CN112904018A - 一种检测病毒中和抗体的试剂盒、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测病毒中和抗体的试剂盒、方法和用途。试剂盒包括作为包被材料的第一受体蛋白、作为标记材料的第二受体蛋白及作为中和材料的中和抗原，其用于与病毒中和抗体结合。本发明首次提出基于竞争抑制原理采用双受体竞争抑制的免疫学方法来检测病毒的中和抗体，通过双受体夹心方式进一步放大了与中和抗原结合的信号，从而当样本中含有中和抗体时，与受体蛋白双竞争进而有更好的抑制率，本方法能够比单受体方法的阴阳性拉得更开，从而达到比单受体方法的灵敏度更高的目的，实现一个快速准确、高灵敏度和易操作以及仅需普通实验室条件的中和抗体检测方法。

Description

一种检测病毒中和抗体的试剂盒、方法和用途
技术领域
本发明涉及病毒抗体检测领域，具体涉及了一种检测病毒中和抗体的试剂盒、方法和用途。
背景技术
当SARS-CoV-2(新型冠状病毒)在侵入机体时，会刺激机体产生具有保护作用的中和抗体，专门阻止病原微生物进入细胞。中和抗体是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白，具有识别病毒表面蛋白、阻断其与细胞表面特异性受体结合的功能。在感染患者恢复期中含有高浓度的特异性抗体，在疫情期间被广泛报道的恢复期血浆疗法，这些特异性的抗体被识别为中和抗体，因此中和抗体的多少被认为是疫苗免疫保护效果的一项重要指标，是疫苗评估和质控的重要依据。接种疫苗的目的是使得人类产生保护性抗体即人体接种疫苗后可通过免疫应答产生的保护性抗体--中和抗体，对中和抗体进行滴度测定，可以判断疫苗的临床疗效。因此对中和抗体的检测，可应用于疫苗的研发评价，以及疫苗研发成功后，正式应用于大众后，对个体自身免疫效果的评价。
目前评价恢复期血浆或免疫球蛋白抗病毒能力的方法只有中和试验 (PRNT)，但是中和试验成本高(需要专业人员，专业场地以及专业的设备)、检测周期长(病毒需要培养，培养周期长)，条件要求高，因为需要使用活病毒，安全风险大，需要在P3实验室里操作。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种检测病毒中和抗体的试剂盒、方法和用途。本发明首次提出基于竞争抑制原理采用双受体竞争抑制的免疫学方法来检测病毒的中和抗体，具体地，通过双受体夹心方式进一步放大了与中和抗原结合的信号，从而当样本中含有中和抗体时，与受体蛋白双竞争进而有更好的抑制率，本方法能够比单受体竞争抑制的免疫学方法(以下简称“单受体方法”)的阴阳性拉得更开，从而达到比单受体方法的灵敏度更高的目的，实现一个快速准确、高灵敏度和易操作以及仅需普通实验室条件的中和抗体检测方法。本方法能够比单受体方法灵敏度提高50倍以上，甚至达到100倍以上，同时其特异性、抗干扰能力也较单受体方法强。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
第一方面，一种检测病毒中和抗体的试剂盒，所述试剂盒包括作为包被材料的第一受体蛋白、作为标记材料的第二受体蛋白及作为中和材料的中和抗原，其用于与病毒中和抗体结合。
通过双受体竞争抑制法来检测血液样品中的病毒中和抗体的存在，如果待测样品存在中和抗体，将会竞争抑制试剂盒的免疫学反应的信号，通过信号的变化来测试出待测样品的中和抗体的浓度变化。当样品中存在高浓度的中和抗体时，受体蛋白与中和抗原的免疫反应信号会被彻底抑制，当存在一定浓度的中和抗体时，免疫反应信号将被抑制一部分，通过抑制的信号强弱，可以判断样本中是否存在中和抗体，当免疫反应信号未受抑制时，机体内可能不存在中和抗体。
作为本发明提供的所述的检测病毒中和抗体的试剂盒的一种优选实施方式，所述第一受体蛋白和第二受体蛋白是通过不同的重组蛋白制备方法分别获得的受体重组蛋白。即，所述包被材料和标记材料为采用不同的重组蛋白制备方法获得的第一受体蛋白和第二受体蛋白，即第一受体蛋白和第二受体蛋白之间存在差异。
作为本发明提供的所述的检测病毒中和抗体的试剂盒的一种优选实施方式，所述第二受体蛋白是生物标记或化学标记的。
作为本发明提供的所述的检测病毒中和抗体的试剂盒的一种优选实施方式，所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记、葡萄糖氧化酶标记、荧光素、生物素、微球、胶体金或胶体硒标记的。
作为本发明提供的所述的检测病毒中和抗体的试剂盒的一种优选实施方式，所述病毒是冠状病毒、埃博拉病毒、流感病毒、登革热病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
作为本发明提供的所述的检测病毒中和抗体的试剂盒的一种优选实施方式，所述冠状病毒是新型冠状病毒。
作为本发明提供的所述的检测病毒中和抗体的试剂盒的一种优选实施方式，所述第一受体蛋白和第二受体蛋白为ACE2受体；所述中和抗原为新型冠状病毒的RBD中和位点蛋白。
第二方面，一种半定量或定性检测病毒中和抗体或评价针对病毒疫苗的有效性的方法，其中包括使用权利要求上述的试剂盒，其中所述的方法不是疾病的诊断和治疗方法。
作为上述方法的一种优选实施方式，其中所述的方法是基于竞争抑制法的胶体金免疫方法、荧光免疫方法、化学发光免疫方法或酶联免疫方法。
作为上述方法的一种优选实施方式，在所述胶体金免疫方法中，胶体金的保存液优选但不限定为含0.5-2％BSA、5-10％蔗糖、0.1-0.5％％Tween-20的pH 8.5 20mMTris-HCl缓冲液。
作为上述方法的一种优选实施方式，在所述胶体金或荧光免疫方法中，硝酸纤维素膜的T线的划线条件为：将待划线物稀释至0.5-2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为50-100mm/s；所述硝酸纤维素膜的C线的划线条件为：将待划线物稀释至1.5～2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为50-100mm/s。
作为上述方法的一种优选实施方式，用于对样本进行稀释的样本稀释液为含1-5％NaCl、1-5％BSA和0.5-5％Tween-20的pH 7.5的磷酸盐缓冲液。
第三方面，一种制备上述的试剂盒的方法，其中使用第一受体蛋白作为包被材料，使用第二受体蛋白作为标记材料以及使用与病毒中和抗体结合的中和抗原作为中和材料。
第四方面，上述方法在检测病毒中和抗体中的用途、在筛选病毒中和性单克隆抗体中的用途、在检测病毒中和抗体效价中的用途、在病毒疫苗开发和质控中的用途、在筛选或制备抗病毒或其相关疾病药物中的用途、或在治疗病毒感染中的用途。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次提出基于竞争抑制原理采用双受体竞争抑制的免疫学方法来检测病毒的中和抗体，具体地，通过双受体夹心方式进一步放大了与中和抗原结合的信号，从而当样本中含有中和抗体时，与受体蛋白双竞争进而有更好的抑制率，本方法能够比单受体方法的阴阳性拉得更开，从而达到比单受体方法的灵敏度更高的目的，实现一个快速准确、高灵敏度和易操作以及仅需普通实验室条件的中和抗体检测方法。本方法能够比单受体方法灵敏度提高50倍以上，甚至达到100倍以上，同时其特异性、抗干扰能力也较单受体方法强。
相比于传统的中和抑制试验对操作环境有高级别生物安全要求(P2\P3实验室)，而本发明只需按照标准的血液管理流程，仅在普通实验室就可以进行；相比于传统的中和抑制试验需要一天甚至以上的检测时间，而本发明在一小时内即可出具报告，检测效率大大提高，同时检测通量也大大提高；相比于传统的中和抑制试验需要对操作人员、判读人员有极高的要求，而本发明仅需对实验人员进行简单培训及相关的配套判读的工具，比如仪器或者比色卡即可完成。
本发明试剂盒检测的是病毒中和抗体，对明确受体的病毒感染均可适用，比如埃博拉病毒等烈性传染病病毒，流感病毒、冠状病毒等呼吸道疾病病毒，登革热病毒等热带传染病病毒，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等传染病病毒。本发明对于疫苗研究与生产过程中的免疫效果的评价具有重要的指导意义，可用于科研院所与生物公司开发针对性病毒疫苗的实验评价以及流行病学调查。
中和抗体是疫苗免疫效果的最直接评价指标，故本发明方法检测到的中和抗体反映了疫苗的有效性或保护性，从而可用于疫苗保护性的分析，以建立体外中和抗体检测方法。如此，可代替病毒动物体内攻毒试验与抗血清体外中和抗体试验来检测中和抗体滴度，克服体内攻毒试验无法进行的缺点。
以新型冠状病毒为例，当前新型冠状病毒感染依然在全球肆虐，对全球经济与人民生命安全造成很大的威胁，所以新型冠状病毒疫苗研发已在紧锣密鼓的进行，而建立的简便安全快捷有效的新型冠状病毒疫苗评价方法，能对其有效性进行科学的评价，具有良好的社会效益。而本发明的双受体竞争抑制免疫检测方法正好实现了这一目的，同时本发明的试验试剂成本低，克服了体内攻毒试验无法进行的缺点，同时也避免了体外中和试验接触活病毒的情况，普通实验室条件即可操作完成，安全性较好，还可以准确的半定量或定性检测病毒中和抗体，其操作简单，所用时间短，且其结果与中和试验方法检测的结果具有较好的一致性。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子生物学、生物化学、免疫学实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规命名和步骤。
下面各实施例以新型冠状病毒为例对本发明进行详细的说明，但可以理解的是，本发明并不仅仅适用于新型冠状病毒。各实施例中的试剂盒制备过程中涉及到的条件参数如微球粒径、结合垫处理液、样品稀释液及划膜条件等等仅是一种实施方式，具体实现时并不局限于此，即并非本发明的特别限定。
实施例1一种检测新型冠状病毒中和抗体的荧光免疫层析试剂盒
本实施例提供的试剂盒包括检测卡和样本稀释液，所述的检测卡包括PVC 底板、样品垫、新型冠状病毒的RBD前垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、新型冠状病毒的RBD前垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板，切割成一定宽度(如 3-4mm)的试纸条，得到所述的检测卡。其中，所述结合垫和硝酸纤维素膜中使用的标记材料和包被材料均为同一重组蛋白制备方法获得的第二受体蛋白和第一受体蛋白，即是采用同一重组蛋白制备方法制得的ACE2受体。
本实施例试剂盒制备过程如下：
(1)制备结合垫：选用200nm荧光微球，先将微球超声混匀，用EDC/NHS 进行活化，用缓冲液对活化的微球进行不小于3次的清洗；然后加入ACE2蛋白/鸡IgY与活化后的微球进行蛋白交联；接着加入封闭液进行封闭，清洗不少于3次以去除未交联的蛋白，浓缩保存待用，获得ACE2/鸡IgY标记荧光微球，即标记物浓缩液；用标记物稀释液将上述标记物浓缩液进行稀释，并均匀涂布在经结合垫处理液处理的玻璃纤维垫上，再进行干燥备用。
其中，所述结合垫处理液为10mM Tris缓冲液(pH8.5)，含0.5％BSA、1％ NaCl、5％蔗糖、0.5％T-20；经结合垫预处理液处理的玻璃纤维垫具体是指将玻璃纤维垫浸泡在上述结合垫处理液中，室温下0.5h，60℃烘干1h备用。
(2)制备硝酸纤维素膜：选择层析速度大于10mm/min的硝酸纤维素膜；将一定浓度的ACE2和羊抗鸡IgY使用划膜仪同时包被在硝酸纤维素膜上的T 线区域(检测线)及C线区域(质控线)，干燥备用。所述的T线为ACE2，稀释至1.0mg/mL进行划线，划液量为1μL/cm，划膜速度为80mm/s。所述的C 线为羊抗鸡IgY，稀释至2.0mg/mL进行划线，划液量为1μL/cm，划膜速度为 80mm/s。
(3)制备新型冠状病毒的RBD前垫：使用抗原稀释液将RBD抗原稀释至合适比例；均匀涂布在玻璃纤维垫上面，干燥备用，得新型冠状病毒的RBD前垫。
(4)制备样品垫：将样品垫稀释液均匀涂布在玻璃纤维上，干燥备用。所述的样本稀释液为含2％NaCl、3％BSA和1％Tween-20的pH 7.5的磷酸盐缓冲液。
(5)组装：将上述材料包括：结合垫，包被好的硝酸纤维素膜，新型冠状病毒的RBD前垫，样品垫等装配于PVC底板上，其中，新型冠状病毒的RBD 前垫设于所述结合垫和样品垫之间，组卡得试剂卡备用，接着将试剂卡放入装有干燥剂的铝箔袋，待用。
测试：拆开铝箔袋，取出试剂卡；分别加入样本(待测血清或血浆)及样本稀释液，开始计时；15分钟插入荧光定量检测仪进行读值。选取6个样本进行测试，结果如下表1所示：
Figure BDA0002905575340000071
注：抑制率越大，样本中含有的中和抗体浓度越高。抑制率≤0％时，代表样本没有中和抗体检出。
本实施例试剂盒还可以对中和抗体进行半定量分析：在荧光定量检测仪中储备有试剂定标曲线，该定标曲线以高免血清为质控品，以质控品制备梯度浓度的标准管，以每个标准管检测的荧光强度信号值为纵坐标、以荧光计算浓度的半对数为横坐标的拟合曲线，该定标曲线可以与本实施例试剂盒检测到的数值联用，以确定样本中和抗体浓度的高低。
实施例2一种检测新型冠状病毒中和抗体的荧光免疫层析试剂盒
本实施例与实施例1不同之处在于：所述结合垫和硝酸纤维素膜中使用的标记材料和包被材料为采用不同的重组蛋白制备方法获得的第二受体蛋白和第一受体蛋白，即第一受体蛋白和第二受体蛋白之间存在差异。
采用本实施例的试剂盒，选取6个样本进行测试，结果如下表2所示：
Figure BDA0002905575340000081
实施例3一种检测新型冠状病毒中和抗体的胶体金免疫层析试剂盒
本实施例提供的试剂盒包括检测卡和样本稀释液，所述的检测卡包括PVC 底板、样品垫、结合垫、新型冠状病毒的RBD前垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、新型冠状病毒的RBD前垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板，切割成一定宽度的试纸条，得到所述的检测卡。其中，所述结合垫和硝酸纤维素膜中使用的标记材料和包被材料均为同一重组蛋白制备方法获得的第二受体蛋白和第一受体蛋白，即是采用同一重组蛋白制备方法制得的ACE2受体。
本实施例试剂盒制备过程如下：
(1)制备结合垫：选用60nm胶体金，使用一定量的碳酸钾对胶体金进行 PH值调整；然后加入ACE2蛋白/鸡IgY与胶体金进行蛋白交联；接着加入封闭液进行封闭，离心去上清，使用复溶液进行浓缩备用，即标记物浓缩液；用标记物稀释液将上述标记物浓缩液进行稀释，并均匀涂布在经结合垫处理液处理的玻璃纤维垫上，再进行干燥备用。
其中，所述结合垫处理液为10mM Tris缓冲液(pH8.5)，含0.5％BSA、1％ NaCl、5％蔗糖、0.5％T-20；经结合垫预处理液处理的玻璃纤维垫具体是指将玻璃纤维垫浸泡在上述结合垫处理液中，室温下0.5h，60℃烘干1h备用。
(2)制备硝酸纤维素膜：选择层析速度大于10mm/min的硝酸纤维素膜；将一定浓度的ACE2和羊抗鸡IgY使用划膜仪同时包被在硝酸纤维素膜上的T 线区域及C线区域，干燥备用。T线区域(检测线)及C线区域(质控线)，干燥备用。所述的T线为ACE2，稀释至1.5mg/mL进行划线，划液量为2μL/cm，划膜速度为100mm/s。所述的C线为羊抗鸡IgY，稀释至1.5mg/mL进行划线，划液量为2μL/cm，划膜速度为100mm/s。
(3)制备新型冠状病毒的RBD前垫：使用抗原稀释液将RBD抗原稀释至合适比例；均匀涂布在玻璃纤维垫上面，干燥备用，得新型冠状病毒的RBD前垫。
(4)制备样品垫：将样品垫稀释液均匀涂布在玻璃纤维上，干燥备用。所述的样本稀释液为含1％NaCl、3％BSA和2％Tween-20的pH 7.5的磷酸盐缓冲液。
(5)组装：将上述材料包括：结合垫，包被好的硝酸纤维素膜，新型冠状病毒的RBD前垫，样品垫等装配于PVC底板上，其中，新型冠状病毒的RBD前垫设于所述样品垫和结合垫之间，组卡得试剂卡备用，接着将试剂卡放入装有干燥剂的铝箔袋，待用。
测试：拆开铝箔袋，取出试剂卡；分别加入样本(待测血清或血浆)及样本稀释液，开始计时；15-20分钟按下比色卡进行判读；当T线颜色大于或等于C 线时为阴性；当T线颜色小于C线时为阳性；当T线不显色时为阳性。
选取6个样本进行测试，结果如下表3所示：
Figure BDA0002905575340000091
注：B1-6为比色卡读值，C线显色读值为B2。字母后面的数字越大，代表显色越弱。显色越弱，代表样本含有的中和抗体浓度越高。
实施例4一种检测新型冠状病毒中和抗体的胶体金免疫层析试剂盒
本实施例与实施例3不同之处在于：所述结合垫和硝酸纤维素膜中使用的标记材料和包被材料为采用不同的重组蛋白制备方法获得的第二受体蛋白和第一受体蛋白，即第一受体蛋白和第二受体蛋白之间存在差异。
采用本实施例的试剂盒，选取6个样本进行测试，结果如下表4所示：
Figure BDA0002905575340000101
实施例5一种检测新型冠状病毒中和抗体的酶联免疫试剂盒
本试剂盒在微孔条上预包被纯化ACE2受体，配以酶标记ACE2受体、RBD 抗原及TMB等其它试剂，采用竞争抑制法原理检测人血清(或血浆)中的新型冠状病毒中和抗体。具体地，本试剂盒包括：ACE2微孔板(包被ACE2)、ACE2 酶标记抗体(辣根过氧化物酶标记ACE2)、阳性对照、阴性对照、RBD抗原、浓缩洗涤液(PBS-T缓冲液)、底物A(过氧化氢)、底物B(四甲基联苯胺)、终止液 (2M H2SO4)。其中，所述微孔板和酶标记抗体中使用的包被材料和标记材料为采用不同的重组蛋白制备方法获得的第一受体蛋白和第二受体蛋白，即第一受体蛋白和第二受体蛋白之间存在差异。
本实施例试剂盒测试过程如下：
(1)平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温(18℃-25℃)，微孔板开封后，余者即时以自封袋封存；
(2)配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀(如有晶体应充分溶解)，浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用；
(3)编号：将微孔条固定于支架，按序编号；
(4)加样：分别用加样器加入阴、阳性对照血清各50μl或待测样品50μl于相应孔中；
(5)加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50μl，轻拍混匀；
(6)中和：分别在每孔中加入RBD抗原50μl，轻拍混匀；
(7)温育：置37℃温育25分钟，室温平衡5分钟；
(8)洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干(每次应保持30-60秒的浸泡时间)；
(9)显色：每孔加底物A、B各50μl，轻拍混匀，置37℃暗置15分钟；
(10)终止：每孔加终止液50μl，混匀；
(11)测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值(用单波长测定时，需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果)。
选取6个样本进行测试，结果如下表5所示：
Figure BDA0002905575340000111
注：抑制率越大，代表样本中含有的中和抗体浓度越高。抑制率≤0％时，代表样本没有中和抗体检出。
本实施例的检测试剂盒也可以对中和抗体进行半定量分析，计算百分吸光率：中和抗体质控品或者样品的百分吸光率等于中和抗体质控品或者样本的平均吸光度值除以0HbU/mL中和抗体质控品的平均吸光度值，再乘以100％。
标准曲线的绘制与计算：以中和抗体质控品的百分吸光率为纵坐标，以中和抗体质控品的中和抗体含量的对数为横坐标，绘制半对数标准曲线图。将样本的百分吸光率带入标准曲线的方程中，计算样本的中和抗体含量，再乘以稀释倍数，可以确定样本中和抗体浓度的高低。。
实施例6一种检测新型冠状病毒中和抗体的化学发光法试剂盒
本试剂盒在微孔条上预包被纯化ACE2受体，配以酶标记ACE2受体、RBD 抗原及鲁米诺发光底物等其它试剂，采用竞争抑制法原理检测人血清(或血浆) 中的新型冠状病毒中和抗体。本试剂盒包括：ACE2微孔板(包被ACE2)、ACE2 酶标记抗体(辣根过氧化物酶标记ACE2)、阳性对照、阴性对照、RBD抗原、浓缩洗涤液(PBS-T缓冲液)、底物A(鲁米诺)、底物B(过氧化氢尿素)，使用前将底物A液与底物B液按1:1比例混合后使用。其中，所述微孔板和酶标记抗体中使用的包被材料和标记材料为采用不同的重组蛋白制备方法获得的第一受体蛋白和第二受体蛋白，即第一受体蛋白和第二受体蛋白之间存在差异。
本实施例试剂盒制备过程如下：
(一)酶标抗体制备
辣根过氧化物酶标记ACE2采用改良过碘酸钠法制备,用酶标记抗体稀释液以1:5000-1:10000工作浓度稀释酶标抗体。其中，辣根过氧化物酵标记ACE2受体蛋白的制备是将标记用的ACE2受体蛋白和辣根过氧化物酶用改良过碘酸钠法结合在一起。
以标记10mg ACE2受体蛋白为例，其具体步骤如下:
(1)称取5mg HRP加1mL 0.1mol/L醋酸钠或水溶解,充分混匀；
(2)于上液中加入0.2mL新配的0.1mol/L NaIO4溶液,室温下避光搅拌30min；
(3)将上述溶液装入透析袋中,在1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜；
(4)加20μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化HRP的pH升高到9.0-9.5,然后立即加入10mg ACE2在1mL 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2h；
(5)加0.1mL新配的4mg/mL NaBH4液,混匀,再置4℃,2h；
(6)将上述液装入透析袋中，用0.15M pH 7.4的PB缓冲液中透析,去除铵离子后,10000rpm离心30min去除沉淀,上清液即为所需的酶结合物,分装后,-20℃保存。
(二)固相包被板的制备
(1)包被
采用0.046M pH4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的ACE2受体混合制成包被液, 并将其负载于固相载体上；
溶解泥匀后，调整pH值至4.6,加入5.0mg ACE2受体蛋白混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110ul，4℃过夜；
(2)洗涤:用生理盐水洗三次；
(3)封闭封闭液(含BSA或脱脂奶粉或酪蛋白)
将上述试剂称量好放入清净容器中,加双蒸水定容,溶解混匀,测定pH值为7.0,甩掉包被液后,每孔分别加入封闭液300u1,室温放置3小时。甩掉封闭液,室温除湿于燥24小时。立即进行封袋，后置2-8℃保存。
本实施例试剂盒操作流程如下：
(1)平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温(18℃-25℃)，微孔板开封后，余者即时以自封袋封存；
(2)配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀(如有晶体应充分溶解)，浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用；
(3)编号：将微孔条固定于支架，按序编号；
(4)加样：分别用加样器加入阴、阳性对照血清各50μl或待测样品50μl于相应孔中；
(5)加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50μl，轻拍混匀；
(6)中和：分别在每孔中加入RBD抗原50μl，轻拍混匀；
(7)温育：置37℃温育25分钟，室温平衡5分钟；
(8)洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干(每次应保持30-60秒的浸泡时间)；
(9)显色：每孔加底物A、B各50μl，轻拍混匀，置37℃暗置15分钟；
(10)测定：用化学发光仪测其信号值。
选取6个样本进行测试，结果如下表6所示：
Figure BDA0002905575340000131
Figure BDA0002905575340000141
注：抑制率越大，代表样本中含有的中和抗体浓度越高。抑制率≤0％时，代表样本没有中和抗体检出。
本实施例的检测试剂盒也可以对中和抗体进行半定量分析：
标准曲线的绘制与计算：以中和抗体质控品的发光值为纵坐标，以中和抗体质控品的中和抗体含量的对数为横坐标，绘制半对数标准曲线图。将样本的发光值带入标准曲线的方程中，计算样本的中和抗体含量，再乘以稀释倍数，可以确定样本中和抗体含量的高低。
实施例7同单受体检测方法的比较(基于荧光免疫学分析方法)
本实施例采用同一检测方法，即基于荧光免疫学分析方法进行灵敏度、特异性及阳性检出率对比实验，结果如下表7所示。
Figure BDA0002905575340000142
在上表7中，对比例1、2所用的试剂盒的制备过程与实施例1试剂盒制备过程一致，所采用的包被材料、标记材料以及中和材料不同，具体不同如上表所示。
如上表7所示，传统免疫学检测采用的是单受体竞争抑制的方法(对比例1、 2)，也就是使用受体蛋白进行包被或者标记，对应的抗原进行标记或者包被，其竞争抑制的效果较本发明所采用的双受体效果较差，本发明方法能够比单受体方法灵敏度提高50倍以上及阳性检测率也提升了一倍以上，特别是采用不同制备方法获得的第一受体蛋白和第二受体蛋白，其效果更好，灵敏度相比单受体方法提升了100倍以上，而且其特异性、抗干扰能力也较单受体方法强。
【基于荧光免疫法同单受体检测方法的灵敏度比较】
具体地，用样品稀释液将质控品稀释至多个梯度浓度，每个浓度重复测试5 次，计算平均信号值MN，根据阈值预估实施例1-2、对比例1-2的检测灵敏度 (低于或等于阈值为阳性，高于阈值为阴性)，数据分别如下表8所示，其中实施例1的阈值为1.8，实施例2的阈值为2.5，对比例1的阈值为1.9，对比例 2的阈值为1.4。
Figure BDA0002905575340000151
Figure BDA0002905575340000161
需要说明的是，具体的检测下限值可以将阈值结合标准曲线获取，在此不再详述。虽然未体现出检测下限值，但上表8中给出的预测下限值也获得了预料不到的效果，即采用本发明方法可以明显将灵敏度提高至50倍以上，甚至100 倍以上。
本发明人进行双受体实验过程中，无意将采用不同来源(来源是指重组蛋白制备方法)的ACE2受体分别第一受体蛋白和第二受体蛋白，且意外发现相比采用同一来源的ACE2作为第一受体蛋白和第二受体蛋白的方法能够显著地提高灵敏度，特异性以及阳性检出率也有较大的提升。由于受体的位点本身相对单一，当采用不同重组蛋白制备方法的ACE2分别作为第一受体蛋白和第二受体蛋白时，检测时与中和抗体竞争过程中降低了发生位点封闭的可能性，能够与受体蛋白更有效地双竞争进而具有更好的抑制率，进一步将阴阳性拉得更开，达到灵敏度更高的目的。
需要说明的是，上述不同的重组蛋白制备方法可以理解为不同制备条件和/ 或不同的制备步骤，但本发明并未对制备步骤及具体条件进行限定，当采用不同制备方法或基于不同制备条件参数制得的受体蛋白均可，即重组蛋白制备方法均为现有方法在此不再详述。为了能够获得更好的检测效果，在确定第一受体蛋白和第二受体蛋白时，可对多种制备方法获得的受体蛋白进行正交实验，基于灵敏度、特异性及阳性检出率作为综合评价指标以筛选出分别作为第一受体蛋白和第二受体蛋白的较佳受体蛋白。
【基于荧光免疫法同单受体检测方法的阳性检出率的比较】
将实施例1-2、对比例1-2制得的试剂盒对同样的10个样品(此10个样品为经中和试验确证的阳性样本)进行检测，获取信号值并记录于下表9中。
Figure BDA0002905575340000171
【基于酶联免疫法同单受体检测方法的阳性检出率的比较】
将实施例4、对比例3-4制得的试剂盒对同样的10个样品(此10个样品为经中和试验确证的阳性样本)进行检测，获取信号值并记录于下表10中。
Figure BDA0002905575340000172
Figure BDA0002905575340000181
上表10中，抑制率≥20％，判读为阳性，即有中和抗体被检测到；抑制率＜ 20％，判读为阴性，即没有中和抗体被检测到。
在上表10中，对比例3、4所用的试剂盒的制备过程与实施例4试剂盒制备过程一致，对比例3所用的包被材料为RBD抗原、标记材料为ACE2，无中和材料；对比例4所用的包被材料为ACE2、标记材料为RBD抗原，无中和材料。
根据表9、10可知，本发明的检测结果与中和试验方法检测的结果具有较好的一致性。
实施例8
采用本发明实施例2试剂盒对二次免疫后不同时间段收集血清进行检测，结果如下表11如下：
表11-时间段 免疫前对照 二免后14天 二免后28天 二免后42天
测试1 3.041 1.052 0.492 0.168
测试2 3.172 1.193 0.543 0.162
平均值 3.057 1.123 0.518 0.165
注：信号值越低，代表体内中和抗体浓度越高。
二次免疫自2周开始，血清抗中和抗体有明显升高，至第六周依然呈上升趋势。该方法的检测结果反映了免疫应答的趋势。证明该方法检测新型冠状病毒中和抗体行之有效，可用于疫苗的筛选与评价。
需要申明的是，发明人采用其他免疫学方法试剂盒(如实施例1、3-6)对新型冠状病毒中和抗体也进行了类似的检测，其结果与上述一致，在此不一一赘述。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括作为包被材料的第一受体蛋白、作为标记材料的第二受体蛋白及作为中和材料的中和抗原，其用于与病毒中和抗体结合。
2.根据权利要求1所述的检测病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述第一受体蛋白和第二受体蛋白是通过不同的重组蛋白制备方法分别获得的受体重组蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的检测病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述第二受体蛋白是生物标记或化学标记的。
4.根据权利要求3所述的检测病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记、葡萄糖氧化酶标记、荧光素、生物素、微球、胶体金或胶体硒标记的。
5.根据权利要求1所述的检测病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述病毒是冠状病毒、埃博拉病毒、流感病毒、登革热病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
6.根据权利要求5所述的检测病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒是新型冠状病毒。
7.根据权利要求6所述的检测病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述第一受体蛋白和第二受体蛋白为ACE2受体；所述中和抗原为新型冠状病毒的RBD中和位点蛋白。
8.一种半定量或定性检测病毒中和抗体或评价针对病毒疫苗的有效性的方法，其特征在于，其中包括使用权利要求1-7任一项所述的试剂盒，其中所述的方法不是疾病的诊断和治疗方法。
9.一种制备权利要求1-7任一项所述的试剂盒的方法，其特征在于，其中使用第一受体蛋白作为包被材料，使用第二受体蛋白作为标记材料以及使用与病毒中和抗体结合的中和抗原作为中和材料。
10.权利要求8-9任一项的方法在检测病毒中和抗体中的用途、在筛选病毒中和性单克隆抗体中的用途、在检测病毒中和抗体效价中的用途、在病毒疫苗开发和质控中的用途、在筛选或制备抗病毒或其相关疾病药物中的用途、或在治疗病毒感染中的用途。
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