CN111273016B - 一种基于s蛋白配体与ace2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测试剂盒，包括量子点标记的ACE2蛋白、量子点标记的兔IgG、重组冠状病毒棘突蛋白S1、羊抗兔IgG的多抗、以及免疫层析试纸条等材料。本发明通过量子点荧光标记和多级偶联放大信号提高检测灵敏度、利用配体与受体结合原理提高检测特异性并避开抗体研发周期，提供一种能够快速检测冠状病毒的试剂盒，通过建立病毒灭活系统保障检测过程中的生物安全性。本发明的试剂盒适合口腔黏膜液、呼吸道、全血、血浆、血清、排泄物等多种生物样本及环境样本的检测，可应用于SARS‑CoV‑19、SARS‑CoV、和HCoV‑NL63等以ACE2为受体的冠状病毒的快速检测。

Description

一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速 检测的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒。
背景技术
冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、猪、猫、穿山甲、犬、狼、鸡、牛、蛇类、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-19,曾用名2019-nCoV)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。研究表明，其中SARS-CoV-19、SARS-CoV和HCoV-NL63是通过病毒包膜spike glycoprotein(S-protein)介导病毒与宿主细胞膜上的ACE2受体相互作用来感染人的。在新疫情突发时，如2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，新病毒的早期检测一般采用核酸检测的方法，因为病毒的基因组可以很快被破译，即可合成特异性核酸荧光探针制备荧光定量PCR检测试剂盒投入使用。该方法具有技术成熟、研发周期短、特异性好、检测准确等优点；但同时也存在样本需前处理、检测时间长、需专业仪器专业人员操作、以及试剂贵等缺点，而且也存在一定的假阴性。另外一种快检方法就是胶体金免疫层析试纸，包括病毒抗原检测和血清学抗病毒蛋白抗体(IgM/IgG)检测。这类试剂的优点在于快速、简单，无需仪器和专业人员操作、试剂成本低等；但缺点在于对于新病毒首先要制备新病毒的蛋白抗原和特异性抗体，造成研发周期长不能及时用于疫情检测，而试剂盒的检测准确性与蛋白抗原和特异性抗体的质量密切相关。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，我们根据配体与受体特异性结合的原理，发明了一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒。如图3所示，冠状病毒CoV的棘突蛋白有2个亚基，S1和S2，其中S1亚基作为配体与人细胞膜上的ACE2受体相互作用形成特异性结合。依据竞争法免疫层析原理，我们用重组的人ACE2蛋白替代其中一个抗S-蛋白单抗来标记量子点荧光并喷涂于试纸条的释放垫上，检测时可通过冠状病毒棘突蛋白S1上的RBD与样本中的冠状病毒结合使病毒颗粒带上量子点荧光；在试纸条的检测线(T线)包被重组冠状病毒棘突蛋白S1，用来捕获层析中量子点标记的ACE2(配体-受体结合原理)，如果检测样本中没有冠状病毒，则T线有较强的量子点荧光信号，如果检测样本中有冠状病毒，则中和量子点标记的ACE2，T线量子点荧光信号减弱，类似于竞争法免疫层析原理。
本发明的优势在于在保留了胶体金免疫层析快速、简便、廉价、稳定好、可实现居家检测等优点外，采用配体与受体相互作用的原理，避免了抗体研发周期长、以及抗体交叉反的问题，既提高检测特异性又可快速提供一种有效的试剂盒。同时，在以ACE2受体介导感染的冠状病毒检测方面又具有通用性，既使病毒突变变异、突发新疫性，该检测试剂盒可即时投入应用。另外，量子点具有激发光谱宽、发射峰窄、斯托克斯位移宽大、生物相容性好、信号稳定、荧光寿命长、抗光漂白能力强等诸多优点，用量子点替代胶体金标记不仅可提高检灵敏度1-2个数量级，而且可进行定量分析。
所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒方法包含标记量子点的ACE2蛋白,标记量子点的ACE2蛋白制备方法包括以下步骤：
1)将人源ACE2胞外域基因的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列，该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后，亚克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达ACE2-定点生物素化序列-蛋白酶切位点标签-纯化标签融合蛋白(简称ACE2融合蛋白，下同)的质粒；
2)将步骤1)构建好的表达ACE2融合蛋白的质粒转染到真核永生化细胞，并建立表达ACE2融合蛋白的基因稳转细胞系，进行培养扩增得到含ACE2融合蛋白的培养上清液；
3)用蛋白纯化柱从步骤2)制备的含ACE2融合蛋白的培养上清液中获得ACE2融合蛋白，随后用特异性蛋白酶切去ACE2融合蛋白的-纯化标签获得ACE2蛋白；
4)将步骤3)获得的ACE2蛋白用生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白ACE2-Biotin；
5)将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；将步骤4)获得的ACE2-Biotin与QM-SA共孵育，获得牢固标记量子点的ACE2蛋白，将其标记为QM-SB-ACE2。
所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤1)中，所述人源ACE2胞外域基因为人源ACE2的细胞膜外部分，即GenBank:AB046569.1的1-739aa部分的编码基因序列；所述蛋白定点生物素化序列为生物素蛋白连接酶BirA，其识别位点序列为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW；所述特异性蛋白酶为EK酶，其切位点标签为Flag标签；所述纯化标签为小鼠IgG Fc段(mFc)；所述密码子优化的宿主为人；所述含有EF1启动表达荧光蛋白的载体为慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，EF1启动表达的荧光蛋白为绿色荧光蛋白copGFP，构建好的ACE2融合蛋白的质粒命名为pCDH-ACE2mFc.copGFP。
其中，在人源ACE2胞外域基因的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签的人工设计序列经宿主细胞密码子优化后的核酸序列如SEQ IDNO：1所示，构建好的pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒所表达的ACE2融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤2)中，所述真核永生化细胞为HEK293，建立表达ACE2融合蛋白的基因稳转细胞系为ACE2mFc.copGFP/293。
其中ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞系的建立过程为：将pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备ACE2mFc.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞系。
所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤3)中，所述蛋白纯化柱为ProteinA/G柱；所述切去纯化标签的ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤4)中，所述定点生物素化的位置是ACE2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:3末端，生物素蛋白连接酶识别位点GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW上的赖氨酸(K)。
所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤5)中，所述羧基量子点微球为表面具有羧基功能团的量子点荧光微球，用EDC/NHS交联剂活化，将链霉亲和素SA通过肽键偶联于量子点荧光微球，获得QM-SA；生物素化的ACE2-Biotin蛋白通过链霉亲和素-生物素反应连接，获得量子点荧光标记的ACE2蛋白。
所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括免疫层析试纸条，免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸；样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，样品垫叠压在释放垫上；检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的检测线区T线和靠近吸水纸的控制线区C线；
将兔IgG偶联于羧基量子点微球，获得QM-兔IgG；将标记量子点的ACE2蛋白和QM-兔IgG混合后喷涂在免疫层析试纸条释放垫上，并在T线区的硝酸纤维素膜上包被ACE2蛋白的配体；C线区的硝酸纤维素膜上包被GAR；结果用紫外手电筒照射免疫层析试纸条，肉眼观察做阴阳定性判断，或采用干式荧光层析分析仪定量分析。
所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述ACE2蛋白的配体为重组新型冠状病毒棘突蛋白S1；所述基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测试剂盒适用于口腔黏膜液、呼吸道、全血、血浆、血清或排泄物的检测，能应用于以ACE2为受体的冠状病毒的快速检测和及其感染疾病的诊断。
采用上述制备的试剂盒，能够对冠状病毒进行快速检测，方法如下：所述试剂盒的免疫层析试纸条进行生物安全性改良，即在样本垫预处理液中添加RNA酶以及光化学法灭活剂，以抑制或灭活检测样本中的病毒；
试剂盒中配有装病毒灭活剂的EP管，取样后先放入装有病毒灭活剂的EP管中对检测样本中的病毒进行灭活处理，然后加入含有RNA酶的样本缓冲液稀释后点样检测；其中，所述光化学法灭活剂为核黄素、补骨脂素、亚甲蓝中的至少一种。所述的病毒灭活剂为酒精、双氧水、乙醚、甲醛、戊二醛、次氯酸钠、氯仿、辛酸、过氧乙酸中的至少一种。
相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：本发明通过量子点荧光标记和多级偶联放大信号提高检测灵敏度、利用配体与受体结合原理提高检测特异性并避开抗体研发周期快速提供一种有效的检测试剂盒、通过建立病毒灭活系统保障检测过程中的生物安全性。该试剂盒适合口腔黏膜液、呼吸道、全血、血浆、血清、排泄物等多种生物样本及环境样本的检测，可应用于SARS-CoV-19、SARS-CoV、和HCoV-NL63等以ACE2为受体的冠状病毒的快速检测。
附图说明
图1为pCDH-ACE2omFc.copGFP质粒图谱；
图2为基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，对口腔黏膜液样本进行快速检测的原理示意图；
图3为S蛋白配体与ACE2受体特异性结合的原理示意图；
图4为试剂盒测定重组新型冠状病毒棘突蛋白S1的标准曲线；
图5为SEQ ID NO：1的具体序列结果；
图6为SEQ ID NO：2的具体序列结果；
图7为SEQ ID NO：3的具体序列结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
以下实施例中，慢病毒包装细胞293V购自于北京英茂盛业生物科技有限公司；重组冠状病毒棘突蛋白S1由杭州迈尔德生物科技有限公司提供。
实施例1 pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒构建
将人源ACE2胞外域基因的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列，其中所述人源ACE2胞外域基因为人源ACE2的细胞膜外部分，即GenBank:AB046569.1的1-739aa部分的编码基因序列；所述蛋白定点生物素化序列为生物素蛋白连接酶BirA，其识别位点序列为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW；所述特异性蛋白酶为EK酶，其切位点标签为Flag标签；所述纯化标签为小鼠IgG Fc段(mFc)。最终得到基因设计ACE2-Flag-mFc融合蛋白的核酸序列，经宿主(人)密码子优化后序列如SEQ IDNO：1所示，两端分别设计EcoR I和NotI限制性内切酶，表达后氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；基因合成序列后，通过连接酶切位点EcoR I和Not I，克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，构建真核表达质粒pCDH-ACE2mFc.copGFP(如图1所示)。
其中SEQ ID NO：1的具体序列如图5所示，SEQ ID NO:1为编码ACE2mFc融合蛋白的DNA基因人工序列。位于两端的限制性内切酶EcoRI(GAATTC)/NotI(GCGGCCGC)用于基因亚克隆；7-2223bp为编码人ACE2蛋白胞外域(1-739aa)部分的基因序列；2224-2295bp为编码BirA酶定点生物化作用识别位点的基因序列(图5中第1个下划线部分)；2302-2325bp为Flag标签的基因序列(图5中第2个下划线部分)；2326-2979bp为纯化标签mFc的基因序列。
其中SEQ ID NO:2的具体序列如图6所示，构建好的pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒所表达的ACE2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2。1-739aa为人ACE2蛋白胞外域基因部分的氨基酸序列(其中1-17aa为信号肽)；740-763为BirA酶定点生物化作用识别位点的氨基酸序列(图6中第1个下划线部分)；766-773aa为Flag标签的氨基酸序列(图6中第2个下划线部分)；774-990aa为纯化标签mFc的氨基酸序列。
其中SEQ ID NO:3的具体序列如图7所示，SEQ ID NO:3为ACE2蛋白人工序列(去掉了信号肽MSSSSWLLLSLVAVTAA，以及mFc标签)的氨基酸序列，723-746aa为BirA酶定点生物化作用识别位点的氨基酸序列(图7中下划线部分)。
实施例2建立ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞系
将pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备ACE2mFc.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞系。具体步骤如下：
1)实验前一天对5个15cm dish进行细胞铺板，保证在转染之前，细胞均达70％-80％汇合度。
2)转染前1～2h，更换dish内培养基为无血清无抗生素的DMEM培养基。
3)准备一支15mL离心管，加入5mL 1×HBS，再依次加入100μg的pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒、100μg PH1/PH2混合质粒(PH1:PH2＝3:1，质量比)，轻轻混匀。
4)加入4mL PEI工作液(10μM)，轻轻混匀，置37℃孵育20min。
5)将转染复合液等分5份，均匀加入5个待转染的15cm dish内，轻轻晃动使复合物分布均匀。
6)转染5.5h后，再准备一支15mL离心管，加入5mL 1×HBS，再依次加入100μg的pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒、100μg PH1/PH2混合质粒(PH1:PH2＝3:1)，轻轻混匀。
7)加入4mL PEI工作液(10μM)，轻轻混匀，置37℃孵育20min。
8)更换dish内培养基为新鲜无血清无抗生素的DMEM培养基。
9)将转染复合液等分5份，均匀加入5个待转染的15cm dish内，轻轻晃动使复合物分布均匀。
10)转染6h后换液，更换为DMEM完全培养基(+10％FBS+1％青霉素/链霉素双抗)。
11)转染48h收集上清，于8000g离心15min后，冻于-80℃冰箱。
12)转染72h收集上清，于8000g离心15min后，合并转染48h所收集上清，过0.45μm滤膜，再以85000g离心2h。
13)弃上清，沉淀以1mL完全培养基(+10％FBS+1％双抗)重悬，感染HEK293细胞(6孔板1个孔，细胞60％-70％汇合度)。
14)感染的HEK293细胞培养2天后传代分至2个6孔板共12个孔；待分散的单个细胞形成克隆细胞团(约1周)，在荧光显微镜下挑取高表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞团进行扩增培养建立ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞系。
实施例3ACE2-Biotin蛋白制备
用无蛋白293细胞培养基扩增培养ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞，收集上清培养液，并用proteinA/G柱纯化ACE2mFc融合蛋白，用EK酶将ACE2从柱上切下，通过生物素蛋白连接酶将生物素偶联于ACE2的(GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW)位点，获得ACE2-Biotin蛋白。具体步骤如下：
1)将ACE2omFc.copGFP/293稳转细胞扩增至五层细胞工厂，用不含蛋白和多肽的HektorHEK293细胞培养基培养；
2)收集培养液，1200g、4℃离心20min后，取上清液，用饱和硫酸铵法沉淀蛋白；
3)沉淀蛋白用1/10～1/100原液体积的PBS(pH7.4)复溶后，用30KD蛋白截留分子量的超滤管脱盐、浓缩、并置换为结合/洗涤缓冲液(0.5M NaCl，20mM Na2HPO4，pH8.0)；
4)脱盐后的蛋白液上ProteinA/G柱，吸附目标蛋白，用洗涤缓冲液洗涤后加入EK酶缓冲液(250mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.4，2.5mM CaCl2)，按产品说明书用EK酶将ACE2部分从柱上切下；
5)切下的ACE2蛋白用10KD蛋白截留分子量的超滤管浓缩，并置换为生物素蛋白连接酶(BirA酶)连接缓冲液(10mM ATP,10mM MgOAc,50μM D-Biotin)，按产品说明书用BirA酶使ACE2蛋白定点生物素化，即将生物素连在GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW序列中赖氨酸(K)上，获得生物素化蛋白ACE2-Biotin。
实施例4量子点荧光标记蛋白QM-SB-ACE2和QM-兔IgG的制备
将链霉亲和素(SA)偶联于羧基量子点微球，ACE2-Biotin即可通过SA-Biotin系统牢固地标记上量子点荧光。该方法不仅避免了ACE2直接通过-NH4和-COOH缩合反应标记造成的ACE2蛋白功能失活的问题，而且检测信号形成多级放大。具体步骤如下：
1)按产品说明书的方法将链霉亲和素(SA)偶联于羧基量子点微球(所述羧基量子点微球为表面具有羧基功能团的量子点荧光微球)，获得QM-SA；
2)同样将兔IgG也偶联于羧基量子点微球，获得QM-兔IgG，用于试纸条质控系统；
3)在pH7.4的PBS缓冲液中将QM-SA和ACE2-Biotin以1:4的摩尔比混合(QM-SA以标记的SA计)，37℃、150rpm振荡孵育1小时，获得QM-SB-ACE2；
4)8000g、4℃离心30分钟，去上清，沉淀用PB缓冲液(pH7.0、1％BSA、8％蔗糖、0.05％NaN3)重悬。
实施例5基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测试剂盒的制备
在参考竞争法免疫层析试纸制备工艺的基础上进行量子点荧光配体-受体竞争法层析试纸的制备，并建立病毒灭活生物安全系统。
1)样品垫预处理液中添加光化学法灭活剂补骨脂素和RNA酶。在后期用紫外线手电筒观察或仪器分析时，补骨脂素/UV(紫外线)形成病毒光化学法灭活系统；冠状病毒属于RNA病毒，因而RNA酶通过降解其核酸抑制或灭活病毒。样品垫预处理液为含0.5％吐温-20的Tris缓冲液，pH7.4，在样品垫预处理液中的补骨脂素的浓度为1μg/ml和RNA酶浓度为0.2U/ml。
2)将上述实施例4制备的QM-SB-ACE2和QM-兔IgG混合后喷涂在试剂盒的释放垫上，37℃烘干12h备用；
3)用包被稀释液(150mM PB，pH 7.4)分别将重组新型冠状病毒棘突蛋白S1和羊抗兔IgG多克隆抗体稀释成0.2mg/mL，以膜液量30μL/30cm分别均匀喷涂划线于硝酸纤维素膜检测线区(标记为T线区)和控制线区(标记为C线区)上，37℃烘干处理12h，封袋备用；
4)将样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区(T线区靠近释放垫，C线区靠近吸水纸)，样品垫叠压在释放垫上，组装后形成试纸板，切割成宽度3.78mm条状，制成所述的基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测试纸。其中，试剂盒对口腔黏膜液样本进行快速检测的原理示意图如图2所示。
实施例6基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测试剂盒的应用
基于本发明技术方案研发的基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测试剂盒可应用于所有以ACE2为受体的冠状病毒(包括不仅限于SARS-CoV-19、SARS-CoV、和HCoV-NL63)的快速检测和及其感染疾病的诊断；适合包括口腔黏膜液、呼吸道、全血、血浆、血清、排泄物等多种生物样本及环境样本的检测。
1)标准曲线：以重组表达的SARS-CoV-19棘突蛋白S1为标准品，用pH7.4的PBS分别配制成50、100、200、400、800ng/ml的浓度，空白为pH7.4的PBS。分别点样本发明的试纸条，每孔100μl，层析10-15分钟后用干式荧光层析分析仪测定T线荧光值；每个浓度设5个重复，以平均荧光值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，结果见图4；曲线方程为y＝-4.7382x+3645，R2＝0.967。
2)目前没有针对新型冠状病毒(SARS-CoV-19)抗原检测的产品，不能作同类产品的对比。我们取5个健康人的血清和3个临床确诊COVID-19病人的血清，用本发明技术方案研发的试剂盒进行检测，结果3个确诊病人的血清均为阳性，5个健康人的血清均为阴性，结果准确。
序列表
<110> 浙江诺迦生物科技有限公司
杭州迈尔德生物科技有限公司
<120> 一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcatga gcagcagcag ctggctgctg ctgagcctgg tggccgtgac cgccgctcag 60
tccaccatcg aggagcaggc caagaccttc ctggacaagt tcaatcacga ggccgaggac 120
ctgttttacc agagcagcct ggcctcctgg aactacaaca ccaatatcac cgaggagaac 180
gtgcagaaca tgaataacgc cggcgataag tggagcgcct tcctgaagga gcagagcacc 240
ctggcccaga tgtaccccct gcaggagatc cagaacctga ccgtgaagct gcagctgcag 300
gccctgcagc agaatggctc cagcgtgctg agcgaggata agtccaagag actgaatacc 360
atcctgaata ccatgtccac catctactcc accggcaagg tgtgcaatcc tgacaatcct 420
caggagtgtc tgctgctgga gcccggcctg aacgagatca tggccaacag cctggattac 480
aatgagaggc tgtgggcctg ggagtcctgg aggagcgagg tgggcaagca gctgaggcct 540
ctgtacgagg agtacgtggt gctgaagaac gagatggcca gggccaacca ctacgaggat 600
tacggcgatt actggagggg cgattacgag gtgaatggcg tggatggcta cgattactcc 660
agaggccagc tgatcgagga tgtggagcac accttcgagg agatcaagcc tctgtacgaa 720
cacctgcacg cctacgtgag agccaagctg atgaacgcct acccctccta catctccccc 780
atcggctgcc tgcctgccca cctgctgggc gatatgtggg gcagattctg gaccaatctg 840
tactccctga ccgtgccttt cggccagaag cccaatatcg atgtgaccga cgccatggtg 900
gatcaggcct gggacgccca gagaatcttt aaggaggccg agaagttctt tgtgtccgtg 960
ggcctgccca atatgaccca gggcttctgg gagaatagca tgctgaccga ccctggcaat 1020
gtgcagaagg ccgtgtgcca ccccaccgcc tgggacctgg gaaagggcga ctttagaatc 1080
ctgatgtgca ccaaggtgac catggatgac ttcctgaccg cccaccacga gatgggccac 1140
atccagtacg acatggccta cgccgcccag cccttcctgc tgaggaatgg cgccaatgag 1200
ggcttccacg aggccgtggg cgagatcatg tccctgtccg ccgccacccc caagcacctg 1260
aagagcatcg gcctgctgag ccctgatttt caggaggaca atgagacaga gatcaacttt 1320
ctgctgaagc aggccctgac catcgtgggc accctgccct tcacctacat gctggagaag 1380
tggaggtgga tggtgtttaa gggcgagatc cctaaggacc agtggatgaa gaagtggtgg 1440
gagatgaaga gagagatcgt gggcgtggtg gagcccgtgc cccacgatga gacatactgt 1500
gaccctgcct ccctgtttca cgtgtccaat gactacagct tcatcaggta ctacaccagg 1560
accctgtacc agtttcagtt ccaggaggcc ctgtgtcagg ccgccaagca cgagggcccc 1620
ctgcataagt gtgatatcag caactccacc gaggccggcc agaagctgtt taatatgctg 1680
aggctgggca agagcgagcc ctggaccctg gccctggaga acgtggtggg cgccaagaat 1740
atgaacgtga ggcccctgct gaactacttt gagcccctgt tcacctggct gaaggaccag 1800
aacaagaact cctttgtggg ctggagcacc gactggtccc cctacgccga ccagagcatc 1860
aaggtgagga tctccctgaa gtccgccctg ggcgatagag cctacgagtg gaacgataac 1920
gagatgtacc tgttcaggag ctccgtggcc tacgccatga ggcagtactt cctgaaggtg 1980
aagaatcaga tgatcctgtt cggcgaggag gatgtgaggg tggccaacct gaagcccaga 2040
atctccttca actttttcgt gaccgccccc aagaacgtgt ccgacatcat ccctaggacc 2100
gaggtggaga aggccatcag aatgtccagg tccagaatca acgacgcctt cagactgaat 2160
gataacagcc tggagttcct gggcatccag cccaccctgg gcccccctaa ccagccacct 2220
gtgggcagcg gcggcagcgg cggaagcgct ggaggaggac tgaacgatat cttcgaggcc 2280
cagaagatcg agtggctcga ggattacaag gacgatgacg ataagatatg tacagtccca 2340
gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca aagcccaagg atgtgctcat gattactctg 2400
actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc 2460
agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag 2520
ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat 2580
ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc 2640
atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct ccacaggtgt acaccatccc acctcccaag 2700
gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg acctgcatga taacagactt cttccctgaa 2760
gacattactg tggagtggca gtggaatggg cagccagcgg agaactacaa gaacactcag 2820
cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc 2880
aactgggagg caggaaatac tttcacctgc tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac 2940
catactgaga agagcctctc ccactctcct ggtaaatgag cggccgc 2987
<210> 2
<211> 990
<212> PRT
<213> pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒(pCDH-ACE2mFc.copGFP plasmid)
<400> 2
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Arg Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Leu
740 745 750
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Leu Glu Asp Tyr Lys
755 760 765
Asp Asp Asp Asp Lys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
770 775 780
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Thr Leu Thr Pro
785 790 795 800
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
805 810 815
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
820 825 830
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
835 840 845
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
850 855 860
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
865 870 875 880
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
885 890 895
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
900 905 910
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
915 920 925
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
930 935 940
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
945 950 955 960
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
965 970 975
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
980 985 990
<210> 3
<211> 756
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
130 135 140
Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
145 150 155 160
Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
290 295 300
Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
305 310 315 320
Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
325 330 335
Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe
340 345 350
Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr
355 360 365
Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His
370 375 380
Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His
385 390 395 400
Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu
405 410 415
Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr
420 425 430
Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys
435 440 445
Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys
450 455 460
Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr
465 470 475 480
Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
485 490 495
Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu
500 505 510
Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser
515 520 525
Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly
530 535 540
Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys
545 550 555 560
Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
565 570 575
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
580 585 590
Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys
595 600 605
Ser Ala Leu Gly Asp Arg Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
610 615 620
Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys
625 630 635 640
Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala
645 650 655
Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys
660 665 670
Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg
675 680 685
Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser
690 695 700
Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro
705 710 715 720
Pro Val Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Leu Asn
725 730 735
Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Leu Glu Asp Tyr Lys Asp
740 745 750
Asp Asp Asp Lys
755

Claims (9)

1.一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒方法包含标记量子点的ACE2蛋白，标记量子点的ACE2蛋白制备方法包括以下步骤：
1）将人源ACE2胞外域基因的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列，该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后，亚克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达ACE2-定点生物素化序列-蛋白酶切位点标签-纯化标签融合蛋白的质粒，简称为ACE2融合蛋白的质粒；
2）将步骤1）构建好的表达ACE2融合蛋白的质粒转染到真核永生化细胞，并建立表达ACE2融合蛋白的基因稳转细胞系，进行培养扩增得到含ACE2融合蛋白的培养上清液；
3）用蛋白纯化柱从步骤2）制备的含ACE2融合蛋白的培养上清液中获得ACE2融合蛋白，随后用特异性蛋白酶切去ACE2融合蛋白的纯化标签获得ACE2蛋白；
4）将步骤3）获得的ACE2蛋白用生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白ACE2-Biotin；
5）将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；将步骤4）获得的ACE2-Biotin与QM-SA共孵育，获得牢固标记量子点的ACE2蛋白，将其标记为QM-SB-ACE2；
所述试剂盒还包括免疫层析试纸条，免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸；样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，样品垫叠压在释放垫上；检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的检测线区T线和靠近吸水纸的控制线区C线；将兔IgG偶联于羧基量子点微球，获得QM-兔IgG；将标记量子点的ACE2蛋白和QM-兔IgG混合后喷涂在免疫层析试纸条释放垫上，并在T线区的硝酸纤维素膜上包被ACE2蛋白的配体；C线区的硝酸纤维素膜上包被GAR。
2.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤1）中，所述人源ACE2胞外域基因为人源ACE2的细胞膜外部分，即GenBank: AB046569.1的1-739aa部分的编码基因序列；所述蛋白定点生物素化序列为生物素蛋白连接酶BirA，其识别位点序列为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW；所述特异性蛋白酶为EK酶，其切位点标签为Flag标签；所述纯化标签为小鼠IgG Fc段；所述密码子优化的宿主为人；所述含有EF1启动表达荧光蛋白的载体为慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，EF1启动表达的荧光蛋白为绿色荧光蛋白copGFP，构建好的ACE2融合蛋白的质粒命名为pCDH-ACE2mFc.copGFP；
其中，在人源ACE2胞外域基因的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签的人工设计序列经宿主细胞密码子优化后的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，构建好的pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒所表达的ACE2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤2）中，所述真核永生化细胞为HEK293，建立表达ACE2融合蛋白的基因稳转细胞系为ACE2mFc.copGFP/293；
其中ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞系的建立过程为：将pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备ACE2mFc.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞系。
4.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤3）中，所述蛋白纯化柱为Protein A/G柱；所述切去纯化标签后的ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤4）中，所述定点生物素化的位置是ACE2蛋白的氨基酸序列SEQID NO:3末端，生物素蛋白连接酶识别位点GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW上的赖氨酸K。
6.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤5）中，所述羧基量子点微球为表面具有羧基功能团的量子点荧光微球，用EDC/NHS交联剂活化，将链霉亲和素SA通过肽键偶联于量子点荧光微球，获得QM-SA；生物素化的ACE2-Biotin蛋白通过链霉亲和素-生物素反应连接，获得量子点荧光标记的ACE2蛋白。
7.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述ACE2蛋白的配体为重组新型冠状病毒棘突蛋白S1；所述试剂盒适用于口腔黏膜液、呼吸道、全血、血浆、血清或排泄物的检测，能应用于以ACE2为受体的冠状病毒的快速检测。
8.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的免疫层析试纸条进行生物安全性改良，即在样本垫预处理液中添加RNA酶以及光化学法灭活剂，以抑制或灭活检测样本中的病毒；其中，所述光化学法灭活剂为核黄素、补骨脂素、亚甲蓝中的至少一种；
试剂盒中配有装病毒灭活剂的EP管，取样后先放入装有病毒灭活剂的EP管中对检测样本中的病毒进行灭活处理，然后加入含有RNA酶的样本缓冲液稀释后点样检测，结果用紫外手电筒照射免疫层析试纸条，肉眼观察做阴阳定性判断，或采用干式荧光层析分析仪定量分析。
9.如权利要求8所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述的病毒灭活剂为酒精、双氧水、乙醚、甲醛、戊二醛、次氯酸钠、氯仿、辛酸、过氧乙酸中的至少一种。
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