CN113754785B

CN113754785B - 融合蛋白及其制备方法与在制备岩藻糖基化产物中的应用

Info

Publication number: CN113754785B
Application number: CN202111161744.8A
Authority: CN
Inventors: 汪家琦; 周洪波; 潘丽娜; 朱玉玲; 刘雯娴; 王玉光; 陈祝; 戴智勇; 程海娜; 颜卫彬
Original assignee: Ausnutria Dairy China Co ltd; Changsha Yun Kang Bio Technology Co ltd; Central South University
Current assignee: Ausnutria Dairy China Co ltd; Changsha Yun Kang Bio Technology Co ltd; Central South University
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN113754785A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及融合蛋白及其制备方法与在制备岩藻糖基化产物中的应用。本发明提供的融合蛋白可以显著增强α‑1,2‑岩藻糖基转移酶异源表达，在较短时间就可以实现细胞内该酶的大量累积，从而达到更高的酶活力和底物转换效率。

Description

融合蛋白及其制备方法与在制备岩藻糖基化产物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及融合蛋白及其制备方法与在制备岩藻糖基化产物中的应用。

背景技术

α-1,2-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.69.)能催化经核苷酸活化的岩藻糖基转移至末端是半乳糖基的受体上，形成α-1,2-糖苷键。岩藻糖基转移酶催化得到的岩藻糖基化产物包括寡糖、糖脂、糖蛋白等，具有广泛的健康益处；由于岩藻糖基化产物如岩藻糖基化寡糖能够参与细胞识别，肿瘤发现和病原体粘附、提供大脑发育和认知所需的潜在必需营养。因此，其在医药、食品、化妆品等工业中也具有广阔的应用前景。

已发现岩藻糖基转移酶的基因供体的微生物主要包括幽门螺杆菌、大肠杆菌、脆弱拟杆菌等，但是，这些野生菌株被认为是可致病微生物，不适合用于食品医药工业；并且其岩藻糖基转移酶产量均十分低下，缺乏直接开发的价值。

因此，本领域寄希望于通过基因工程手段异源表达获得α-1,2-岩藻糖基转移酶。但是，从目前的研究成果来看，在大肠杆菌等商业化菌株中异源表达岩藻糖基转移酶基因不仅初始表达量极低，还易形成包涵体；且岩藻糖基转移酶为胞内分泌，提取岩藻糖基转移酶需破壁，会导致酶活及酶量的损失；同时，以随机突变的方式改造岩藻糖基转移酶的底物结合结构域和催化结构域以提高酶活具有随机突变的不确定，会导致的筛选困难。上述技术均并不能够真正运用于工业生产，极大地阻碍了其产物的大规模应用。

因此，急需找到一种新的可克服表达量低、易形成包涵体等缺陷且可大幅度提高岩藻糖基转移酶表达量的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种表达量高，且可溶性蛋白更高的融合蛋白及其制备方法与在制备岩藻糖基化产物中的应用。

本发明提供的融合蛋白包括：融合短肽和α-1,2-岩藻糖基转移酶片段；

所述α-1,2-岩藻糖基转移酶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述融合短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2～5任一项所示。

本发明中，所述融合短肽位于α-1,2-岩藻糖基转移酶片段的N端。

一些实施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6～9所示。

本发明还提供了编码所述融合蛋白的核酸。

本发明中，编码所述融合蛋白的核酸序列的5’端还包括RBS序列。

一些实施例中，编码所述融合蛋白的核酸的序列如SEQ ID NO:10～13所示。

本发明还提供了一种表达载体，其含有所述核酸的表达载体。

本发明中，所述表达载体的骨架载体选自pET系列载体。一些具体实施例中，所述表达载体的骨架载体为pET22b。

本发明还提供了转化或转染有所述表达载体的宿主细胞。

一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。一些具体实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)。

所述宿主细胞的构建方法包括：将构建获得的表达载体转化入宿主细胞。所述转化的方法为热激转化。

本发明所述融合蛋白的制备方法，其包括培养所述的宿主细胞，诱导融合蛋白的表达。

本发明所述突变体、核酸、表达载体、宿主细胞或所述制备方法制得的产物，在岩藻糖基化产物合成中的应用。

本发明还提供了一种促进岩藻糖基化产物的合成的生物制剂，其包括：所述的突变体，核酸，表达载体，宿主细胞或所述制备方法制得的产物。

一些实施例中，所述生物制剂的制备原料包含所述突变体的发酵液。

本发明还提供了岩藻糖基化产物的合成方法，其以乳糖为底物，以本发明所述生物制剂促进岩藻糖基化产物的合成。一些实施例中，所述合成的反应条件包括：在pH＝6.0～8.0，20～40℃条件下反应10～120min。

本发明提供的融合蛋白，将α-1,2-岩藻糖基转移酶片段与RBS、3×FLAG、SUMO、HA或cMyc中的至少一种进行融合。所获得的融合蛋白表达量大，在较短时间就可以实现细胞内该酶的大量累积，并且具有更高的酶活力和底物转换效率。

附图说明

图1示SDS-PAGE检测蛋白表达量；

图2示HPLC检测产物种类和含量。

具体实施方式

本发明提供了融合蛋白及其制备方法与在制备岩藻糖基化产物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中，所述融合短肽为亲水性较强的序列，通过将α-1,2-岩藻糖基转移酶(futC)与该融合短肽融合，提高融合蛋白的可溶性表达，减少包涵体的形成。本发明中，所述融合短肽包括3×FLAG、SUMO、HA或cMyc中的至少一种。一些实施例中，所述融合片段为3×FLAG(SEQ ID NO:2)、SUMO(SEQ ID NO:3)、HA(SEQ ID NO:4)或cMyc(SEQ ID NO:5)。

为了增强蛋白的表达，在编码融合蛋白的核酸序列的5’端添加RBS序列。

一些具体实施例中，所述融合蛋白为RBS-futC(SEQ ID NO:1)、RBS-3×FLAG-futC(SEQ ID NO:6)、RBS-SUMO-futC(SEQ ID NO:7)、RBS-HA-futC(SEQ ID NO:8)、RBS-cMyc-futC(SEQ ID NO:9)。

具体的，本发明中涉及的片段名称及序列如下：

futC的氨基酸序列为(SEQ ID NO:1)：

MDMMAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHLNTPVLLDITSFDWSNRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDTLKCMGFDRVSQEIVFEYEPGLLKPSRLTYFYGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPENGNNKKKEEEYHRKLALILAAKNSVFVHVRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYIAKRVPNMELFVFCEDLKFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCKHGIIANSTYSWWAAYLINNPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSKKYNALE

编码futC的核酸序列为：

atggatatgatggcgttcaaggtggttcagatttgcggtggcctgggtaaccagatgttccaatatgcgtttgcgaaaagcctgcaaaagcacctgaacaccccggttctgctggacattaccagcttcgattggagcaaccgtaaaatgcagctggagctgtttccgatcgacctgccgtacgcgagcgcgaaagaaattgcgatcgcgaagatgcagcacctgccgaaactggtgcgtgacaccctgaagtgcatgggtttcgatcgtgttagccaagagatcgtgtttgagtatgaaccgggtctgctgaaaccgagccgtctgacctacttctatggctactttcaggacccgcgttacttcgatgcgattagcccgctgatcaagcaaacctttaccctgccgccgccggaaaacggcaacaacaagaagaaggaagaggagtatcaccgtaagctggcgctgattctggcggcgaaaaacagcgtgtttgttcacgtgcgtcgtggtgactacgttggtattggctgccagctgggcatcgattatcagaagaaggcgctggagtacatcgcgaagcgtgttccgaacatggagctgttcgtgttttgcgaagacctgaaattcacccagaacctggatctgggttatccgtttatggacatgaccacccgtgataaggaagaggaagcgtactgggatatgctgctgatgcaaagctgcaaacacggcatcattgcgaacagcacctattcctggtgggcggcgtacctgatcaacaacccggaaaagatcattatcggtccgaaacactggctgttcggccacgagaacattctgtgcaaagaatgggttaagatcgagagccactttgaagtgaaaagcaaaaagtacaacgcgctcgag

3×FLAG的氨基酸序列为(SEQ ID NO:2)：

DYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK

编码3×FLAG的核酸序列为：

gattacaaggatgacgacgataaggattacaaggatgacgacgataaggattacaaggatgacgacgataag

SUMO的氨基酸序列为(SEQ ID NO:3)：

LVPELNEKDDDQVQKALASRENTQLMNRDNIEITVRDFKTLAPRRWLNDTIIEFFMKYIEKSTPNTVAFNSFFYTNLSERGYQGVRRWMKRKKTQIDKLDKIFTPINLNQSHWALGIIDLKKKTIGYVDSLSNGPNAMSFAILTDLQKYVMEESKHTIGEDFDLIHLDCPQQPNGYDCGIYVCMNTLYGSADAPLDFDYKDAIRMRRFIAHLILTDALKSS

编码SUMO的核酸序列为：

ctggtgccggaactgaatgagaaagacgacgaccaggtgcagaaagccctggccagccgtgaaaacacccagctgatgaaccgcgacaacatcgagatcaccgtgcgtgacttcaagaccttagccccgcgccgctggctgaacgataccattatcgaattttttatgaaatatattgaaaaaagcaccccgaacaccgtggcatttaacagtttcttttataccaacctgagcgagcgcggttatcagggcgtgcgccgctggatgaaacgtaagaaaactcagattgataaactggataaaatcttcaccccgatcaacctgaatcagagccattgggccctgggcattattgatctgaagaagaaaactattggctatgttgatagcctgagcaacggcccgaacgccatgagcttcgccatcctgaccgatctgcagaagtatgtgatggaggagagcaagcacaccatcggcgaggatttcgacctgatccatctggattgcccgcagcagccgaacggctacgattgcggcatttatgtgtgcatgaacaccctgtatggcagcgccgatgcaccgctggatttcgactacaaggacgccattcgcatgcgccgctttattgcccacctgatcctgacagatgccctgaaaagcagc

HA的氨基酸序列为：YPYDVPDYA(SEQ ID NO:4)

编码HA的核酸序列为：tacccatacgacgtcccagactacgctc

cMyc的氨基酸序列为：EQKLISEEDL(SEQ ID NO:5)

编码cMyc的核酸序列为：gagcagaaactcatctctgaagaggatctgc

3×FLAG前RBS核酸序列为：agcgcgcggcaacctcgcgcgaacaatagagaaagaagattaaggaggtttttt

SUMO前RBS核酸序列为aacaattacaataaaacaacgtaaggaggttgatt

HA前RBS核酸序列为attctaaggaaatttgaagattaaggaggtttttt

cMyc前RBS核酸序列为gacggacaagtcagcttgtattataggtaaggaggtttatt

futC前RBS核酸序列为tttgtttaactttaagaaggagatata

RBS-3×FLAG-futC融合蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO:6)：

DYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDKMDMMAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHLNTPVLLDITSFDWSNRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDTLKCMGFDRVSQEIVFEYEPGLLKPSRLTYFYGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPENGNNKKKEEEYHRKLALILAAKNSVFVHVRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYIAKRVPNMELFVFCEDLKFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCKHGIIANSTYSWWAAYLINNPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSKKYNALE

编码RBS-3×FLAG-futC融合蛋白的核酸序列为(SEQ ID NO:10)：

agcgcgcggcaacctcgcgcgaacaatagagaaagaagattaaggaggttttttatggattacaaggatgacgacgataaggattacaaggatgacgacgataaggattacaaggatgacgacgataagatggatatgatggcgttcaaggtggttcagatttgcggtggcctgggtaaccagatgttccaatatgcgtttgcgaaaagcctgcaaaagcacctgaacaccccggttctgctggacattaccagcttcgattggagcaaccgtaaaatgcagctggagctgtttccgatcgacctgccgtacgcgagcgcgaaagaaattgcgatcgcgaagatgcagcacctgccgaaactggtgcgtgacaccctgaagtgcatgggtttcgatcgtgttagccaagagatcgtgtttgagtatgaaccgggtctgctgaaaccgagccgtctgacctacttctatggctactttcaggacccgcgttacttcgatgcgattagcccgctgatcaagcaaacctttaccctgccgccgccggaaaacggcaacaacaagaagaaggaagaggagtatcaccgtaagctggcgctgattctggcggcgaaaaacagcgtgtttgttcacgtgcgtcgtggtgactacgttggtattggctgccagctgggcatcgattatcagaagaaggcgctggagtacatcgcgaagcgtgttccgaacatggagctgttcgtgttttgcgaagacctgaaattcacccagaacctggatctgggttatccgtttatggacatgaccacccgtgataaggaagaggaagcgtactgggatatgctgctgatgcaaagctgcaaacacggcatcattgcgaacagcacctattcctggtgggcggcgtacctgatcaacaacccggaaaagatcattatcggtccgaaacactggctgttcggccacgagaacattctgtgcaaagaatgggttaagatcgagagccactttgaagtgaaaagcaaaaagtacaacgcgctcgag

RBS-SUMO-futC融合蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO:7)：

LVPELNEKDDDQVQKALASRENTQLMNRDNIEITVRDFKTLAPRRWLNDTIIEFFMKYIEKSTPNTVAFNSFFYTNLSERGYQGVRRWMKRKKTQIDKLDKIFTPINLNQSHWALGIIDLKKKTIGYVDSLSNGPNAMSFAILTDLQKYVMEESKHTIGEDFDLIHLDCPQQPNGYDCGIYVCMNTLYGSADAPLDFDYKDAIRMRRFIAHLILTDALKSSHMDMMAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHLNTPVLLDITSFDWSNRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDTLKCMGFDRVSQEIVFEYEPGLLKPSRLTYFYGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPENGNNKKKEEEYHRKLALILAAKNSVFVHVRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYIAKRVPNMELFVFCEDLKFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCKHGIIANSTYSWWAAYLINNPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSKKYNALE

编码RBS-SUMO-futC融合蛋白的核酸序列为(SEQ ID NO:11)：

aacaattacaataaaacaacgtaaggaggttgattatgctggtgccggaactgaatgagaaagacgacgaccaggtgcagaaagccctggccagccgtgaaaacacccagctgatgaaccgcgacaacatcgagatcaccgtgcgtgacttcaagaccttagccccgcgccgctggctgaacgataccattatcgaattttttatgaaatatattgaaaaaagcaccccgaacaccgtggcatttaacagtttcttttataccaacctgagcgagcgcggttatcagggcgtgcgccgctggatgaaacgtaagaaaactcagattgataaactggataaaatcttcaccccgatcaacctgaatcagagccattgggccctgggcattattgatctgaagaagaaaactattggctatgttgatagcctgagcaacggcccgaacgccatgagcttcgccatcctgaccgatctgcagaagtatgtgatggaggagagcaagcacaccatcggcgaggatttcgacctgatccatctggattgcccgcagcagccgaacggctacgattgcggcatttatgtgtgcatgaacaccctgtatggcagcgccgatgcaccgctggatttcgactacaaggacgccattcgcatgcgccgctttattgcccacctgatcctgacagatgccctgaaaagcagccatatggatatgatggcgttcaaggtggttcagatttgcggtggcctgggtaaccagatgttccaatatgcgtttgcgaaaagcctgcaaaagcacctgaacaccccggttctgctggacattaccagcttcgattggagcaaccgtaaaatgcagctggagctgtttccgatcgacctgccgtacgcgagcgcgaaagaaattgcgatcgcgaagatgcagcacctgccgaaactggtgcgtgacaccctgaagtgcatgggtttcgatcgtgttagccaagagatcgtgtttgagtatgaaccgggtctgctgaaaccgagccgtctgacctacttctatggctactttcaggacccgcgttacttcgatgcgattagcccgctgatcaagcaaacctttaccctgccgccgccggaaaacggcaacaacaagaagaaggaagaggagtatcaccgtaagctggcgctgattctggcggcgaaaaacagcgtgtttgttcacgtgcgtcgtggtgactacgttggtattggctgccagctgggcatcgattatcagaagaaggcgctggagtacatcgcgaagcgtgttccgaacatggagctgttcgtgttttgcgaagacctgaaattcacccagaacctggatctgggttatccgtttatggacatgaccacccgtgataaggaagaggaagcgtactgggatatgctgctgatgcaaagctgcaaacacggcatcattgcgaacagcacctattcctggtgggcggcgtacctgatcaacaacccggaaaagatcattatcggtccgaaacactggctgttcggccacgagaacattctgtgcaaagaatgggttaagatcgagagccactttgaagtgaaaagcaaaaagtacaacgcgctcgag

RBS-HA-futC融合蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO:8)：

YPYDVPDYAHMDMMAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHLNTPVLLDITSFDWSNRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDTLKCMGFDRVSQEIVFEYEPGLLKPSRLTYFYGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPENGNNKKKEEEYHRKLALILAAKNSVFVHVRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYIAKRVPNMELFVFCEDLKFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCKHGIIANSTYSWWAAYLINNPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSKKYNALE

编码RBS-HA-futC融合蛋白核酸序列为(SEQ ID NO:12)：

attctaaggaaatttgaagattaaggaggttttttatgtacccatacgacgtcccagactacgctcatatggatatgatggcgttcaaggtggttcagatttgcggtggcctgggtaaccagatgttccaatatgcgtttgcgaaaagcctgcaaaagcacctgaacaccccggttctgctggacattaccagcttcgattggagcaaccgtaaaatgcagctggagctgtttccgatcgacctgccgtacgcgagcgcgaaagaaattgcgatcgcgaagatgcagcacctgccgaaactggtgcgtgacaccctgaagtgcatgggtttcgatcgtgttagccaagagatcgtgtttgagtatgaaccgggtctgctgaaaccgagccgtctgacctacttctatggctactttcaggacccgcgttacttcgatgcgattagcccgctgatcaagcaaacctttaccctgccgccgccggaaaacggcaacaacaagaagaaggaagaggagtatcaccgtaagctggcgctgattctggcggcgaaaaacagcgtgtttgttcacgtgcgtcgtggtgactacgttggtattggctgccagctgggcatcgattatcagaagaaggcgctggagtacatcgcgaagcgtgttccgaacatggagctgttcgtgttttgcgaagacctgaaattcacccagaacctggatctgggttatccgtttatggacatgaccacccgtgataaggaagaggaagcgtactgggatatgctgctgatgcaaagctgcaaacacggcatcattgcgaacagcacctattcctggtgggcggcgtacctgatcaacaacccggaaaagatcattatcggtccgaaacactggctgttcggccacgagaacattctgtgcaaagaatgggttaagatcgagagccactttgaagtgaaaagcaaaaagtacaacgcgctcgag

RBS-cMyc-futC融合蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO:9)：

EQKLISEEDLHMDMMAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHLNTPVLLDITSFDWSNRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDTLKCMGFDRVSQEIVFEYEPGLLKPSRLTYFYGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPENGNNKKKEEEYHRKLALILAAKNSVFVHVRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYIAKRVPNMELFVFCEDLKFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCKHGIIANSTYSWWAAYLINNPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSKKYNALE

编码RBS-cMyc-futC融合蛋白的核酸序列为(SEQ ID NO:13)：

gacggacaagtcagcttgtattataggtaaggaggtttattatggagcagaaactcatctctgaagaggatctgcatatggatatgatggcgttcaaggtggttcagatttgcggtggcctgggtaaccagatgttccaatatgcgtttgcgaaaagcctgcaaaagcacctgaacaccccggttctgctggacattaccagcttcgattggagcaaccgtaaaatgcagctggagctgtttccgatcgacctgccgtacgcgagcgcgaaagaaattgcgatcgcgaagatgcagcacctgccgaaactggtgcgtgacaccctgaagtgcatgggtttcgatcgtgttagccaagagatcgtgtttgagtatgaaccgggtctgctgaaaccgagccgtctgacctacttctatggctactttcaggacccgcgttacttcgatgcgattagcccgctgatcaagcaaacctttaccctgccgccgccggaaaacggcaacaacaagaagaaggaagaggagtatcaccgtaagctggcgctgattctggcggcgaaaaacagcgtgtttgttcacgtgcgtcgtggtgactacgttggtattggctgccagctgggcatcgattatcagaagaaggcgctggagtacatcgcgaagcgtgttccgaacatggagctgttcgtgttttgcgaagacctgaaattcacccagaacctggatctgggttatccgtttatggacatgaccacccgtgataaggaagaggaagcgtactgggatatgctgctgatgcaaagctgcaaacacggcatcattgcgaacagcacctattcctggtgggcggcgtacctgatcaacaacccggaaaagatcattatcggtccgaaacactggctgttcggccacgagaacattctgtgcaaagaatgggttaagatcgagagccactttgaagtgaaaagcaaaaagtacaacgcgctcgag

本发明提供的表达载体中，编码所述融合蛋白的核酸插入在骨架载体中。本发明对构建重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明实施中，所述骨架载体为pET系列载体。具体实施例中，采用的骨架在题为pET22b。

本发明所述转化或转染有表达载体的宿主细胞，优选的以大肠杆菌作为宿主菌；所述大肠杆菌优选的包括E.coli BL21(DE3)，NovaBlue，Origami，PlySs，T7 shuffle等DE3系列菌株。本发明对所述重组菌的构建方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，所述重组菌采用以下方法制备得到：所述将表达载体转化E.coliBL21，获得重组菌。

本发明中所述融合蛋白优选的采用以下方法制备得到：培养所述重组菌，诱导获得融合蛋白。所述培养的方法包括活化和发酵。活化步骤中，采用的培养基为LB培养基。发酵步骤中培养基为TB培养基。所述培养温度优选为37℃，所述培养的时间以培养物的OD600达到0.6-0.8为准，所述诱导的方式优选为在培养基中加入终浓度为0.1～1.0mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于16～37℃诱导培养4～28h。

取上述诱导后的发酵液经离心取菌体破碎后取上清液，用于促进岩藻糖基化产物的合成。本发明的具体实施过程中，以GDP-L-岩藻糖和乳糖、乙酰基乳糖等为底物，所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体或其重组菌，无辅酶，在20-40℃，与pH值为6.0-8.0的缓冲液构成的体外催化反应体系中反应0.1-2h,得到包括α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的混合酶促反应体系。

一些实施例中，所述岩藻糖基化产物为2’-岩藻糖基乳糖。一些具体实施例中，所述2’-岩藻糖基乳糖的制备方法包括：将发酵菌体裂解后的上清液加入含有GDP-岩藻糖和乳糖的TRIS-HCl缓冲发酵液中，于20-40℃下孵育10-120min，获得含有2’-岩藻糖基乳糖的反应液。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(1)异源表达幽门螺杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶

全基因合成NCBI上公布的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori J166)的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC序列，通过PCR对futC基因和表达载体pET22b进行扩增，使用DpnI酶消化模板质粒，随后将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃复苏1h涂布于终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-16h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC是否构建成功，测序正确的质粒为pET22b-futC。

(2)构建协同优化融合蛋白质粒pET22b-RBS-3×FLAG-futC

合成所需RBS序列、RBS序列-3×FLAG片段和融合于蛋白质N端的外源序列；

以上述步骤(1)中测序正确的重组质粒pET22b-futC为模板，设置合适酶切位点进行酶切，纯化回收pET22b-futC线性化载体片段。然后使用T4连接酶将RBS片段、3×FLAG片段和线性化载体pET22b-futC进行重组连接。其中，RBS序连接到futC基因的N端，构建协同优化融合蛋白序列RBS-futC。RBS和3×FLAG的基因序列按顺序连接到futC基因的N端，构建协同优化融合蛋白序列RBS-3×FLAG-futC。

重组反应体系转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-16h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认融合蛋白RBS-futC(SEQ ID NO:1)、RBS-3×FLAG-futC(SEQ ID NO:6)是否构建成功。

实施例2：

构建协同优化融合蛋白载体pET22b-RBS-SUMO-futC

全基因合成RBS-sumo的基因片段，随后制备pET22b-futC线性化载体片段，步骤同实施例1。然后使用T4连接酶将sumo基因片段和线性化载体pET22b-futC进行重组连接。其中，RBS-sumo的基因序列连接到futC基因的N端，构建协同优化融合蛋白RBS-SUMO-futC。重组反应体系转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-16h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认融合蛋白RBS-SUMO-futC(SEQ ID NO:7)是否构建成功。

实施例3：

构建协同优化融合蛋白载体pET22b-RBS-HA-futC

全基因合成RBS-HA的基因片段，随后制备pET22b-futC线性化载体片段，步骤同实施例1。然后使用T4连接酶将RBS-HA基因和线性化载体pET22b-futC进行重组连接。其中，RBS-HA的基因序列连接到futC基因的N端，构建协同优化融合蛋白RBS-HA-futC。重组反应体系转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-16h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认融合蛋白RBS-HA-futC(SEQ ID NO:8)是否构建成功。

实施例4：

构建协同优化融合蛋白载体pET22b-RBS-cMyc-futC

全基因合成RBS-cMyc的基因序列，随后制备pET22b-futC线性化载体片段，步骤同实施例1。然后使用T4连接酶将RBS-cMyc基因和线性化载体pET22b-futC进行重组连接。其中，RBS-cMyc的基因序列连接到futC基因的N端，构建协同优化融合蛋白RBS-cMyc-futC。重组反应体系转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-16h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认融合蛋白RBS-cMyc-futC(SEQ ID NO:9)是否构建成功。

实施例5：

摇瓶发酵重验证重组菌产酶能力

将上述实施例和对比例测序正确的重组质粒pET22b-futC、、pET22b-RBS-futC、pET22b-RBS-3×FLAG-futC、pET22b-RBS-SUMO-futC、pET22b-RBS-HA-futC和pET22b-RBS-cMyc-futC分别转入BL21感受态中，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-16h，以获得不同含有RBS和N端融合蛋白的的pET22b-RBS-FP-futC发酵重组菌。挑取单菌落到终浓度为0.1mM氨苄霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L)中培养8-10h，作为摇瓶发酵的种子液。然后将种子液按1％的接种量接入到装有20-25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为0.1mM的氨苄霉素，发酵培养基的配方是：1.2％(W/V)胰蛋白胨，2.4％(W/V)酵母提取物，0.4％(V/V)甘油，磷酸盐缓冲液17mM KH₂PO₄，72mM K₂HPO₄。随后将三角瓶置于37℃、200r/min条件下培养2-4h后，添加终浓度为0.25mM的IPTG至摇瓶中，于26℃、150r/min条件下培养2-10h。

首先取20mL发酵液在12000rpm下离心15-20min后，收集菌体，重悬后经超声波破碎，低温高速离心得到细胞破碎上清液。利用组氨酸标签亲和纯化原理，使用Ni-NTA对目标蛋白进行纯化。细胞破碎上清液穿流镍柱三次，后用洗涤液洗(Tris-HCl缓冲体系，10mM咪唑浓度)去除非亲和吸附的杂蛋白，最后用洗脱液(Tris-HCl缓冲体系，500mM咪唑浓度)洗脱目标蛋白，洗脱三次，分别收集。通过透析除去洗脱液中的咪唑，最终得到较纯的重组融合蛋白。

将上清液加入含有GDP-岩藻糖和乳糖的TRIS-HCl缓冲发酵液中，于20-40℃下孵育10-120min。反应结束后，将反应液通过除盐柱进行超滤除杂后，再通过0.22μm的滤膜，备用。对各成分进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1。其中，M:marker FT:穿流液Sup:细胞破碎上清液E2：第二遍洗脱液。CK为未进行RBS和N端协同优化的FUTC蛋白，Ropt为只进行RBS区域优化的融合蛋白，Fhf RBS和HA序列协同优化的融合蛋白、Fmcf RBS和cMYC序列协同优化的融合蛋白、F3Ff RBS和3×FLAG序列协同优化的融合蛋白、Fsf RBS和SUMO序列协同优化的融合蛋白。采用bradford法统计各融合蛋白的表达量，结果如表1。

酶活检测：

首先取20mL发酵液在12000rpm下离心15-20min后，收集菌体，重悬后经超声波破碎，低温高速离心得到细胞破碎上清液。经组氨酸标签纯化得到较纯的酶液，并通过透析除去咪唑、调整缓冲液盐浓度。最终得到的酶液保存备用。

加入100μM GDP-L-岩藻糖100μL和5mM乳糖100μL，而后加入250μL酶液，在20-40℃下孵育10-120min，实现催化生成2'-FL。催化完成后立即置于冰上停止反应。随后在低温下高速离心并通过除盐柱进行超滤除杂后，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定催化体系中的2'-FL产量以及底物的剩余量。

将催化得到的反应液，通过0.22μm的滤膜，备用。准备液相色谱检测所需的流动相，流动相A：乙腈，流动相B＝0.5％醋酸三乙胺的水溶液。选用amide色谱柱(150mm×2.1um)，检测条件为：流动相比例80：20，流速0.2m/L，柱温35℃，检测器使用蒸发光散射检测器，蒸发温度70℃,载气流量为2.0SLM。通过外标法定量产物。HPLC检测结果如图2所示。

在催化体系的样品中，产生了新的物质峰，检测到了产物2'-FL生成，并且观察到GDP-岩藻糖物质峰的减少和消失。通过外标法，利用峰面积计算物质的含量，此时产物产量为4.01μM 2'-FL/mM Lactose。

表1

	表达量(g/L)	酶活力(U/mL)
			futC	0.09	0.41
RBS-futC	0.46	2.34
			RBS-3×FLAG-futC	1.15	6.03
RBS-SUMO-futC	0.84	3.44
			RBS-HA-futC	0.70	1.22
RBS-cMyc-futC	0.84	2.14

结果显示：

本发明通过先设计不同强度的RBS序列替换载体上原有部分，然后将亲水性不同的外源序列融合至岩藻糖基转移酶基因N端，并在表达宿主中进行表达，成功将岩藻糖基转移酶的表达量提高至野生型菌株发酵的将近12倍；

将本发明的重组大肠杆菌重组菌诱导培养5h，可使得胞内的岩藻糖基转移酶酶活提高13.71倍；

本发明实现了岩藻糖基转移酶在工程化大肠杆菌中的高效表达，且提高了酶活力，在工业生产中具有巨大的应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中南大学；澳优乳业（中国）有限公司；长沙运康生物科技有限公司

<120> 融合蛋白及其制备方法与在制备岩藻糖基化产物中的应用

<130> MP21018069

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Met Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly

1 5 10 15

Asn Gln Met Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Leu

20 25 30

Asn Thr Pro Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg

35 40 45

Lys Met Gln Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala

50 55 60

Lys Glu Ile Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg

65 70 75 80

Asp Thr Leu Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val

85 90 95

Phe Glu Tyr Glu Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe

100 105 110

Tyr Gly Tyr Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu

115 120 125

Ile Lys Gln Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys

130 135 140

Lys Lys Glu Glu Glu Tyr His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala

145 150 155 160

Lys Asn Ser Val Phe Val His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile

165 170 175

Gly Cys Gln Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Ile

180 185 190

Ala Lys Arg Val Pro Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu

195 200 205

Lys Phe Thr Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr

210 215 220

Thr Arg Asp Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln

225 230 235 240

Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala

245 250 255

Ala Tyr Leu Ile Asn Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His

260 265 270

Trp Leu Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile

275 280 285

Glu Ser His Phe Glu Val Lys Ser Lys Lys Tyr Asn Ala Leu Glu

290 295 300

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

20

<210> 3

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu Met Asn Arg Asp Asn Ile Glu

20 25 30

Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu Ala Pro Arg Arg Trp Leu Asn

35 40 45

Asp Thr Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys Tyr Ile Glu Lys Ser Thr Pro

50 55 60

Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Glu Arg

65 70 75 80

Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met Lys Arg Lys Lys Thr Gln Ile

85 90 95

Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ile Asn Leu Asn Gln Ser His

100 105 110

Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val

115 120 125

Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala Met Ser Phe Ala Ile Leu Thr

130 135 140

Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu Ser Lys His Thr Ile Gly Glu

145 150 155 160

Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys Pro Gln Gln Pro Asn Gly Tyr

165 170 175

Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn Thr Leu Tyr Gly Ser Ala Asp

180 185 190

Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Met Arg Arg Phe

195 200 205

Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala Leu Lys Ser Ser

210 215 220

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 6

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Asp Met Met Ala Phe Lys Val

20 25 30

Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln Tyr Ala Phe

35 40 45

Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Leu Asn Thr Pro Val Leu Leu Asp Ile

50 55 60

Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met Gln Leu Glu Leu Phe Pro

65 70 75 80

Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu Ile Ala Ile Ala Lys Met

85 90 95

Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Thr Leu Lys Cys Met Gly Phe

100 105 110

Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr Glu Pro Gly Leu Leu

115 120 125

Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr Phe Gln Asp Pro Arg

130 135 140

Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln Thr Phe Thr Leu Pro

145 150 155 160

Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys Lys Glu Glu Glu Tyr His Arg

165 170 175

Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe Val His Val

180 185 190

Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys Gln Leu Gly Ile Asp Tyr

195 200 205

Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Ile Ala Lys Arg Val Pro Asn Met Glu

210 215 220

Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Lys Phe Thr Gln Asn Leu Asp Leu

225 230 235 240

Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg Asp Lys Glu Glu Glu Ala

245 250 255

Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Ala

260 265 270

Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Asn Asn Pro Glu

275 280 285

Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu Phe Gly His Glu Asn Ile

290 295 300

Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser His Phe Glu Val Lys Ser

305 310 315 320

Lys Lys Tyr Asn Ala Leu Glu

325

<210> 7

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu Met Asn Arg Asp Asn Ile Glu

20 25 30

Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu Ala Pro Arg Arg Trp Leu Asn

35 40 45

Asp Thr Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys Tyr Ile Glu Lys Ser Thr Pro

50 55 60

Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Glu Arg

65 70 75 80

Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met Lys Arg Lys Lys Thr Gln Ile

85 90 95

Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ile Asn Leu Asn Gln Ser His

100 105 110

Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val

115 120 125

Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala Met Ser Phe Ala Ile Leu Thr

130 135 140

Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu Ser Lys His Thr Ile Gly Glu

145 150 155 160

Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys Pro Gln Gln Pro Asn Gly Tyr

165 170 175

Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn Thr Leu Tyr Gly Ser Ala Asp

180 185 190

Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Met Arg Arg Phe

195 200 205

Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala Leu Lys Ser Ser His Met Asp

210 215 220

Met Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln

225 230 235 240

Met Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Leu Asn Thr

245 250 255

Pro Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met

260 265 270

Gln Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu

275 280 285

Ile Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Thr

290 295 300

Leu Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu

305 310 315 320

Tyr Glu Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly

325 330 335

Tyr Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys

340 345 350

Gln Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys Lys

355 360 365

Glu Glu Glu Tyr His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn

370 375 380

Ser Val Phe Val His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys

385 390 395 400

Gln Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Ile Ala Lys

405 410 415

Arg Val Pro Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Lys Phe

420 425 430

Thr Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg

435 440 445

Asp Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys

450 455 460

Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr

465 470 475 480

Leu Ile Asn Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu

485 490 495

Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser

500 505 510

His Phe Glu Val Lys Ser Lys Lys Tyr Asn Ala Leu Glu

515 520 525

<210> 8

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala His Met Asp Met Met Ala Phe

1 5 10 15

Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln Tyr

20 25 30

Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Leu Asn Thr Pro Val Leu Leu

35 40 45

Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met Gln Leu Glu Leu

50 55 60

Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu Ile Ala Ile Ala

65 70 75 80

Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Thr Leu Lys Cys Met

85 90 95

Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr Glu Pro Gly

100 105 110

Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr Phe Gln Asp

115 120 125

Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln Thr Phe Thr

130 135 140

Leu Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys Lys Glu Glu Glu Tyr

145 150 155 160

His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe Val

165 170 175

His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys Gln Leu Gly Ile

180 185 190

Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Ile Ala Lys Arg Val Pro Asn

195 200 205

Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Lys Phe Thr Gln Asn Leu

210 215 220

Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg Asp Lys Glu Glu

225 230 235 240

Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly Ile

245 250 255

Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Asn Asn

260 265 270

Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu Phe Gly His Glu

275 280 285

Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser His Phe Glu Val

290 295 300

Lys Ser Lys Lys Tyr Asn Ala Leu Glu

305 310

<210> 9

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His Met Asp Met Met Ala

1 5 10 15

Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln

20 25 30

Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Leu Asn Thr Pro Val Leu

35 40 45

Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met Gln Leu Glu

50 55 60

Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu Ile Ala Ile

65 70 75 80

Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Thr Leu Lys Cys

85 90 95

Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr Glu Pro

100 105 110

Gly Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr Phe Gln

115 120 125

Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln Thr Phe

130 135 140

Thr Leu Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys Lys Glu Glu Glu

145 150 155 160

Tyr His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe

165 170 175

Val His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys Gln Leu Gly

180 185 190

Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Ile Ala Lys Arg Val Pro

195 200 205

Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Lys Phe Thr Gln Asn

210 215 220

Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg Asp Lys Glu

225 230 235 240

Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly

245 250 255

Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Asn

260 265 270

Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu Phe Gly His

275 280 285

Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser His Phe Glu

290 295 300

Val Lys Ser Lys Lys Tyr Asn Ala Leu Glu

305 310

<210> 10

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcgcgcggc aacctcgcgc gaacaataga gaaagaagat taaggaggtt ttttatggat 60

tacaaggatg acgacgataa ggattacaag gatgacgacg ataaggatta caaggatgac 120

gacgataaga tggatatgat ggcgttcaag gtggttcaga tttgcggtgg cctgggtaac 180

cagatgttcc aatatgcgtt tgcgaaaagc ctgcaaaagc acctgaacac cccggttctg 240

ctggacatta ccagcttcga ttggagcaac cgtaaaatgc agctggagct gtttccgatc 300

gacctgccgt acgcgagcgc gaaagaaatt gcgatcgcga agatgcagca cctgccgaaa 360

ctggtgcgtg acaccctgaa gtgcatgggt ttcgatcgtg ttagccaaga gatcgtgttt 420

gagtatgaac cgggtctgct gaaaccgagc cgtctgacct acttctatgg ctactttcag 480

gacccgcgtt acttcgatgc gattagcccg ctgatcaagc aaacctttac cctgccgccg 540

ccggaaaacg gcaacaacaa gaagaaggaa gaggagtatc accgtaagct ggcgctgatt 600

ctggcggcga aaaacagcgt gtttgttcac gtgcgtcgtg gtgactacgt tggtattggc 660

tgccagctgg gcatcgatta tcagaagaag gcgctggagt acatcgcgaa gcgtgttccg 720

aacatggagc tgttcgtgtt ttgcgaagac ctgaaattca cccagaacct ggatctgggt 780

tatccgttta tggacatgac cacccgtgat aaggaagagg aagcgtactg ggatatgctg 840

ctgatgcaaa gctgcaaaca cggcatcatt gcgaacagca cctattcctg gtgggcggcg 900

tacctgatca acaacccgga aaagatcatt atcggtccga aacactggct gttcggccac 960

gagaacattc tgtgcaaaga atgggttaag atcgagagcc actttgaagt gaaaagcaaa 1020

aagtacaacg cgctcgag 1038

<210> 11

<211> 1613

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacaattaca ataaaacaac gtaaggaggt tgattatgct ggtgccggaa ctgaatgaga 60

aagacgacga ccaggtgcag aaagccctgg ccagccgtga aaacacccag ctgatgaacc 120

gcgacaacat cgagatcacc gtgcgtgact tcaagacctt agccccgcgc cgctggctga 180

acgataccat tatcgaattt tttatgaaat atattgaaaa aagcaccccg aacaccgtgg 240

catttaacag tttcttttat accaacctga gcgagcgcgg ttatcagggc gtgcgccgct 300

ggatgaaacg taagaaaact cagattgata aactggataa aatcttcacc ccgatcaacc 360

tgaatcagag ccattgggcc ctgggcatta ttgatctgaa gaagaaaact attggctatg 420

ttgatagcct gagcaacggc ccgaacgcca tgagcttcgc catcctgacc gatctgcaga 480

agtatgtgat ggaggagagc aagcacacca tcggcgagga tttcgacctg atccatctgg 540

attgcccgca gcagccgaac ggctacgatt gcggcattta tgtgtgcatg aacaccctgt 600

atggcagcgc cgatgcaccg ctggatttcg actacaagga cgccattcgc atgcgccgct 660

ttattgccca cctgatcctg acagatgccc tgaaaagcag ccatatggat atgatggcgt 720

tcaaggtggt tcagatttgc ggtggcctgg gtaaccagat gttccaatat gcgtttgcga 780

aaagcctgca aaagcacctg aacaccccgg ttctgctgga cattaccagc ttcgattgga 840

gcaaccgtaa aatgcagctg gagctgtttc cgatcgacct gccgtacgcg agcgcgaaag 900

aaattgcgat cgcgaagatg cagcacctgc cgaaactggt gcgtgacacc ctgaagtgca 960

tgggtttcga tcgtgttagc caagagatcg tgtttgagta tgaaccgggt ctgctgaaac 1020

cgagccgtct gacctacttc tatggctact ttcaggaccc gcgttacttc gatgcgatta 1080

gcccgctgat caagcaaacc tttaccctgc cgccgccgga aaacggcaac aacaagaaga 1140

aggaagagga gtatcaccgt aagctggcgc tgattctggc ggcgaaaaac agcgtgtttg 1200

ttcacgtgcg tcgtggtgac tacgttggta ttggctgcca gctgggcatc gattatcaga 1260

agaaggcgct ggagtacatc gcgaagcgtg ttccgaacat ggagctgttc gtgttttgcg 1320

aagacctgaa attcacccag aacctggatc tgggttatcc gtttatggac atgaccaccc 1380

gtgataagga agaggaagcg tactgggata tgctgctgat gcaaagctgc aaacacggca 1440

tcattgcgaa cagcacctat tcctggtggg cggcgtacct gatcaacaac ccggaaaaga 1500

tcattatcgg tccgaaacac tggctgttcg gccacgagaa cattctgtgc aaagaatggg 1560

ttaagatcga gagccacttt gaagtgaaaa gcaaaaagta caacgcgctc gag 1613

<210> 12

<211> 977

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attctaagga aatttgaaga ttaaggaggt tttttatgta cccatacgac gtcccagact 60

acgctcatat ggatatgatg gcgttcaagg tggttcagat ttgcggtggc ctgggtaacc 120

agatgttcca atatgcgttt gcgaaaagcc tgcaaaagca cctgaacacc ccggttctgc 180

tggacattac cagcttcgat tggagcaacc gtaaaatgca gctggagctg tttccgatcg 240

acctgccgta cgcgagcgcg aaagaaattg cgatcgcgaa gatgcagcac ctgccgaaac 300

tggtgcgtga caccctgaag tgcatgggtt tcgatcgtgt tagccaagag atcgtgtttg 360

agtatgaacc gggtctgctg aaaccgagcc gtctgaccta cttctatggc tactttcagg 420

acccgcgtta cttcgatgcg attagcccgc tgatcaagca aacctttacc ctgccgccgc 480

cggaaaacgg caacaacaag aagaaggaag aggagtatca ccgtaagctg gcgctgattc 540

tggcggcgaa aaacagcgtg tttgttcacg tgcgtcgtgg tgactacgtt ggtattggct 600

gccagctggg catcgattat cagaagaagg cgctggagta catcgcgaag cgtgttccga 660

acatggagct gttcgtgttt tgcgaagacc tgaaattcac ccagaacctg gatctgggtt 720

atccgtttat ggacatgacc acccgtgata aggaagagga agcgtactgg gatatgctgc 780

tgatgcaaag ctgcaaacac ggcatcattg cgaacagcac ctattcctgg tgggcggcgt 840

acctgatcaa caacccggaa aagatcatta tcggtccgaa acactggctg ttcggccacg 900

agaacattct gtgcaaagaa tgggttaaga tcgagagcca ctttgaagtg aaaagcaaaa 960

agtacaacgc gctcgag 977

<210> 13

<211> 986

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacggacaag tcagcttgta ttataggtaa ggaggtttat tatggagcag aaactcatct 60

ctgaagagga tctgcatatg gatatgatgg cgttcaaggt ggttcagatt tgcggtggcc 120

tgggtaacca gatgttccaa tatgcgtttg cgaaaagcct gcaaaagcac ctgaacaccc 180

cggttctgct ggacattacc agcttcgatt ggagcaaccg taaaatgcag ctggagctgt 240

ttccgatcga cctgccgtac gcgagcgcga aagaaattgc gatcgcgaag atgcagcacc 300

tgccgaaact ggtgcgtgac accctgaagt gcatgggttt cgatcgtgtt agccaagaga 360

tcgtgtttga gtatgaaccg ggtctgctga aaccgagccg tctgacctac ttctatggct 420

actttcagga cccgcgttac ttcgatgcga ttagcccgct gatcaagcaa acctttaccc 480

tgccgccgcc ggaaaacggc aacaacaaga agaaggaaga ggagtatcac cgtaagctgg 540

cgctgattct ggcggcgaaa aacagcgtgt ttgttcacgt gcgtcgtggt gactacgttg 600

gtattggctg ccagctgggc atcgattatc agaagaaggc gctggagtac atcgcgaagc 660

gtgttccgaa catggagctg ttcgtgtttt gcgaagacct gaaattcacc cagaacctgg 720

atctgggtta tccgtttatg gacatgacca cccgtgataa ggaagaggaa gcgtactggg 780

atatgctgct gatgcaaagc tgcaaacacg gcatcattgc gaacagcacc tattcctggt 840

gggcggcgta cctgatcaac aacccggaaa agatcattat cggtccgaaa cactggctgt 900

tcggccacga gaacattctg tgcaaagaat gggttaagat cgagagccac tttgaagtga 960

aaagcaaaaa gtacaacgcg ctcgag 986

Claims

1.核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10~13所示。

2.含有权利要求1所述核酸的表达载体。

3.宿主细胞，其转化或转染有权利要求2所述表达载体。

4.融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括培养权利要求3所述的宿主细胞，诱导融合蛋白的表达。

5.权利要求1所述的核酸，权利要求2所述的表达载体或权利要求3所述的宿主细胞在岩藻糖基化产物合成中的应用，所述岩藻糖基化产物为2’-岩藻糖基乳糖。

6.一种促进岩藻糖基化产物的合成的生物制剂，其特征在于，包括：权利要求1所述的核酸，权利要求2所述的表达载体或权利要求3所述的宿主细胞。

7.岩藻糖基化产物的合成方法，其特征在于，以乳糖为底物，以权利要求6所述的生物制剂促进岩藻糖基化产物的合成；所述岩藻糖基化产物为2’-岩藻糖基乳糖。