CN101915848B - Rbd蛋白在制备sars病人辅助诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了RBD蛋白在制备SARS病人辅助诊断试剂中的应用。所述RBD蛋白为如下(a)或(b)：(a)氨基酸序列如序列表的序列1所示的蛋白；(b)序列表的序列2自5’末端第37至753位核苷酸所示DNA编码的蛋白。基于RBD的免疫学监测方法(如ELISA、WB、胶体金快速诊断等)具有高度的灵敏度和特异性，可以用于SARS-CoV感染的临床诊断和流行病学调查。
Description
技术领域
本发明涉及RBD蛋白在制备SARS病人辅助诊断试剂中的应用。
背景技术
严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndromes，简称SARS)由一种新型的冠状病毒(SARS-CoV)感染引起，导致以发热、干咳、胸闷为主要症状，严重者出现快速进展的呼吸系统衰竭，是一种新的呼吸道传染病，传染性极强、病情进展快速。2002/2003年的SARS全球爆发引起8000多人感染，导致约10％的感染者死亡，严重威胁人类健康和社会安定。现有的研究认为，SARS病毒可能来源于动物，由蝙蝠经果子狸作为中介而传人，但有待于进一步研究。因此，SARS-CoV重现引起再次爆发的可能性不能完全排除，开发有效的SARS诊断试剂及其他防治手段仍很重要。
SARS-CoV感染的实验室检测方法主要有(1)聚合酶链反应(PCR)：用于检测SARS-CoV的病毒核酸，包括逆转录PCR、实时PCR、套式PCR和增强的实时PCR等；(2)特异性抗体检测：用于检测血清中针对SARS-CoV的特异性抗体的方法有ELISA、间接IFA I等。血清抗体的特异性检测不但用于临床实验室诊断，也可用于流行病学调查。目前市场上销售的试剂盒主要采用裂解的SARS-CoV全病毒(viral lysates)为抗原，检测灵敏度和特异性都有待于提高。同时，制备病毒存在严重的安全隐患。发展基因工程重组抗原用于SARS-CoV的血清学检测十分必要。
类似其它的冠状病毒，SARS-CoV是一个有囊膜的正链RNA病毒，基因组接近30Kb，除编码多聚酶外，编码的结构蛋白主要有包膜刺突蛋白S(spike)、膜蛋白M(membrane)和E(envelope)、核衣壳蛋白N(nucleocapsid)。冠状病毒的S蛋白主要负责病毒与细胞受体的结合、膜融合及进入，但同时也是诱导中和抗体的主要免疫原。
同其它冠状病毒的S蛋白一样，SARS-CoV的S蛋白属于I型跨膜糖蛋白，由S1和S2两个结构域组成。S1位于整个蛋白的N末端，负责病毒与靶细胞的受体结合。已经证明血管紧张素转换酶(ACE2)是SARS-CoV的功能受体。位于S1中间区域的片段是受体结合结构域(RBD)，由318-510位的193个氨基酸组成，对介导病毒感染至关重要。S2位于整个蛋白的C末端，主要包含融合肽和两个七残基重复序列(HR1和HR2)等功能片段，主司病毒和靶细胞之间的膜融合，也是病毒感染的关键部位。
发明内容
本发明的目的是提供RBD蛋白在制备SARS病人辅助诊断试剂中的应用。
本发明提供了RBD蛋白的新用途，即RBD蛋白在制备SARS病人辅助诊断试剂中的应用；所述RBD蛋白为如下(a)或(b)：
(a)氨基酸序列如序列表的序列1所示的蛋白；
(b)序列表的序列2自5’末端第37至753位核苷酸所示DNA编码的蛋白。
所述RBD蛋白可采用如下方法制备：
(1)将序列表的序列2所示的DNA插入表达质粒，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染哺乳动物细胞，得到重组细胞；
(3)培养重组细胞，得到RBD蛋白。
常规的表达质粒和哺乳动物细胞均可采用。所述表达质粒具体可为pcDNA4/myc-His A。所述哺乳动物细胞具体可为293T细胞。
基于以上用途，所述RBD蛋白可用于制备SARS病人辅助诊断试剂盒。
本发明还保护一种辅助诊断SARS病人的试剂盒，包括RBD蛋白；所述RBD蛋白为如下(a)或(b)：
(a)氨基酸序列如序列表的序列1所示的蛋白；
(b)序列表的序列2自5’末端第37至753位核苷酸所示DNA编码的蛋白。
所述RBD蛋白的编码基因具体可如序列表的序列2自5’末端第37至753位核苷酸所示。
所述RBD蛋白可采用如下方法制备：
(1)将序列表的序列2所示的DNA插入表达质粒，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染哺乳动物细胞，得到重组细胞；
(3)培养重组细胞，得到RBD蛋白。
常规的表达质粒和哺乳动物细胞均可采用。所述表达质粒具体可为pcDNA4/myc-His A。所述哺乳动物细胞具体可为293T细胞。
本发明提供采用SARS-CoV的S蛋白受体结合区(RBD)作为抗原，通过病毒特异性抗体检测SARS冠状病毒(SARS-CoV)。重组RBD抗原可在原核、酵母、昆虫和真核细胞及任何表达系统中制备和生产。基于RBD的免疫学监测方法(如ELISA、WB、胶体金快速诊断等)具有高度的灵敏度和特异性，可以用于SARS-CoV感染的临床诊断和流行病学调查。
附图说明
图1为RBD重组蛋白的鉴定；A：SDS-PAGE；B：Western-blot。
图2为实施例2的结果。
图3为实施例3的结果；A：OD450值；B：阳性率。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、RBD重组蛋白的制备
一、基因的合成
人工合成编码SARS-CoV包膜刺突蛋白S(spike)受体结合区的DNA(序列表的序列2所示DNA)。序列2所示DNA是根据SARS病毒株Tor2的相应序列进行密码子优化，并分别在5’和3’末端加入Kpn I和Xho I酶切位点得到的，编码Tor2刺突蛋白S蛋白的317-535位氨基酸残基(序列表的序列1所示蛋白)。
二、重组质粒的构建和扩增
1、重组质粒的构建
①用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切步骤1合成的DNA(序列2所示DNA)，回收纯化酶切产物。
②用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切真核细胞表达质粒pcDNA 4/myc-His A(购自美国Invitrogen)，回收纯化载体骨架。
③将步骤①回收的酶切产物和步骤②回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到连接产物。
④将连接产物进行测序，测序结果表明，得到了重组质粒pcDNA 4-RBD(在pcDNA4/myc-His A的Kpn I和Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA)。
2、重组质粒的扩增
(1)转化
取0.5μl重组质粒pcDNA 4-RBD转化大肠杆菌Stbl2(购自Invitrogen，目录号：10268-019)：置冰上20分钟；42℃热激40秒；置冰上3分钟；每管加500μl LB培养基，37℃摇床45分钟。
取50μl菌液涂布于含氨苄青霉素(Amp+)培养皿中，37℃恒温培养14-16小时。
(2)质粒提取
①挑单克隆菌落于250ml的LB培养基中，37℃、250rpm培养14-16小时。
②离心收集菌体。
③质粒提取(QIAGEN plasmid Mini，Midi and Maxi Kits，QIAGEN)。
④扩增的重组质粒放-20℃保存，备用。
三、RBD重组蛋白的表达和纯化
1、RBD重组蛋白的表达
①转染前1天，铺293T细胞(购自Clontech Laboratories，Inc，目录号：632180)于75cm2培养瓶(用无抗生素含10％FBS的DMEM培养基)。
②将1.5ml OPTI-MEM(无血清培养基，Invitrogen)和16μg重组质粒pcDNA 4-RBD混匀，室温放置5分钟。
③将1.5ml OPTI-MEM和40μl转染试剂PEI(Sigma，1mg/ml)混匀，室温放置5分钟。
④将步骤②的溶液和步骤③的溶液混匀，室温孵育20分钟。
⑤将3ml步骤④的混合液加入293T细胞已长成单层的75cm2培养瓶中(293T细胞长满瓶面积的60-80％时较好)，轻轻混匀，进行转染。
⑥37℃，5％的CO2孵箱中培养6-8小时，用新鲜并预热的(37℃)OPTI-MEM(无血清培养基)替换原有的DMEM培养基。
⑦转染48小时后收获培养上清(含重组表达的RBD蛋白)。
⑧在收获的培养上清中加入蛋白酶抑制剂，10000g、4℃、离心15分钟(去除培养上清中的杂质)，上清用于重组蛋白的纯化。
2、RBD重组蛋白的纯化(通过重力流方法纯化目的蛋白)
清洗缓冲液：50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；20mM咪唑。
洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；500mM咪唑。
①纯化柱的准备：加1ml悬浮的Ni-NTA树脂(Invitrogen)至纯化柱(柱长为8.5cm，内径为1cm)。
②纯化柱的平衡：用10倍Ni-NTA柱体积的清洗缓冲液清洗柱子，将纯化柱置于4℃环境中。
③将步骤1得到的上清滴加至平衡后的Ni-NTA柱(每3秒一滴)。
④以10倍Ni-NTA柱体积的PBS(0.01M，pH7.4)清洗Ni-NTA柱，然后以10倍柱体积的清洗缓冲液清洗Ni-NTA柱。
⑤洗脱目的蛋白：用5倍Ni-NTA柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱下来的溶液。
⑥将洗脱下来的溶液加入15ml离心超滤装置(Amicon Ultra-Centrifugal FilterUnits 15ml离心超滤装置；MILLIPORE)，5500g、4℃、离心15分钟。
⑦加入PBS(0.01M，pH7.4)，5500g、4℃，重新离心15分钟。
⑧加入PBS(0.01M，pH7.4)，5500g、4℃，重新离心15分钟。
⑨以PBS(0.01M/L，pH7.4)收集超滤管内浓缩的RBD重组蛋白，调整其终浓度为1mg/ml(使用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo)测定蛋白浓度)，用于步骤四的鉴定以及实施例2、3的检测。
四、RBD重组蛋白的鉴定
1、SDS-PAGE方法鉴定(依据分子量鉴定)
将步骤三得到的RBD重组蛋白进行10％SDS-PAGE电泳。
结果见图1A。RBD重组蛋白具有预期条带(分子量约30KDa)。
2、Western blot分析(依据抗6-his标签的抗体进行鉴定)
①将步骤三得到的RBD重组蛋白进行10％SDS-PAGE电泳。
②将RBD重组蛋白转于PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉溶液封闭1小时。
③用PBS洗膜3次，每次10分钟。
④加HRP标记的anti-his-IgG 37℃，孵育1小时。
⑤用PBS洗膜3次，每次10分钟。
⑥加SuperECL plus超敏发光液，暗室中曝光感光胶片。
含6-his的蛋白可使感光胶片上对应位置出现清晰的条带。结果见图1B。
实施例2、RBD重组蛋白在检测SARS-CoV抗体中的应用
以实施例1制备的RBD重组蛋白作为抗原，采用ELISA法检测35份SARS病人血清(知情志愿者)和25份健康人血清(知情志愿者)。
每份血清的检测方法如下：
(1)用实施例1制备的RBD重组蛋白溶液包被96孔ELISA测定板(Corning Costar，Acton，MA)，每孔包被100ng，4℃过夜。
(2)用350μl封闭液(3％脱脂奶粉)封闭，37℃放置2小时。
(3)加入100μl 100倍稀释的血清，37℃温育1小时；然后用含0.1％吐温20的洗涤液反复洗涤3次，拍干。
(4)加入100μl HRP酶标记的羊抗人IgG(Invitrogen，Carlsbad，CA)，37℃温育1小时，用洗涤液反复洗涤3次，拍干。
(5)加入100μl 3，3’，5，5’-四甲基联苯氨(TMB)底物液显色反应。
(6)使用50μl终止液(1M H2SO4)终止反应后，于ELISA微孔板阅读仪(Bio-Rad，Hercules，CA)获得450/630nm双波长读数。
OD450值结果见图2。设置阈值为0.18，大于该阈值为阳性、小于等于该阈值为阴性。所有恢复期SARS病人的血清标本均为阳性结果，即血清与RBD重组蛋白强反应。健康人的血清标本均为阴性结果。结果表明：RBD重组蛋白作为抗原，用于检测患者SARS-CoV抗体具有很高的敏感度和特异性，可以用于制备诊断试剂盒。
实施例3、RBD重组蛋白在检测SARS-CoV抗体中的应用
血清样本来自如下SARS患者(知情志愿者)：发病后3个月(M3)，19例；发病后12个月(1年)(M12)，19例；发病后18个月(M18)，19例；发病后24个月(2年)(M24)，19例；发病后36个月(3年)(M36)，19例。
一、用实施例1制备的RBD重组蛋白溶液作为抗原检测各个血清样本
每份血清的检测方法如下：
(1)用实施例1制备的RBD重组蛋白溶液包被96孔ELISA测定板(Corning Costar，Acton，MA)，每孔包被100ng，4℃过夜。
(2)用350μl封闭液(3％脱脂奶粉)封闭，37℃放置2小时。
(3)加入100μl 100倍稀释的血清，37℃温育1小时；然后用洗涤液反复洗涤5次，拍干。
(4)加入100μl HRP酶标记的羊抗人IgG(Invitrogen，Carlsbad，CA)，37℃温育40分钟，用洗涤液反复洗涤5次，拍干。
(5)加入100μl 3，3’，5，5’-四甲基联苯氨(TMB)底物液显色反应。
(6)使用50μl终止液(1M H2SO4)终止反应后，于ELISA微孔板阅读仪(Bio-Rad，Hercules，CA)获得450/630nm双波长读数。
设置阈值为0.23，大于该阈值为阳性、小于等于该阈值为阴性。
二、用市售试剂盒检测各个血清样本
以市场销售的试剂盒(北京华大GBI诊断试剂公司，采用裂解病毒作为抗原)对各个血清样本进行平行检测，作为对照。检测时按说明书进行操作，待测血清标本稀释10倍。阈值为0.18，大于该阈值为阳性、小于等于该阈值为阴性。
三、检测效果比较
将处于发病后相同时期的19份血清样本，取OD450值的平均值，结果见图3A(RBD-His为步骤一的结果；Kit为步骤二的结果)。将处于发病后相同时期的19份血清样本，计算阳性率，结果见图3B(RBD-His为步骤一的结果；Kit为步骤二的结果)。
步骤一中，RBD重组蛋白作为抗原方法对3个月、12个月、18个月、24个月和36个月的血清标本检测的阳性率分别为：100％，100％，100％，95％和95％。步骤二中，市售试剂盒对3个月、12个月、18个月、24个月和36个月的血清标本检测的阳性率分别为：100％，95％，84％，84％和42％。
步骤二中，血清的稀释度为步骤一中血清稀释度的10倍。对于同一血清样本，步骤一的OD450值均显著高于步骤二的OD450值。结果表明：以RBD重组蛋白作为抗原检测SARS-CoV特异抗体具有较高的灵敏度。
Claims (4)
1.RBD蛋白在制备SARS病人辅助诊断试剂中的应用；所述RBD蛋白为如下(a)或(b)：
(a)氨基酸序列如序列表的序列1所示的蛋白；
(b)序列表的序列2自5’末端第37至753位核苷酸所示DNA编码的蛋白；
(b)所述RBD蛋白的制备方法如下：
(1)将序列表的序列2所示的DNA插入表达质粒，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染哺乳动物细胞，得到重组细胞；
(3)培养重组细胞，得到RBD蛋白；
所述表达质粒为pcDNA4/myc-His A；所述哺乳动物细胞为293T细胞。
2.RBD蛋白在制备SARS病人辅助诊断试剂盒中的应用；所述RBD蛋白为如下(a)或(b)：
(a)氨基酸序列如序列表的序列1所示的蛋白；
(b)序列表的序列2自5’末端第37-753位核苷酸所示DNA编码的蛋白；
(b)所述RBD蛋白的制备方法如下：
(1)将序列表的序列2所示的DNA插入表达质粒，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染哺乳动物细胞，得到重组细胞；
(3)培养重组细胞，得到RBD蛋白；
所述表达质粒为pcDNA4/myc-His A；所述哺乳动物细胞为293T细胞。
3.辅助诊断SARS病人的试剂盒，包括RBD蛋白；所述RBD蛋白为如下(a)或(b)：
(a)氨基酸序列如序列表的序列1所示的蛋白；
(b)序列表的序列2自5’末端第37至753位核苷酸所示DNA编码的蛋白；
(b)所述RBD蛋白的制备方法如下：
(1)将序列表的序列2所示的DNA插入表达质粒，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染哺乳动物细胞，得到重组细胞；
(3)培养重组细胞，得到RBD蛋白；
所述表达质粒为pcDNA4/myc-His A；所述哺乳动物细胞为293T细胞。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：(b)所述RBD蛋白的编码基因如序列表的序列2自5’末端第37至753位核苷酸所示。
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