CN111983226A - SARSr-CoV抗体的检测 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于检测严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr‑CoV)的抗体、以及用于诊断SARSr‑CoV感染的套件、组合物和方法。

Description

SARSr-CoV抗体的检测
相关申请和引用并入
本申请要求2020年3月25日提交的新加坡专利申请10202002784P以及2020 年5月14日提交的新加坡专利申请10202004468Q的优先权。
上述申请、在上述申请中引用的全部文件、和在上述申请的审查过程中引用的全部文件(“申请引用文件”)，在本申请中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本申请引用文件”)，在本申请引用文件中引用或提及的所有文件，以及本申请或任意本申请引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本申请，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本申请，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何Genbank 序列通过引用的方式并入本申请。
对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。
发明领域
本申请涉及严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)抗体的检测，以及涉及SARSr-CoV感染的诊断。
背景技术
截至2020年3月23日，2019冠状病毒病(COVID-19)已经波及了160多个国家，计332,930多例感染和14,509例死亡。病原体是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，其与造成2002-2003严重急性呼吸综合征爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV或SARS-CoV-1)具有80％的遗传相似度[3]。
当前有关COVID-19的诊断基本基于临床史和胸部射线检测，且当前 COVID-19的确诊基于核酸类检测。
急需一种可靠的且随时可用的SARS-CoV-2检测方法，以扩充当前的检测工具，从而应对现代人类历史上最严重的流行病。
不像分子检测，血清检测方法较难开展，且有特异性问题。当前的“黄金标准”是病毒中和检测(VNT)，需要在专业的生物防护设施(三级生物安全实验室，BSL3) 中使用活病毒。该检测方法不仅十分昂贵，具有生物安全风险，而且很慢，通常需要3-5天才能拿到结果。
一些研究团队正在开发ELISA类测试，来满足BSL2类检测的需求，这类检测在几个小时内完成，而非几天。当前的发明人是最先使用ELISA和VNT检测在新加坡进行接触者追踪的[30]。自那之后，一些其他的研究团队开发出了对于 SARS-CoV-2感染的ELISA检测[31，32]。大多数研究团队正在使用的是间接 ELISA，即用抗原包被ELISA板，之后与检测血清以及HRP标记的二抗进行结合 (图1)。这是最简单/最便宜的血清检测形式，因而广泛使用。但是通常存在特异性问题。ELISA检测当前被用于筛查的第一线，通常需要使用更加特异且可靠的 VNT检测进行确证[30]。
所有当前的ELISA检测都是物种-(通常为人)和同种型-(IgG或IgM)特异的，这可能是在监测和研究人类以外血清方面存在的主要缺憾。而如今急需对不同野生动物进行血清学监测，以帮助找到可能未被发现的促成病毒从动物到人的传播链。开发对于所有将被调查的野生动物特异的ELISA是一项艰巨的任务。
发明内容
在第一个方面，本申请提供一种套件，其可以包含：(i)由SARSr-CoV编码的多肽或其片段，(ii)与(i)的多肽或其片段特异结合的多肽或其片段，以及(iii) 用于检测(i)的多肽或其片段与(ii)的多肽或其片段的相互作用的体系。
同时提供一种套件，其可以包含：(i)由SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段，以及(ii)与(i)的刺突蛋白或其片段特异结合的ACE2蛋白或其片段。
在一些实施方式中，套件还可以包含用于检测(i)的刺突蛋白或其片段与(ii) 的ACE2蛋白或其片段的相互作用的体系。
在一些实施方式中，(i)的刺突蛋白或其片段、或者(ii)的ACE2蛋白或其片段可以与检测物质偶联。在一些实施方式中，(i)的刺突蛋白或其片段或者(ii) 的ACE2蛋白或其片段可以固定于固体支持物。
在一些实施方式中，
(a)(i)的刺突蛋白或其片段与检测物质偶联，其中(ii)的ACE2或其片段固定于固体支持物；或者
(b)(ii)的ACE2或其片段与检测物质偶联，其中(i)的刺突蛋白或其片段固定于固体支持物。
在一些实施方式中，SARSr-CoV可以是SARS-CoV-2或其变体。
在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含S1亚基，或由S1亚基构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：12或27具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：12或27具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，或由刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：13或26具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：13或26具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。刺突蛋白或其片段可以包含刺突蛋白的受体结合基序 (RBM)，或由刺突蛋白的受体结合基序(RBM)构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含与SEQ ID NO：15、16或29具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：15、16或29具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，ACE2蛋白或其片段可以包含胞外结构域，或由胞外结构域构成。在一些实施方式中，ACE2蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，检测物质可以是辣根过氧化酶。
本申请还提供一种组合物，其可以包含：
(a)固体支持物，以及
(b)(i)由SARSr-CoV编码的多肽或其片段，和/或(ii)与(i)的多肽或其片段特异结合的多肽或其片段。
本申请还提供一种组合物，其可以包含：
(a)固体支持物，以及
(b)(i)由SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段，和/或(ii)与(i)的刺突蛋白或其片段特异结合的ACE2蛋白或其片段。
在一些实施方式中，该组合物还可以包含用于检测(i)的刺突蛋白或其片段与(ii)的ACE2蛋白或其蛋白的相互作用的体系。
在一些实施方式中，(i)的刺突蛋白或其片段或者(ii)的ACE2蛋白或其片段可以固定于固体支持物。
在一些实施方式中，(i)的刺突蛋白或其片段、或者(ii)的ACE2蛋白或其片段可以与检测物质偶联。
在一些实施方式中，
(a)(i)的刺突蛋白或其片段与检测物质偶联，其中(ii)的ACE2或其片段固定于固体支持物；或者
(b)(ii)的ACE2或其片段与检测物质偶联，其中(i)的刺突蛋白或其片段固定于固体支持物。
在一些实施方式中，SARSr-CoV可以是SARS-CoV-2或其变体。
在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含S1亚基，或由S1亚基构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：12或27具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：12或27具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，或由刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：13或26具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：13或26具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。刺突蛋白或其片段可以包含刺突蛋白的受体结合基序 (RBM)，或由刺突蛋白的受体结合基序(RBM)构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含与SEQ ID NO：15、16或29具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：15、16或29具有70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，ACE2蛋白或其片段可以包含胞外结构域，或由胞外结构域构成。在一些实施方式中，ACE2蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，检测物质可以是辣根过氧化酶。
本发明还提供一种多肽，其可以包含由SARSr-CoV编码的多肽或其片段的氨基酸序列，其中该多肽可以与检测物质偶联。
本申请还提供一种多肽，其可以包含由SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段的氨基酸序列，其中该多肽可以与检测物质偶联。
在一些实施方式中，SARSr-CoV可以是SARS-CoV-2或其变体。
在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含S1亚基，或由S1亚基构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：12或27具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：12或27具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，或由刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：13或26具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：13或26具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含刺突蛋白的受体结合基序(RBM)，或由刺突蛋白的受体结合基序(RBM)构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：14具有至少70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。
本申请还提供一种可以与SARSr-CoV编码多肽或其片段特异结合的多肽，其中该多肽可以与检测物质偶联。
本申请还提供一种可以包含ACE2蛋白或其片段的氨基酸序列的多肽，其中该多肽可以与检测物质偶联。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含与SEQ ID NO：15、16或29具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：15、16或29具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，ACE2蛋白或其片段可以包含胞外结构域，或由胞外结构域构成。在一些实施方式中，ACE2蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，检测物质可以是辣根过氧化酶。
本申请还提供一种核酸，编码本申请的多肽。
本申请还提供一种载体，其可以包含本申请的核酸。
本申请还提供一种细胞，其可以包含本申请的核酸或载体。
本申请还提供本申请套件、组合物或多肽在用于检测样本中是否存在 SARSr-CoV抗体的方法中的用途。
在一些实施方式中，SARSr-CoV可以是SARS-CoV-2或其变体。
本申请还提供本申请套件、组合物或多肽在确定一个受试者是否被 SARSr-CoV感染的方法中的用途。
在一些实施方式中，SARSr-CoV可以是SARS-CoV-2或其变体。
在一些实施方式中，受试者可以是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者可以是人。
本申请还提供一种分析样本中是否存在SARSr-CoV抗体的方法，其可以包括：
-将样本与(i)SARSr-CoV编码的多肽或其片段、以及(ii)与(i)的多肽或其片段特异结合的多肽或其片段接触，以及
-确定(i)的多肽或其片段与(ii)的多肽或其片段之间的相互作用水平。
在一些实施方式中，SARSr-CoV可以是SARS-CoV-2或其变体。
在一些实施方式中，样本可以是血液样本、淋巴样本、唾液样本、关节滑液。在一个实施方式中，样本可以是血清。
本申请还提供一种用于确定受试者是否被SARSr-CoV感染的方法，其可以包括：
-将来自受试者的样本与(i)SARSr-CoV编码的多肽或其片段、以及(ii)与 (i)的多肽或其片段特异结合的多肽或其片段接触，以及
-确定(i)的多肽或其片段与(ii)的多肽或其片段之间的相互作用水平。
在一些实施方式中，SARSr-CoV可以是SARS-CoV-2或其变体。
在一些实施方式中，受试者可以是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者可以是人。
在一些实施方式中，样本可以是血液样本、淋巴样本、唾液样本、关节滑液。在一个实施方式中，样本可以是血清。
本申请还提供一种分析样本中是否存在SARSr-CoV抗体的方法，其可以包含：
-将样本与(i)SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段、以及(ii)与(i)的刺突蛋白或其片段特异结合的ACE2蛋白或其片段接触，以及
-确定(i)的刺突蛋白或其片段与(ii)的ACE2蛋白或其片段之间的相互作用水平。
本申请还提供一种用于确定受试者是否被SARSr-CoV感染的方法，其可以包括：
-将来自受试者的样本与(i)SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段、以及(ii) 与(i)的多肽或其片段特异结合的ACE2蛋白或其片段接触，以及
-确定(i)的多肽或其片段与(ii)的多肽或其片段之间的相互作用水平。
在一些实施方式中，(i)的刺突蛋白或其片段、或者(ii)的ACE2蛋白或其片段可以与检测物质偶联。
在一些实施方式中，(i)的刺突蛋白或其片段、或者(ii)的ACE2蛋白或其片段可以固定于固体支持物。
在一些实施方式中，(i)的刺突蛋白或其片段与检测物质偶联，其中(ii)的 ACE2或其片段固定于固体支持物。
在一些实施方式中，SARSr-CoV可以是SARS-CoV-2或其变体。
在一些实施方式中，受试者可以是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者可以是人。
在一些实施方式中，样本可以是血液样本、淋巴样本、唾液样本、关节滑液。在一个实施方式中，样本可以是血清。
在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含S1亚基，或由S1亚基构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：12或27具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：12或27具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，或由刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：13或26具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：13或26具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。刺突蛋白或其片段可以包含刺突蛋白的受体结合基序 (RBM)，或由刺突蛋白的受体结合基序(RBM)构成。在一些实施方式中，刺突蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含与SEQ ID NO：15、16或29具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：15、16或29具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，ACE2蛋白或其片段可以包含胞外结构域，或由胞外结构域构成。在一些实施方式中，ACE2蛋白或其片段可以包含与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，检测物质可以是辣根过氧化酶。
基于以下具体描述和实施例，当前公开的其他特征和优势将是非常明晰的，这些具体描述和实施例不应当看做是限制性的。在本申请中引用的所有引用文献、 GenBank登记号、专利和公开的专利申请，均明确地通过引用的方式并入本文。
应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由。。。组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。
附图说明
以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
图1示出间接ELISA的原理示意图，1)抗原包被；2)抗原特异性抗体的结合；3)HRP偶联二抗的结合；4)用HRP底物(TMB)进行染色。
图2A和2B示出病毒中和的原理示意图。图2A示出大多数病毒中和抗体通过阻断病毒附着而发挥作用，尽管一些抗体也可以通过阻断病毒脱壳进行作用。图2B示出替代病毒中和模拟大多数中和抗体通过阻断受体-病毒蛋白相互作用的作用机制。
图3A和3B示出HRP偶联的重组SARS-CoV-2刺突蛋白RBD(3A)、HRP 偶联的重组SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基、和HRP偶联的重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白(3B)对包被于ELISA板的hACE2的直接结合的结果图。
图4A和4B示出通过替代病毒中和测试(sVNT)使用固定的人ACE2蛋白以及HRP偶联的重组SARS-CoV-2刺突蛋白RBD(4A)、或HRP偶联的重组 SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基(4B)分析血清样本的结果图。
图5示出通过sVNT使用固定的人ACE2蛋白和HRP偶联的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD分析74个经PCR确诊的COVID-19患者样本和11个阴性(健康)人血清样本的结果图。
图6A-6F示出SARS-CoV-2替代病毒中和测试(sVNT)的原理和初始验证示意图。图6A示出常规病毒中和测试(VNT)的机制，SARS-CoV-2中和抗体阻断 SARS-CoV-2刺突蛋白与宿主细胞表面的hACE2受体蛋白结合。图6B示出在sVNT 检测中，SARS-CoV-2中和抗体阻断HRP偶联的RBD蛋白与预包被于ELISA板的hACE2蛋白的结合。图6C示出HRP偶联的SARS-CoV-2N、S1和RBD蛋白与hACE2的结合。图6D示出COVID-19患者血清对SARS-CoV-2RBD-hACE2 相互作用的抑制。图6E示出HRP偶联的SARS-CoV RBD与hACE2的结合。图 6F示出SARS患者血清对SARS-CoV RBD-hACE2相互作用的抑制。
图7A-7D示出具有不同IgM和IgG抗体含量的人血清的不依赖于同种型的中和效果柱形图。图7A示出高含量IgM/低含量IgG的中和效果(n＝5)。图7B示出低含量IgM/高含量IgG的中和效果(n＝3)。图7C示出低含量IgM/低含量IgG的中和效果(n＝9)。图7D示出高含量IgM/高含量IgG的中和效果(n＝5)。IgM和 IgG的含量通过特定同种型捕获ELISA确定。
图8A-8G示出不依赖于物种的病毒特异性中和效果图。图8A示出经接种得到的兔抗SARS-CoV-2RBD血清的中和效果(n＝3)。图8B示出经感染得到的麝猫抗-SARS-CoV血清的中和效果(n＝2)。图8C示出经接种得到的兔抗SARS-CoV 血清的中和效果(n＝2)。图8D示出使用不同冠状病毒感染血清的SARS-CoV-2 sVNT结果：COVID-19患者血清(n＝10)、2003年采样的SARS患者血清(n＝7，＜1年)、2020年采样的人SARS-CoV血清(n＝10，＞17年)、人OC43血清(n＝8)、人229E/NL63血清(n＝10)、经试验感染MERS-CoV的羊驼的血清(n＝4)。图8E 示出2003SARS血清的同源和异源NAb含量的比较分析。图8F示出2020SARS 血清的同源和异源NAb量的比较分析。图8G示出三个血清样本组中同源N特异性抗体的比较分析，即对于COVID-19血清的SARS-CoV-2N蛋白间接ELISA、以及对于两个SARS血清组的SARS-CoV N蛋白间接ELISA。
图9A-9C示出sVNT和VNT之间的相关性，以及使用两个不同国家的两个 COVID-19患者组的sVNT测试。图9A示出通过VNT和sVNT测试的具有不同 SARS-CoV-2抗体含量的13个COVID-19血清在70％抑制水平的相关性分析。图 9B和9C示出在新加坡(9B)和中国南京(9C)的健康对照和COVID-19血清组的测试(新加坡COVID-19n＝77，对照n＝75；南京COVID-19n＝50，对照n＝50)。
图10示出不同COVID-19血清的VNT和sVNT之间相关性的表格。得自两个生物重复的中和滴度，各个生物重复进行两个技术重复。分别示出在90％、70％、 50％和30％抑制度的sVNT滴度。
图11示出具有417个不同含量SARS-CoV-2抗体的COVID-19血清的滴定。血清样本两倍稀释，起始浓度为1∶10。针对两个阴性对照和13个PCR阳性患者的 COVID-19血清在各稀释度做出的抑制百分比。
具体实施方式
本发明在检测SARSr-CoV中和抗体的检测中使用活SARSr-CoV病毒的替代分子。本发明基于抗体对病毒赖以进入细胞的细胞受体(ACE2)与关键的病毒刺突蛋白S1结构域(RBD)之间相互作用的阻断(FIG.2B)，将传统的病毒中和测试拆分回分子元素。
有利的是，根据本申请的方法以及使用本申请的物件所进行的样本分析，比ELISA类分析更可靠，更加通用，不限于某些抗体同种型，也不限于某些特定物种的抗体。更确切地说，本申请的物件和方法可以用来检测SARSr-CoV的中和抗体，不管抗体同种型如何，不管样本得自哪个物种。当前申请的物件和方法提供更加敏感且特异的分析，不需要通过病毒中和测试进行结果验证，而病毒中和测试验证是ELISA类分析通常所需的。
而且，使用本申请物件根据本申请方法的样本分析具有超越病毒中和测试的优势，即不需要使用活病毒或感染性材料，因而是安全的，不需要使用BSL3设施。此外，本申请物件和方法的使用比起病毒中和测试更便宜，费时更短，在数小时内即可得到结果。
SARSr-CoV
本申请涉及严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)。SARSr-CoV的病毒学以及与SARSr-CoV感染相关疾病的流行病学在例如Cheng et al.，Clin Microbiol Rev(2007)20(4)：660-694、和de Wit et al.，Nat Rev Microbiol(201 6)14： 523-534中有过综述，这两篇综述均通过引用的方式全部并入本文。
SARSr-CoV是一种感染人、蝙蝠和某些其他哺乳动物的冠状病毒，属于乙型冠状病毒属、Sarbecoronavirus亚属。这是一种包膜的正义单链RNA病毒。
两种SARSr-CoV菌株已经在人中造成了严重的呼吸疾病爆发：SARS-CoV，在2002到2003年间造成严重急性呼吸综合征(SARS)的爆发；以及SARS-CoV-2，造成了2019冠状病毒疾病(COVID-19)大流行。已知有几百个SARSr-CoV菌株仅感染非人物种；蝙蝠是很多SARS相关冠状病毒的主要储库。
根据本申请多个方面的一些实施方式中，SARSr-CoV是在人中造成冠状病毒疾病的SARSr-CoV物种。
在一些实施方式中，SARSr-CoV是SARS-CoV或其变体、或是SARS-CoV-2 或其变体。在一些实施方式中，SARSr-CoV是SARS-CoV-2或其变体。
在本文的一些实施方式中，“SARSr-CoV”是指核苷酸序列为GenBank登录号：AY278488.2(“SARS冠状病毒BJ01，完整基因组”，参见Wu et al.，Genomics ProteomicsBioinformatics 1(2)，131-144(2003))的SARSr-CoV菌株。SARS-CoV 的变体可以包含与GenBank登录号：AY278488.2的核苷酸序列具有至少80％，例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列一致度的核苷酸序列。
本文所用的“序列一致度”是指在序列比对后，一个序列中的核苷酸/氨基酸残基与参照序列中核苷酸/氨基酸残基一致的百分比，如果必要的话，引入空格以实现两个序列间最高的序列一致度百分比。可以以本领域技术人员所知的多种方式，比如，使用公开的计算机软件例如ClustalOmega(
Figure RE-GDA0002735133740000101
J.2005，Bioinformatics 21，951-960)、T-coffee(Notredame et al.2000，J.Mol.Biol.(2000)302，205-217)、Kalign (Lassmann andSonnhammer 2005，BMC Bioinformatics，6(298))和MAFFT(Katoh and Standley 2013，Molecular Biology and Evolution，30(4)772-780)软件，来实现用于确定两个或更多个氨基酸或核酸序列间序列一致度百分比的两两序列比对和多个序列比对。当使用这些软件的时候，优选使用例如空格罚分和扩展罚分的缺省参数。
在本文的一些实施方式中，“SARS-CoV-2”是指核苷酸序列为GenBank登录号：MN996527.1(“严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离体WIV02，完整基因组”)的 SARSr-CoV菌株。SARS-CoV-2的变体可以包含与GenBank登录号：MN996527.1 的核苷酸序列具有至少80％，例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、 99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列一致度的核苷酸序列。
在优选实施方式中，SARSr-CoV是SARS-CoV-2或其变体。
SARSr-CoV编码的多肽
本申请还涉及由SARSr-CoV编码的多肽。
本文中，多肽是指任何包含有经肽键连接的三个或更多个氨基酸残基的分子。根据本申请的多肽包含肽(例如，三肽、寡肽等)，以及可能包含化学修饰(例如糖化(糖聚肽)、磷酸化、羟化、磺化、棕榈酰化和二硫键形成)的肽。多肽也可以指蛋白。
由SARSr-CoV基因组编码的组成蛋白和糖蛋白在例如Masters，Adv Virus Res.(2006)66：193-292和Song et al.，Viruses(2019)11(1)：59中有过描述，两个文献均通过引用的方式全部并入本文。SARSr-CoV基因组编码四个主要结构蛋白：刺突(S) 蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白、和核衣壳(N)蛋白。
SARS-CoV的刺突蛋白可以具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。SARS-CoV 的包膜蛋白可以具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。SARS-CoV的膜蛋白可以具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。SARS-CoV的核衣壳蛋白可以具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
SARS-CoV-2的刺突蛋白可以具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。 SARS-CoV-2的包膜蛋白可以具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。SARS-CoV-2 的膜蛋白可以具有SEQ IDNO：7所示的氨基酸序列。SARS-CoV-2的核衣壳蛋白可以具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，由SARS-CoV编码的多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：1氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由SARS-CoV编码的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由SARS-CoV编码的多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：3氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由SARS-CoV编码的多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：4氨基酸具有至少 70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，由SARS-CoV-2编码的多肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：5氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由 SARS-CoV-2编码的多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：6氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由SARS-CoV-2编码的多肽包含SEQ IDNO： 7的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：7氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由SARS-CoV-2编码的多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：8 氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽选自刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白，或刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白或核衣壳蛋白的片段。在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽选自刺突蛋白、包膜蛋白和膜蛋白，或刺突蛋白、包膜蛋白和膜蛋白的片段。在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽是刺突蛋白或刺突蛋白片段。
如本文所用的，参照蛋白/多肽的“片段”可以是任何长度(按氨基酸数量计)，尽管可以任选地是参照蛋白/多肽长度的至少25％，可以具有参照蛋白/多肽的 50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的最大长度。
SARSr-CoV刺突蛋白包含S1和S2亚基。S1亚基包含最小的受体结合结构域 (RBD)，SARSr-CoV通过RBD与宿主细胞表达的ACE2结合。尽管病毒中和可以通过其他类型的抗体完成，阻断受体/病毒进入细胞的抗体代表了任何特定病毒的中和抗体的绝大多数[33]。
RBD在体外实验中显示出，其足以结合ACE2[34]。从SARS的研究中，已显示出大多数SARS-CoV中和抗体靶向RBD区域[35]。
RBD反过来包含受体结合基序(RBM)，其是RBD中接触ACE2的区域。
在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽可以包含刺突蛋白的S1亚基，或由S1亚基构成。在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽可以包含刺突蛋白的RBD，或由RBD构成。在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽可以包含刺突蛋白的RBM，或由RBM构成。
SARS-CoV的刺突蛋白的S1亚基可以具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。 SARS-CoV的刺突蛋白的RBD可以具有SEQ ID NO：10或28所示的氨基酸序列。 SARS-CoV的刺突蛋白的RBM可以具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚基可以具有SEQ ID NO：12或27所示的氨基酸序列。SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD可以具有SEQ ID NO：13或26所示的氨基酸序列。SARS-CoV的刺突蛋白的RBM可以具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽(例如，SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)可以包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些序列构成。在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽(例如，SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)可以包含SEQ ID NO：10或28的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：10或28的氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽(例如，SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)可以包含SEQ ID NO：11 的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽(例如，SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)可以包含SEQ ID NO：12或27的氨基酸序列，或与SEQ ID NO： 12或27的氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽(例如， SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)可以包含SEQ ID NO：13或26的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13或26的氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。在一些实施方式中，由 SARSr-CoV编码的多肽(例如，SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)可以包含 SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由这些氨基酸序列构成。
与SARSr-CoV编码的多肽特异结合的多肽
本申请还涉及与SARSr-CoV编码的多肽/其片段特异结合的多肽或其片段。
如本文所使用的，“特异结合”是指对于相关分子的有选择性的相互作用，与非特异结合区分开。特异结合特定分子的多肽，优选地与结合其不特异结合的其他分子时相比，以更高的亲和力、和/或更长的持续时间结合该特定分子。
某一多肽特异性结合特定分子的能力可以通过本领域已知方法的分析而确定，本领域已知方法为例如ELISA、表面等离子共振(SPR；参见例如Hearty et al.， Methods MolBiol(2012)907：411-442)、生物膜干涉(参见例如Lad et al.，(2015)J Biomol Screen 20(4)：498-507)、流式细胞术、或放射标记的抗原结合检测(RIA)、酶联免疫吸附实验。通过这些分析，可以对与特定分子的结合进行确定和定量。在一些实施方式中，结合可以是在特定检测中检测到的反应。
在一些实施方式中，多肽与非靶向分子的结合程度比与多肽特异结合的分子结合度低约10％，如通过ELISA、SPR、生物膜干涉或RIA所测量的。或者，特异结合可以反映在结合亲和力方面，其中，多肽以比多肽结合非靶向分子的解离常数(KD)高出至少0.1数量级(即，0.1x 10n，其中n是表示数量级的整数)的 KD，与多肽特异结合的分子结合。该数量级可以任选地为至少0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0。
与SARSr-CoV编码的多肽/其片段特异结合的多肽可以例如是SARSr-CoV编码的多肽/其片段的相互作用伴侣(interaction partner)、或与SARSr-CoV编码的多肽/片段特异结合的抗原结合分子。
由SARSr-CoV编码的多肽/片段的相互作用伴侣可以是与该多肽/片段有关联的任何多肽。上述关联可以包括SARSr-CoV编码的多肽/片段与相互作用伴侣之间的共价相互作用(例如，二硫键)和/或非共价相互作用(例如，静电作用(例如，离子键、氢键)、范德华力)。
本文所用的“抗原结合分子”是指能够特异结合靶多肽的分子，且包括，例如单抗、多抗、单特异和多特异抗体(例如，双特异抗体)、和抗体片段(例如，Fv、 scFv)Fab、scFab、F(ab’)2、Fab2、二聚抗体(diantibodies)、三聚抗体(triabodies)、 scFv-Fc、微型抗体(minibodies)、单域抗体(e.g.VhH)等)、和适体。
在一些实施方式中，由SARSr-CoV编码的多肽/片段的相互作用伴侣是由 SARSr-CoV结合的细胞所表达的多肽、或其片段。在一些实施方式中，相互作用伴侣是在SARSr-CoV结合的细胞表面表达的受体分子、或其片段。
在一些实施方式中，与SARSr-CoV编码的多肽/其片段特异结合的多肽可以包含ACE2或其片段的氨基酸序列、或与ACE2或其片段的氨基酸序列具有至少60％序列一致度，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
血管紧张素转化酶2(ACE2)是单次跨膜I型羧肽酶，其附着于肺、动脉、心脏、肾脏和肠的外表组织细胞的细胞膜。ACE2的结构和功能在Hamming et al.， J Pathol(2004)203(2)：631-637中有过描述，该文献通过引用的方式全部并入本文。 ACE2已经被识别为SARS-CoV和SARS-CoV-2经由刺突蛋白与其的相互作用而进入细胞的进入点。SARSr-CoV刺突蛋白与ACE2胞外结构域结合。ACE2已经被认定为SARS-CoV和SARS-CoV-2进入细胞的关键受体[3，7]。
在说明书中，“ACE2”是指任何物种的ACE2，且包括得自任何物种的ACE2 亚型、片段、变体(包括突变体)、或同系物。在一些实施方式中，ACE2是哺乳动物(例如，兽亚纲、真哺乳亚纲、真兽亚纲、原兽亚纲、统兽总目、灵长目(猴、非人灵长类、或人))的ACE2。在一些实施方式中，ACE2是人、蝙蝠、穿山甲、麝猫、或猪的ACE2。ACE2的亚型、片段、变体或同系物可以任选地以与特定物种例如人的非成熟或成熟ACE2亚型具有至少70％序列一致度、优选80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度为特征。
人ACE2亚型1的氨基酸序列如SEQ ID NO：15或29所示。人ACE2亚型2 的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。人ACE2亚型1的胞外结构域如SEQ ID NO： 17或30所示。
蝙蝠ACE2可以具有SEQ ID NO：18或31所示的氨基酸序列。蝙蝠ACE2的胞外结构域可以具有SEQ ID NO：19或32所示的氨基酸序列。
穿山甲ACE2可以具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。穿山甲ACE2的胞外结构域可以具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
麝猫ACE2可以具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。麝猫ACE2的胞外结构域可以具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
猪ACE2可以具有SEQ ID NO：24或33所示的氨基酸序列。猪ACE2的胞外结构域可以具有SEQ ID NO：25或34所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：15或29所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：15或29所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：16所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：17或30所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17或30所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：18或31所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：18或31所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：19或32所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：19或32所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：20所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：22所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：23所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：24或33所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：24或33所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，ACE2或其片段可以包含SEQ ID NO：25或34所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：25或34所示氨基酸具有至少70％序列一致度，例如至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致度的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，本申请的ACE2或片段根据本申请的套件、组合物、用途和方法来选择，以显示(i)对于SARSr-CoV所编码的多肽/其片段(例如 SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)的特异结合，和(ii)对于SARSr-CoV编码的多肽/其片段的足够灵敏、可以有效检测样本中对SARSr-CoV编码多肽/其片段(例如SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)特异的抗体的存在的结合亲和力。
本申请的套件和组合物
本申请提供套件和组合物，其可以包含SARSr-CoV编码的多肽或其片段 (SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)、和/或与SARSr-CoV编码多肽或其片段特异结合的多肽或其片段(例如，与SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段特异结合的ACE2蛋白或其片段)。
在根据该方面的一些实施方式中，套件和组合物还可以包含固体支持物。
固体支持物可以是多肽可方便固定(例如，通过吸附或偶联)、且适用于分析含有抗体的样本(例如，根据本申请的得自血液的样本，例如血清样本)的任何固体支持物。用在这类套件和组合物中的合适固体支持物为本领域已知。
在一些实施方式中，固体支持物可以包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃、玻璃、或石英。在一些实施方式中，固体支持物可以是微量滴定(或“多孔”) 板或微阵列板。在一些实施方式中，固体支持物可以是珠子，例如磁珠。
根据本申请的多肽可以以本领域已知的方法固定(或“包被”)于本申请的固体支持物。多肽可以共价地或非共价地固定于固体支持物。
例如，可以通过在缓冲液中施用多肽溶液，在适合于多肽吸附于固体支持物表面的条件下，持续充足的时间，从而将多肽固定于固体支持物上。或者，多肽可以通过例如共价键而偶联至固体支持物。
在一些实施方式中，本申请的物件还可以包含用于检测SARSr-CoV编码多肽或其片段(例如SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)与SARSr-CoV编码多肽或片断特异结合的多肽或其片段(例如，与SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段特异结合的ACE2蛋白或其片段)之间相互作用的体系。
用于检测相互作用的体系可以是任何合适的体系。例如，该体系可以采用能够和SARSr-CoV编码多肽或其片段与特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽或片段所形成的多肽复合体特异结合的抗体，或者可以采用反映SARSr-CoV编码多肽或其片段与特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽或片段之间相互作用的报告蛋白。
在一些实施方式中，用于检测相互作用的体系可以采用检测物质。在以举例方式示出的以下实验例中，SARS-CoV-2 S1和RBD多肽与辣根过氧化酶(HRP) 偶联。在清洗除去未结合的SARS-CoV-2 S1和RBD多肽后，辣根过氧化酶活性水平显示出与固定的ACE2结合的S1/RBD的量。
因而，在根据本申请多个方面的一些实施方式中，SARSr-CoV编码的多肽或其片段(例如SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)、和/或与SARSr-CoV编码多肽或片段特异结合的多肽或片段(例如，与SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段特异结合的ACE2蛋白或其片段)，与用于检测SARSr-CoV编码多肽或其片段与特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽或片段之间相互作用的检测物质偶联。
检测物质可以例如是可检测的基团，例如荧光标记、冷光标记、可免疫检测的标记、辐射标记、化学标记、核酸标记或多肽标记。在一些实施方式中，检测物质可以是具有可检测活性，例如对于特定底物的酶活性，的基团。具有可检测活性的检测物质的例子包括例如辣根过氧化酶(HRP)和荧光素酶基团。
在检测物质是具有可检测活性基团的一些实施方式中，本申请的套件或组合物还可以包含分析可检测活性所需的体系。
在一些实施方式中，根据本申请的套件或组合物可以采用化学发光检测。即，在一些实施方式中，可检测活性是化学发光。基于化学发光的检测在例如Kricka et al.，Analytica chimica acta，(2003)，500(1)：279-286和Chen et al.，Chinese Journal ofAnalytical Chemistry(2012)40(1)：3-10中有过描述，这两篇文献均通过引用的方式全文并入。
在一些实施方式中，检测物质可以例如是在合适激发时产生电磁辐射的化学物质。在一些实施方式中，化学物质可以是吖啶化合物(例如吖啶酯或吖啶磺酰胺酯)，该化合物可以使用碱性双氧水而激活。
在一些实施方式中，检测物质可以是例如催化冷光化合物发出电磁辐射的酶。在一些实施方式中，酶可以是HRP，其可以用于在过氧化氢存在下催化发光氨降解。在一些实施方式中，酶可以是碱性磷酸酶，其可以用于催化AMPPD降解。
在一些实施方式中，在本申请的套件或组合物中提供SARSr-CoV编码的多肽或其片段(例如，SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段(RBD))，从而用于分析样本，其中SARSr-CoV编码的多肽或其片段(例如SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段(例如RBD))的量或浓度(a)低于使用该套件或组合物分析的样本中的SARSr-CoV中和抗体的量/浓度，和/或(b)在不存在样本中的SARSr-CoV中和抗体的情况下，足以产生反映SARSr-CoV编码多肽或其片段(例如SARSr-CoV 编码的刺突蛋白或其片段(例如RBD))与特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽或片段(例如特异结合SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段的ACE2蛋白或其片段)之间相互作用的可检测信号。
本领域技术人员能够确定SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段的合适量/浓度，其中套件和组合物可通过例如确定/参考已确定的或已知含有SARSr-CoV中和抗体的样本中的SARSr-CoV中和抗体的量/浓度后而投入使用。例如，在一些实施方式中，合适的多肽或片段的量/浓度，可以(在摩尔比上)低于或等于含有SARSr-CoV中和抗体的参照样本中的SARSr-CoV中和抗体的平均 (例如算数平均值)量/浓度。在一些实施方式中，待测样本的梯度稀释可以用于确定SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段的合适量。
本领域技术人员能够确定SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段的合适量/浓度，其中组合物和套件通过例如确定/参考在样本中不存在SARSr-CoV 中和抗体的情况下生成反映SARSr-CoV编码多肽或其片段(例如SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)与特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽(例如 ACE2)或其片段之间相互作用的可检测信号所需的最小量/浓度后而投入使用。
多肽
本申请还提供本文所述套件和组合物的组成多肽。多肽可以以分离的或基本纯的形式提供。
在一些实施方式中，本申请的多肽可以在氨基酸序列之间，例如在SARSr-CoV 编码的刺突蛋白或其片段与检测物质之间包含一个或多个接头序列。
接头序列为本领域所知，且在例如Chen et al.，Adv Drug Deliv Rev(2013) 65(10)：1357-1369中有过描述，该文献通过引用的方式并入本文。在一些实施方式中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列使得经接头序列连接的氨基酸序列可以相对移动。柔性接头为本领域技术人员所知，有一些在Chen et al.，Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-1369中描述。柔性接头序列经常包含高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。
在一些实施方式中，接头序列可以包含至少一个甘氨酸残基和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方式中，接头序列可以由甘氨酸和丝氨酸残基构成。在一些实施方式中，接头序列可以具有1-2、1-3、1-4、1-5、或1-10氨基酸的长度。
本申请的多肽还可以包含额外的氨基酸或氨基酸序列。例如，多肽可以包含促进多肽表达、折叠、转运、加工或纯化的氨基酸序列。例如，多肽可以任选地在多肽的N端或C端包含编码His(例如6X His)、Myc、GST、MBP、FLAG、 HA、E或生物素标签的氨基酸序列。
本申请的多肽可以额外地包含信号肽(也称为前导序列或信号肽)。信号肽通常由5-30疏水氨基酸序列构成，其形成单α螺旋。分泌蛋白和表达在细胞表面的蛋白通常包含信号肽。
信号肽可以存在于多肽的N端，可以存在于新合成的多肽中。信号肽用于多肽的高效转运和分泌。信号肽通常通过切割而去除，因而并不包含在从表达多肽的细胞中分泌的成熟多肽中。
信号肽存在于很多蛋白中，并记录在例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白信息源(Protein Information Resource)、蛋白数据银行(Protein DataBank)、Ensembl和InterPro的数据库中，和/或可以例如使用氨基酸序列分析工具如SignalP(Petersen et al.，2011 Nature Methods 8：785-786)或Signal-BLAST(Frankand Sippl，2008 Bioinformatics 24：2172-2176)来识别/预测。
根据本申请的多肽可以根据本领域已知的制备多肽的方法而制备。
多肽可以通过化学合成，例如液相或固相合成，而制备。例如，肽/多肽可以使用在例如Chandrudu et al.，Molecules(2013)，18：4373-4388中所述的方法进行合成，该文献通过引用的方式并入本文。
或者，多肽可以通过重组表达而制备。适用于多肽重组制备的分子生物学技术为领域内熟知，例如在Green and Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(4thEdition)，Cold Spring Harbor Press，2012、和Nat Methods.(2008)；5(2)： 135-146中所述的，这两个文献均通过引用的方式并入本文。
对于本申请的重组制备，可以使用任何适于多肽表达的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方式中，细胞是原核细胞，例如古菌或细菌细胞。在一些实施方式中，细菌可以是革兰氏阴性菌，例如肠杆菌科的菌，例如大肠杆菌。在一些实施方式中，细胞是真核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，例如CHO、HEK(例如HEK293)、HeLa或COS细胞。在一些实施方式中，细胞为瞬时或稳定表达多肽的CHO细胞。
在一些情况下，细胞不是原核细胞，因为原核细胞中不发生与真核细胞中相同的折叠或翻译后修饰。此外，在真核细胞中可以实现非常高的表达量，且蛋白可以使用合适的标签更容易地从真核细胞中纯化出来。也可以使用特定的增强蛋白分泌到培养液中的质粒。
在一些实施方式中，多肽可以通过无细胞蛋白合成(CFPS)，使用例如Zemella etal.Chembiochem(2015)16(17)：2420-2431中描述的系统，进行制备，该文献通过引用的方式并入本文。
制备可以包括已改造成表达目标蛋白的真核细胞的培养或发酵。培养或发酵可以在配备有适当营养素、空气/氧气和/或生长因子供应的生物反应器中进行。分泌的蛋白可以通过将细胞和培养液/发酵液分离、提取蛋白、以及分开个体蛋白而分离分泌多肽，而进行收集。培养、发酵和分离技术为本领域技术人员所知，并在例如Green and Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(4th Edition)中有过描述，文献通过引用的方式并入本文。
生物反应器包括一个或多个可以培养细胞的容器。在生物反应器中的培养可以连续进行，反应物连续流入反应器，而培养细胞连续流出反应器。或者，培养可以分批次进行。生物反应器监控并控制容器中的环境条件，例如pH、空气、进出流量和搅拌，从而向培养的细胞提供最佳的条件。
在培养表达多肽的细胞后，可以分离目标多肽。可以使用本领域已知的任何适于从细胞分离蛋白的方法。为分离多肽，可能需要从营养培养基中分离细胞。如果多肽是从细胞分泌的，可以通过对含有目标分泌多肽的培养基进行离心来分离细胞。如果在细胞内收集目标多肽，则蛋白分离可以包括离心，以从细胞培养基中分离细胞，用裂解缓冲液处理细胞团，以及例如通过超声、快速冷冻-解冻或渗透裂解来破坏细胞。
之后可能需要从包含其他蛋白和非蛋白组分的上清液或培养基中分离目标多肽。从上清液或培养基中分离蛋白组分的通常做法是通过沉淀。不同溶解度的蛋白在不同浓度的沉淀剂例如硫酸铵下沉淀。例如，处于低浓度沉淀剂时，提取水溶性蛋白。因此，通过添加不断递增浓度的沉淀剂，不同溶解度的蛋白可以区分开来。随后可以进行透析来从分离蛋白中出去硫酸铵。
区分不同蛋白的其他方法为领域内所知，例如离子交换色谱和体积排阻色谱。这些可以用作沉淀的可替换方法，或者可以在沉淀后进行。
一旦目标多肽从培养液中分离出来，可能需要浓缩多肽。本领域已知多种浓缩蛋白的方法，例如超滤或冻干。
本申请的其他物件
本申请提供编码本申请多肽的核酸。应当意识到的是，“(一个)核酸”包括多个该核酸。
在一些实施方式种，核酸例如从其他核酸、或自然存在的生物材料中纯化或分离出来。在一些实施方式中，核酸包括DNA和/或RNA，或由DNA和/或RNA 构成。
本申请还提供可以包含本申请核酸的载体。
核苷酸序列可以包含在载体例如表达载体中。本文所用的“载体”是用作向细胞转移外源核酸的载体的核酸分子。载体可以是用于在细胞中表达核酸的载体。这些载体可以包含与编码待表达序列的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。载体也可以包含终止密码子和表达增强子。可以使用领域内已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子，从本申请的载体中表达肽或多肽。
术语“可操作地连接”可以包括所选核酸序列与调控核酸序列(例如启动子和/ 或增强子)共价连接以将核酸序列的表达置于调控序列的影响或控制下(从而形成表达盒)的情况。因此，如果调控序列能够作用于核酸序列的转录，则调控序列可操作地连接所述核酸序列。所得的转录子可以翻译成所需的肽/多肽。
合适的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒(例如，得自鼠白血病病毒(MLV)的载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、痘苗病毒载体、和孢疹病毒载体)、转座子类载体、和人工染色体(例如，酵母人工染色体)。
在一些实施方式中，载体可以是真核载体，例如可以包含载体在真核细胞中表达蛋白所需的元件的载体。在一些实施方式中，载体可以是哺乳动物载体，例如可以包含巨细胞病毒(CMV)或SV40启动子以驱动蛋白表达的哺乳动物载体。
本申请还提供可以包含或表达本申请多肽的细胞。还提供可以包含或表达本申请的核酸或载体的细胞。该细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物可以是灵长类(猴、非人灵长类或人)或非人哺乳动物(例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠、或其他啮齿动物(包括任何啮齿目的动物)、猫、狗、猪、羊、山羊、牛(包括奶牛，例如乳牛、和任何牛属的动物)、马(包括任何马科动物)、驴、和非人灵长类)。
本申请还提供一种用于制备可以包含本申请核酸或载体的细胞的方法，包括向细胞引入本申请的核酸或载体。在一些实施方式中，向细胞引入本申请的分离核酸或载体包括转化、转染、电穿孔或转导(例如逆转录病毒转导)。
本申请还提供一种用于制备可以包含本申请多肽的细胞的方法，包括向细胞中引入本申请的核酸或载体。在一些实施方式中，方法还额外地包括在适于核酸或载体在细胞中表达的条件下培养细胞。在一些实施方式中，方法在体外进行。
本申请还提供通过本申请方法获得、或者可通过本申请方法获得的细胞。
使用本发明物件的方法以及本发明物件的用途
本申请还涉及使用本申请套件、组合物和多肽的方法，以及本申请套件、组合物和多肽的用途。
本申请的物件可用于检测针对SARSr-CoV编码的多肽或其片段(例如 SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段)的抗体。
具体而言，本申请的物件可用于检测减少或抑制SARSr-CoV编码多肽或其片段与特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽或片段的结合的抗体的存在。这些抗体可以称为中和抗体。
通过进一步解释的方式，参照下文的实验例，基于对SARS-CoV-2刺突蛋白 S1亚基或SARS-CoV-2刺突蛋白RBD与固定于固体支持物的ACE2之间相互作用的减少程度的确定，来检测样本中抑制SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基和 SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的结合的抗体的存在。相对于缺乏SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基或SARS-CoV-2刺突蛋白RBD中和抗体的样本的对照，对相互作用的减少的确定，可以推断出中和抗体的存在。
因而，本申请的物件可应用于检测样本中SARSr-CoV抗体的存在的方法中。应当意识到的是，该方法可用于检测针对套件/组合物中采用的由SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段的抗体的存在。
通过示例的方式，本文示出的检测采用SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基或 SARS-CoV-2刺突蛋白RBD，因而可用于检测针对SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基或SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的抗体。
检测样本中SARSr-CoV抗体的存在可以表明该样本之前所在的受试者正在或之前被SARSr-CoV感染。检测样本中SARSr-CoV抗体的存在可以表明该样本之前所在的受试者对于当前或之前SARSr-CoV感染的免疫反应，特别是体液免疫反应。
因而，本申请提供用于确定受试者是否正在或者已经被SARSr-CoV感染的方法，以及确定受试者是否正在或者已经激发出对SARSr-CoV的免疫反应(例如，体液免疫反应)。
方法可以大体地包括分析样本，以确定，相对于在合适阴性对照条件下观察到的相互作用水平而言，样本内容物是否减少或抑制SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段与特异性结合SARSr-CoV编码多肽或其片段的多肽或片段(例如ACE2)之间的相互作用水平。
合适的阴性对照条件可以例如采用已知缺少能够减少或抑制SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段与特异结合SARSr-CoV编码多肽或其片段的多肽或片段(例如ACE2)之间相互作用水平的抗体的相当样本。例如，对照样本可以来自已知未受感染的受试者，例如已知未被SARSr-CoV感染的受试者。
对于减少的或抑制的相互作用水平的确认，表明样本中存在着SARSr-CoV编码多肽或其片段(例如刺突蛋白或其片段)的中和抗体。
如本文所用的，“减少的”或“抑制的”相互作用可以比在阴性对照条件下观察到的SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段与特异结合SARSr-CoV编码多肽或其片段的多肽或片段(例如ACE2)的相互作用水平低1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55 倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍
或者，“减少的”或“抑制的”相互作用可以以对阴性对照条件下观察到的 SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段与特异结合SARSr-CoV编码多肽或其片段的多肽或片段(例如ACE2)的相互作用的抑制百分比来表示。在这种情况下，“减少的”或“抑制的”相互作用可以指对于阴性对照条件下观察到的 SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段与特异结合SARSr-CoV编码多肽或其片段的多肽或片段(例如ACE2)的相互作用的高于0％的抑制百分比，例如高于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％or 99％、或100％的抑制百分比。
在一些实施方式中，本申请的一个方面可以包括：
-使从受试者获得的样本与(i)SARSr-CoV编码多肽(例如，刺突蛋白)或其片段、以及(ii)与SARSr-CoV编码多肽或片段特异结合的多肽(例如ACE2) 或其片段接触，以及
-确定(i)的多肽或片段与(ii)的多肽或其片段之间的相互作用的水平。
在一些实施方式中，本申请的一个方面可以包括：
-(a)使从受试者获得的样本与(i)SARSr-CoV编码的多肽(例如，刺突蛋白)或其片段接触，
-(b)使步骤(a)中形成的混合物与(ii)特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽(例如，ACE2)或其片段接触，以及
-(c)确定(i)的多肽或片段与(ii)的多肽或其片段之间相互作用的水平。
在一些实施方式中，本申请的一个方面可以包括：
-(a)使从受试者获得的样本与(i)特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽(例如，ACE2)或其片段接触，
-(b)使步骤(a)中形成的混合物与(ii)SARSr-CoV编码的多肽(例如，刺突蛋白)或其片段接触，以及
-(c)确定(i)的多肽或其片段与(ii)的多肽或片段之间相互作用的水平。
在一些实施方式中，根据本申请使样本/混合物与多肽“接触”可以包括将这些样本/混合物和可包含多肽的组合物(例如，溶液)，例如在合适的容器中或合适的固体支持物上混合。
在一些实施方式中，根据本申请将样本/混合物与多肽“接触”可以包括向固定有多肽的固体支持物施加样本/混合物。
在一些实施方式中，本申请可以包括将样本与包含SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段(RBD)的组合物接触，其中多肽或其片段的量或浓度(a) 按摩尔比计，低于或等于样本中中和抗体的量/浓度，和/或(b)足以在样本不存在SARSr-CoV中和抗体的情况下生成反映(i)的多肽或片段与(ii)的多肽或片段之间相互作用的可检测信号。
在一些实施方式中，本申请的该方面可以包括确定样本中SARSr-CoV中和抗体的存在与否。在一些实施方式中，本申请的该方面可以包括确定样本中 SARSr-CoV中和抗体的量和/或浓度。
本领域技术人员能够，例如通过确定/参照已确定的或已知包含SARSr-CoV中和抗体的样本中的SARSr-CoV中和抗体的量/浓度，确定在这些方法中采用的 SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段的合适量/浓度。例如，在一些实施方式中，合适的多肽的量/浓度可以，以摩尔比计，低于或等于包含SARSr-CoV 中和抗体的参照样本中的SARSr-CoV中和抗体的平均(例如，算术平均值)量/ 浓度。
本领域技术人员还能够，例如通过确定/参照在样本中不存在SARSr-CoV中和抗体的情况下生成反映SARSr-CoV编码多肽或其片段(例如SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段(例如RBD))与特异结合SARSr-CoV编码多肽或片段的多肽 (例如ACE2)或片断相互作用的可检测信号的最少量/浓度，来确定在这些方法中采用的SARSr-CoV编码多肽(例如，刺突蛋白)或其片段的合适量/浓度。
在一些实施方式中，本申请的该方面可以采用一定范围内的不同量/浓度的SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段，以分析给定的样本。即，在一些实施方式中，本申请的该方面可以包括用一定范围内的不同量/浓度的 SARSr-CoV编码多肽(例如刺突蛋白)或其片段来分析所给出的同一样本的等分试样。一定范围内的不同量/浓度的多肽可以是梯度稀释，且可以例如通过多肽溶液的梯度稀释而制备。
在一些实施方式中，本申请的该方面还可以包含一个或多个以下内容：
-从受试者获得样本(例如血液样本)；
-制备得自受试者的血液样本的血液类样本(例如血清样本)；
-提供本申请的组合物或套件；
-向本申请的组合物或套件施用得自血液的样本(例如，血清样本)；
-将样本与多肽/组合物在适于抗体：抗原复合物形成的条件下孵育充足的时间；
-抽吸样本；
-清洗以除去未结合蛋白；
-检测(i)的多肽或片段与(ii)的多肽或片段之间的相互作用。
在一些实施方式中，本申请的该方面还包括确定(i)的多肽或片段与(ii)的多肽或片段之间的相互作用的抑制水平(例如，百分比)。
在一些实施方式中，本申请的该方面还可以包括将观察到的(i)的多肽或片段与(ii)的多肽或片段之间的相互作用的抑制水平(例如百分比)与用于确定样本包含SARSr-CoV中和抗体的参照阈值进行比较。在一些实施方式中，本申请的该方面还包括在该比较的基础上确定样本是否包含、或不包含SARSr-CoV中和抗体(即，确定样本中SARSr-CoV中和抗体的存在或不存在)。
在方法中采用的合适的试剂、缓冲剂和清洗步骤为分子生物学领域的技术人员所知，且还可以通过参照本文的实验例和Bossart et al.，J Viol Meth(2007)142： 29-40(通过引用的方式并入本文)来推断。
在一些方面，本申请的物件和方法被用于诊断SARSr-CoV，例如SARS-CoV-2 的感染。在一些方面，物件和方法被用于诊断由SARSr-CoV感染造成的疾病，例如COVID-19。
本申请的该方面涉及受试者样本的分析。样本可以是受试者产生的任何产物、或源自于受试者产生产物的任何产物。样本可以取自任何组织或体液，例如血液样本(包括得自血液的样本)、血清样本、淋巴样本、唾液样本、关节滑液。得自血液的样本可以是患者血液的所选部分，例如所选的含有细胞的部分、或血浆或血清部分。
样本可以是含有体液免疫反应的抗体产物的任何样本。在一些实施方式中，得自受试者的样本是含有抗体的样本或其含有抗体的部分。样本优选为血液样本或得自血液的样本，更优选为血清样本。
样本可以根据已知的技术，以及根据将要在样本上进行的分析来采集(例如通过静脉切放血)、加工和/或储存(例如冷冻并储存于-80℃)。
样本可以从目标受试者处采集，或者已经从目标受试者处采集。根据本申请多个方面的受试者可以是任何动物。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物(例如，兽亚纲、真哺乳亚纲、真兽亚纲、原兽亚纲、统兽总目、灵长目(猴、非人灵长类、或人))。在一些实施方式中，受试者是人、蝙蝠、穿山甲、麝猫、或猪。受试者可以是非人哺乳动物，但是更优选为人。受试者可以是雄性/男性或雌性/女性。受试者可以是患者。
受试者可以被怀疑正在受到SARSr-CoV的感染、或者可以被怀疑患有由 SARSr-CoV感染引起的疾病。受试者可以被怀疑在之前受到SARSr-CoV感染，或者可以被怀疑先前患有由SARSr-CoV感染引起的疾病。
受试者可以被诊断为受SARSr-CoV感染，或可以被诊断为患有SARSr-CoV 感染引起的疾病。受试者可以经历过SARSr-CoV的感染，或者可以在之前患有 SARSr-CoV感染引起的疾病。
特别相关的实施方式
在特定的实施方式中，本申请的物件和方法，基于SARSr-CoV中和抗体对 ACE2蛋白或其片段与SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段(例如SARSr-CoV的 RBD)的相互作用/结合的阻断，检测样本(例如，得自患者的样本)中SARSr-CoV (例如SARS-CoV-2)中和抗体的存在。
更具体而言，优选的实施方式，基于SARS-CoV-2中和抗体对ACE2蛋白或其片段与SARS-CoV-2的RBD的相互作用/结合的阻断，检测样本(例如，得自 COVID-19患者的样本)中SARS-CoV-2中和抗体的存在。
即便样本中存在这些中和抗体，它们通常以低含量存在(即，具有有限量的抗体)。在这些情况下，如果在反应混合物中过量供应刺突蛋白/其片段(例如 RBD)，检测样本中抗体的量可能不足以结合所有刺突蛋白/其片段(例如RBD)，而过量的刺突蛋白/其片段(例如RBD)将与ACE2蛋白/其片段结合，生成信号，出现假阴性结果。
因此，在根据本申请的优选实施方式中，刺突蛋白/其片段(例如RBD)的量以(i)在不存在SARSr-CoV中和抗体的情况下足以提供(即，与ACE2蛋白/其片段)可检测水平的信号，以保证正确识别缺乏SARSr-CoV中和抗体的真阴性样本；但(ii)以摩尔比计，不高于(即，没有摩尔过量的)样本中SARSr-CoV中和抗体量，从而所有存在于反应混合物中的所有刺突蛋白/其片段(例如RBD)被样本中抗体所中和，避免假阴性结果，的含量存在于反应混合物中。
应当意识到的是，实现反应混合物中刺突蛋白/其片段(例如RBD)的最佳量的一种方式是(例如使用合适的缓冲液)制备含有合适浓度的可溶刺突蛋白/其片段(例如RBD)(例如通过储备液的梯度稀释)的溶液，以及在反应混合物中使用合适体积的含有刺突蛋白/其片段(例如RBD)的溶液。
实现反应混合物中最佳量的刺突蛋白/其片段(例如RBD)的另一种方式是向反应混合物提供合适量的，例如固定于固体支持物的刺突蛋白/其片段(例如 RBD)，例如固定于珠子的刺突蛋白/其片段(例如RBD)。
本领域技术人员将容易地意识到，可以进行上述特别相关实施方式的排列组合，且本申请的物件和方法可以校准，从而变得可定量，或至少为半定量。
本申请套件、组合物和方法的功能特征
在根据本申请多个方面的一些实施方式中，套件、组合物和方法可以通过某些功能特征而表征。
在一些实施方式中，根据本申请的套件、组合物和/或方法可以具有一个或多个以下特征：
-(i)能够以高于90％(例如高于91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、或99％、或100％)的特异性检测样本中SARSr-CoV中和抗体的存在；
-(ii)能够以高于90％(例如高于91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、或99％、或100％)的灵敏度检测样本中SARSr-CoV中和抗体的存在；
-(iii)能够检测样本中SARSr-CoV中和抗体的存在而无需采用活SARSr-CoV；
-(iv)能够检测SARSr-CoV中和抗体的存在而无需考虑抗体的同种型；
-(v)能够检测样本中SARSr-CoV中和抗体的存在而无需考虑样本之前所在受试者的物种；
-(vi)能够在少于12小时(例如少于11小时、10小时、9小时、8小时、7 小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时或1小时)的时间内确定样本中 SARSr-CoV中和抗体的存在与否。
本申请包括所述的各个方面和优选特征的组合，明确不允许或避免的组分除外。
在以上描述、权利要求、或附图中公开的特征，合适地以其具体形式或以执行所公开功能的手段、或获得所公开结果的方法或过程来表示，可以分别地，或以这些特征的任意组合方式，以多样的形式实现本申请。
为避免任何疑问，本文中的任何理论解释仅出于增强读者理解的目的而给出。本申请将不受到任何这些理论解释的束缚。
在本文公开核酸序列的情况中，也相当于明确地公开了其反向互补体。同时，当本文公开编码多肽的核酸序列时，也明确地公开了因遗传密码简并性而带来的等同多肽编码序列。
单数形式的“一个”和“一种”包括复数的事物，除非上下文清楚地指出相反情况。范围可以在本文中以从“约”一个具体值，和/或至“约”一个具体值进行表达。当表达这样的范围时，另一个实施方式包括从一个具体值和/或至另一具体值。相似地，当数值以近似值表达时，通过在之前使用“约”，应当理解为该特定值形成另一实施方式。与数值相关联的术语“约”是任选的，且表示例如+/-10％。
本文公开的方法可以在体外、离体、或体内进行，或者产品可以以体外、离体、或体内形式存在。术语“体外”是指在实验室条件或培养液中使用材料、生物物质、细胞和/或组织的实验；而术语“体内”是指使用完整多细胞有机体的实验和工序。在一些实施方式中，体内进行的方法可以在非人动物上进行。“离体”是指存在于有机体外或发生在有机体外，例如在人或动物体外，的事件，例如可以在取自有机体的组织(例如整个器官)或细胞上存在或发生的事件。
对于标准的分子生物学技术，参见Sambrook，J.，Russel，D.W.MolecularCloning，A Laboratory Manual.3ed.2001，Cold Spring Harbor，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press。
本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。在本文中描述的所有文献通过引用的方式全部并入本文。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述，很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而，本申请的示例性实施方式是示例性的，非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化，而不脱离本申请的宗旨和范围。
实施例
实施例1：替代病毒中和测试
在本实施例中，发明人提出一种新的替代病毒中和测试(COVID-sVNT)。
1.1材料和方法
带His标签的重组人ACE2(hACE2，Cat#：10108-H08H)购自SinoBiologics。重组的SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)(Cat#：Z03488)、刺突蛋白S1亚基(Cat#： Z03501)和刺突蛋白RBD(Cat#：Z03479)购自金斯瑞，并通过金斯瑞的客制服务与辣根过氧化酶(HRP)偶联。
1)间接ELISA：RBD蛋白(50ng)包被在96孔ELISA板上。在清洗除去未结合蛋白后，测试血清以1∶100稀释度孵育，之后与HRP-偶联的抗人抗体 (1∶10,000稀释)孵育。在清洗后，加入HRP底物进行显色。
2)替代病毒-宿主结合检测：hACE2以100ng/孔的浓度包被于96孔板。在清洗除去未结合蛋白后，加入HRP-偶联的重组核衣壳蛋白、S1或RBD蛋白(20-100 ng)，来评测特异结合。在清洗后，加入HRP底物进行显色。
3)替代病毒中和测试(sVNT)：hACE2以100ng/孔的浓度包被于96孔板。在另外的板中，将HRP-偶联的重组核衣壳蛋白、S1、或RBD蛋白(20-100ng) 与不同稀释度的测试血清进行孵育。之后将血清-HRP-蛋白混合物加入hACE2包被的板中，以评测特异性的抑制/中和。在清洗后，加入HRP底物进行显色。
1.2结果
使用6个血清样本来进行概念验证性研究：2个SARS-CoV-2阳性血清样本 (COVID-55、COVID-63)、两个SARS-CoV阳性血清样本(SARS-2、SARS-7)、一个阴性血清样本(阴性)、和一个未知的血清样本(测试-007)。
上述两个检测，即间接ELISA和sVNT，的结果显示在以下表1中，+ve表示阳性，-ve表示阴性。
表1.间接ELISA和sVNT的结果
样本 ELISA<sup>1</sup> sVNT-RBD<sup>2</sup> sVNT-S1<sup>2</sup> VNT<sup>3</sup>
COVID-55 1.49 +ve +ve +ve
COVID-63 1.62 +ve +ve +ve
测试-007 1.04 -ve -ve -ve
SARS-2 0.20 -ve -ve -ve
SARS-7 0.25 -ve -ve -ve
阴性 0.10 -ve -ve -ve
1两个独立实验的平均值
2在1∶40或更高稀释度的抑制/中和
3在1∶20或更高稀释度的中和
在替代病毒-宿主结合检测中，当向hACE2包被板加入不同的HRP-蛋白偶联物时，HRP-NP完全不显示结合(图3B)，而HRP-S1和HRP-RBD显示出显著的结合(图3A和图3B)，表明重组的S1和RBD蛋白是功能性的，适于用在替代病毒中和检测中。
为验证本实施例中的概念，发明人使用间接ELISA中用的同一批血清进行 sVNT。
如图4A和4B所示，仅有两个SARS-CoV-2阳性血清在基于RBD(图4A) 或S1(图4B)的sVNT中显示出显著的抑制/中和。这个检测显示出极佳的特异性，图4A和4B中COVID-19样本的抑制曲线完全是剂量和稀释度依赖的。
发明人接下来通过采用HRP-偶联的重组SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的 sVNT，对从PCR检测为SARS-CoV-2感染阳性的COVID-19患者中获得的74个血清样本以及11个阴性(健康)人血清样本进行分析。
结果显示在图5中，sVNT能够可靠地区分出含有SARS-CoV-2中和抗体的样本和不含这类抗体的样本。
已知并非所有COVID-19患者都能生成对于SARS-CoV-2的较强的中和抗体，这解释了经sVNT确定的一些样本为弱阳性的原因。
1.3结论
综上所述，发明人开发出了一种能够以高灵敏度和高特异性检测SARS-CoV-2 中和抗体的测试方式。
重要的是，替代病毒中和检测比起广泛使用的间接ELISA更加特异，如测试 -007样本所证实的，其在间接ELISA检测中给出阳性信号，而在替代病毒中和测试出显示为阴性(经活病毒中和测试验证)。
实施例2：基于抗体介导的ACE2-刺突蛋白(RBD)相互作用抑制的SARS-CoV-2替代 病毒中和测试(sVNT)
急需一种完善的血液学测试来检测SARS-CoV-2中和抗体。这样的测试不仅对于接触者追踪是重要的，而且对于确定感染率、群体免疫和预测体液保护而言也是很重要的。当前的黄金标准是病毒中和测试(VNT)，需要活病毒和三级生物安全(BSL3)实验室。另一方面，ELISA或侧向层析测试用于检测结合抗体，而该检测结果与中和能力并不直接相关。发明人在此描述了一种SARS-CoV-2替代病毒中和测试(sVNT)，其设计成以不依赖同种型和物种的方法检测总的中和抗体。这种简单和快速的检测基于抗体介导的ACE2受体蛋白与病毒刺突蛋白RBD 之间的病毒-宿主相互作用的抑制。测试已经用两个不同国家的两个COVID-19患者群进行了验证，达到了100％特异性和95-100％的灵敏度，能够区分对于 SARS-CoV-2以及对于其他已知人冠状病毒的抗体反应。重要的是，sVNT不需要 BSL3控制，从而使得全球社区均可操作该测试。
2.1介绍
截至2020年4月18日，COVID-19已有2,160,207例感染，146,088例死亡[2]。致病菌为2019-nCoV，命名为SARS-CoV-2[3，4]，与17年前引起SARS爆发的 SARS-CoV，同属SARS相关冠状病毒(SARSr-CoV)种。
分子检测，例如聚合酶链式反应(PCR)和二代测序(NGS)，在急性诊断和病毒遗传突变的监控方面发挥着重要的作用，并将继续发挥重要的作用。然而，先今急需一种可靠的多用途血液学检测或抗体检测。需要这样一种检测来进行可回溯的接触者追踪、无症状感染率的调查、病例死亡率的准确确定、恢复健康后患者和接种人群的群体免疫和体液免疫水平的评估、以及对天然宿主和中间宿主的搜寻[6]。研究实验室和药物公司正在比拼抗体检测研发和制备的速度，该抗体检测需要能够以充分的特异性和敏感度检测SARS-CoV-2感染[6]。目前研发的主要有两类抗体测试。第一类是可以检测患者血液中中和抗体(NAb)的病毒中和测试(VNT)。VNT需要在专门的BSL3设施中操作活SARS-CoV-2，过程繁冗，耗时较长，需要2-4天来完成。基于假病毒的病毒中和测试(pVNT)也很相似，仍需要使用活病毒和细胞，尽管只需要在BSL2级别的实验室进行[7，8]。所有其他检测，例如ELISA和侧向层析快速检测，代表了第二种检测类型，其仅检测结合抗体，而非NAb[6，9-11]。
在本实施例中，发明人描述了一种替代病毒中和测试(sVNT)，其检测NAb 而无需使用任何病毒或细胞，且可以在BSL2实验中在1-2小时内完成。该检测设计成，使用纯化的病毒刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)和宿主细胞受体 ACE2，用其在测试管或ELISA板中蛋白-蛋白直接相互作用，来模拟病毒-宿主的相互作用。这种高度特异的相互作用可以被患者或动物血清中高度特异的NAb以与传统VNT中相同的方式中和，即阻断。
2.2材料和方法
人胚肾(HEK293T)细胞(ATCC#CRL-3216)和非洲绿猴肾克隆6(Vero-E6) 细胞(ATCC#CRL-1586)置于补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中。 SARS-CoV-2，BetaCoV/新加坡/2/2020分离体(登陆ID EPI_ISL_406973)，按之前所述，在Vero-E6上进行病毒中和测试[26]。
在新加坡，用于本研究的COVID-19患者血清来自新加坡PROTECT研究[13]，另外还有2003年取自恢复健康的SARS患者的血清[15]。对于2020年SARS召回采样，发明人从之前得过SARS且知情同意的个体中取得血液[伦理审批号：NHG DSRB E 2020/00091]。hCoV血清样本包括在之前研究中用SeeGene RV12呼吸多元试剂盒确定为CoV 229/NL63和CoV OC43阳性个体(伦理审批号：NUS-IRB 11-3640)中取得的感染后样本[27]。阴性对照血清得自之前无关联研究的剩余血清样本。
在南京，经南京第二医院伦理委员会批准(伦理审批号：2020-LS-ky003)，经知情同意采集COVID-19恢复期血清。兔抗SARS-CoV-2RBD血清购自金斯瑞。兔和麝猫抗SARS-CoV血清、和羊驼抗MERS-CoV血清在之前研究中有过描述[28， 29]。
直接结合和sVNT检测
对于直接结合，在100mM碳酸盐-碳酸氢盐包被缓冲液(pH 9.6)中的hACE2 蛋白(金斯瑞，Cat#：Z03484)以100ng/孔进行包被。HRP-偶联的SARS-CoV-2核衣壳(下文中简称为N，金斯瑞，Cat#：Z03488)、S1(金斯瑞，Cat#：Z03501)、RBD (金斯瑞，Cat#：Z03479)，或HRP-偶联的SARS-CoV-RBD(金斯瑞定制服务)，于 OptEIA检测稀释液(BD)中，以不同浓度加至hACE2包被板，室温孵育1小时。通过5次磷酸缓冲液+0.05％吐温20(PBST)清洗，除去未结合的HRP-偶联蛋白。经HRP与显色底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(Invitrogen)的酶促反应获得色度信号。加入等体积的TMB终止液(KPL)，停止反应，使用Cytation 5酶标仪(BioTek)来获得450nm和570nm的吸光度读数。
对于替代病毒中和测试(sVNT)，将6ng HRP-RBD(SARS-CoV RBD或 SARS-CoV-2RBD)与1∶20终稀释度的测试血清37℃孵育1小时，之后加入hACE2 室温孵育1小时。抑制率(％)＝(1-样本OD值/阴性对照OD值)x100。
间接ELISA
SARS-CoV-2 N蛋白与SARS-CoV N蛋白由pcDNA3.1 SARS-CoV-2N和 pDualGCSARS-CoV N转染的HEK293T细胞表达，并用Ni琼脂糖凝胶(GE healthcare)纯化。对于间接ELISA，将100ng各蛋白于100nM碳酸盐缓冲液中包被于MaxiSORP ELISA板(Nunc)，并用BDOptEIA检测稀释液(BD)封闭。 COVID-19和SARS患者血清以1∶50稀释度进行检测，并用1∶10,000稀释的山羊抗人IgG-HRP(Santa Cruz)检测。用TMB底物(Invitrogen)显色，反应用TMB 终止液(KPL)停止。使用Cytation 5酶标仪(BioTek)获得450nm和570nm的吸光度读数。
捕获ELISA
用碳酸氢盐缓冲液中的10μg/ml抗人IgM(SeraCare)或抗人IgG(Jackson labs)包被96孔Maxisorp板(Nunc)，4℃过夜。板用BD OptEIA检测稀释液(BD) 37℃封闭1小时，随后加入稀释1∶50的热失活血清，37℃孵育1小时。在反复清洗后，加入稀释为4μg/ml的SARS-CoV-2-RBD-HRP(金斯瑞)，37℃孵育30分钟。在加入TMB底物(Invitrogen)和终止液(KPLSeraCare)后，对显色反应进行定量。样本的吸光度在450nm测量，背景在570nm测量。阴性对照由37个未感染人血清构成。结果以倍数变化随阴性对照平均读数变化的形式进行呈现。
统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计分析，使用Kruskal-Wallis检测来比较多个组间差异，之后进行Dunn’s多重比较。如果*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、 ****P＜0.0001，则认为数据是显著的。
2.3结果
病毒-受体相互作用的生物化学模拟和抗体介导的中和
在SARS-CoV-2被认为是COVID-19爆发的原因后不久，即发现人血管紧张素转化酶2(hACE2)是病毒进入细胞的主要功能受体[3]。发明人推测可以在体外使用纯化的重组hACE2和SARS-CoV-2刺突蛋白RBD经蛋白-蛋白相互作用来模拟病毒-受体结合。该相互作用可以通过测试血清中存在的病毒NAb进行阻断，原理与在BSL3设施中使用活病毒进行的传统VNT相同(图6A和6B)。
使用偶联辣根过氧化酶(HRP)的不同SARS-CoV-2蛋白，来验证SARS-CoV-2 蛋白与hACE2的直接结合。在hACE2和RBD或S1之间有着剂量依赖的特异性结合，但hACE2不结合核衣壳(N)蛋白，其中RBD有着最佳结合特性(图6C)。选择HRP-RBD蛋白进行之后的研究。
之后发现RBD-hACE2的特异结合可以被COVID-19血清以剂量依赖的方式阻断或中和，但不会被健康对照的血清阻断或中和(图6D)。为证实这一原理也适用于极其相关的以hACE2作为进入细胞受体的SARS-CoV[12]，用SARS-CoV蛋白重复了相似的实验，并证实了SARS-CoV RBD在本申请新测试(即替代病毒中和测试，sVNT)中的表现几乎相同(图6E和6F)。
不依赖于同种型和物种的中和反应
sVNT的一个好处是能够检测患者血清中的总抗体，相对而言，大多数公开发表或在市面上使用的SARS-CoV-2抗体测试几乎都是适用于特定同种型的，大多数适用于IgM或IgG，有部分适用IgA[9-11]。发明人将从新加坡患者得到的77个 COVID-19阳性血清，基于ELISA(内部做的捕获ELISA检测，见方法部分)测定的患者恢复期血清中存在的IgM或IgG的含量分成了4组：a)高IgM/低IgG； b)低IgM/高IgG；c)低IgM/低IgG；和d)高IgM/高IgG。所有组在sVNT中均显示出强大的中和活性(图7A-7D)，表明该检测方法不依赖于抗体的同种型。值得注意的是，对于图7C中的低IgM/低IgG，sVNT的抑制％在70-75％时仍然较为显著，表明其优越的特异性，因为这组血清在基于单独IgM或IgG的同种型特异捕获ELISA中被认为是阴性或弱阳性的。
发明人随后在sVNT检测中测试了不同动物血清，来显示其不依赖于物种的性能。从用SARS-CoV-2 RBD蛋白接种免疫的三只独立的兔子得到的结果显示，血清在SARS-CoV-2sVNT中有着非常强大的中和活性(图8A)。相似地，得自感染SARS-CoV的麝猫(图8B)和经失活SARS-CoV接种免疫的兔子(图8C)的血清也在SARS-CoV sVNT中显示出对于hACE2-SARS-CoV RBD相互作用的高效剂量依赖式抑制。
对其他hCoV的特异性以及2003 vs.2020采集的SARS血清的比较
为表明特异性，发明人测试了不同批次的针对其他已知人冠状病毒(hCoV) 的血清的效果，并证实了本申请的SARS-CoV-2sVNT可以区分对SARS-CoV-2和其他冠状病毒感染的抗体反应(图8D)。SARS血清对SARS-CoV-2存在一些交叉反应性，这可从两种病毒相近的遗传相关性和之前发表的研究中得出[3，7]。但是中和效果的差异是统计显著的，因而sVNT可以用于区分SARS-CoV-2感染和之前的SARS感染。对于229/NL63或OC43感染患者的血清，以及得自实验性 MERS-CoV感染的羊驼血清，没有检测到交叉中和效果。
在调查SARS血清与SARS-CoV-2病毒之间的潜在交叉反应性期间，观察到了一些重要的现象。首先，尽管在我们和其他研究组观察到的VNT中缺乏SARS血清对SARS-CoV-2活病毒的交叉中和[13]，在sVNT中检测到一定水平的交叉中和现象(图8D)，表明sVNT比VNT更加敏感。第二，SARS NAb在患者恢复健康至少17年后仍能检测到(图8F)。第三，在2020取得的SARS血清中的交叉中和水平高于2003年的样本(图8D)，尽管2020 SARS血清的同源中和水平(图8F) 低于2003 SARS血清(图8E)。最后，2020 SARS血清中N蛋白特异抗体的量比 2003样本低得多(图8G)。
活病毒VNT与生物化学sVNT之间的相关性
经sVNT测得的含有不同量SARS-CoV-2 NAb的一组COVID-19血清(图11)，用于基于活病毒的VNT与基于RBD-hACE2的sVNT之间的比较关联性研究。结果显示出两种检测之间良好的总体关联性(图9A和图10)。SARS-CoV-2 sVNT 比VNT更加灵敏。在50％抑制率的截止点上，所有COVID-19患者血清在1∶20 或更高稀释度显示出中和效果，COVID-19患者13血清达到了等于或大于640的中和滴度(图11)，其中50％抑制率是从图11的滴度曲线得出的最严格的截止点。
使用两个国家的两组阳性和阴性血清进行的验证
为证实SARS-CoV-2 sVNT的性能，分析了两个不同的阳性和阴性血清组。检测在两个不同国家经两个独立群体进行，来进一步确保可靠性和可重复性。对于第一组，测试了77个经PCR证实的新加坡COVID-19患者于症状发生14-33天后采集的血清、和75个健康对照血清。所有对照血清均为阴性，表明100％特异性。使用20％抑制率的截止点，检测灵敏度为100％。选用40％抑制率的截止点时，灵敏度降至95.6％(图9B)。对于第二组，测试了50个健康对照的血清、和50个经 PCR证实的南京COVID-19患者于症状发生27-61后采集的血清。特异性为100％。截止点为20％和40％抑制率时，灵敏度分别为98％和96％。
2.3讨论
当COVID-19在全世界爆发数月后，科学界和国家政策制定者均已经把焦点从最初的急性诊断策略和能力转移到了依赖于个体和群体水平感染患病率的准确确定的血清免疫学，以制定“退出战略”。这个概念下的血清免疫学的讨论和争议异常激烈[6]。
尽管市面上有很多有关COVID-19的实验室用或即时检测(POC)用抗体检测试剂盒，没有一个能够测定NAb。VNT或pVNT仍是检测NAb的仅有平台。两者均需要活病毒和细胞、以及熟练操作者，总体而言不太灵敏，且需要数日得到结果。因而，VNT和pVNT不适用于大量生产和检测，即便在发达国家和地区。
世界卫生组织(WHO)已经提醒，抗体检测的阳性结果并不等同于保护性的免疫反应[14]，因为两方面原因或障碍。首先，大多数，如果并非是全部的话，当前大规模的检测都是仅为了检测结合抗体，而不是测定NAb。第二，NAb的存在可能与保护性相关，或者不相关。尽管第二个方面将需要很多更加深度的科学研究和临床研究在COVID-19感染的特定情况下解决，过去的关于病毒感染的总体经验认为，在大多数恢复健康的患者中，NAb量是保护性免疫反应的良好指示物，尽管一些患者的情况可能不遵照这个“经验法则”[15，16]。在本实施例中，发明人描述了新的sVNT平台，来应对第一个障碍。
这里呈现的数据表明，sVNT与VNT一样特异，且更加灵敏。从sVNT得到的结果与VNT具有良好的相关性。sVNT的主要好处在于，可以在大多数研究实验室或临床实验室快速进行，而无需使用活的生物材料以及进行生物安全控制。 sVNT还可以经少量修改，变为高通量测试，和/或完全自动的测试。
sVNT的另一个好处是能够以不依赖物种的方式检测SARS-CoV-2抗体。由于 SARS-CoV-2的源头和早期传播尚未明了，sVNT检测将会完美适合于“病毒搜寻”，因为过去的研究已经充分表明血清学调查要优于分子检测，因为病毒特异抗体在动物体内比病毒遗传材料更持久地存在[17-19]。抗体检测的血清采样比用于分子检测的采样方法更加可靠，因为不同病毒的靶向组织可能是各异的[20-22]。
此外，sVNT相对于大多数ELISA或POC检测的最主要优势在于，能够以不依赖于同种型的方式检测总的NAb。这不仅能简化测试策略，而且还可以增加检测灵敏度。在图7C中，在同种型特异ELISA中检测为低IgM和低IgG的COVID-19 患者血清，在sVNT测试中仍检测出显著量的NAb。尽管机制需要进一步探讨，至少存在两种可能：存在其他Ig同种型，或者来自于靶向不同中和反应关键表位的不同同种型抗体组合的协同中和作用或相互合作，如之前在HIV和其他病毒中观察到的一样[23-25]。
从两组SARS血清获得的结果非常有意思。考虑到SARS-CoV和SARS-CoV-2 病毒之间的紧密关系，在感染后17年长期存在的NAb，对于恢复健康的COVID-19 患者而言是非常欢欣鼓舞的。与感染17年后增加的对于SARS-CoV-2的交叉中和性以及核衣壳特异性抗体的减少/消失相关的机制和生物学意义，使得进一步更好了解SARSr-CoV免疫反应动力学的研究变得很有必要。
综上所述，发明人已经以一种新的方法解决了COVID-19血清免疫学的难题，使得可以以简单、安全、快速和价廉的方式检测NAb，并具有改善的特异性和灵敏度。数据表明，其性能在大体上是高度相关的。其应用可以涵盖COVID-19研究的很多方面，从接触者追踪、血清阳性率调查、源头动物/中间动物追踪，以评估群体免疫、保护免疫反应的延续期、以及不同候选疫苗的效力。
本申请的示例性序列如下所示。
Figure RE-GDA0002735133740000351
Figure RE-GDA0002735133740000361
Figure RE-GDA0002735133740000371
Figure RE-GDA0002735133740000381
Figure RE-GDA0002735133740000391
Figure RE-GDA0002735133740000401
Figure RE-GDA0002735133740000411
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以上已经详细描述了本申请的优选实施方式，应当理解的是，本申请的内容不限于以上述具体内容，因为可以做出很多明显的变动，而不脱离本申请的精神和范围。
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Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
1 5 10 15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
20 25 30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
35 40 45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
50 55 60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val
65 70 75 80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
85 90 95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
100 105 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
115 120 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
130 135 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145 150 155 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
165 170 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
180 185 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
195 200 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
210 215 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225 230 235 240
Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
275 280 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
420 425 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
435 440 445
Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
450 455 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465 470 475 480
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485 490 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
500 505 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
515 520 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
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Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545 550 555 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
565 570 575
Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
580 585 590
Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr
595 600 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
610 615 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
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Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
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Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
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Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705 710 715 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
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Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
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Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
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<213> SARS-CoV
<400> 10
Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met
100 105 110
Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg
130 135 140
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Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
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Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
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<210> 11
<211> 71
<212> PRT
<213> SARS-CoV
<400> 11
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Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile
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<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 12
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35 40 45
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660 665 670
Arg
<210> 13
<211> 223
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 13
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<211> 72
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 14
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
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His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
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435 440 445
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Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
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<210> 17
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
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180 185 190
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195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
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Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
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305 310 315 320
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325 330 335
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Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu
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Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr
420 425 430
Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys
435 440 445
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Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
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Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
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Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
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Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys
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Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser
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Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro
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Pro Val Ser
<210> 18
<211> 805
<212> PRT
<213> 马铁菊头蝠
<400> 18
Met Ser Gly Ser Ser Trp Phe Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Thr Glu Asp Leu Ala Lys Lys Phe Leu Asp Asp Phe
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Asn Ser Glu Ala Glu Asn Leu Ser His Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
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165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
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Gly Tyr His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Arg Asp Tyr Glu
195 200 205
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Asp Val Glu Arg Ile Phe Ala Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu Gln Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Thr Lys Leu Met Asp Thr Tyr Pro Phe His Ile
245 250 255
Ser Pro Thr Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
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<213> 马铁菊头蝠
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Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
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Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
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Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
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Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
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Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
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Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
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<213> 中华菊头蝠
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<212> PRT
<213> 中华菊头蝠
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580 585 590
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595 600 605
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<211> 805
<212> PRT
<213> 欧亚野猪
<400> 33
Met Ser Gly Ser Phe Trp Leu Leu Leu Ser Leu Ile Pro Val Thr Ala
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<212> PRT
<213> 欧亚野猪
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565 570 575
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690 695 700
Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asp Glu Pro
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Pro Val Thr

Claims (16)

1.一种套件，包含：
-(i)由SARSr-CoV编码的刺突蛋白或其片段，以及
-(ii)与(i)的刺突蛋白或其片段特异结合的ACE2蛋白或其片段。
2.如权利要求1所述的套件，还包含用于检测(i)的刺突蛋白或其片段与(ii)的ACE2或其片段之间相互作用的检测物质。
3.如权利要求2所述的套件，其中(i)的刺突蛋白或其片段、或(ii)的ACE2蛋白或其片段与所述检测物质偶联。
4.如权利要求3所述的套件，其中，
(a)(i)的刺突蛋白或其片段与所述检测物质偶联，(ii)的ACE2或其片段固定于固体支持物；或者
(b)(ii)的ACE2或其片段与所述检测物质偶联，(i)的刺突蛋白或其片段固定于固体支持物。
5.如权利要求1所述的套件，其中所述SARSr-CoV是SARS-CoV-2或其变体。
6.如权利要求1所述的套件，其中，(i)的刺突蛋白或其片段包含S1亚基。
7.如权利要求6所述的套件，其中所述S1亚基包含与SEQ ID NO：12或27具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的套件，其中(i)的刺突蛋白或其片段包含刺突蛋白的受体结合结构域。
9.如权利要求8所述的套件，其中所述刺突蛋白的受体结合结构域包含与SEQ ID NO：13或26具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的套件，其中(ii)的ACE2蛋白或其片段包含ACE2蛋白的胞外结构域。
11.如权利要求10所述的套件，其中所述ACE2蛋白的胞外结构域包含与SEQ ID NO：17或30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
12.如权利要求2所示的套件，其中所述检测物质为辣根过氧化酶。
13.权利要求1-12中任一项所述的套件在制备用于检测样本中SARSr-CoV抗体的组合物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述套件中(i)的刺突蛋白或其片段与用于检测(i)的刺突蛋白或其片段与(ii)的ACE2或其片段之间相互作用的检测物质偶联，(ii)的ACE2或其片段固定于固体支持物。
15.如权利要求14所述的用途，其中，(i)的刺突蛋白或其片段的量为(a)以摩尔比计，低于或等于所述样本中的SARSr-CoV抗体的量，且(b)足以在存在不含SARSr-CoV抗体的样本的情况下生成反映(i)的刺突蛋白或其片段与(ii)的ACE2蛋白或其片段之间相互作用的检测信号。
16.如权利要求14所述的用途，其中，(i)的刺突蛋白或其片段的量为在存在不含SARSr-CoV抗体的样本的情况下生成反映(i)的刺突蛋白或其片段与(ii)的ACE2蛋白或其片段之间相互作用的检测信号所需的最低量。
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