CN105906719A - 一种自聚肽融合cd151蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

一种自聚肽融合cd151蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105906719A
CN105906719A CN201610301779.XA CN201610301779A CN105906719A CN 105906719 A CN105906719 A CN 105906719A CN 201610301779 A CN201610301779 A CN 201610301779A CN 105906719 A CN105906719 A CN 105906719A
Authority
CN
China
Prior art keywords
prrsv
albumen
protein
virus
autohemagglutination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610301779.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105906719B (zh
Inventor
孙怀昌
宗晓银
李洋洋
张鑫宇
夏晓莉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Taizhou Animal Drug Engineering Technology Center
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201610301779.XA priority Critical patent/CN105906719B/zh
Publication of CN105906719A publication Critical patent/CN105906719A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105906719B publication Critical patent/CN105906719B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术研究领域，具体涉及一种自聚肽融合CD151蛋白及其制备方法和应用。所述的自聚肽融合CD151蛋白由猪CD151蛋白PRRSV结合片段和ELK16自聚肽组成，其制备方法包括表达载体构建、融合蛋白表达与纯化、PRRSV结合片段确定以及病毒浓缩、纯化和检测。所述自聚肽融合CD151蛋白可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)浓缩、纯化和环境监测中。与其他方法相比，用本发明的自聚肽融合CD151蛋白浓缩、纯化和检测PRRSV具有敏感、简单和经济等优点，不仅可用于组织样品的PRRSV浓缩和纯化，还可用于环境样品的PRRSV检测和分离培养。

Description

一种自聚肽融合CD151蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术研究领域，具体涉及一种自聚肽融合CD151蛋白的制备方法及其在猪繁殖与呼吸综合征病毒浓缩、纯化和环境监测中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触和免疫抑制性传染病，以母猪繁殖障碍、青年猪死亡率高和所有年龄猪呼吸道症状为特征，给世界养猪业造成巨大的经济损失。目前PRRS主要用疫苗免疫进行控制，但灭活苗免疫保护效果不佳，活疫苗存在安全隐患。病毒浓缩与纯化是抗体和疫苗制备的重要环节，现有的PRRSV纯化方法主要有密度梯度离心法、超滤膜过滤法和亲和层析法，但这些方法均存在费时、费力、回收率低和费用高等缺点。PRRSV能通过垂直和水平两种方式传播，水平传播包括接触病毒感染猪的唾液、鼻液、乳汁、精液、污染物和污水等，因此环境监测是控制PRRSV流行传播的重要环节。尽管RT-PCR可用于感染组织样品的PRRSV检测，但污水、粪尿等环境样品不仅病毒滴度低，而且存在RT-PCR反应抑制物。尽管经典的超速离心、聚乙二醇沉淀和吸附/洗脱可用于PRRSV浓缩，但这些方法不仅耗时、敏感性低，而且也能浓缩RT-PCR反应抑制物。
受体结合与磁珠捕捉技术(Receptor-binding capture and magneticsequestration)是近几年出现的病毒浓缩与纯化新技术，其基本原理是利用病毒与受体结合的特异性，用病毒受体蛋白偶联磁珠捕获病毒。尽管该技术具有快速、高效等优点，已成功用于食品、污水等环境样品的病毒浓缩与检测，但磁珠价格较贵，而且需用专门设备，其实际应用受到限制。自聚肽(Self-aggregating peptide)能在水溶液中自动装配成聚合物，其融合蛋白在重组大肠杆菌内能形成活性包涵体，不仅能用离心等简单方法分离纯化，而且能直接用于体外实验，但能否用于病毒捕捉尚无研究报道。
CD151是PRRSV受体之一。本发明将CD151蛋白胞外区与ELK16自聚肽在大肠杆菌中融合表达，将纯化的融合蛋白用于PRRSV浓缩、纯化和环境监测。尽管这种策略是容易想到的，但在具体设计时却面临以下技术问题：自聚肽融合CD151蛋白能否在大肠杆菌中表达、表达的融合蛋白能否保持PRRSV结合活性、结合PRRSV的最小片段是什么、最佳结合和洗脱条件是什么、能否用于PRRSV的浓缩、纯化与环境监测？
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种自聚肽融合CD151蛋白及其制备方法与应用。
本发明的自聚肽融合CD151蛋白，由CD151蛋白PRRSV结合区与ELK16自聚肽组成。经病毒滴定证明，利用该融合蛋白能从病毒感染细胞和模拟污染环境样品中浓缩、纯化和检测PRRSV。
本发明所述的自聚肽融合CD151蛋白用下列方法制备：
(1)将PT连接头和ELK16编码序列插入pET-30a载体，获得融合表达载体pET-PT16；
(2)将PCR克隆的猪CD151蛋白第158～220位氨基酸(C63)编码序列插入pET-PT16载体，获得重组载体pC63-PT16；
(3)将重组载体pC63-PT16转化大肠杆菌，在37℃诱导融合蛋白表达；
(3)用14000g离心沉淀融合蛋白；
(4)用0.2％TritonX-100离心洗涤融合蛋白。
其中步骤(2)是：CD151蛋白C63片段具有PRRSV结合活性。
本发明还公布了所述的自聚肽融合CD151蛋白在PRRSV浓缩、纯化和环境监测中的应用，其具体方法如下：
(1)将75μg/ml自聚肽融合CD151蛋白与PRRSV感染细胞或模拟污染环境水样混合，28℃孵育60min；
(2)用14000g离心沉淀蛋白-病毒复合物；
(3)用pH5.0缓冲液洗脱病毒；
(4)用14000g离心去除自聚肽融合CD151蛋白；
(5)用病毒滴定法检测PRRSV。
进一步地，公开了上述自聚肽融合CD151蛋白在PRRSV浓缩、纯化和环境监测中的应用。
本发明采用了以下方法对所自聚肽融合CD151蛋白进行验证：
(1)按照常规方法进行Marc-145细胞PRRSV感染，感染后收集细胞培养上清和裂解细胞；
(2)将不同剂量PRRSV接种自来水、细菌裂解液、猪尿液和粪便悬浮液，获得模拟PRRSV污染环境样品；
(3)将75μg/ml融合蛋白与PRRSV感染细胞或模拟污染环境样品混合，28℃孵育60min；
(2)用14000g离心沉淀蛋白-病毒复合物；
(3)用pH5.0缓冲液洗脱病毒；
(4)用14000g离心去除融合蛋白；
(5)用病毒滴定法检测PRRSV。
本发明将容易导致不溶性表达的CD151蛋白跨膜区去除，分别将胞外区及其两个片段克隆入不同自聚肽融合表达载体，以确保融合蛋白表达；分别将不同融合蛋白与PRRSV进行共孵育，用病毒滴定法检测与病毒结合；对融合蛋白结合PRRSV及洗脱条件进行优化，以便洗脱病毒不被灭活；分别将PRRSV接种自来水、细菌裂解液、猪尿液和粪便悬浮液，用融合蛋白回收病毒，以验证融合蛋白能否用于PRRSV污染环境样品监测。与现有的其他方法相比，用本发明的自聚肽融合CD151蛋白浓缩、纯化和检测PRRSV具有敏感、简单和经济等优点，不仅可用于组织样品PRRSV浓缩与纯化，还可用于环境样品PRRSV检测和分离培养。
附图说明
图1是融合蛋白表达载体的结构示意图。PT7是T7启动子，RBS是核糖体结合位点，His-Tag是组氨酸标签，PT是由17个脯氨酸(P)或苏氨酸(T)组成的PT连接头，ELK16为自聚肽编码序列，Target指目的基因序列。
图2是猪CD151蛋白结构及其片段表达策略示意图。LEL是CD151胞外区，从115位酪氨酸(Y115)开始到220位亮氨酸(L220)结束；N63为CD151胞外区前63个氨基酸片段，从115位酪氨酸(Y115)开始到177位天冬氨酸(D177)结束；C63为CD151胞外区后63个氨基酸片段，从158位丝氨酸(S158)开始到220位亮氨酸(L220)结束。
图3是自聚肽融合CD151蛋白表达与纯化电泳图。M为蛋白质分子量Marker，1是重组菌裂解物，2是裂解重组菌上清，3是裂解重组菌沉淀，4是纯化的融合蛋白。
图4是自聚肽融合CD151蛋白结合PRRSV的RT-PCT检测。M是DNA Marker；1是PRRSV阳性对照，2是His-CD151融合蛋白沉淀病毒，3是ELK16-N63融合蛋白沉淀病毒，4是ELK16-ELE融合蛋白沉淀病毒，5是C63-ELK16融合蛋白沉淀病毒，6是ELK16-BoIFNg融合蛋白沉淀病毒阴性对照。
具体实施方式
生物材料来源：
1.pET-30a载体：从美国Novagen公司引进，本实验室保存。
2.DH5a大肠杆菌：从美国BD Biosciences Clontech公司引进，本实验室保存。
3.BL21(DE3)大肠杆菌：从美国Novagen公司引进，本实验室保存。
4.VR2332株PRRSV：从美国ATCC引起，本实验室保存。
5.Marc-145细胞：从美国ATCC引起，本实验室保存。
6.pET-IgV-CD151载体：本实验室构建(文献：张钰，孙怀昌，黄燕燕，等.猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用.扬州大学学报(农业与生命科学版)，2012，33(2):1-5)。
7.ELK16-BoIFNg融合蛋白：本实验室制备(文献：李光亚.自凝肽融合烟草蚀纹病毒蛋白酶的表达、纯化、活性检测与应用.扬州大学硕士学位论文，2016)。
具体操作步骤如下：
1.融合表达载体构建
(1)根据标准密码子表，将PT连接头和ELK16氨基酸序列(文献：Wei Wu,Lei Xing,Bihong Zhou,et al.Active protein aggregates induced by terminally attachedself-assembling peptide ELK16in Escherichia coli.Microbial Cell Factories2011,10:9)推导成核苷酸序列，分别以PT-ELK16(简称PT16)和PT-ELK16-PT(简称P16P)两种连接方式，将序列送南京金瑞斯生物科技有限公司合成，分别克隆在pUC57载体(美国Addgene公司)中。
5-GGATCCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGACCCCGCTGGAACTGGAACTGAAACTGAAACTGGAACTGGAACTGAAACTGAAATAACTCGAG-3(PT16，SEQ ID No.1)；
5-AGATCTCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGACCCCGCTGGAACTGGAACTGAAACTGAAACTGGAACTGGAACTGAAACTGAAACCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGACCCCGTAAGGTACC-3(P16P，SEQ ID No.2)。
(2)用限制酶BamHI和XhoI消化法将PT16序列从pUC57载体上切下，插入pET-30a的相应位点，获得融合表达载体pET-PT16(图1)。
(3)用限制酶BglII和KpnI消化法将P16P序列从pUC57载体上切下，克隆入pET-30a的相应位点，获得融合表达载体pET-P16P(图1)。
(4)根据猪CD151mRNA序列(GenBank:AK240006)设计下列1对引物，正向引物引入EcoRI酶切位点，反向引物引入XhoI酶切位点：
正向引物：5-TCGAATTCTACCAGCAGCTGAGTGCAG-3(SEQ ID No.3)；
反向引物：5-TACTCGAGTTACAGGTGCTCCCGGATGAA-3(SEQ ID No.4)。
以pET-IgV-CD151为模板，按照LA Taq DNA聚合酶(Fermentas公司)说明书，用PCR扩增CD151胞外区(LEL)编码序列(图2)；用限制酶EcoRI和XhoI消化PCR产物，与相同酶切pET-P16P载体连接，获得重组载体pP16P-LEL。
(5)根据猪CD151mRNA序列设计下列1对引物，正向引物引入EcoRI酶切位点，反向引物引入XhoI酶切位点：
正向引物：5-TCGAATTCTACCAGCAGCTGAGTGCAG-3(SEQ ID No.5)；
反向引物：5-TACTCGAGTTAGTCGCCTGCCTCACCCGA-3(SEQ ID No.6)。
以pET-IgV-CD151为模板，按照LA Taq DNA聚合酶说明书，用PCR扩增CD151胞外区前63个氨基酸(N63)基因片段(图2)；用限制酶EcoRI和XhoI消化PCR产物，与相同酶切pET-P16P载体连接，获得重组载体pP16P-N63。
(6)根据猪CD151mRNA序列设计下列1对引物，正向引物引入NdeI酶切位点，反向引物引入KpnI酶切位点：
正向引物：5-TCCATATGAGCAACAACTCCCAGGACT-3(SEQ ID No.7)；
反向引物：5-TAGGTACCCAGGTGCTCCCGGATGAA-3(SEQ ID No.8)。
以pET-IgV-CD151为模板，按照LA Taq DNA聚合酶说明书，用PCR扩增猪CD151胞外区后63个氨基酸(C63)基因片段(图2)；用限制酶NdeI和KpnI消化PCR产物，与相同酶切pET-PT16载体连接，获得重组载体pC63-PT16。
2.融合蛋白表达与纯化
(1)分别将重组载体pP16P-LEL、pP16P-N63和pC63-PT16转化BL21(DE3)大肠杆菌，在卡那霉素(50μg/mL)LB平板上培养过夜；挑取单菌落接种卡那霉素LB培养液，37℃摇床培养过夜；按1：100比例接种卡那霉素2×YT培养液(Tryptone 16g，Yeast extract 10g，NaCl5g，调节pH7.4，加去离子水至1L)，37℃摇床培养至OD600＝0.5，加入0.2mmol/L IPTG，37℃诱导表达6h。
(2)将细菌培养4℃、4000g离心10min，沉淀用细菌裂解液(50mM Tris-HCl,50mMNaCl,1mM EDTA，5％甘油，pH7.2)离心洗涤3次，用细菌裂解液悬浮，超声波裂解(20W，10s，停15s，3min)，4℃、14000g离心20min；沉淀蛋白用含0.2％Triton X-100细菌裂解液离心洗涤3次，用细菌裂解液离心洗涤3次。SDS-PAGE分析结果显示：pP16P-LEL、pP16P-N63和pC63-PT16重组菌能表达预期的24kDa、20kDa和12kDa ELK16-LEL、ELK16-N63和C63-ELK16融合蛋白；经过3次离心洗涤后，纯化融合蛋白为单一蛋白条带(图3)。
3.CD151蛋白PRRSV结合区的确定
(1)用细菌裂解液分别将ELK16-LEL、ELK16-N63和C63-ELK16融合蛋白稀释为500μg/mL，各取100μL与等量PRRSV(106TCID50)混合，4℃孵育60min，设His-CD151融合蛋白阳性对照，ELK16-BoIFNg融合蛋白阴性对照；4℃、14000g离心20min，离心沉淀用细菌裂解液离心洗涤3次，分别用100μL悬浮。
(2)按照RNAisoTMPlus试剂盒(TaKaRa公司)说明书提取病毒RNA，按照RevertAidTMReverse Transcriptase(Fermentas公司)使用说明书进行反转录，根据PRRSV ORF7基因序列(GenBank:EF473139.1)设计下列1对引物：
正向引物：5-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3(SEQ ID No.9)；
反向引物：5-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3(SEQ ID No.10)。
(3)以上述反转录产物为模板，按照rTaq DNA polymerase(TaKaRa公司)说明书进行PCR扩增，PCR程序为：94℃/5min；94℃/30s，56℃/30s，72℃/30s，30次循环；72℃/10min。琼脂糖凝胶电泳分析结果显示：从His-CD151、ELK16-LEL和C63-ELK16融合蛋白沉淀中可以扩增出PRRSV ORF7基因片段，在ELK16-N63和ELK16-BoIFNg融合蛋白沉淀中不能扩增出此基因片段(图4)，表明CD151蛋白及其C63片段含PRRSV结合区。
4.C63-ELK16融合蛋白结合PRRSV的条件优化
(1)用细菌裂解液将C63-ELK16融合蛋白稀释至0、25、50、75、100μg/mL，各取100μL与等量PRRSV混合，4℃孵育60min，4℃、14000g离心20min，离心沉淀用PBS离心洗涤3次，用PBS溶解，在Marc-145细胞上进行病毒滴定(文献：Jacobs AC,Hermann JR,Munoz-Zanzi C,Prickett JR,Roof MB,Yoon KJ,Zimmerman JJ.Stability of porcine reproductiveand respiratory syndrome virus at ambient temperatures.Journal of VeterinaryDiagnostic Investigation,2010,22:257-260)。结果显示：C63-ELK16融合蛋白结合PRRSV的最佳浓度为75μg/mL。
(2)将100μL(75μg/ml)C63-ELK16融合蛋白与等量PRRSV混合，分别在4、16、28、37℃孵育60min，如前进行离心沉淀、洗涤和病毒滴定。结果显示:C63-ELK16融合蛋白结合PRRSV的最佳温度为28℃。
(3)分别用pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0细菌裂解液将C63-ELK16融合蛋白稀释至75μg/mL，各取100μL与等量PRRSV混合，28℃孵育60min，如前进行离心沉淀、洗涤和病毒滴定。结果显示：C63-ELK16融合蛋白结合PRRSV的最佳pH为7.0.
(4)用pH7.0细菌裂解液将C63-ELK16融合蛋白稀释至75μg/mL，取100μL与等量PRRSV混合，在28℃分别孵育15、30、45、60、90min，如前进行离心沉淀、洗涤和病毒滴定。结果显示：C63-ELK16融合蛋白结合PRRSV的最佳时间为60min。
5.PRRSV洗脱条件的优化
(1)在最佳条件下用C63-ELK16融合蛋白从感染细胞裂解液中沉淀PRRSV，沉淀病毒用菌体裂解液离心洗涤3次，分别用pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0PBS溶解，4℃孵育60min；用2倍浓度pH7.0PBS中和，4℃、14000g离心20min。病毒滴定结果显示：从C63-ELK16融合蛋白洗脱PRRSV的最佳pH为5.0。
(2)用C63-ELK16融合蛋白从感染细胞裂解液中沉淀PRRSV，沉淀病毒用菌体裂解液离心洗涤3次，沉淀病毒用pH5.0PBS溶解，分别在4、16、28、37℃洗脱10min。病毒滴定结果显示：从C63-ELK16融合蛋白洗脱PRRSV的最佳温度为28℃.
(3)用C63-ELK16融合蛋白从感染细胞裂解液中沉淀PRRSV，沉淀病毒用菌体裂解液离心洗涤3次，用pH5.0PBS溶解，分别在28℃洗脱5、10、15、30、45、60、90min，如前进行离心。病毒滴定结果显示：从C63-ELK16融合蛋白洗脱PRRSV的最佳时间为10min。
6.自聚肽融合CD151蛋白的应用
(1)按照常规方法培养Marc-145细胞，在90％细胞密度时进行PRRSV感染，感染后48h收集细胞培养上清，1000g离心5min；加入同体积PBS，反复冻融细胞3次，1000g离心5min；用PBS(pH7.0)将C63-ELK16融合蛋白稀释为75μg/mL，各取30μL与等体积PRRSV感染细胞上清或裂解细胞混合，在最佳条件下(pH7.0，28℃，60min)沉淀PRRSV，病毒滴定结果显示：PRRSV回收率分别为70.6％和64.3％。在最佳条件(pH5.0,28℃,10min)下进行PRRSV洗脱，用2倍浓度pH7.0PBS中和，4℃、14000g离心20min。病毒滴定结果显示：洗脱后PRRSV回收率分别52.9％和56.3％。
(2)按照常规方法培养大肠杆菌，37℃培养过夜后离心，细菌沉淀用pH7.0PBS悬浮，超声波裂解，离心收集上清液；向大肠杆菌裂解液加入103、104、105PFU/mL PRRSV，各取30μL与等体积C63-ELK16融合蛋白(75μg/ml)混合，在最佳沉淀条件下沉淀(pH7.0，28℃，60min)和洗脱(pH5.0，28℃，10min)病毒。病毒滴定结果显示：从≥103PFU/mL PRRSV细菌裂解液能回收到病毒，从103PFU/mL PRRSV细菌裂解液沉淀病毒的回收率为69.5％。
(2)向自来水加入103、104或105PFU/mL PRRSV，各取30μL与等体积C63-ELK16融合蛋白(75μg/ml)混合，在最佳沉淀条件下沉淀(pH7.0，28℃，60min)和洗脱(pH5.0，28℃，10min)病毒。病毒滴定结果显示：从≥103PFU/mL PRRSV自来水均能回收到病毒，从103PFU/mL PRRSV自来水沉淀病毒的回收率为62.4％。
(3)将1mL猪尿液用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，加入105PFU/mL PRRSV，各取30μL与等体积C63-ELK16融合蛋白(75μg/ml)混合，在最佳沉淀条件下沉淀(pH7.0，28℃，60min)和洗脱(pH5.0，28℃，10min)病毒。病毒滴定结果显示：从猪尿液中沉淀PRRSV的回收率为57.6％。
(4)将0.5g猪粪便用5mL PBS(pH7.0)悬浮，4℃、14000g离心20min，上清用0.2μm微孔滤膜过滤除菌；加入105PFU/mL PRRSV，各取30μL与等体积C63-ELK16融合蛋白(75μg/ml)混合，在最佳沉淀条件下沉淀(pH7.0，28℃，60min)和洗脱(pH5.0，28℃，10min)病毒。病毒滴定结果显示：从猪粪便悬浮液中沉淀PRRSV的回收率为50.7％。

Claims (6)

1.一种自聚肽融合CD151蛋白，其特征在于，由猪CD151蛋白PRRSV结合片段和ELK16自聚肽组成。
2.一种制备权利要求1所述自聚肽融合CD151蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将PT连接头和ELK16自聚肽编码序列插入pET-30a表达载体，获得融合表达载体pET-PT16；
(2)将PCR克隆的猪CD151蛋白第158～220位氨基酸编码序列插入pET-PT16载体，获得重组载体pC63-PT16；
(3)将重组载体pC63-PT16转化大肠杆菌，在37℃诱导融合蛋白表达；
(3)用14000g离心沉淀融合蛋白；
(4)用0.2％TritonX-100离心洗涤融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)是：CD151蛋白第158～220位氨基酸编码序列具有PRRSV结合活性。
4.权利要求1所述的自聚肽融合CD151蛋白在PRRSV浓缩、纯化和环境监测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于。具体方法如下:
(1)将75μg/ml自聚肽融合CD151蛋白与PRRSV感染细胞或模拟污染环境水样混合，28℃孵育60min；
(2)用14000g离心沉淀蛋白-病毒复合物；
(3)用pH5.0缓冲液洗脱病毒；
(4)用14000g离心去除自聚肽融合CD151蛋白；
(5)用病毒滴定法检测PRRSV。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(1)是：可用于感染细胞以及污水、尿液、粪便等环境样品PRRSV检测；步骤(2)是：沉淀的病毒可直接用于动物体内外试验；步骤(3)是：纯化的PRRSV可用于抗体和疫苗制备。
CN201610301779.XA 2016-05-09 2016-05-09 一种自聚肽融合cd151蛋白及其制备方法与应用 Expired - Fee Related CN105906719B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610301779.XA CN105906719B (zh) 2016-05-09 2016-05-09 一种自聚肽融合cd151蛋白及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610301779.XA CN105906719B (zh) 2016-05-09 2016-05-09 一种自聚肽融合cd151蛋白及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105906719A true CN105906719A (zh) 2016-08-31
CN105906719B CN105906719B (zh) 2019-06-11

Family

ID=56747878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610301779.XA Expired - Fee Related CN105906719B (zh) 2016-05-09 2016-05-09 一种自聚肽融合cd151蛋白及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105906719B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113801240A (zh) * 2021-08-26 2021-12-17 华南理工大学 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002060924A2 (en) * 2001-01-29 2002-08-08 Kansas State University Research Foundation Identification and applications of porcine reproductive and respiratory syndrome virus host susceptibility factor(s) for improved swine breeding and development of a non-simian recombinant cell line for propagation of the virus and a target for a novel class of antiviral compounds
CN101698852A (zh) * 2009-10-23 2010-04-28 江苏先声药物研究有限公司 具有cd137l功能的蛋白或多肽及其基因和应用
CN102226172A (zh) * 2011-05-09 2011-10-26 清华大学 基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法
CN103757042A (zh) * 2014-01-15 2014-04-30 华南理工大学 基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶及制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002060924A2 (en) * 2001-01-29 2002-08-08 Kansas State University Research Foundation Identification and applications of porcine reproductive and respiratory syndrome virus host susceptibility factor(s) for improved swine breeding and development of a non-simian recombinant cell line for propagation of the virus and a target for a novel class of antiviral compounds
CN101698852A (zh) * 2009-10-23 2010-04-28 江苏先声药物研究有限公司 具有cd137l功能的蛋白或多肽及其基因和应用
CN102226172A (zh) * 2011-05-09 2011-10-26 清华大学 基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法
CN103757042A (zh) * 2014-01-15 2014-04-30 华南理工大学 基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶及制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUMAR SHANMUKHAPPA 等: "Role of CD151, A tetrasprespiratory syndrome virus infectionanin, in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection", 《VIROLOGY JOURNAL》 *
WEI WU 等: "Active protein aggregates induced by terminally attached self-assembling peptide ELK16 in Escherichia coli", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *
张钰 等: ""猪CDl51重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用PRRSV", 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》 *
肖一红 等: "Marc-145细胞CD151蛋白主要抗原表位区的表达及其与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染关系的研究", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113801240A (zh) * 2021-08-26 2021-12-17 华南理工大学 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用
CN113801240B (zh) * 2021-08-26 2022-05-03 华南理工大学 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105906719B (zh) 2019-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101900731B (zh) 一种区别检测猪瘟疫苗免疫与野毒感染抗体的elisa试剂盒及其制备方法
CN102174086B (zh) 一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白和亚单位疫苗
Liu et al. Molecular epidemiology of bovine coronavirus on the basis of comparative analyses of the S gene
CN103760365B (zh) 一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒
CN102532281B (zh) 一种猪瘟病毒重组E2蛋白及其IgM抗体ELISA检测试剂盒
CN104086652B (zh) 抗o型口蹄疫病毒特异性单域抗体及其重组表达载体
CN104862285A (zh) 猪流行性腹泻病毒抗体捕获elisa检测方法及应用
CN112175086A (zh) 一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及应用
CN104611358A (zh) 一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法
CN101915848B (zh) Rbd蛋白在制备sars病人辅助诊断试剂中的应用
CN105175554A (zh) 一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白及其制备方法和应用
CN105906719A (zh) 一种自聚肽融合cd151蛋白及其制备方法与应用
CN106754981B (zh) 一种利用大肠杆菌系统制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法
Huang et al. Secreted expression of the classical swine fever virus glycoprotein Erns in yeast and application to a sandwich blocking ELISA
CN105481953A (zh) 作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白和疫苗组合物
CN102643335B (zh) 重组轮状病毒vp6载体蛋白及其制备
Chang et al. Leader of the capsid protein in feline calicivirus promotes replication of Norwalk virus in cell culture
CN106397546A (zh) 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
CN103276007A (zh) 利用非经典分泌蛋白质实现外源蛋白质的分泌表达
CN103554233B (zh) 鸭瘟病毒ul13截段重组蛋白、其多克隆抗体及制备方法和应用
CN109136267B (zh) BVDV Erns蛋白和抗体及筛选BVDV感染的牛的方法
CN102495209B (zh) 基于33k蛋白的favi抗体间接elisa检测试剂盒及其应用
CN109735505A (zh) 一株犬细小病毒毒株及其基因序列的扩增和应用
CN113563477B (zh) 新冠病毒重组蛋白和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白及其制备方法和应用
CN104072591B (zh) 鸭疱疹病毒1型ul7截短重组蛋白及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210125

Address after: 225300 building 16, 8 Fenghuang East Road, Taizhou City, Jiangsu Province

Patentee after: Jiangsu Taizhou animal drug Engineering Technology Center

Address before: 225009 No. 88 South Road, Yangzhou University, Yangzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: YANGZHOU University

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190611