CN113801240B - 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶工程技术领域，公开了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用。该D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶活性聚集体，包括D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶和自聚集短肽，可以提高D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的反应温度及半衰期；对金属离子的依赖性显著降低；重复利用次数提高。

Description

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用。
背景技术
随着城市化进程加快、环境污染日益严重、人们生活方式的改变及人口老龄化，肥胖、糖尿病等慢性代谢性疾病的发病率在全球范围急剧上升。而过多食用糖类造成能量过剩是引起肥胖和糖尿病的一个重要原因。如何保持人们习以为常的甜味程度，同时能降低糖在肠道的吸收，减少能量摄入是目前营养和医学界研究的热点之一，同时也是食品行业亟需解决的重要问题。
D-阿洛酮糖(D-psicose)是D-果糖(D-fructose)C-3的差向异构体，其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖0.3％，是一种具有特殊保健功能的新型功能性单糖。D-阿洛酮糖具有与蔗糖相近的口感及容积特性，并与蔗糖一样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应，可作为食品中蔗糖理想的替代品。动物实验显示，D-阿洛酮糖具有控制2型糖尿病患者血糖的功效，同时对肥胖等相关疾病也一定的预防作用。动物与人体实验证明，D-阿洛酮糖没有任何不良副作用。2011年8月，美国食品与药物管理局(FD A)确定D-阿洛酮糖为公认安全使用物质(GRAS)，并可作为食品或食品添加剂的组成成分。D-阿洛酮糖在膳食、保健、医药等领域拥有广阔的应用前景。
D-阿洛酮糖极其少量地存在于自然界中，如存在于甘蔗、甜菜糖蜜、小麦和鼠刺属植物，而化学法合成D-阿洛酮糖面临产物纯化步骤复杂、化学污染严重和副产物杂多等问题，目前尚未取得突破性进展。生物转化方法最早由日本香川大学Izumori团队发现，其具有反应单一、纯化步骤简单等优点，逐渐成为生产D-阿洛酮糖的主要方法。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶作为D-阿洛酮糖生物转化的重要催化剂，可催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的相互转化。近年来，发现越来越多的细菌具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)H10和Trepone ma primitia ZAS-1等。其中，含有解纤维梭菌和根癌农杆菌的dpe基因的重组大肠杆菌具有较高的D-果糖和D-阿洛酮糖转化率，约33％，但后者在最适反应条件下(50℃)半衰期仅为63.5min。
此外，目前的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶普遍存在在最适反应条件下热稳定性差和重复利用率低等问题，不利于工业化大规模生产D-阿洛酮糖的成本控制。因此，需要开发稳定性优良、能够重复利用的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，以满足工业化生产的需求。
发明内容
本发明第一个方面的目的，在于提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。
本发明的第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的核酸分子。
本发明的第三方面的目的，在于提供包含本发明第二方面的核酸分子的重组载体。
本发明的第四方面的目的，在于提供包含本发明第三方面的重组载体的工程菌。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的制备方法。
本发明的第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体在制备D-阿洛酮糖中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体，包含D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和自聚集短肽。
优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体还包含连接肽。
优选地，所述连接肽位于D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和自聚集短肽之间。
优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为(a)～(e)中任一种：
(a)具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；
(b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加后仍具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的氨基酸序列所示的酶；
(c)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的氨基酸序列所示的酶；
(d)在(a)、(b)或(c)所述酶的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
(e)在(a)、(b)或(c)所述酶的氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
优选地，所述自聚集短肽的二级结构为α螺旋或β折叠；进一步为α螺旋。
优选地，所述自聚集短肽为口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1(PDB：1FMD)、人β-淀粉样蛋白Aβ42(F19D)(PDB：2LFM)、麦芽糖结合蛋白MalE(PDB：3W15)、麦芽糖结合蛋白突变体MalE31(PDB：1LAX)、纤维素结合域(PDB：1AZ6)、类弹性蛋白多肽、ELK16(SEQ ID NO.2)、L6KD(SEQID NO.3)、18A(SEQ ID NO.4)和R18A(SEQ ID NO.5)中的至少一种；进一步为ELK16和L6KD中的至少一种；更进一步为ELK16。
优选地，所述类弹性蛋白多肽为VPGXG(SEQ ID NO.57)、VPGXGVPGXG(SEQ IDNO.58)、VPGXGVPGXGVPGXG(SEQ ID NO.59)和VPGXGVPGXGVPGXGVPGXG(SEQ ID NO.60)中的至少一种。
优选地，所述连接肽为PT-linker(SEQ ID NO.6)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO.7)、GGGGGGG(SEQ ID NO.8)、GGGGGGGGG(SEQ ID NO.9)、EAAAK(SEQ ID NO.10)、EAAAKEAAAK(SEQ ID NO.11)和EAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO.12)中的至少一种；进一步为PT-linker。
优选地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体为Rum55-ELK16聚集体(SEQID NO.13)，Rum55-L6KD聚集体(SEQ ID NO.14)、Rum55-18A聚集体(SEQ ID NO.15)和Rum55-R18A聚集体(SEQ ID NO.16)中的至少一种；进一步为Rum55-ELK16聚集体(SEQ IDNO.13)和Rum55-L6KD聚集体(SEQ ID NO.14)中的至少一种；更进一步为Rum55-ELK16聚集体(SEQ ID NO.13)。
本发明的第二个方面，提供编码本发明第一方面的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的核酸分子。
本发明的第三个方面，提供一种包含本发明第二方面的核酸分子的重组载体。
优选地，所述重组载体的出发载体为pET30a、pET28a、pET24a、pET21a、pET22b、pET32a、pET14a、pBAD、pCold I、pMA5、pHY300PLK、pAXO1、pHT01和pHT43中的至少一种。
本发明的第四个方面，提供一种包含本发明第三方面的重组载体的工程菌。
优选地，所述工程菌为真核细胞和原核细胞中的至少一种；进一步为大肠杆菌和核枯草芽孢杆菌中的至少一种。
优选地，所述大肠杆菌为E.coli DH5α、E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)/plysS、E.coli Rosetta、E.coli Rosetta(DE3)、E.coli JM109、E.coli JM110和E.coli TOP10中的至少一种。
优选地，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌1012、枯草芽孢杆菌BS168、枯草芽孢杆菌WB600和枯草芽孢杆菌WB800N中的至少一种。
本发明的第五个方面，提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的制备方法，采用本发明第四方面的工程菌发酵得到。
优选地，所述工程菌为大肠杆菌时，所述制备方法包括如下步骤：将本发明第四方面的工程菌接入LB培养基，35～37℃、150～250rpm下培养至OD600为0.4～0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷，16～30℃、150～250rpm下培养14～22h，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。
优选地，所述工程菌为枯草芽孢杆菌时，所述制备方法包括如下步骤：将本发明第四方面的工程菌接入LB培养基，35～37℃、150～250rpm下培养至OD600为0.4～0.8，加入KB培养基及异丙基硫代半乳糖苷，28～32℃、150～250rpm下培养20～28h，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体。
优选地，所述制备方法还包括如下步骤：收集菌体，破碎，纯化。
优选地，所述破碎的方法包括超声破碎法、溶菌酶破碎法和高压匀浆破碎法中的至少一种；进一步为超声破碎法。
优选地，所述纯化的方法为离心和/或过滤。
本发明的第六个方面，提供本发明第一方面的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体在制备D-阿洛酮糖中的应用。
优选地，所述应用包括如下步骤：将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与果糖混合，反应，得到D-阿洛酮糖。
优选地，所述果糖与D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的质量比为(50～100)：1。
优选地，所述反应的条件为：pH为4～10；温度为20～70℃。
进一步优选地，所述反应的条件为：pH为6～10；温度为40～55℃。
优选地，所述pH通过缓冲液调节。
优选地，所述缓冲液包括但不限于Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液；进一步优选地，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
优选地，所述缓冲液的浓度为10～100mM。
优选地，所述反应在钴(Co)离子存在下进行。
优选地，所述钴离子的浓度为0.05～1mM。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体，包括D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和自聚集短肽，该D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体可以提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的反应温度及半衰期：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的最适反应温度为50～55℃，高于D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的50℃；并且在Co离子存在的条件下，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的热稳定性(半衰期)显著提高：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的半衰期大于7h，而D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的半衰期小于0.5h；
同时，该D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体对金属离子的依赖性显著降低：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体在没有Co离子存在的条件下，其活性和半衰期与D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在Co离子存在下的活性和半衰期相近，可见，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体显著降低了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶对金属离子的依赖性；
最后，本发明提供的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体重复利用6次时活性仍能保持90％以上，重复利用20次时活性仍能保持50％以上，而D-阿洛酮糖-3-差向异构酶只能催化一次。
本发明通过限定自聚集短肽为ELK16或L6KD，得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体不溶于水，在纯化阿洛酮糖时只需简单的固液分离即可将聚集体和阿洛酮糖分离开，简化了纯化步骤，避免了在高温灭活酶时阿洛酮糖发生美拉德效应而导致阿洛酮糖的损失，同时该聚集体可以重复使用，提高阿洛酮糖的产率和收率，降低了生产成本。
本发明提供的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体有利于推进D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工业应用，可用于制备D-阿洛酮糖，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是pET30a-Rum55-ELK16质粒图谱。
图2是不同浓度的BSA、Rum55-ELK16聚集体及Rum55纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图3是不同浓度的Rum55-ELK16聚集体的转化率图。
图4是Rum55-ELK16聚集体及Rum55纯化蛋白在不同反应温度下的相对活性图。
图5是Rum55-ELK16聚集体及Rum55纯化蛋白在50℃下孵育不同时间后的相对活性图。
图6是Rum55-ELK16聚集体及Rum55纯化蛋白重复利用不同次数后的相对活性图。
图7是不同工程菌破碎后的上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。
图8是pET30a-Surgl-ELK16质粒图谱。
图9是BS1012/pMA5-Rum55-ELK16及BS1012/pMA5-Rum55破碎后的上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。
图10是E.coli Rosetta(DE3)/pET30-Surgl-ELK1及E.coli Rosetta(DE3)/pET30-Surgl破碎后的上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所采用的原料，除特殊说明外，均通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。
下述实施例中有未注明具体条件的实验方法，则是按照常规的分子克隆手册所述的条件进行操作。
下述实施例中所有基因操作均可根据Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))的教导进行。
如无特别说明，全部试剂来自于Fisher Scientific。
培养基和缓冲液请参见《分子克隆实验指南》下册(第三版，科学出版社，2002年)附录2的培养基部分。
所采用的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来源于瘤胃球菌属细菌Ruminococcussp.CAG55，对应本实施例中Rum55序列，GenBank号:CDC15199.1。
实施例1 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的获得(含有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶-连接肽-自聚集短肽的片段的获得)
1.获得含有pET30a载体和酶切位点序列的Rum55-PT-ELK16目的片段
根据连接肽PT-linker(SEQ ID NO.18)、自聚集短肽ELK16(SEQ ID NO.19)、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶Rum55(SEQ ID NO.17)，以及pET30a载体(购自Solarbio，货号P3120)的基因序列，分别设计引物进行PT-ELK16片段、Rum55-PT片段扩增，并以上述两个扩增片段为模板，设计含有pET30a载体和酶切位点序列的引物进行overlap PCR扩增，最终获得含有pET30a载体和酶切位点序列的Rum55-PT-ELK16目的片段。具体细节如下：
(1)PT-ELK16片段PCR扩增
以引物PT-ELK16-F、PT-ELK16-R进行扩增，得到长度为116bp的PT-ELK16片段(SEQID NO.20)；
PT-ELK16-F：CCGACCCCACCGACCACGCCAACGCCACCAACCACCCCAACCCCGACGCCGCTGGAACT(SEQ ID NO.21)；
Figure BDA0003231099900000051
下划线碱基为限制性内切酶NotI识别位点，斜体标记为保护碱基。
(2)Rum55-PT片段PCR扩增
以pET30a-Rum55质粒为模板(pET30a-Rum55质粒构建过程如下：将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶Rum55(SEQ ID NO.17)插入pET30a载体的BamHI和NotI酶切位点之间，得到pET30a-Rum55质粒)，以Rum55-F和Rum55-PT-R为引物进行PCR扩增，得到长度为907bp的Rum55-PT片段(SEQ ID NO.23)；
Rum55-F：GGATCCATGAACAAGATCGGAGTTCATT(SEQ ID NO.24)，下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点；
Rum55-PT-R：GCGTTGGCGTGGTCGGTGGGGTCGGTCTTTGCATTTTTTTTCTCA(SEQ IDNO.25)，下划线碱基为PT-linker部分序列。
(3)含有pET30a载体和酶切位点序列的Rum55-PT-ELK16目的片段overlap PCR扩增
以(1)和(2)中获得的PT-ELK16片段和Rum55-PT片段为模板，以pET30-Rum55-F和pET30-R为引物进行overlap PCR扩增，获得含有pET30a载体和酶切位点序列的Rum55-PT-ELK16目的片段(SEQ ID NO.26)，长度为1098bp；
pET30-Rum55-F：ccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcGGATCCATGAACAAGATCGG(SEQ ID NO.27)，下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点；
Figure BDA0003231099900000052
Figure BDA0003231099900000053
下划线碱基为限制性内切酶NotI识别位点，斜体标记为保护碱基。
2.质粒pET30a-Rum55 ELK16的构建
用限制性内切酶BamHI和NotI对pET30a-Rum55质粒进行双酶切，并对酶切后的载体片段进行切胶回收；使用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术有限公司)，将回收的载体片段与步骤1得到含有pET30a载体和酶切位点序列的Rum55-PT-ELK16目的片段(SEQ ID NO.26)进行混合，反应15min后(具体操作参见说明书)，转化至Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到质粒pET30a-Rum55-ELK16，如图1所示。
3、大肠杆菌胞内表达Rum555-ELK16活性聚集体工程菌的构建。
将步骤2中构建的质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-ELK16。
4、大肠杆菌胞中Rum55-ELK16聚集体的表达
步骤3中构建的工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-ELK16和实验室前期构建的E.coli Rosett a(DE3)/pET30a-Rum55(将pET30a-Rum55质粒转化至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到E.coliRosetta(DE3)/pET30a-Rum55)分别接种在含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养至OD600达到0.6，加入终浓度为0.5mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，在25℃、200rpm条件下诱导18小时。离心收集菌体，用pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液重悬，采用超声破碎法进行菌体破碎，破碎后10000rpm离心10min。
对E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55保留上清，采用镍柱亲和层析纯化可溶表达的Rum55纯化蛋白(记为Rum55纯化蛋白：SEQ ID NO.1所述的蛋白尾部接6个His)。
对E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-ELK16去除上清，沉淀用含有0.8％(v/v)Triton X-100的pH＝8.0的Tris-HCl(20mM)缓冲液洗涤一次，再用pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液洗涤两次，所得样品即为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体(记为Rum55-ELK16聚集体，Rum55-PT-ELK16，氨基酸序列：SEQ ID NO.13)。
对不同浓度的BSA、Rum55纯化蛋白以及Rum55-ELK16聚集体进行凝胶电泳，结果如图2所示：Rum55-ELK16的分子量约45kDa，Rum55分子量约40kDa，相差5kDa左右，与PTlinker+ELK16分子量相近，并且聚集体纯度较高；根据BSA和Rum55纯化蛋白的浓度可以估算出，浓度为5mg/mL的沉淀中Rum55-ELK16聚集体蛋白的浓度约0.2mg/mL，即Rum55-ELK16聚集体蛋白在细胞破碎沉淀中的含量约4％。
5、Rum55-ELK16聚集体的浓度与转化率的关系
取Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、D-果糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)以及不同浓度的Rum55-ELK16聚集体(终浓度分别为：0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/mL)，反应体系为1mL，测定50℃条件下反应时间为30min时，然后沸水加热5min使酶失活，终止反应；12000rpm离心2min，取上清液经2μm过滤器过滤，进行HPLC检测底物的转化率：D-果糖和D-阿洛酮糖浓度测定采用HPLC法检测，条件如下：安捷伦1260HPLC和G1362A RID检测器；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mm column；流动相：水；流速：0.4mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度55℃；上样量为20μL；以Sigma公司的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，配置为1～10mg/mL溶液并进行色谱分析，绘制标准曲线：D果糖的保留时间为14.885min，D阿洛酮糖的保留时间为21.413min；根据标准曲线计算不同浓度的Rum55-ELK16聚集体下，底物消耗量和产物生成量，计算底物转化率。Rum55-ELK16活性聚集体浓度与转化率之间的关系，结果如图3所示：随着Rum55-ELK16活性聚集体浓度的增加，转化率逐渐升高，活性聚集体在浓度为0.7mg/mL时，反应30min达到平衡转化率。
6、Rum55纯化蛋白与Rum55-ELK16聚集体的最适反应温度
以果糖为底物，分别用Rum55纯化蛋白与Rum55-ELK16聚集体在水相体系中，在不同温度下，测定相同反应体系、相同反应时间下两种酶的转化率，具体如下：取Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、果糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)以及Rum55-ELK16聚集体/Rum55纯化蛋白(终浓度分别为：20μg/mL)，反应体系为1mL，分别在30、35、40、45、50、55、60、65和70℃水浴条件下反应30min，然后沸水加热5min使酶失活，终止反应；12000rpm离心2min，取上清液经2μm过滤器过滤，进行HPLC检测底物的转化率，条件如下：安捷伦1260HPLC和G1362A RID检测器；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mmcolumn；流动相：水；流速：0.4mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度55℃；上样量为20μL；以Sigma公司的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，配置为1～10mg/mL溶液并进行色谱分析，绘制标准曲线：D果糖的保留时间为14.885min，D阿洛酮糖的保留时间为21.413min；根据标准曲线计算不同反应温度下，两种酶的底物消耗量和产物生成量，计算底物转化率，将活性最高的数值定义为100％，结果如图4所示：Rum55-ELK16活性聚集体的最适反应温度为50～55℃，Rum55纯化的最适反应温度为50℃。
7、Rum55纯化蛋白与Rum55-ELK16聚集体的热稳定性
分别将Rum55纯化蛋白与Rum55-ELK16聚集体在50℃下放置0、0.5、1、2、3、4、5、6、7h后，测定酶活性，分别进行如下处理：Rum55+Co：Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、D-果糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)以及50℃下放置不同时间的Rum55纯化蛋白(终浓度为：0.05mg/mL)，反应体系为1mL；Rum55-no Co：Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、D-果糖(终浓度为50mg/mL)以及50℃下放置不同时间的Rum55纯化蛋白(终浓度为：0.05mg/mL)，反应体系为1mL；Rum55-ELK16+Co：Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、D-果糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)以及50℃下放置不同时间的Rum55-ELK16聚集体(终浓度为：0.7mg/mL)，反应体系为1mL；Rum55-ELK16-no Co：Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、D-果糖(终浓度为50mg/mL)以及50℃下放置不同时间的Rum55-ELK16聚集体(终浓度为：0.7mg/mL)，反应体系为1mL；然后沸水加热5min使酶失活，终止反应；12000rpm离心2min，取上清液经2μm过滤器过滤，进行HPLC检测底物的转化率，条件如下：安捷伦1260HPLC和G1362A RID检测器；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mm column；流动相：水；流速：0.4mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度55℃；上样量为20μL；以Sigma公司的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，配置为1-10mg/mL溶液并进行色谱分析，绘制标准曲线：D果糖的保留时间为14.885min，D阿洛酮糖的保留时间为21.413min；根据标准曲线计算不同反应温度下，两种酶的底物消耗量和产物生成量，计算底物转化率，将活性最高的数值定义为100％，结果如图5所示：在Co离子存在的条件下，Rum55-ELK16聚集体在最适反应温度50℃下的半衰期>7h，Rum55纯化蛋白在最适反应温度50℃下的半衰期<0.5h；而在无Co离子存在的情况下，二者的半衰期都低于Co离子存在下各自的半衰期；但是Rum55-ELK16聚集体在没有Co离子存在的条件下，在最适反应温度下的活性和半衰期与在Co离子存在下Rum55纯化蛋白的活性和半衰期相近，表明：与Rum55纯化蛋白相比，Rum55-ELK16聚集体的热稳定性显著提高；同时，Rum55-ELK16聚集体显著降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶对金属离子的依赖性。
8、Rum55-ELK16聚集体重复使用的酶活保留情况
分别取0.7mg/mLRum55纯化蛋白和Rum55-ELK16聚集体，加入Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、果糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)，反应体系为1mL，分别在50℃水浴条件下反应30min(反应1次)；然后，加入Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、果糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)，反应体系为1mL，分别在50℃水浴条件下反应30min(反应2次)；重复上述步骤，分别进行反应3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；反应完成后，沸水加热5min使酶失活，终止反应；12000rpm离心2min，取上清液经2μm过滤器过滤，进行HPLC检测底物的转化率，条件如下：安捷伦1260HPLC和G1362A RID检测器；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mm column；流动相：水；流速：0.4mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度55℃；上样量为20μL；以Sigma公司的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，配置为1～10mg/mL溶液并进行色谱分析，绘制标准曲线：D果糖的保留时间为14.885min，D阿洛酮糖的保留时间为21.413min；根据标准曲线计算不同反应温度下，两种酶的底物消耗量和产物生成量，计算底物转化率，将活性最高的数值定义为100％，结果如图6所示：Rum55-ELK16聚集体重复利用6次时活性仍能保持90％以上，重复利用20次时活性仍能保持50％以上；而Rum55纯化蛋白只能催化一次。
实施例2 不同自聚集短肽对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体活性的影响
按照实施例1的方法，将自聚集短肽(ELK16，SEQ ID NO.2、18A，SEQ ID NO.4、R18A，SEQ ID NO.5和L6KD，SEQ ID NO.3)-PT-linker构建至Rum55的C端，获得表达不同自聚集短肽组成的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体：Rum55-L6KD聚集体(Rum55-PT-L6KD，SEQ ID NO.14)、Rum55-18A聚集体(Rum55-PT-18A，SEQ ID NO.15)和Rum55-R18A聚集体(Rum55-PT-R18A，SEQ ID NO.16)的工程菌：E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-L6KD、E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-18A、E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-R18A，具体如下：
L6KD、18A和R18A的基因序列分别如SEQ ID NO.40、41和42所示。分别以引物PT-L6KD-F(SEQ ID NO.44)和PT-L6KD-R(SEQ ID NO.45)、PT-18A-F(SEQ ID NO.47)和PT-18A-R(SEQ ID NO.48)、PT-R18A-F(SEQ ID NO.50)和PT-R18A-R(SEQ ID NO.51)进行扩增，得到长度为92bp的PT-L6KD片段(SEQ ID NO.43)、长度为122bp的PT-18A片段(SEQ ID NO.46)和长度为122bp的PT-R18A片段(SEQ ID NO.49)；下划线碱基为限制性内切酶NotI识别位点，斜体标记为保护碱基；
PT-L6KD-F：CCGACCCCACCGACCACGCCAACGCCACCAACCACCCCAACCCCGACGCCGCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGAAAGAT(SEQ ID NO.44)；
Figure BDA0003231099900000081
PT-18A-F：CCGACCCCACCGACCACGCCAACGCCACCAACCACCCCAACCCCGACGCCGCTGAATGGCTGAAAGC(SEQ ID NO.47)；
Figure BDA0003231099900000082
PT-R18A-F：CCGACCCCACCGACCACGCCAACGCCACCAACCACCCCAACCCCGACGCCGCTAAATGGCTGGAAGCGTTCTA(SEQ ID NO.50)；
Figure BDA0003231099900000083
以PT-L6KD片段和Rum55-PT片段(SEQ ID NO.23)为模板，以pET30-Rum55-F(SEQID NO.27)和pET30-R(SEQ ID NO.28)为引物进行overlap PCR扩增，获得含有pET30a载体和酶切位点序列的Rum55-PT-L6KD目的片段，长度为1074bp(SEQ ID NO.52)；同样的，分别以PT-18A片段、PT-R18A片段和Rum55-PT片段为模板，以pET30-Rum55-F和pET30-R为引物进行overlap PCR扩增，获得含有pET30a载体和酶切位点序列的Rum55-PT-18A目的片段(SEQID NO.53)和Rum55-PT-R18A目的片段(SEQ ID NO.54)，长度均为1104bp。
用限制性内切酶BamHI和NotI对pET30a-Rum55质粒进行双酶切，并对酶切后的载体片段进行切胶回收；使用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术有限公司)，将回收的载体片段与overlap PCR扩增得到含有pET30a载体分别和酶切位点序列的Rum55-PT-L6KD、Rum55-PT-18A、Rum55-PT-R18A目的片段进行混合，反应15min后(具体操作参见说明书)，转化至Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到质粒pET30a-Rum55-L6KD、pET30-Rum55-18A和pET30-Rum55-R18A。将三个质粒分别转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-L6KD、E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-18A和E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Rum55-R18A。
将实施例1及实施例2得到的工程菌接种在含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，培养至OD600达到0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，在25℃、200rpm条件下诱导18小时。离心收集菌体，用pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液重悬，采用超声破碎法进行菌体破碎，破碎后10000rpm离心10min。分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳和活性测定，具体如下：沉淀用与上清相同体积的含有0.8％(v/v)Triton X-100的pH＝8.0的Tris-HCl(20mM)缓冲液洗涤一次，再用相同体积的pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液洗涤两次，最后用相同体积的pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液重悬，得到沉淀悬液；分别取10μL破碎上清和10μL沉淀悬液进行SDS-PAGE蛋白电泳；上清和沉淀的活性测定方法如下：1mL反应体系中，分别加入连有不同聚集肽的工程菌破碎后的上清和沉淀悬液各500uL、果糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)，用Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)将体积补至1mL，分别在50℃水浴条件下反应30min和3h，然后沸水加热5min使酶失活，终止反应；12000rpm离心2min，取上清液经2μm过滤器过滤，进行HPLC检测底物的转化率，条件如下：安捷伦1260HPLC和G1362A RID检测器；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mm column；流动相：水；流速：0.4mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度55℃；上样量为20μL；以Sigma公司的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，配置为1-10mg/mL溶液并进行色谱分析，绘制标准曲线：D果糖的保留时间为14.885min，D阿洛酮糖的保留时间为21.413min；根据标准曲线计算不同反应温度下，两种酶的底物消耗量和产物生成量，计算底物转化率，结果如图7及表1所示：连有自聚集短肽ELK16和L6KD的聚集体表达主要存在于沉淀物中，并且沉淀物中的活性高于上清液部分的活性，其中Rum55-ELK16聚集体活性高于Rum55-PT-L6KD聚集体；而连有自聚集短肽18A和R18A的聚集体在上清液和沉淀物中的占比比较接近，并且上清液中的活性高于沉淀物中的活性；上述四种自聚集短肽中，ELK16具有α螺旋特点，18A和R18A具有β折叠特点，L6KD只有8个氨基酸，没有明显的结构特点，具有类似表面活性剂的功能特点，可见，对于阿洛酮糖差向异构酶Rum55，具有α螺旋特点的自聚集短肽更易于形成活性聚集体。
表1 不同工程菌破碎后的上清、沉淀的转化率
反应30min 破碎上清 破碎沉淀 反应3h 破碎上清 破碎沉淀
18A 12.42％ 2.93％ 18A 15.55％ 4.76％
R18A 17.44％ 3.41％ R18A 21.52％ 5.98％
ELK16 6.51％ 20.22％ ELK16 13.94％ 29.53％
L6KD 9.55％ 15.25％ L6KD 11.90％ 22.10％
由于自聚集短肽ELK16和L6KD构建的聚集体主要分布在沉淀物中，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产阿洛酮糖存在于上清液中，为可溶蛋白；在用于生产D-阿洛酮糖时，使用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产D-阿洛酮糖后对D-阿洛酮糖进行纯化时需要进行对酶灭活处理，在此过程中，会因为高温灭活酶而导致D-阿洛酮糖产生美拉德反应；而使用上述聚集体时，由于其不溶于水，在纯化D-阿洛酮糖时只需简单的固液分离即可将聚集体和D-阿洛酮糖分离开，简化了纯化步骤，避免了D-阿洛酮糖因酶高温灭活而导致的损失，同时该聚集体可以重复使用，提高D-阿洛酮糖的产率和收率，降低了生产成本。
实施例3 Rum55-ELK16在枯草芽孢杆菌中的表达
1、质粒pMA5-Rum55 ELK16的构建
将pMA5空载体质粒用限制性内切酶BamHI和MluI进行双酶切，并对酶切后的载体片段进行切胶回收；以实施例1中获得的Rum55-PT-ELK16片段为模板，用含有pMA5载体和酶切位点序列的引物pMA5-BamHI-Rum55-F：agaatgcaaaaagtgaaatcagggggatccATGAACAAGATCGGAGTTCATTTTGGA(SEQ ID NO.29，下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点，)和pMA5-MluI-ELK-R：tcgaggtgaatttcgacctctagaacgcgtTTATTTCAGCTTTAATTCTAATTCCAGTTTTAA(SEQ ID NO.30，下划线碱基为限制性内切酶MluI识别位点)进行扩增，得到含有含有pMA5载体和酶切位点序列的Rum55-PT-ELK16目的片段(SEQ ID NO.31)，使用pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术有限公司)，将回收的载体片段与扩增得到的含有pMA5载体和酶切位点序列的Rum55-PT-ELK16目的片段进行混合，反应15min后(具体操作参见说明书)，转化至Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到质粒pMA5-Rum55 ELK16，如图8所示。
2、枯草芽孢杆菌表达Rum55-ELK16聚集体工程菌的构建
将步骤1中构建的质粒转化至1012感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到1012/pMA5-Rum55-ELK16。
3、枯草芽孢杆菌中Rum55-ELK16活性聚集体的表达
1)1012/pMA5-Rum55工程菌的构建
将pMA5空载体质粒用限制性内切酶BamHI和MluI进行双酶切，并对酶切后的载体片段进行切胶回收；以pET30a-Rum55质粒为模板，用含有pMA5载体和酶切位点序列的引物pMA5-BamHI-Rum55-F：agaatgcaaaaagtgaaatcagggggatccATGAACAAGATCGGAGTTCATTTTGGA(SEQ ID NO.29，下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)和pMA5-MluI-Rum55-R：tcgaggtgaatttcgacctctagaacgcgtTTATCTTTGCATTTTTTTTCTCA(SEQ ID NO.55，下划线碱基为限制性内切酶MluI识别位点)进行扩增，得到含有pMA5载体和酶切位点序列的pMA5-Rum55目的片段(SEQ ID NO.56)，长度为939bp。使用pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit(北京全式金生物技术有限公司)，将回收的载体片段与扩增得到的含有pMA5载体和酶切位点序列的pMA5-Rum55目的片段进行混合，反应15min后(具体操作参见说明书)，转化至Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到质粒pMA5-Rum55。将pMA5-Rum55质粒转化至1012感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到1012/pMA5-Rum55菌株。
2)将步骤2中构建的工程菌1012/pMA5-Rum55-ELK16和构建的1012/pMA5-Rum55用LB培养基在37℃下过夜活化，然后按1：100比例将活化菌液转化至新鲜的LB培养基中，37℃、200rpm下培养，待OD600达到0.5，将菌液(按1％)转接至KB培养基中，30℃发酵24h，收集菌体，用pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液重悬，采用超声破碎法进行菌体破碎，破碎后10000rpm离心10min；分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳和活性测定：沉淀用与上清相同体积的含有0.8％(v/v)Triton X-100的pH＝8.0的Tris-HCl(20mM)缓冲液洗涤一次，再用相同体积的pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液洗涤两次，最后用相同体积的pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液重悬，得到沉淀悬液；分别取10μL破碎上清和10μL沉淀悬液进行SDS-PAGE蛋白电泳；上清和沉淀的活性测定方法如下：1mL反应体系中，分别加入不同工程菌破碎后的上清和沉淀悬液各500uL、果糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)，用Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)将体积补至1mL，在50℃水浴条件下反应30min，然后沸水加热5min使酶失活，终止反应；12000rpm离心2min，取上清液经2μm过滤器过滤，进行HPLC检测底物的转化率，条件如下：安捷伦1260HPLC和G1362A RID检测器；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mm column；流动相：水；流速：0.4mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度55℃；上样量为20μL；以Sigma公司的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，配置为1-10mg/mL溶液并进行色谱分析，绘制标准曲线：D果糖的保留时间为14.885min，D阿洛酮糖的保留时间为21.413min；根据标准曲线计算不同反应温度下，两种酶的底物消耗量和产物生成量，计算底物转化率，如图9和表2所示：枯草芽孢杆菌表达系统的Rum55活性较好，30min可以基本达到平衡，但可溶蛋白表达量低；Rum55-ELK16聚集体的表达量较高，并且30min时也可以达到较高的转化率，说明Rum55-ELK16聚集体在枯草芽孢杆菌表达体系中也是可行的。D-阿洛酮糖作为食品原料，需要使用GRAS(Generally Recognized asSafe，一般认为安全)认定菌株进行生产，枯草芽孢杆菌在目录中，因此构建枯草芽孢杆菌表达体系的活性聚集体具有实际应用意义。
表2 不同工程菌破碎后的上清、沉淀的转化率
反应30min 破碎上清 破碎沉淀
1012/pMA5-Rum55 29.38％ 14.84％
1012/pMA5-Rum55-ELK16 16.25％ 29.12％
对比例1 ELK16与葡萄糖异构酶构建的聚集体
1、葡萄糖异构酶-ELK16的大肠杆菌构建和蛋白表达
从NCBI数据库中找到来源于解纤维素酸热菌(Acidothermus cellulolyticus)的葡萄糖异构酶序列，经过密码子优化后进行基因合成，将其命名为Surgl，基因序列为SEQID NO.32，氨基酸序列为SEQ ID NO.33。pET30a-Surgl质粒由苏州金唯智公司进行Surgl基因合成和质粒构建：以pET30a-Surgl质粒为模板，以Surgl-PT-F和pET30-NotI-Surgl-ELK-R为引物进行PCR扩增，得到片段1；以pET30-NdeI-Surgl-F和PT-Surgl-R为引物进行PCR扩增，得到片段2；以片段1和2为模板，以pET30-NdeI-Surgl-F和pET30-NotI-Surgl-ELK-R为引物进行PCR扩增，得到Surgl-ELK16片段(SEQ ID NO.34)，相关引物见表3，下划线表示NdeI和NotI酶切位点，下划线表示NdeI和NotI酶切位点。用限制性内切酶BamHI和NotI对pET30a-Surgl质粒进行双酶切，并对酶切后的载体片段进行切胶回收；使用pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术有限公司)，将回收的载体片段与overlap PCR扩增得到含有pET30a载体分别和酶切位点序列的Surgl-ELK16片段进行混合，反应15min后(具体操作参见说明书)，转化至Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到质粒pET30a-Surgl-ELK16。将pET30a-Surgl-ELK16质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Surgl-ELK16菌株。将构建的工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET30-Surgl-ELK16和实验室前期构建的E.coli Rosetta(DE3)/pET30-Surgl(将Surgl基因(SEQ ID NO.32)插入pET30a的NdeI和NotI酶切位点之间，得到pET30a-Surgl质粒；将pET30a-Surgl质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、酶切及测序分析鉴定阳性转化子，得到E.coli Rosetta(DE3)/pET30a-Surgl菌株)按照实施例1中的方法进行诱导表达，离心收集菌体，用pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液重悬，采用超声破碎法进行菌体破碎，破碎后10000rpm离心10min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳：沉淀用相同体积的含有0.8％(v/v)Triton X-100的pH＝8.0的Tris-HCl(20mM)缓冲液洗涤一次，再用用相同体积的pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液洗涤两次，最后用相同体积的pH＝8.0的Tris-HCl(50mM)缓冲液重悬，得到沉淀悬液。分别取10μL破碎上清和10μL沉淀悬液进行SDS-PAGE蛋白电泳，Surgl-ELK16聚集体的氨基序列如SEQ ID NO.35所示，结果如图10所示：Surgl-ELK16的分子量约48kDa，Surgl分子量约43kDa，相差5kDa左右，与PTl inker+ELK16分子量相近，并且聚集体纯度较高。
2、Surgl-ELK16聚集体和Surgl活性测定
取Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)(终浓度为50mM)、葡萄糖(终浓度为50mg/mL)、CoCl2(终浓度为0.1mM)，分别加入500uL E.coli Rosetta(DE3)/pET30-Surgl-ELK16和E.coliRosetta(DE3)/pET30-Surgl的上清和沉淀悬液，50℃条件下反应时间为3h，测定葡萄糖的转化率(参照D-阿洛酮糖转化率测定方法)，结果如表4所示：Surgl-ELK16聚集体没有葡萄糖异构酶活性。
表3 引物序列
Figure BDA0003231099900000111
Figure BDA0003231099900000121
表4 不同工程菌破碎后的上清、沉淀的转化率
反应3h 破碎上清 破碎沉淀
E.coli Rosetta(DE3)/pET30-Surgl 11.01％ -
E.coli Rosetta(DE3)/pET30-Surgl-ELK16 - -
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
中粮营养健康研究院有限公司
<120> 一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用
<130>
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 292
<212> PRT
<213> Ruminococcus sp
<400> 1
Met Asn Lys Ile Gly Val His Phe Gly Tyr Phe Asn Arg Asp Trp Asn
1 5 10 15
Thr Asp Phe Ile Lys Arg Ile Glu Gln Val Lys Lys Ile Gly Leu Asp
20 25 30
Ile Leu Glu Val Ala Pro Ala Pro Leu Leu Ala Leu Thr Lys Phe Gln
35 40 45
Arg Asp Glu Ile Ala Ala Ala Ala Lys Ala Asn Asp Ile Glu Leu Thr
50 55 60
Phe Ser Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Asp Leu Ala Ser Glu Asp Glu
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Asn Gly Ile Lys Phe Thr Thr Asp Thr Phe Gln Ile
85 90 95
Met Ser Glu Met Gly Gly Lys Thr Tyr Ser Gly Val Asp Ile Ala Ala
100 105 110
Trp Asn Lys Thr Phe Met Glu Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ala Thr Trp
115 120 125
Glu Arg Ser Ile Ser Ala Val Lys Glu Ile Met Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
Lys Gly Ile Thr Phe Ala Val Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Ser Ser
145 150 155 160
Leu Val Asn Thr Ala Glu Glu Ala Val Lys Tyr Val Asp Glu Val Gly
165 170 175
Ser Pro Asn Cys Lys Ile Leu Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Asp Ser Phe Ala Gly Ala Ile Lys Leu Val Gly Asn Arg Leu Gly
195 200 205
His Phe His Val Gly Glu Ser Asn Arg Arg Pro Pro Cys Glu Asn Gly
210 215 220
Lys Met Pro Trp Asn Glu Ile Thr Asn Ala Leu Lys Glu Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Ile Lys Met Gly Gly Glu Val
245 250 255
Gly Arg Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Glu Gly Ala Ser Glu
260 265 270
Ser Glu Met Glu Gln Leu Leu Ala Asp Ala Ala Met Met Leu Arg Lys
275 280 285
Lys Met Gln Arg
290
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Asp
1 5
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu
1 5 10 15
Leu Phe
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Lys Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Glu Val Leu Lys Glu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Leu Phe
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 13
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Asn Lys Ile Gly Val His Phe Gly Tyr Phe Asn Arg Asp Trp Asn
1 5 10 15
Thr Asp Phe Ile Lys Arg Ile Glu Gln Val Lys Lys Ile Gly Leu Asp
20 25 30
Ile Leu Glu Val Ala Pro Ala Pro Leu Leu Ala Leu Thr Lys Phe Gln
35 40 45
Arg Asp Glu Ile Ala Ala Ala Ala Lys Ala Asn Asp Ile Glu Leu Thr
50 55 60
Phe Ser Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Asp Leu Ala Ser Glu Asp Glu
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Asn Gly Ile Lys Phe Thr Thr Asp Thr Phe Gln Ile
85 90 95
Met Ser Glu Met Gly Gly Lys Thr Tyr Ser Gly Val Asp Ile Ala Ala
100 105 110
Trp Asn Lys Thr Phe Met Glu Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ala Thr Trp
115 120 125
Glu Arg Ser Ile Ser Ala Val Lys Glu Ile Met Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
Lys Gly Ile Thr Phe Ala Val Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Ser Ser
145 150 155 160
Leu Val Asn Thr Ala Glu Glu Ala Val Lys Tyr Val Asp Glu Val Gly
165 170 175
Ser Pro Asn Cys Lys Ile Leu Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Asp Ser Phe Ala Gly Ala Ile Lys Leu Val Gly Asn Arg Leu Gly
195 200 205
His Phe His Val Gly Glu Ser Asn Arg Arg Pro Pro Cys Glu Asn Gly
210 215 220
Lys Met Pro Trp Asn Glu Ile Thr Asn Ala Leu Lys Glu Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Ile Lys Met Gly Gly Glu Val
245 250 255
Gly Arg Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Glu Gly Ala Ser Glu
260 265 270
Ser Glu Met Glu Gln Leu Leu Ala Asp Ala Ala Met Met Leu Arg Lys
275 280 285
Lys Met Gln Arg Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr
290 295 300
Pro Thr Pro Thr Pro Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Leu Glu Leu
305 310 315 320
Glu Leu Lys Leu Lys
325
<210> 14
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Met Asn Lys Ile Gly Val His Phe Gly Tyr Phe Asn Arg Asp Trp Asn
1 5 10 15
Thr Asp Phe Ile Lys Arg Ile Glu Gln Val Lys Lys Ile Gly Leu Asp
20 25 30
Ile Leu Glu Val Ala Pro Ala Pro Leu Leu Ala Leu Thr Lys Phe Gln
35 40 45
Arg Asp Glu Ile Ala Ala Ala Ala Lys Ala Asn Asp Ile Glu Leu Thr
50 55 60
Phe Ser Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Asp Leu Ala Ser Glu Asp Glu
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Asn Gly Ile Lys Phe Thr Thr Asp Thr Phe Gln Ile
85 90 95
Met Ser Glu Met Gly Gly Lys Thr Tyr Ser Gly Val Asp Ile Ala Ala
100 105 110
Trp Asn Lys Thr Phe Met Glu Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ala Thr Trp
115 120 125
Glu Arg Ser Ile Ser Ala Val Lys Glu Ile Met Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
Lys Gly Ile Thr Phe Ala Val Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Ser Ser
145 150 155 160
Leu Val Asn Thr Ala Glu Glu Ala Val Lys Tyr Val Asp Glu Val Gly
165 170 175
Ser Pro Asn Cys Lys Ile Leu Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Asp Ser Phe Ala Gly Ala Ile Lys Leu Val Gly Asn Arg Leu Gly
195 200 205
His Phe His Val Gly Glu Ser Asn Arg Arg Pro Pro Cys Glu Asn Gly
210 215 220
Lys Met Pro Trp Asn Glu Ile Thr Asn Ala Leu Lys Glu Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Ile Lys Met Gly Gly Glu Val
245 250 255
Gly Arg Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Glu Gly Ala Ser Glu
260 265 270
Ser Glu Met Glu Gln Leu Leu Ala Asp Ala Ala Met Met Leu Arg Lys
275 280 285
Lys Met Gln Arg Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr
290 295 300
Pro Thr Pro Thr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Asp
305 310 315
<210> 15
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Asn Lys Ile Gly Val His Phe Gly Tyr Phe Asn Arg Asp Trp Asn
1 5 10 15
Thr Asp Phe Ile Lys Arg Ile Glu Gln Val Lys Lys Ile Gly Leu Asp
20 25 30
Ile Leu Glu Val Ala Pro Ala Pro Leu Leu Ala Leu Thr Lys Phe Gln
35 40 45
Arg Asp Glu Ile Ala Ala Ala Ala Lys Ala Asn Asp Ile Glu Leu Thr
50 55 60
Phe Ser Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Asp Leu Ala Ser Glu Asp Glu
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Asn Gly Ile Lys Phe Thr Thr Asp Thr Phe Gln Ile
85 90 95
Met Ser Glu Met Gly Gly Lys Thr Tyr Ser Gly Val Asp Ile Ala Ala
100 105 110
Trp Asn Lys Thr Phe Met Glu Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ala Thr Trp
115 120 125
Glu Arg Ser Ile Ser Ala Val Lys Glu Ile Met Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
Lys Gly Ile Thr Phe Ala Val Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Ser Ser
145 150 155 160
Leu Val Asn Thr Ala Glu Glu Ala Val Lys Tyr Val Asp Glu Val Gly
165 170 175
Ser Pro Asn Cys Lys Ile Leu Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Asp Ser Phe Ala Gly Ala Ile Lys Leu Val Gly Asn Arg Leu Gly
195 200 205
His Phe His Val Gly Glu Ser Asn Arg Arg Pro Pro Cys Glu Asn Gly
210 215 220
Lys Met Pro Trp Asn Glu Ile Thr Asn Ala Leu Lys Glu Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Ile Lys Met Gly Gly Glu Val
245 250 255
Gly Arg Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Glu Gly Ala Ser Glu
260 265 270
Ser Glu Met Glu Gln Leu Leu Ala Asp Ala Ala Met Met Leu Arg Lys
275 280 285
Lys Met Gln Arg Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr
290 295 300
Pro Thr Pro Thr Pro Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu
305 310 315 320
Glu Lys Leu Lys Glu Leu Phe
325
<210> 16
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Asn Lys Ile Gly Val His Phe Gly Tyr Phe Asn Arg Asp Trp Asn
1 5 10 15
Thr Asp Phe Ile Lys Arg Ile Glu Gln Val Lys Lys Ile Gly Leu Asp
20 25 30
Ile Leu Glu Val Ala Pro Ala Pro Leu Leu Ala Leu Thr Lys Phe Gln
35 40 45
Arg Asp Glu Ile Ala Ala Ala Ala Lys Ala Asn Asp Ile Glu Leu Thr
50 55 60
Phe Ser Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Asp Leu Ala Ser Glu Asp Glu
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Asn Gly Ile Lys Phe Thr Thr Asp Thr Phe Gln Ile
85 90 95
Met Ser Glu Met Gly Gly Lys Thr Tyr Ser Gly Val Asp Ile Ala Ala
100 105 110
Trp Asn Lys Thr Phe Met Glu Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ala Thr Trp
115 120 125
Glu Arg Ser Ile Ser Ala Val Lys Glu Ile Met Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
Lys Gly Ile Thr Phe Ala Val Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Ser Ser
145 150 155 160
Leu Val Asn Thr Ala Glu Glu Ala Val Lys Tyr Val Asp Glu Val Gly
165 170 175
Ser Pro Asn Cys Lys Ile Leu Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Asp Ser Phe Ala Gly Ala Ile Lys Leu Val Gly Asn Arg Leu Gly
195 200 205
His Phe His Val Gly Glu Ser Asn Arg Arg Pro Pro Cys Glu Asn Gly
210 215 220
Lys Met Pro Trp Asn Glu Ile Thr Asn Ala Leu Lys Glu Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Ile Lys Met Gly Gly Glu Val
245 250 255
Gly Arg Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Glu Gly Ala Ser Glu
260 265 270
Ser Glu Met Glu Gln Leu Leu Ala Asp Ala Ala Met Met Leu Arg Lys
275 280 285
Lys Met Gln Arg Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr
290 295 300
Pro Thr Pro Thr Pro Lys Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Glu Val Leu
305 310 315 320
Lys Glu Leu Glu Lys Leu Phe
325
<210> 17
<211> 879
<212> DNA
<213> Ruminococcus sp
<400> 17
atgaacaaga tcggagttca ttttggatat tttaacagag attggaacac agatttcatt 60
aaaagaatcg aacaggttaa gaagatcgga ctggatattc ttgaagtggc accggcaccg 120
ctgcttgcac ttacaaaatt tcagagagat gaaattgcag cagcggcaaa agcaaatgat 180
attgaactga catttagcgt gggacttagc gcaaatcaag atcttgcgag cgaagatgaa 240
gaaattagaa aaaatggaat caagttcacg acagatacat ttcagattat gtcagaaatg 300
ggaggaaaaa catatagcgg cgttgatatt gcagcgtgga ataaaacatt tatggaagga 360
attacggaca aatcagcaac atgggaaaga tcaattagcg cggttaaaga aattatgaaa 420
gttgcagaag acaagggaat tacatttgcg gttgaagttg ttaatagata tgaatcaagc 480
cttgtgaata cagcagaaga agcagttaaa tatgtggatg aagttggaag cccgaattgt 540
aaaattcttc ttgatacata ccacatgaac attgaagaag atagctttgc gggcgcgatt 600
aaactggtgg gcaatagact tggccatttt catgttggag aaagcaatag aagaccgccg 660
tgtgaaaatg gaaaaatgcc gtggaatgaa attacaaatg cacttaaaga gatcgattac 720
caaggagcga ttgtgatgga accgtttatt aaaatgggcg gagaagttgg cagagatatt 780
aaagtgtgga gagatattag cgaaggcgcg tcagaaagcg aaatggaaca gcttcttgca 840
gatgcagcaa tgatgctgag aaaaaaaatg caaagataa 879
<210> 18
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc g 51
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctggaacttg aactgaagtt aaaactggaa ttagaattaa agctgaaa 48
<210> 20
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gctggaactt 60
gaactgaagt taaaactgga attagaatta aagctgaaat aaacgcgtgc ggccgc 116
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gctggaact 59
<210> 22
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gcggccgcac gcgtttattt cagctttaat tctaattcca gttttaactt cagttcaagt 60
tccagcggcg tcgggg 76
<210> 23
<211> 907
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggatccatga acaagatcgg agttcatttt ggatatttta acagagattg gaacacagat 60
ttcattaaaa gaatcgaaca ggttaagaag atcggactgg atattcttga agtggcaccg 120
gcaccgctgc ttgcacttac aaaatttcag agagatgaaa ttgcagcagc ggcaaaagca 180
aatgatattg aactgacatt tagcgtggga cttagcgcaa atcaagatct tgcgagcgaa 240
gatgaagaaa ttagaaaaaa tggaatcaag ttcacgacag atacatttca gattatgtca 300
gaaatgggag gaaaaacata tagcggcgtt gatattgcag cgtggaataa aacatttatg 360
gaaggaatta cggacaaatc agcaacatgg gaaagatcaa ttagcgcggt taaagaaatt 420
atgaaagttg cagaagacaa gggaattaca tttgcggttg aagttgttaa tagatatgaa 480
tcaagccttg tgaatacagc agaagaagca gttaaatatg tggatgaagt tggaagcccg 540
aattgtaaaa ttcttcttga tacataccac atgaacattg aagaagatag ctttgcgggc 600
gcgattaaac tggtgggcaa tagacttggc cattttcatg ttggagaaag caatagaaga 660
ccgccgtgtg aaaatggaaa aatgccgtgg aatgaaatta caaatgcact taaagagatc 720
gattaccaag gagcgattgt gatggaaccg tttattaaaa tgggcggaga agttggcaga 780
gatattaaag tgtggagaga tattagcgaa ggcgcgtcag aaagcgaaat ggaacagctt 840
cttgcagatg cagcaatgat gctgagaaaa aaaatgcaaa gaccgacccc accgaccacg 900
ccaacgc 907
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ggatccatga acaagatcgg agttcatt 28
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcgttggcgt ggtcggtggg gtcggtcttt gcattttttt tctca 45
<210> 26
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg gctgatatcg gatccatgaa 60
caagatcgga gttcattttg gatattttaa cagagattgg aacacagatt tcattaaaag 120
aatcgaacag gttaagaaga tcggactgga tattcttgaa gtggcaccgg caccgctgct 180
tgcacttaca aaatttcaga gagatgaaat tgcagcagcg gcaaaagcaa atgatattga 240
actgacattt agcgtgggac ttagcgcaaa tcaagatctt gcgagcgaag atgaagaaat 300
tagaaaaaat ggaatcaagt tcacgacaga tacatttcag attatgtcag aaatgggagg 360
aaaaacatat agcggcgttg atattgcagc gtggaataaa acatttatgg aaggaattac 420
ggacaaatca gcaacatggg aaagatcaat tagcgcggtt aaagaaatta tgaaagttgc 480
agaagacaag ggaattacat ttgcggttga agttgttaat agatatgaat caagccttgt 540
gaatacagca gaagaagcag ttaaatatgt ggatgaagtt ggaagcccga attgtaaaat 600
tcttcttgat acataccaca tgaacattga agaagatagc tttgcgggcg cgattaaact 660
ggtgggcaat agacttggcc attttcatgt tggagaaagc aatagaagac cgccgtgtga 720
aaatggaaaa atgccgtgga atgaaattac aaatgcactt aaagagatcg attaccaagg 780
agcgattgtg atggaaccgt ttattaaaat gggcggagaa gttggcagag atattaaagt 840
gtggagagat attagcgaag gcgcgtcaga aagcgaaatg gaacagcttc ttgcagatgc 900
agcaatgatg ctgagaaaaa aaatgcaaag accgacccca ccgaccacgc caacgccacc 960
aaccacccca accccgacgc cgctggaact tgaactgaag ttaaaactgg aattagaatt 1020
aaagctgaaa taaacgcgtg cggccgcact cgagcaccac caccaccacc actgagatcc 1080
ggctgctaac aaagcccg 1098
<210> 27
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gccatggctg atatcggatc catgaacaag 60
atcgg 65
<210> 28
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cgggctttgt tagcagccgg atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag tgcggccgca 60
cgcgttta 68
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
agaatgcaaa aagtgaaatc agggggatcc atgaacaaga tcggagttca ttttgga 57
<210> 30
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tcgaggtgaa tttcgacctc tagaacgcgt ttatttcagc tttaattcta attccagttt 60
taa 63
<210> 31
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
agaatgcaaa aagtgaaatc agggggatcc atgaacaaga tcggagttca ttttggatat 60
tttaacagag attggaacac agatttcatt aaaagaatcg aacaggttaa gaagatcgga 120
ctggatattc ttgaagtggc accggcaccg ctgcttgcac ttacaaaatt tcagagagat 180
gaaattgcag cagcggcaaa agcaaatgat attgaactga catttagcgt gggacttagc 240
gcaaatcaag atcttgcgag cgaagatgaa gaaattagaa aaaatggaat caagttcacg 300
acagatacat ttcagattat gtcagaaatg ggaggaaaaa catatagcgg cgttgatatt 360
gcagcgtgga ataaaacatt tatggaagga attacggaca aatcagcaac atgggaaaga 420
tcaattagcg cggttaaaga aattatgaaa gttgcagaag acaagggaat tacatttgcg 480
gttgaagttg ttaatagata tgaatcaagc cttgtgaata cagcagaaga agcagttaaa 540
tatgtggatg aagttggaag cccgaattgt aaaattcttc ttgatacata ccacatgaac 600
attgaagaag atagctttgc gggcgcgatt aaactggtgg gcaatagact tggccatttt 660
catgttggag aaagcaatag aagaccgccg tgtgaaaatg gaaaaatgcc gtggaatgaa 720
attacaaatg cacttaaaga gatcgattac caaggagcga ttgtgatgga accgtttatt 780
aaaatgggcg gagaagttgg cagagatatt aaagtgtgga gagatattag cgaaggcgcg 840
tcagaaagcg aaatggaaca gcttcttgca gatgcagcaa tgatgctgag aaaaaaaatg 900
caaagaccga ccccaccgac cacgccaacg ccaccaacca ccccaacccc gacgccgctg 960
gaacttgaac tgaagttaaa actggaatta gaattaaagc tgaaataaac gcgttctaga 1020
ggtcgaaatt cacctcga 1038
<210> 32
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
atgagcctga caacagcgag ctcaaaaaca attgaagtgg cgacaccgag caaagaagat 60
agattttctt ttggcctttg gacagttggc tggcaagcga gagatccgtt tggagaagca 120
acaagaccgc cgctggaccc tgtggaagcg gttcataaac ttgcagaact gggagcgtat 180
ggcgtgacat ttcatgatga tgatctggtg ccgtttggaa gcagcgatgc ggaaagagcg 240
agacttattg atagattcaa aaaagcgctg gcggatacag gccttgttgt tccgatgatg 300
acaacaaatc tgtttacaca tccgattttt aaggatggag cgtttacagc gaatgataga 360
tcaattagaa gatatgcgat cagaaaagtg atgagaaatc ttgatctggc ggcagaactt 420
ggcgcaagaa catatgtttt ctggggaggc agagaaggca gcgaaattga tgcagcaaaa 480
gatattagag cagcacttga tagatataga gaagcgattg atacactggc gcaatatgtg 540
aaagatcaag gatatggaat tagatttgca ctggaaccga aaccgaatga accgagaggc 600
gatatttttc ttccgacaat tggccatgca ctggcgttta ttaatagcct tgaacatagc 660
gatatcgtgg gccttaatcc ggaagttgga catgaacaaa tgtcaaatct gaattttgtg 720
catggaattg cgcaggcact ttggcatggc aaactttttc atattgatct gaatggccag 780
catggcccga aatatgatca agatctggtt tttggacatg gcgatctgct gagcgcgttt 840
ttcctggttg atctgctgga aaatggcttt ccgggcggcg gaccggttta tgatggaccg 900
agacattttg attataaacc gatgagaaca gaagatattg atggagtgtg ggcgagcgcg 960
gcggcaaata tgagaacata tcttctgctt aaacagagag caaaagcatt tcgcgcagat 1020
ccggaagttc aagcagcact tacagcgagc agagtgccgg aacttgcggt tccgacactg 1080
ggcgaaggag aaagctatgc ggatctgctg gcggatagat cagcatggga agaatttgat 1140
gttgatagag cagcgaatca gggctatgga tatgcaagac tggatcagct tgcgattgaa 1200
catctgcttg gcgcacgcgg ataa 1224
<210> 33
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Met Ser Leu Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Ile Glu Val Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Lys Glu Asp Arg Phe Ser Phe Gly Leu Trp Thr Val Gly Trp Gln
20 25 30
Ala Arg Asp Pro Phe Gly Glu Ala Thr Arg Pro Pro Leu Asp Pro Val
35 40 45
Glu Ala Val His Lys Leu Ala Glu Leu Gly Ala Tyr Gly Val Thr Phe
50 55 60
His Asp Asp Asp Leu Val Pro Phe Gly Ser Ser Asp Ala Glu Arg Ala
65 70 75 80
Arg Leu Ile Asp Arg Phe Lys Lys Ala Leu Ala Asp Thr Gly Leu Val
85 90 95
Val Pro Met Met Thr Thr Asn Leu Phe Thr His Pro Ile Phe Lys Asp
100 105 110
Gly Ala Phe Thr Ala Asn Asp Arg Ser Ile Arg Arg Tyr Ala Ile Arg
115 120 125
Lys Val Met Arg Asn Leu Asp Leu Ala Ala Glu Leu Gly Ala Arg Thr
130 135 140
Tyr Val Phe Trp Gly Gly Arg Glu Gly Ser Glu Ile Asp Ala Ala Lys
145 150 155 160
Asp Ile Arg Ala Ala Leu Asp Arg Tyr Arg Glu Ala Ile Asp Thr Leu
165 170 175
Ala Gln Tyr Val Lys Asp Gln Gly Tyr Gly Ile Arg Phe Ala Leu Glu
180 185 190
Pro Lys Pro Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile Phe Leu Pro Thr Ile Gly
195 200 205
His Ala Leu Ala Phe Ile Asn Ser Leu Glu His Ser Asp Ile Val Gly
210 215 220
Leu Asn Pro Glu Val Gly His Glu Gln Met Ser Asn Leu Asn Phe Val
225 230 235 240
His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Trp His Gly Lys Leu Phe His Ile Asp
245 250 255
Leu Asn Gly Gln His Gly Pro Lys Tyr Asp Gln Asp Leu Val Phe Gly
260 265 270
His Gly Asp Leu Leu Ser Ala Phe Phe Leu Val Asp Leu Leu Glu Asn
275 280 285
Gly Phe Pro Gly Gly Gly Pro Val Tyr Asp Gly Pro Arg His Phe Asp
290 295 300
Tyr Lys Pro Met Arg Thr Glu Asp Ile Asp Gly Val Trp Ala Ser Ala
305 310 315 320
Ala Ala Asn Met Arg Thr Tyr Leu Leu Leu Lys Gln Arg Ala Lys Ala
325 330 335
Phe Arg Ala Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Leu Thr Ala Ser Arg Val
340 345 350
Pro Glu Leu Ala Val Pro Thr Leu Gly Glu Gly Glu Ser Tyr Ala Asp
355 360 365
Leu Leu Ala Asp Arg Ser Ala Trp Glu Glu Phe Asp Val Asp Arg Ala
370 375 380
Ala Asn Gln Gly Tyr Gly Tyr Ala Arg Leu Asp Gln Leu Ala Ile Glu
385 390 395 400
His Leu Leu Gly Ala Arg Gly
405
<210> 34
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
actttaagaa ggagatataa tgagcctgac aacagcgagc tcaaaaacaa ttgaagtggc 60
gacaccgagc aaagaagata gattttcttt tggcctttgg acagttggct ggcaagcgag 120
agatccgttt ggagaagcaa caagaccgcc gctggaccct gtggaagcgg ttcataaact 180
tgcagaactg ggagcgtatg gcgtgacatt tcatgatgat gatctggtgc cgtttggaag 240
cagcgatgcg gaaagagcga gacttattga tagattcaaa aaagcgctgg cggatacagg 300
ccttgttgtt ccgatgatga caacaaatct gtttacacat ccgattttta aggatggagc 360
gtttacagcg aatgatagat caattagaag atatgcgatc agaaaagtga tgagaaatct 420
tgatctggcg gcagaacttg gcgcaagaac atatgttttc tggggaggca gagaaggcag 480
cgaaattgat gcagcaaaag atattagagc agcacttgat agatatagag aagcgattga 540
tacactggcg caatatgtga aagatcaagg atatggaatt agatttgcac tggaaccgaa 600
accgaatgaa ccgagaggcg atatttttct tccgacaatt ggccatgcac tggcgtttat 660
taatagcctt gaacatagcg atatcgtggg ccttaatccg gaagttggac atgaacaaat 720
gtcaaatctg aattttgtgc atggaattgc gcaggcactt tggcatggca aactttttca 780
tattgatctg aatggccagc atggcccgaa atatgatcaa gatctggttt ttggacatgg 840
cgatctgctg agcgcgtttt tcctggttga tctgctggaa aatggctttc cgggcggcgg 900
accggtttat gatggaccga gacattttga ttataaaccg atgagaacag aagatattga 960
tggagtgtgg gcgagcgcgg cggcaaatat gagaacatat cttctgctta aacagagagc 1020
aaaagcattt cgcgcagatc cggaagttca agcagcactt acagcgagca gagtgccgga 1080
acttgcggtt ccgacactgg gcgaaggaga aagctatgcg gatctgctgg cggatagatc 1140
agcatgggaa gaatttgatg ttgatagagc agcgaatcag ggctatggat atgcaagact 1200
ggatcagctt gcgattgaac atctgcttgg cgcacgcgga ccgaccccac cgaccacgcc 1260
aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gctggaactt gaactgaagt taaaactgga 1320
attagaatta aagctgaaat aaactcgagc accaccacca ccaccactga gatc 1374
<210> 35
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Met Ser Leu Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Ile Glu Val Ala Thr Pro
1 5 10 15
Ser Lys Glu Asp Arg Phe Ser Phe Gly Leu Trp Thr Val Gly Trp Gln
20 25 30
Ala Arg Asp Pro Phe Gly Glu Ala Thr Arg Pro Pro Leu Asp Pro Val
35 40 45
Glu Ala Val His Lys Leu Ala Glu Leu Gly Ala Tyr Gly Val Thr Phe
50 55 60
His Asp Asp Asp Leu Val Pro Phe Gly Ser Ser Asp Ala Glu Arg Ala
65 70 75 80
Arg Leu Ile Asp Arg Phe Lys Lys Ala Leu Ala Asp Thr Gly Leu Val
85 90 95
Val Pro Met Met Thr Thr Asn Leu Phe Thr His Pro Ile Phe Lys Asp
100 105 110
Gly Ala Phe Thr Ala Asn Asp Arg Ser Ile Arg Arg Tyr Ala Ile Arg
115 120 125
Lys Val Met Arg Asn Leu Asp Leu Ala Ala Glu Leu Gly Ala Arg Thr
130 135 140
Tyr Val Phe Trp Gly Gly Arg Glu Gly Ser Glu Ile Asp Ala Ala Lys
145 150 155 160
Asp Ile Arg Ala Ala Leu Asp Arg Tyr Arg Glu Ala Ile Asp Thr Leu
165 170 175
Ala Gln Tyr Val Lys Asp Gln Gly Tyr Gly Ile Arg Phe Ala Leu Glu
180 185 190
Pro Lys Pro Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile Phe Leu Pro Thr Ile Gly
195 200 205
His Ala Leu Ala Phe Ile Asn Ser Leu Glu His Ser Asp Ile Val Gly
210 215 220
Leu Asn Pro Glu Val Gly His Glu Gln Met Ser Asn Leu Asn Phe Val
225 230 235 240
His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Trp His Gly Lys Leu Phe His Ile Asp
245 250 255
Leu Asn Gly Gln His Gly Pro Lys Tyr Asp Gln Asp Leu Val Phe Gly
260 265 270
His Gly Asp Leu Leu Ser Ala Phe Phe Leu Val Asp Leu Leu Glu Asn
275 280 285
Gly Phe Pro Gly Gly Gly Pro Val Tyr Asp Gly Pro Arg His Phe Asp
290 295 300
Tyr Lys Pro Met Arg Thr Glu Asp Ile Asp Gly Val Trp Ala Ser Ala
305 310 315 320
Ala Ala Asn Met Arg Thr Tyr Leu Leu Leu Lys Gln Arg Ala Lys Ala
325 330 335
Phe Arg Ala Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Leu Thr Ala Ser Arg Val
340 345 350
Pro Glu Leu Ala Val Pro Thr Leu Gly Glu Gly Glu Ser Tyr Ala Asp
355 360 365
Leu Leu Ala Asp Arg Ser Ala Trp Glu Glu Phe Asp Val Asp Arg Ala
370 375 380
Ala Asn Gln Gly Tyr Gly Tyr Ala Arg Leu Asp Gln Leu Ala Ile Glu
385 390 395 400
His Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro
405 410 415
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
420 425 430
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
435 440
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
atctgcttgg cgcacgcgga ccgaccccac cgaccacgc 39
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gcgtggtcgg tggggtcggt ccgcgtgcgc caagcagat 39
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
actttaagaa ggagatatac atatgagcct gacaacagcg 40
<210> 39
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gatctcagtg gtggtggtgg tggtgctcga gtgcggccgc ttatttcagc tttaattcta 60
at 62
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ctgctgctgc tgctgctgaa agat 24
<210> 41
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gaatggctga aagctttcta cgaaaaagtt ctggaaaaac tgaaagaact gttc 54
<210> 42
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aaatggctgg aagcattcta taaagaagtt ctgaaagaac tggaaaaact gttt 54
<210> 43
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gctgctgctg 60
ctgctgctga aagattaaac gcgtgcggcc gc 92
<210> 44
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gctctgctgc 60
tgctgctgct gaaagat 77
<210> 45
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gcggccgcac gcgtttaatc tttcagcagc agcagcagca gagcggcgtc ggggttgggg 60
tggttggtgg cgttggcgt 79
<210> 46
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc ggaatggctg 60
aaagctttct acgaaaaagt tctggaaaaa ctgaaagaac tgttctaaac gcgtgcggcc 120
gc 122
<210> 47
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gctgaatggc 60
tgaaagc 67
<210> 48
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gcggccgcac gcgtttagaa cagctctttc agcttttcca gcactttttc gtagaacgct 60
ttcagccatt cagcggcgtc ggg 83
<210> 49
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gaaatggctg 60
gaagcattct ataaagaagt tctgaaagaa ctggaaaaac tgttttaaac gcgtgcggcc 120
gc 122
<210> 50
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gctaaatggc 60
tggaagcgtt cta 73
<210> 51
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gcggccgcac gcgtttaaaa cagtttttcc agttctttca ggacttcttt atagaacgct 60
tccagccatt tagcggcgtc ggggttg 87
<210> 52
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg gctgatatcg gatccatgaa 60
caagatcgga gttcattttg gatattttaa cagagattgg aacacagatt tcattaaaag 120
aatcgaacag gttaagaaga tcggactgga tattcttgaa gtggcaccgg caccgctgct 180
tgcacttaca aaatttcaga gagatgaaat tgcagcagcg gcaaaagcaa atgatattga 240
actgacattt agcgtgggac ttagcgcaaa tcaagatctt gcgagcgaag atgaagaaat 300
tagaaaaaat ggaatcaagt tcacgacaga tacatttcag attatgtcag aaatgggagg 360
aaaaacatat agcggcgttg atattgcagc gtggaataaa acatttatgg aaggaattac 420
ggacaaatca gcaacatggg aaagatcaat tagcgcggtt aaagaaatta tgaaagttgc 480
agaagacaag ggaattacat ttgcggttga agttgttaat agatatgaat caagccttgt 540
gaatacagca gaagaagcag ttaaatatgt ggatgaagtt ggaagcccga attgtaaaat 600
tcttcttgat acataccaca tgaacattga agaagatagc tttgcgggcg cgattaaact 660
ggtgggcaat agacttggcc attttcatgt tggagaaagc aatagaagac cgccgtgtga 720
aaatggaaaa atgccgtgga atgaaattac aaatgcactt aaagagatcg attaccaagg 780
agcgattgtg atggaaccgt ttattaaaat gggcggagaa gttggcagag atattaaagt 840
gtggagagat attagcgaag gcgcgtcaga aagcgaaatg gaacagcttc ttgcagatgc 900
agcaatgatg ctgagaaaaa aaatgcaaag accgacccca ccgaccacgc caacgccacc 960
aaccacccca accccgacgc cgctgctgct gctgctgctg aaagattaaa cgcgtgcggc 1020
cgcactcgag caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccg 1074
<210> 53
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg gctgatatcg gatccatgaa 60
caagatcgga gttcattttg gatattttaa cagagattgg aacacagatt tcattaaaag 120
aatcgaacag gttaagaaga tcggactgga tattcttgaa gtggcaccgg caccgctgct 180
tgcacttaca aaatttcaga gagatgaaat tgcagcagcg gcaaaagcaa atgatattga 240
actgacattt agcgtgggac ttagcgcaaa tcaagatctt gcgagcgaag atgaagaaat 300
tagaaaaaat ggaatcaagt tcacgacaga tacatttcag attatgtcag aaatgggagg 360
aaaaacatat agcggcgttg atattgcagc gtggaataaa acatttatgg aaggaattac 420
ggacaaatca gcaacatggg aaagatcaat tagcgcggtt aaagaaatta tgaaagttgc 480
agaagacaag ggaattacat ttgcggttga agttgttaat agatatgaat caagccttgt 540
gaatacagca gaagaagcag ttaaatatgt ggatgaagtt ggaagcccga attgtaaaat 600
tcttcttgat acataccaca tgaacattga agaagatagc tttgcgggcg cgattaaact 660
ggtgggcaat agacttggcc attttcatgt tggagaaagc aatagaagac cgccgtgtga 720
aaatggaaaa atgccgtgga atgaaattac aaatgcactt aaagagatcg attaccaagg 780
agcgattgtg atggaaccgt ttattaaaat gggcggagaa gttggcagag atattaaagt 840
gtggagagat attagcgaag gcgcgtcaga aagcgaaatg gaacagcttc ttgcagatgc 900
agcaatgatg ctgagaaaaa aaatgcaaag accgacccca ccgaccacgc caacgccacc 960
aaccacccca accccgacgc cggaatggct gaaagctttc tacgaaaaag ttctggaaaa 1020
actgaaagaa ctgttctaaa cgcgtgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg 1080
agatccggct gctaacaaag cccg 1104
<210> 54
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg gctgatatcg gatccatgaa 60
caagatcgga gttcattttg gatattttaa cagagattgg aacacagatt tcattaaaag 120
aatcgaacag gttaagaaga tcggactgga tattcttgaa gtggcaccgg caccgctgct 180
tgcacttaca aaatttcaga gagatgaaat tgcagcagcg gcaaaagcaa atgatattga 240
actgacattt agcgtgggac ttagcgcaaa tcaagatctt gcgagcgaag atgaagaaat 300
tagaaaaaat ggaatcaagt tcacgacaga tacatttcag attatgtcag aaatgggagg 360
aaaaacatat agcggcgttg atattgcagc gtggaataaa acatttatgg aaggaattac 420
ggacaaatca gcaacatggg aaagatcaat tagcgcggtt aaagaaatta tgaaagttgc 480
agaagacaag ggaattacat ttgcggttga agttgttaat agatatgaat caagccttgt 540
gaatacagca gaagaagcag ttaaatatgt ggatgaagtt ggaagcccga attgtaaaat 600
tcttcttgat acataccaca tgaacattga agaagatagc tttgcgggcg cgattaaact 660
ggtgggcaat agacttggcc attttcatgt tggagaaagc aatagaagac cgccgtgtga 720
aaatggaaaa atgccgtgga atgaaattac aaatgcactt aaagagatcg attaccaagg 780
agcgattgtg atggaaccgt ttattaaaat gggcggagaa gttggcagag atattaaagt 840
gtggagagat attagcgaag gcgcgtcaga aagcgaaatg gaacagcttc ttgcagatgc 900
agcaatgatg ctgagaaaaa aaatgcaaag accgacccca ccgaccacgc caacgccacc 960
aaccacccca accccgacgc cgaaatggct ggaagcattc tataaagaag ttctgaaaga 1020
actggaaaaa ctgttttaaa cgcgtgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg 1080
agatccggct gctaacaaag cccg 1104
<210> 55
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tcgaggtgaa tttcgacctc tagaacgcgt ttatctttgc attttttttc tca 53
<210> 56
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
agaatgcaaa aagtgaaatc agggggatcc atgaacaaga tcggagttca ttttggatat 60
tttaacagag attggaacac agatttcatt aaaagaatcg aacaggttaa gaagatcgga 120
ctggatattc ttgaagtggc accggcaccg ctgcttgcac ttacaaaatt tcagagagat 180
gaaattgcag cagcggcaaa agcaaatgat attgaactga catttagcgt gggacttagc 240
gcaaatcaag atcttgcgag cgaagatgaa gaaattagaa aaaatggaat caagttcacg 300
acagatacat ttcagattat gtcagaaatg ggaggaaaaa catatagcgg cgttgatatt 360
gcagcgtgga ataaaacatt tatggaagga attacggaca aatcagcaac atgggaaaga 420
tcaattagcg cggttaaaga aattatgaaa gttgcagaag acaagggaat tacatttgcg 480
gttgaagttg ttaatagata tgaatcaagc cttgtgaata cagcagaaga agcagttaaa 540
tatgtggatg aagttggaag cccgaattgt aaaattcttc ttgatacata ccacatgaac 600
attgaagaag atagctttgc gggcgcgatt aaactggtgg gcaatagact tggccatttt 660
catgttggag aaagcaatag aagaccgccg tgtgaaaatg gaaaaatgcc gtggaatgaa 720
attacaaatg cacttaaaga gatcgattac caaggagcga ttgtgatgga accgtttatt 780
aaaatgggcg gagaagttgg cagagatatt aaagtgtgga gagatattag cgaaggcgcg 840
tcagaaagcg aaatggaaca gcttcttgca gatgcagcaa tgatgctgag aaaaaaaatg 900
caaagataaa cgcgttctag aggtcgaaat tcacctcga 939
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 57
Val Pro Gly Xaa Gly
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 58
Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly
1 5 10
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 59
Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly
1 5 10 15
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 60
Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Xaa Gly
20

Claims (12)

1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体，包含：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和自聚集短肽；所述自聚集短肽为口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、人β-淀粉样蛋白Aβ42、麦芽糖结合蛋白MalE、麦芽糖结合蛋白突变体MalE31、纤维素结合域、类弹性蛋白多肽、ELK16(SEQ IDNO.2)、L6KD(SEQ ID NO.3)、18A(SEQ ID NO.4)和R18A(SEQ ID NO.5)中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体，其特征在于：
所述自聚集短肽为ELK16和L6KD中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体，其特征在于：所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体还包含连接肽。
4.根据权利要求3所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体，其特征在于：
所述连接肽位于所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和所述自聚集短肽之间。
5.编码权利要求1～4中任一项所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的核酸分子。
6.一种重组载体，包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种工程菌，包含权利要求6所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为真核细胞和原核细胞中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于：
所述工程菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的至少一种。
10.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体的制备方法，采用权利要求7～9中任一项所述的工程菌发酵得到。
11.权利要求1～4中任一项所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体在制备D-阿洛酮糖中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体与果糖混合，反应，得到D-阿洛酮糖。
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