIGEFDTLVRKQLPLIVIIMNNQSWGWTEHFQQLAVGPNRVTGTRLENGSYHGVAAAFGADGYHVDSVESFSAALAQALAHNRPACINVAVALDPIPPEELILIGMDPFA。
以pET28a-als为模板，以als-F和als-R为引物进行PCR扩增得到乙醛裂合酶als基因片段，用Nde I和EcoR I双酶切质粒pET22b-xyl-ELPs得到线性化载体，胶回收PCR产物和酶切产物，使用同源重组试剂盒将基因片段和线性化载体进行连接，然后通过转化将连接产物转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到转化子。通过提取阳性转化子的重组质粒经过双酶切验证即可得到正确的重组质粒pET22b-als-ELPs。
引物als-F和als-R的核苷酸序列如下：
als-F：
5’-TAAGAAGGAGATATACATATGGCGATGATTACAGGCGGCGAAC-3’，下划线为酶切位点NdeI；
als-R：
5’-GAGCCGCTGGATCCGAATTCTGCGAAGGGGTCCATGCCGATC-3’，下划线为酶切位点EcoRI。
2、融合蛋白ALS-ELP的诱导表达
将重组质粒pET22b-als-ELPs通过转化转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-als-ELPs。挑取重组表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET22b-als-ELPs于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中过夜活化，按照1％(V/V)的接种量转接至含有100μg/mL氨苄青霉素的新鲜的LB培养基中，37℃、180rpm恒温摇床培养2-2.5h，培养至OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM IPTG，转移至18℃、180rpm恒温摇床诱导24小时，离心收集菌体，超声破碎后进行SDS-PAGE观察蛋白表达情况。
3、乙醛裂合酶ALS和基于ITC循环的融合蛋白ALS-ELP的纯化
(1)乙醛裂合酶ALS的纯化
pET28a作为表达载体时其表达的蛋白上含有6×His标签，乙醛裂合酶M1的纯化可以利用镍离子与6×His标签的特异性亲和作用，使用Ni-NTA填料来对目标蛋白进行纯化。纯化步骤如下：
①取用诱导完成的菌体，通过低温离心的方式将菌体收集到离心管中，弃去上清培养基，然后使用Lysis Buffer将菌体重悬后置于冰上进行超声破碎；
②破碎完成后将破碎液取出，于4℃，8000rpm，20min条件下离心，其上清即为粗酶液；
③将粗酶液加入至Lysis Buffer平衡的Ni-NTA柱中，置于混匀仪在4℃条件下混匀2h以上，以保证其标签与填料充分结合；
④结合完成后，加入10倍柱体积的Wash Buffer进行洗杂，去除非特异性蛋白；
⑤最后加入适量的Elution Buffer将目标蛋白从填料中洗脱下来，收集的洗脱液即为纯的目标蛋白。
纯化过程中所用的所有试剂如表1所示：
表1蛋白纯化过程中所用试剂
(2)基于ITC循环的融合蛋白ALS-ELP的纯化
ELPs类弹性蛋白具有可逆相变的特性，即当环境温度低于相变温度时，该蛋白可溶于水溶液；当环境温度高于相变温度或盐离子浓度较高时，ELPs类弹性蛋白疏水集团暴露发生聚集，自组装形成纳米大小的颗粒，从而不溶于水，成絮状析出。根据这一特性，可以通过控制体系的温度变化或者调整体系内盐离子浓度以达到快速将目标蛋白纯化的目的。
纯化步骤如下：
①取用诱导完成的菌体，通过低温离心的方式将菌体收集到离心管中，弃去上清培养基，然后使用磷酸缓冲液溶液(50mM PBS pH 8.0)重悬菌体置于冰上进行超声破碎；
②破碎完成后将破碎液取出，于4℃，8000rpm，20min条件下离心，其上清即为粗酶液；
③向粗酶液中加入终浓度为3M的NaCl，待NaCl完全溶解后在室温环境下静置15min以保证所有的融合蛋白ALS-ELP沉淀，然后在室温环境下8000rpm离心30min，弃上清，得到的沉淀即为融合蛋白ALS-ELP聚集体；
④使用预冷的PBS溶液将沉淀重悬，于冰上静置30min，此时大部分融合蛋白ALS-ELP重新溶于水相中，然后在4℃，8000rpm，20min条件下离心，去除沉淀，此时剩余的杂蛋白和一些已经变性的融合蛋白ALS-ELP存在于沉淀中；
按照上述步骤完整操作一次即为一轮ITC纯化，重复2～3轮ITC纯化步骤后即可得到较高纯度的目标蛋白。
融合蛋白ALS-ELP即乙醛裂合酶融合蛋白，其氨基酸序列如下所示(SEQ IDNo.2)：
MAMITGGELVVRTLIKAGVEHLFGLHGVHIDTIFQACLDHDVPIIDTRHEA
AAGHAAEGYARAGAKLGVALVTAGGGFTNAVTPIANARTDRTPVLFLTGS
GALRDDETNTLQAGIDQVAMAAPITKWAHRVMATEHIPRLVMQAIRAAL
SAPRGPVLLDLPWDILMNQIDEDSVIIPDLVLSAHGAHPDPADLDQALALL
RKAERPVIVLGSEASRTARKTALSAFVAATGVPVFADYEGLSMLSGLPDA
MRGGLVQNLYSFAKADAAPDLVLMLGARFGLNTGHGSGQLIPHSAQVIQ
VDPDACELGRLQGIALGIVADVGGTIEALAQATAQDAAWPDRGDWCAK
VTDLAQERYASIAAKSSSEHALHPFHASQVIAKHVDAGVTVVADGGLTYL
WLSEVMSRVKPGGFLCHGYLNSMGVGFGTALGAQVADLEAGRRTILVTG
DGSVGYSIGEFDTLVRKQLPLIVIIMNNQSWGWTEHFQQLAVGPNRVTGT
RLENGSYHGVAAAFGADGYHVDSVESFSAALAQALAHNRPACINVAVAL
DPIPPEELILIGMDPFAEFGSSGSGSGSGSGHGVGVPGKGVPGVGVPGVGV
PGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGVGVPGKGVPGVGVPG
VGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGVGVPGKGVPGVG
VPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGVGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGWP。
实施例2：乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP酶学测定
1、乙偶姻的测定
反应体系中乙偶姻的含量可以通过V-P反应进行测定，反应体系中若含有乙偶姻在经过V-P反应后会呈现粉红色，显色效果如图1所示(左边为空白对照，右边为乙偶姻)，显色完成后通过分光光度计在520nm波长下进行检测。通过配制不同浓度的乙偶姻标准溶液，测定其在V-P反应后在520nm波长下的吸收值，以乙偶姻标准溶液浓度为横坐标，520nm波长下的吸收值为纵坐标，即可获得乙偶姻标准曲线用于反应体系中乙偶姻含量的测定。
标准曲线的测定：
(1)配制100mg/L的乙偶姻标准溶液母液，按照表2将母液梯度稀释成不同浓度的标准溶液。
(2)按照表2配制V-P反应体系，充分混匀后在30℃下反应1h，测定其吸光值，记录数据并绘制标准曲线，乙偶姻标准曲线如图2所示。
表2不同浓度乙偶姻溶液配制
表3V-P显色反应体系
2、乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP酶活的测定
在50mM PBS pH 8.0缓冲液中，以100mM乙醛为底物，加入0.1mM辅酶TPP，1mM Mg2+，分别加入乙醛裂合酶ALS纯酶30μg和融合蛋白ALS-ELP纯酶39μg(乙醛裂合酶M1和融合蛋白ALS-ELP的分子量分别为59.1kDa和77.4kDa，根据分子量折算，两者等摩尔，摩尔数为5×10-4mM)，加入PBS缓冲液，反应体积为0.5mL，30℃下反应1h，按照上述测定乙偶姻的方法测定生成乙偶姻的浓度。
酶活力单位定义：每min生成1mM乙偶姻所需要的蛋白量。
3、乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP最适温度和最适pH的测定
最适温度的测定：分别取适量乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP纯酶液于50mMPBS pH 8.0缓冲液中，根据上述酶活测定方法分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃温度下测定其活性，定义最高酶活力值为100％，计算其温度下的相对酶活，绘制相对酶活随温度变化曲线。
最适pH的测定：配制不同pH的缓冲液(pH 6.0～8.0 50mM PBS缓冲液，pH 9.0～10.0甘氨酸-NaOH缓冲液)，分别取适量乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP纯酶液于缓冲液中，与底物和辅酶按上述比例混合，在对应pH和最适温度的条件下进行酶活的测定，定义最高酶活力值为100％，计算其温度下的相对酶活，绘制得到相对酶活随pH变化曲线。
4、乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP热稳定性和pH稳定性的测定
热稳定性的测定：将纯酶液分别置于不同温度(30～70℃)下孵育24h，在不同时间点取适量酶液，与底物和辅酶按上述比例混合，在各自的最适条件下进行酶活的测定，记最初的酶活为100％，计算其在不同温度和不同时间点的剩余酶活，绘制得到不同温度下两种酶剩余酶活随时间的变化曲线。
pH稳定性的测定：将纯酶液分别置于不同pH(6.0～10.0)缓冲体系中，在室温放置24h，在不同时间点取适量酶液，按上述方法进行酶活的测定，绘制得到不同pH条件下两种酶剩余酶活随时间的变化曲线。
5、乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP酶动力学参数的测定
以乙醛为底物，浓度范围为2mM到300mM，分别与30μg乙醛裂合酶ALS纯酶和39μg融合蛋白ALS-ELP纯酶(等摩尔数)在各自最适条件下反应1h后，通过V-P显色反应测定乙偶姻的产生量。基于乙偶姻的生成速率和对应的乙醛浓度，通过软件GraphPad Prism 5进行拟合得到Km与Vmax值，根据kcat＝Vmax/[Enzyme]，最后求得催化转换数kcat及催化效率常数kcat/Km。
6、乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP乙醛耐受度的测定
以高浓度乙醛为底物，浓度范围为0.5M到3M，分别与100μg乙醛裂合酶ALS粗酶和130μg融合蛋白ALS-ELP粗酶(等摩尔数)，在30℃，180rpm条件下震荡反应1h，每2h取样，测定其酶活，观察其在不同浓度下乙醛的转化率。
7、分批补料反应
对乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP进行补料反应以确定这些表达菌株中乙醛裂合酶突变体的催化能力。由于高浓度的乙醛对酶有毒性，容易引起酶解聚和变性，同时过高的底物浓度会造成底物抑制，导致催化反应的效率下降，因此，在最适底物浓度的条件进行补料可提高产物的产量。按照前期测定的各个突变体的乙醛耐受度，此次催化反应的乙醛浓度设置3个梯度，分别为1M、1.5M和2M。在催化反应过程中对乙偶姻的生成量进行实时检测，当乙醛的转化率达到90％以上开始进行补料，补料的浓度与初始乙醛浓度相同。催化反应至乙偶姻的生成量不再增加时，停止反应。催化反应中使用的乙醛裂合酶均为菌株破碎后的粗酶液，反应浓度为5mg/mL。具体的催化反应体系见表4。
表4补料反应反应体系
8、结果与分析
(1)重组质粒pET22b-als-ELPs的构建
以pET28a-als(I28V/L482E)为模板，以als-F和als-R为引物进行PCR扩增乙醛裂合酶基因片段als(I28V/L482E)，扩增结果如图3所示，其中在DNA Marker条带为2000bp的下方有一条明显的条带，符合目的基因片段als(I28V/L482E)的大小1692bp，证明扩增成功。通过观察琼脂糖凝胶电泳图可以看出PCR结果中出现杂带，因此，采用切胶回收的方式对基因片段进行回收。
将基因片段als(I28V/L482E)和线型化载体片段pET22b-ELPs通过同源重组的方法连接完成后，将连接产物转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到转化子，挑取阳性转化子进行活化培养14～16h后提取质粒，然后对重组质粒使用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证结果如图4所示，电泳图中出现三个条带，从上至下分别为线性化重组质粒(7726bp)，线性化载体片段(6034bp)和目的基因片段(1692bp)，条带大小符合实际大小，证明重组质粒pET22b-als(I28V/L482E)-ELPs构建成功。
(2)乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP表达情况的对比及其纯化结果
将质粒pET28a-als(I28V/L482E)和重组质粒pET22b-als(I28V/L482E)-ELPs分别转入至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到重组表达菌株，在IPTG的诱导下，乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP成功表达，然后通过SDS-PAGE电泳观察两个蛋白的表达情况，如图5所示。
两个蛋白大小分别为59.1kDa和77.4kDa，通过观察电泳图，明显看出在目的条带大小处均有明显的过量表达蛋白，证明目的蛋白成功表达。图5A中乙醛裂合酶ALS在上清液中占比与全菌体相比较低，即蛋白的可溶性表达较差，大部分表达的蛋白存在于包涵体中，而融合蛋白ALS-ELP(图5B)基本上存在于上清液当中，沉淀中基本没有条带。通过对比两者的蛋白表达情况，类弹性蛋白多肽ELPs与乙醛裂合酶ALS融合表达后大大提高了乙醛裂合酶的可溶性表达。
(3)乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的制备
乙醛裂合酶ALS的制备：在18℃条件下对乙醛裂合酶ALS进行大量的诱导，诱导完成后离心收集菌体，使用Lysis Buffer重悬菌体，进行超声破碎菌体细胞，通过离心收集上清液，然后利用6×His标签使用镍离子亲和层析的方法对乙醛裂合酶ALS进行纯化。纯化结果如图6所示，泳道1为纯化后乙醛裂合酶ALS，在目的蛋白59.1kDa处有明显条带，且无明显杂带。
融合蛋白ALS-ELP的制备：融合蛋白ALS-ELP诱导的条件与乙醛裂合酶ALS相同，在18℃下诱导24h后即可通过离心收集菌体，使用PBS缓冲液(pH 8.0)重悬菌体，通过超声破碎的方法收集菌体，离心收集上清液即为粗酶液。将收集的菌体利用ITC循环技术进行蛋白纯化，纯化过程中融合蛋白ALS-ELP的相变过程如图7所示，在加入终浓度为3M的NaCl时，由于溶液中离子强度升高，引起融合蛋白ALS-ELP相变，粗酶液立即由澄清透明变成浑浊的状态。在静置15min后，有大量絮状物出现，此时的融合蛋白中ELPs类弹性蛋白的疏水基团在高离子浓度下暴露发生聚集，自发组装形成微米级可见的颗粒，从而不溶于水相，呈絮状析出。
通过离心对絮状物进行收集，得到的沉淀即为融合蛋白ALS-ELP聚集体，此时的融合蛋白ALS-ELP中含有部分杂蛋白需要进一步纯化。使用预冷的PBS缓冲液将沉淀重悬，冰浴10min，融合蛋白ALS-ELP重新溶于水中，再次离心，得到的沉淀为不溶于水的杂蛋白，至此一轮ITC循环结束，经过2次ITC循环后，即可得到较纯的融合蛋白ALS-ELP。
基于ITC循环的融合蛋白ALS-ELP的纯化结果如图8所示，其中，泳道1为融合蛋白ALS-ELP上清粗酶液，在77.4kDa处有明显过量表达蛋白，说明融合蛋白ALS-ELP成功表达；泳道2为一次盐沉后经过离心后的上清弃去液，样品中基本没有目的蛋白条带，说明加入NaCl对融合蛋白进行盐沉可以将绝大部分融合蛋白沉淀下来；泳道3为再次通过PBS缓冲液重悬复溶的融合蛋白即一次ITC循环纯化蛋白，泳道4为离心后沉淀，即部分杂蛋白和完全变性的融合蛋白。通过观察泳道3的电泳条带，发现一次ITC循环纯化的蛋白纯度不够，杂蛋白较多；泳道5、6为二次ITC循环纯化结果，对比泳道4和6的电泳，剩余的杂蛋白在经过二次盐沉后，可以通过再次离心全部去除；泳道5中目的蛋白条带清晰，无明显杂带，此时得到的上清液即为纯的融合蛋白。通过对电泳结果的分析在经过两次ITC循环后即可得到纯度较高的融合蛋白ALS-ELP。
(4)乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的酶学性质
①乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的最适温度和最适pH
在30～70℃温度范围内测定乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的酶活力，以最高酶活力为100％酶活，结果如图9所示。两者的酶活在温度为30℃时最高，即乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的最适反应温度为30℃。从图9中可以观察到融合蛋白ALS-ELP在40℃时的酶活较乙醛裂合酶ALS高，但融合蛋白ALS-ELP在50℃时的酶活发生骤降，这主要是因为融合蛋白ALS-ELP中类弹性蛋白多肽ELPs会随温度的升高发生相变形成不溶性聚集体，导致反应中的传质速率下降，从而使得融合蛋白ALS-ELP的酶活低于该温度下的乙醛裂合酶ALS的酶活。
通过观察温度对乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP酶活力的影响，确定了两者的最适温度后，在各自的最适温度下进行pH对两者酶活力影响的测定。测定的结果如图9B所示。从图中可以看出乙醛裂合酶ALS在pH为8.0时酶活最高，而融合蛋白ALS-ELP在pH为7.0时酶活最高，所以乙醛裂合酶ALS的最适反应pH为8.0，融合蛋白ALS-ELP的最适反应pH为7.0，加入类弹性蛋白多肽ELPs后，最适反应pH呈中性，因此，在反应过程中可考虑直接用水作为溶剂。
②乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP保存稳定性比较
为了更好的测定两者的保存稳定性，测定酶的保存稳定性的保藏温度设置为4℃，其中融合蛋白由于其本身具有可逆相变的特性，拥有水相和固相两种状态，融合蛋白在4℃下的保藏形式可以分为两种，一种是溶于水的溶液型，另一种是聚集状态的沉淀型。因此，测定的样品共有3个，乙醛裂合酶ALS、融合蛋白ALS-ELP溶液型和融合蛋白ALS-ELP沉淀型，分别测定这3个样品在4℃下孵育不同时间后的剩余酶活，测定条件与上述方法一致，具体的结果如图10所示。乙醛裂合酶ALS在保藏2天后，剩余酶活仅有40％，在保藏时间达到7天后，基本完全失活，而融合蛋白ALS-ELP溶液型在保藏4天后剩余酶活才达到40％，在保藏时间达到18天时还有一定的酶活，说明在同样状态下保藏的乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP，后者的保存稳定性更高。在对融合蛋白ALS-ELP沉淀型的热稳定性测定中发现，在保藏时间达到8天时，其剩余酶活还有50％，直到保藏时间达到24天融合蛋白ALS-ELP沉淀型才完全失去酶活，说明在该状态下保藏的融合蛋白热稳定性得到了明显的提升。
对乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的pH稳定性进行测定，实验选择将两种酶的纯酶液分别置于不同pH(6.0～10.0)的缓冲溶液中在室温环境下进行孵育，在不同的时间点(0.5～24h)取适量粗酶液，在各自的最适条件下测定两者的剩余酶活，其结果如图11所示。乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP均是在pH为8.0时pH稳定性最高。随着孵育环境pH的下降或升高，两者的pH稳定性均有一定的下降。从图中可以明显观察到在pH为7.0和8.0时融合蛋白ALS-ELP的剩余酶活高于乙醛裂合酶ALS，在pH为8.0环境孵育24h后融合蛋白的剩余酶活可达50％，而乙醛裂合酶ALS的剩余酶活仅为10％。因此，与乙醛裂合酶ALS相比，融合蛋白ALS-ELP对不同pH环境的耐受性更强。
③融合蛋白ALS-ELP的酶动力学参数
通过对融合蛋白ALS-ELP表达菌株进行活化、转接、诱导、纯化得到融合蛋白纯酶，测定酶动力学参数如表5和图12所示。乙醛裂合酶ALS的Vmax和Kcat/Km值8.90U/mg和23.34s-1·M-1相比，融合蛋白ALS-ELP的Vmax和Kcat/Km值分别提高了3.42倍和6.54倍，从测定结果来看，类弹性蛋白多肽ELPs的加入在一定程度上改善了乙醛裂合酶的催化效率，提高了乙醛裂合酶在工厂化生产的利用价值，乙醛裂合酶ALS在融合ELPs后催化反应的Km值从375.55mM降低至210.39mM，说明ELPs的加入提高了乙醛裂合酶对底物的亲和性。
表5融合蛋白ALS-ELP的酶动力学参数
④乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的乙醛耐受度
乙醛是有机溶剂，具有一定的毒性，高浓度乙醛对酶蛋白结构会有一定的破坏性，导致酶的失活，而从成本上讲，工业生产又要求酶催化能在高底物浓度下进行，因此，酶对底物的耐受性是其能否应用于工业化生产的重要指标之一。
乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP的乙醛耐受度，其结果如图13所示。每个酶均选择3个时间点测定乙偶姻产量，图中每组柱状图左边3个柱为乙醛裂合酶ALS，右边3个柱为融合蛋白ALS-ELP。随着时间的增加，催化乙醛生成乙偶姻的产量也随之增加，在乙醛浓度达到2.5M时，乙偶姻的产量发生骤降，由此说明乙醛裂合酶ALS和融合蛋白ALS-ELP对乙醛耐受浓度最大可达2M。融合蛋白ALS-ELP对乙醛的转化率在乙醛浓度达到1.5M后高于乙醛裂合酶ALS；在乙醛浓度达到2M时，乙醛裂合酶ALS的乙醛转化率仅有70％，而融合蛋白ALS-ELP的乙醛转化率可达91.5％，说明融合蛋白ALS-ELP对乙醛的耐受度较高，类弹性蛋白多肽ELPs的加入有利于提高乙醛裂合酶的乙醛耐受性。
⑤分批补料反应
此次分批补料反应的起始乙醛浓度分别为1M、1.5M和2M，补料的时间为乙醛的转化率达到90％以上，补料的乙醛浓度与起始乙醛浓度一致。
将补料反应的催化反应体系提前配制完成后将三个浓度的乙醛分别加入至催化反应体系后，反应体系溶液的变化如图14所示，其中三个离心管分别代表加入的乙醛浓度，从左至右分别为1M、1.5M和2M。通过对离心管中粗酶液的状态进行观察，发现在高浓度乙醛加入至反应体系后，粗酶均有不同程度的变性。从粗酶的整体变化情况中，可以明显看出乙醛裂合酶ALS对乙醛的耐受度是最差的，加入1.5M浓度的乙醛后反应体系中乙醛裂合酶ALS粗酶很快变性，溶液变浑浊；通过将类弹性蛋白多肽ELPs与乙醛裂合酶融合表达后，乙醛耐受度有明显提升，在1.5M浓度的乙醛加入反应体系后融合蛋白ALS-ELP没有剧烈的变化，溶液微微浑浊，在加入2M浓度的乙醛后溶液才明显浑浊。
分批补料反应过程中的乙醇浓度以及补料时间如表6所示。对分批补料反应的乙偶姻浓度测定，具体结果见图15，图中实线为乙偶姻生成量的变化，虚线为乙醛含量的变化。从图中可以看出，补料反应能够明显提高酶催化反应生成乙偶姻的产量。经过补料反应，乙醛裂合酶ALS在乙醛浓度为2M的条件下进行补料反应时乙偶姻产量最高，产量为0.68M(60.67g/L)。融合蛋白ALS-ELP由于类弹性蛋白多肽ELPs的加入，提高了融合蛋白的乙醛耐受度，使其在乙醛浓度为2M的条件下进行补料反应时乙偶姻的产量达到了1.09M(95.75g/L)，是乙醛裂合酶ALS的1.58倍。因此，类弹性蛋白多肽ELPs的加入在一定程度上提高了乙醛裂合酶的工业化潜能。
表6补料的乙醛浓度及其补料时间
综上所述，本发明通过将类弹性蛋白多肽ELPs和乙醛裂合酶融合表达，大大提高了乙醛裂合酶的ALS可溶性表达，经过实验研究表明，ELPs的加入不仅没有对乙醛裂合酶的活性造成影响，而且还提高了其酶活和乙醛耐受度，通过补料反应，ELPs的加入还提高了乙醛裂合酶催化生产乙偶姻的量，在一定程度上提升了乙醛裂合酶的工业化潜能。此结果表明乙醛裂合酶加入ELPs是一种有效提高乙醛裂合酶可溶性表达的方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种乙醛裂合酶，其特征在于，所述乙醛裂合酶的氨基酸序列为：将如SEQ ID No.1所示的野生型甲醛裂合酶第28位异亮氨酸突变为缬氨酸，第482位亮氨酸突变为谷氨酸。
2.一种乙醛裂合酶融合蛋白，其特征在于，包括权利要求1所述的乙醛裂合酶以及类弹性蛋白ELP。
3.权利要求2所述的乙醛裂合酶融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计突变引物，以携带乙醛裂合酶编码基因的载体为模板进行PCR扩增，得到含有乙醛裂合酶的基因片段；
(2)将质粒进行双酶切得到线性化载体，然后与含有乙醛裂合酶的基因片段进行连接构建重组质粒；
(3)将重组质粒转化到感受态细胞中，得到阳性转化子，对阳性转化子进行诱导表达，并采用ITC循环方法进行纯化，获得乙醛裂合酶融合蛋白。
4.权利要求1所述的乙醛裂合酶或权利要求2所述的乙醛裂合酶融合蛋白在催化乙醛制备乙偶姻方面的应用。
5.采用权利要求权利要求1所述的乙醛裂合酶或权利要求2所述的乙醛裂合酶融合蛋白催化乙醛制备乙偶姻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向乙醛中加入乙醛裂合酶和缓冲液进行催化反应，制备乙偶姻。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，乙醛浓度为0.5-2.5M，乙醛和乙醛裂合酶或乙醛裂合酶融合蛋白的摩尔比为1:3-8×10-6。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应过程中pH为6-8，温度为20-50℃，反应时间为1-3h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当加入乙醛裂合酶融合蛋白时，pH为7，温度为30℃，反应时间为1h；当加入乙醛裂合酶时，pH为8，温度为30℃，反应时间为1h。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系中还包括辅酶，浓度为0.08-0.12mM。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系中还包括金属离子，金属离子浓度为0.8-1.2mM。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211560186.7A CN115838714A (zh) | 2022-12-07 | 2022-12-07 | 一种乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211560186.7A CN115838714A (zh) | 2022-12-07 | 2022-12-07 | 一种乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115838714A true CN115838714A (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=85578141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211560186.7A Pending CN115838714A (zh) | 2022-12-07 | 2022-12-07 | 一种乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115838714A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104017758A (zh) * | 2014-06-05 | 2014-09-03 | 江南大学 | 适度表达新型枯草芽孢杆菌nadh氧化酶高效发酵生产乙偶姻 |
| CN105331642A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-17 | 浙江汇宁生物科技有限公司 | 一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法 |
| WO2019124782A2 (ko) * | 2017-12-20 | 2019-06-27 | 건국대학교 산학협력단 | 에탄올에서 아세토인, 부탄디올 또는 부탄올의 생산방법 |
| CN110438169A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-12 | 福建农林大学 | 一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法 |
| CN113136377A (zh) * | 2020-01-19 | 2021-07-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用 |
| CN113151230A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-07-23 | 北京化工大学 | 一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用 |
-
2022
- 2022-12-07 CN CN202211560186.7A patent/CN115838714A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104017758A (zh) * | 2014-06-05 | 2014-09-03 | 江南大学 | 适度表达新型枯草芽孢杆菌nadh氧化酶高效发酵生产乙偶姻 |
| CN105331642A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-17 | 浙江汇宁生物科技有限公司 | 一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法 |
| WO2019124782A2 (ko) * | 2017-12-20 | 2019-06-27 | 건국대학교 산학협력단 | 에탄올에서 아세토인, 부탄디올 또는 부탄올의 생산방법 |
| CN110438169A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-12 | 福建农林大学 | 一种全细胞催化合成1-羟基-2-丁酮的方法 |
| CN113136377A (zh) * | 2020-01-19 | 2021-07-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用 |
| CN113151230A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-07-23 | 北京化工大学 | 一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KAI PENG等: "Synthesis of Ligustrazine from Acetaldehyde by a Combined Biological-Chemical Approach", 《ACS SYNTH BIOL》, vol. 9, no. 11, 6 November 2020 (2020-11-06), pages 2902 - 2908 * |
| 无: "Chain A, Formolase", GENBANK：PDB: 4QQ8_A, 1 December 2020 (2020-12-01) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109825484B (zh) | 玉米赤霉烯酮水解酶zhd101突变体及利用该突变体水解玉米赤霉烯酮的方法 | |
| CN110396513B (zh) | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 | |
| CN113151198B (zh) | 一种γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN110791494A (zh) | 一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用 | |
| CN113969290B (zh) | 一种深海细菌来源的α-葡萄糖苷酶QsGH97a及其编码基因与应用 | |
| CN111172142B (zh) | 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体 | |
| CN114525268B (zh) | 一种pH耐受性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸合成中的应用 | |
| CN112280755A (zh) | 一种突变酶及其应用和酶催化法制备三胜肽的工艺 | |
| CN111808829B (zh) | 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用 | |
| CN112646800A (zh) | 制备固定化酶或固定化蛋白质的方法以及固定化酶或固定化蛋白质 | |
| CN107267474B (zh) | 一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN113122526A (zh) | 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k1、编码基因及应用 | |
| CN112175980B (zh) | 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用 | |
| CN115838714A (zh) | 一种乙醛裂合酶、乙醛裂合酶融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN110904062B (zh) | 一株高产l-丙氨酸的菌株 | |
| CN115247158B (zh) | 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用 | |
| CN111051508A (zh) | D型氨基酸脱氢酶 | |
| US20210238576A1 (en) | L-aspartate alpha-decarboxylase Mutant and Application thereof | |
| CN113881611B (zh) | 一种提高谷氨酸棒杆菌合成l-谷氨酸产量的方法 | |
| CN109161539B (zh) | 一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用 | |
| CN113699131A (zh) | 一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用 | |
| CN114763552B (zh) | 一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法 | |
| CN113754785B (zh) | 融合蛋白及其制备方法与在制备岩藻糖基化产物中的应用 | |
| CN116426499B (zh) | 一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用 | |
| CN107236718B (zh) | 一种来源于宏基因组的低温酯酶、编码基因及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |