CN113391075A - 一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条和试剂盒,其包括PVC底板和依次相互搭接地设置其上的样品垫、白金垫、结合垫、硝酸纤维素膜、以及吸水垫,其中,所述结合垫上固定有胶体金标记的抗组氨酸标签的抗体和胶体金标记的兔IgG,所述硝酸纤维素膜上设有包被血管紧张素转换酶2的检测线、以及包被羊抗兔IgG多克隆抗体的对照线,所述白金垫为固定有带有组氨酸标签的新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白的玻璃纤维纸。所述新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,具有快速、便捷,且高灵敏度的优点,可用于2019‑nCoV疫苗接种人员评估疫苗效力和再接种评估,也可用于COVID‑19患者的疾病预后评估。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测领域,具体而言,涉及一种快速、便捷的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条和试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)属于β属病毒,其导致的新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)是一种急性呼吸道传染病,其临床表现以发热、乏力、干咳为主,鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见,因此病传染性强,发病具有隐蔽性,对人类的健康威胁非常大。目前的研究发现,2019-nCoV通过刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)结合宿主细胞上的受体--血管紧张素转化酶2(ACE2),并发生细胞膜融合过程。然后,病毒通过内吞作用进入细胞,进行复制加工和感染机体。
新型冠状病毒(2019-nCoV)中和抗体是在接种2019-nCoV疫苗或感染2019-nCoV后由人体产生的保护性抗体。针对2019-nCoV S蛋白RBD的阻断型中和抗体可以阻止病毒与ACE2结合,从而阻止病毒与宿主细胞接触,并最终防止病毒感染。这是中和抗体发挥抗病毒作用的重要途径。因此,2019-nCoV中和抗体的检测可作为2019-nCoV疫苗效果的评价指标,以及作为COVID-19患者疾病预后的评价指标。
目前检测2019-nCoV中和抗体的金标准是空斑减少中和试验(PRNT),但是该方法需要在专门的生物安全三级(BSL3)封闭设施中处理2019-nCoV,这既繁琐又耗时,需要2-4天才能完成。也有基于假病毒的病毒中和试验(pVNT)可以在BSL2实验室进行,虽然不需要使用2019-nCoV活病毒,但仍然需要使用其他类型的活病毒和细胞。此外,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)也可用于检测2019-nCoV中和抗体,该方法虽然不需要使用病毒和细胞,但也存在操作繁琐和检测时间长等问题。因此建立一种快速、便捷的2019-nCoV中和抗体检测方法具有重要意义。
免疫层析试剂因其操作简便、快速的优点,被广泛使用。自从新型冠状病毒(2019-nCoV)被发现以来,全世界范围内,有很多技术人员对检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的试纸条进行研发,主要集中在追求灵敏度、准确性的提高上。由于个体差异,2019-nCoV中和抗体在有些免疫接种者体内的含量较低,因此便对检测试剂的灵敏度提出了较高的要求。免疫层析检测是比较成熟的技术,但在现有成果上,每进一步提高其灵敏度或者是特异性,对研发人员都是一种考验。而且,新型冠状病毒中和抗体检测试剂的研发还有待进一步加强。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有高灵敏度的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条。
本发明所述检测试纸条采用侧流向免疫层析胶体金法,应用竞争法检测人血清、血浆、全血中的新型冠状病毒(2019-nCoV)中和抗体。
实现上述目的的技术方案如下。
一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,包括PVC底板和依次相互搭接地设置其上的样品垫、白金垫、结合垫、硝酸纤维素膜、以及吸水垫,其中,所述结合垫上固定有胶体金标记的抗组氨酸标签的抗体(抗His-Tag Ab)和胶体金标记的兔IgG,所述硝酸纤维素膜上设有包被血管紧张素转换酶2(ACE2)的检测线、以及包被羊抗兔IgG多克隆抗体(GAR)的对照线,所述白金垫为固定有带有组氨酸标签的新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白(RBD(His-Tag))的玻璃纤维纸。
在其中一些实施例中,新型冠状病毒是2019-nCoV。
在其中一些实施例中,所述白金垫的制备包括:将工作浓度为0.5μg/mL-5.0μg/mL(优选浓度为:1.0μg/mL-3.0μg/mL,进一步优选为1.5μg/mL-2.5μg/mL)的所述新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白溶液按0.8-1.2mL/5cm×5cm的量涂布到玻璃纤维纸上,干燥,即得。
在其中一些实施例中,优选为所述新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白溶液按照0.9-1.1mL/5cm*5cm的量涂布到玻璃纤维纸上。
在其中一些实施例中,所述检测线上包被的血管紧张素转换酶2(ACE2)的浓度为0.2mg/mL-1.5mg/mL,优选浓度为0.8mg/mL-1.2mg/mL,质控线上包被的GAR的浓度为0.5mg/mL-1.5mg/mL,优选浓度为0.8mg/mL-1.2mg/mL。
所述胶体金粒径为20nm-100nm,优选为20-50nm,所述胶体金标记的材料是抗组氨酸标签的抗体和兔IgG。
优选地,胶体金标记时,浓度为每毫升万分之四的胶体金溶液(或者是:最大吸收峰波长在526nm–532nm,且最大吸收峰对应的OD值为3.8-4.2)中加入10μg-20μg的抗组氨酸标签的抗体或兔IgG。
在其中一个实施例中,所述样品垫经过处理液处理,所述处理液包括含PVP40的质量浓度为0.8-1.2%、BSA的质量浓度为0.8-1.2%、NaCl的质量浓度为1.4-1.6%、NaN3的体积浓度为0.04-0.06%、Tween-20体积浓度为0.04-0.06%、P-RBC终浓度为0.1-0.2mg/mL的pH为8.0的0.1M Tris缓冲液。
更优选为含PVP40的质量浓度为1.0%、BSA的质量浓度为1.0%、NaCl的质量浓度为1.5%、NaN3的体积浓度为0.05%、Tween-20体积浓度为0.05%、P-RBC终浓度为0.2mg/mL的pH为8.0的0.1M Tris缓冲液。
本发明的另一目的提供一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其包括有装在金标盒中的上述检测试纸条。
在其中一些实施例中,还包括有样本稀释液(滴瓶)、滴管。
所述样本稀释液是含PVP40的质量浓度为0.8-1.2%、NaCl的质量浓度为0.6-1.0%、NaN3的体积浓度为0.04-0.06%、Tween-20体积浓度为0.2-0.5%的pH为8.0的0.1MTris缓冲液。
更优选为含PVP40的质量浓度为1.0%、NaCl的质量浓度为0.85%、NaN3的体积浓度为0.05%、Tween-20体积浓度为0.3%的pH为8.0的0.1M Tris缓冲液。
本发明采用的是竞争法检测2019-nCoV中和抗体,通过在试纸条中的样品垫、结合垫之间引入所述白金垫,适当延长样本的反应时间进而提高检测灵敏度,同时巧妙地结合抗组氨酸标签的抗体与RBD(His-Tag)的高亲和力,可以实现在白金垫中加入较少量合适的RBD(His-Tag),检测阴性样本的显色也达到较强,而当样本中即使有少量的2019-nCoV中和抗体时,可和少量的RBD结合,抑制其与T线上的ACE2结合,从而抑制T线的显色,从而实现大幅度提高检测灵敏度。
本发明提供了一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,具有快速、便捷,且高灵敏度的优点,可用于2019-nCoV疫苗接种人员评估疫苗效力和再接种评估,也可用于COVID-19患者的疾病预后评估。
附图说明
图1为本发明中新型冠状病毒中和抗体检测条的结构示意图。
图2为本发明中新型冠状病毒中和抗体检测卡的结构示意图。
图3为常规的新型冠状病毒中和抗体检测条的结构示意图。
图4为本发明中新型冠状病毒中和抗体检测卡的检测结果示意图。
附图标记:1:PVC底板,2:样品垫,3:白金垫,4:结合垫,5:检测区,6:质控区,7:硝酸纤维素膜,8:吸水垫;21:金标盒,22:加样孔,23:显色窗口;31:PVC底板,32:样品垫,33:结合垫,34:胶体金标记的RBD,35:胶体金标记的兔IgG,36:硝酸纤维素膜,37:检测线包被的血管紧张素转换酶2(ACE2),38:质控线包被的羊抗兔IgG多克隆抗体,39:吸水垫。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中,以下术语具有与本文明确相关的含义,除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案,尽管其可能是。此外,在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案,尽管其可能是。因此,如下所述,可以容易地组合本发明的各个实施方案,而不脱离本发明的范围或精神。
本发明提供一种检测2019-nCoV中和抗体的胶体金试纸条,包括PVC底板和设置其上的样品垫、白金垫、结合垫、硝酸纤维素膜、以及吸水垫。
其中,所述结合垫上固定有胶体金标记的抗组氨酸标签的抗体(抗His-Tag Ab)和胶体金标记的兔IgG,所述硝酸纤维素膜上设有包被血管紧张素转换酶2(ACE2)的检测线、以及包被羊抗兔IgG多克隆抗体(GAR)的对照线,所述白金垫为固定有带有组氨酸标签的新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白的玻璃纤维纸。
本发明在其中一些实施例中,所述硝酸纤维素膜采用的是135s层析膜,沿样品流动方向依次设有检测线T和质控线C。
本发明提供的胶体金试纸条检测原理如下:所述试纸条采用免疫层析技术原理,应用竞争法检测人血清、血浆、全血中的新型冠状病毒(2019-nCoV)中和抗体。检测试纸条的硝酸纤维素膜检测区(T)上包被有血管紧张素转换酶2(ACE2),质控区(C)上包被羊抗兔IgG多克隆抗体,结合垫固定有胶体金标记抗His-Tag Ab和兔IgG,同时在结合垫和样品垫之间加入白金垫(RBD-His)。检测时,在检测试剂卡的加样孔加入待测样本,当样本中不含新型冠状病毒(2019-nCoV)中和抗体或浓度低于最低检测限(检测菲鹏中和抗体质控品,最低检出限为62.5ng/mL)时,在层析作用下,白金垫中的RBD-His先和结合垫中的胶体金标记抗His-Tag Ab结合,沿着硝酸纤维素膜向前移动至检测线(T),与硝酸纤维素膜上预先包被的ACE2反应形成复合物,在检测线(T)最终形成一条红色反应线,且检测线(T)显色等于或深于质控线(C),此时结果为阴性。当样本中新型冠状病毒(2019-nCoV)中和抗体(NAb)浓度高于或等于最低检测限时,NAb先与白金垫中的RBD-His结合形成复合物,然后再与结合垫中的胶体金标记抗His-Tag Ab结合,但该复合物不会和T线上的ACE2结合,剩余的RBD-His和胶体金标记的抗His-Tag Ab结合后才会和T线上的ACE2结合,此时T线的显色被竞争抑制,会使得T线的显色弱于C线,或T线消线,此时的结果为阳性。无论样本中是否含有相应的待测物,质控区(C)都将显色,这是判断检测反应是否正常的标准。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例一:本发明的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备
如图1和图2所示,本实施例提供一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条和试剂卡构成的试剂盒。
所述新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,在包括PVC底板1和沿样本液体流动方向依次设置其上的样品垫2、白金垫3、结合垫4、硝酸纤维素膜7(含检测区5–检测线、质控区6–对照线)和吸水垫8。其中,硝酸纤维素膜7检测区(T)上包被有血管紧张素转换酶2(ACE2)、质控区(C)上包被羊抗兔IgG多克隆抗体,结合垫上固定有胶体金标记抗组氨酸标签的抗体(抗His-Tag Ab)和兔IgG,白金垫上固定有2019-nCoV S Protein RBD(上海近岸,DRA36),即RBD(His-Tag)。
所述检测卡,包括所述新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其设置在常规的金标盒(塑料卡壳)中。所述塑料卡壳是由塑料上壳和塑料下壳扣合而成,沿样本液体流动方向依次设置有加样区,显示窗口区和吸水垫区。其中,加样区内对应于所述试纸条的样品垫,显示窗口区内对应于所述试纸条的硝酸纤维素膜,故从显示窗口区可观察到检测线和质控线的显色情况,吸水垫区对应于所述试纸条的吸水垫。
(一)胶体金的制备
1.取250ml三角瓶一个,加100ml双蒸水及4ml 1%氯化金溶液(100ml水加入1g氯金酸),加热至沸腾;
2.在磁力搅拌器的搅拌下快速准确地加入2%柠檬酸三钠水溶液2.5ml,混匀,再保持沸腾15分钟,溶液颜色首先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。
3.冷却后以蒸馏水定容至原体积(100ml),胶体金的浓度为万分之四(1万mL里面有4g左右的胶体金),搅拌均匀,置于室温保存,备用。取适量的金溶胶溶液,采用紫外可见光分光光度计进行检测,其最大吸收峰波长应在526nm–532nm,且最大吸收峰对应的OD值应在:3.8-4.2。电镜检测胶体金颗粒直径。按照此方法所制胶体金颗粒直径约20-50nm,置于洁净容器中可于常温保存半年。
(二)胶体金标记抗组氨酸标签的抗体和兔IgG及结合垫的制备
取上述制备好的浓度为万分之四的胶体金溶液10mL,按每mL胶体金溶液中加入10μL的0.1M K2CO3溶液,即加入100μL,混匀后再按每mL胶体金溶液中加入20μg的抗组氨酸标签的抗体(菲鹏生物,货号:His-PS-Ab1),即加入200μg,混匀,反应10-15min。然后再按每mL胶体金溶液中加入20μL的5%BSA(即200μL)进行封闭,混匀,反应10-15min。4500g,离心20min,弃上清,沉淀用含0.5%BSA、0.5%Tween 20、10%蔗糖的20mMPBS溶液重悬,重悬至1mL溶液中,得到胶体金标记的抗组氨酸标签抗体的结合物。用同样步骤的制备胶体金标记的兔IgG(隆基生物,货号:AS01001)结合物,并用上述重悬液将抗组氨酸标签抗体的结合物和兔IgG的结合物分别按10%、1.0%的比例稀释得到结合物工作液,将该结合物工作液按1mL/5cm*5cm的量涂布到玻璃纤维纸上,置于50℃烘箱烘干得到结合垫。
(三)白金垫的制备
用含0.5%BSA、0.5%Tween 20、10%蔗糖的20mMPBS溶液稀释新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白(2019-nCoV S Protein RBD(C-6His)(上海近岸,DRA36)),将其工作浓度稀释至2μg/mL,将稀释后的RBD蛋白溶液按1mL/5cmx5cm的量涂布到玻璃纤维纸上,置于干燥房(温度:30℃~40℃,相对湿度<30%)干燥12h~24h,得到白金垫。
(四)硝酸纤维素膜的制备
1.配制T线(检测线)包被液:使用20mM PBS溶液作为包被稀释液,将血管紧张素转换酶2(ACE2)稀释至浓度为1.0mg/mL的工作液。
2.配制C线(质控线)包被液:使用20mM PBS溶液作为包被稀释液,将羊抗兔IgG多克隆抗体(GAR)稀释至浓度为1.0mg/mL的工作液。
3.然后将T、C线包被工作液用喷膜机分别以0.08μL/mm的速度喷于硝酸纤维素膜(预先贴于PVC板上)上,分别作为检测线T和质控线C,置于50℃烘箱中烘干,得到包被了目标材料的硝酸纤维素膜。
(五)样品垫的处理
所述样品垫上涂有样品垫处理液,所述样品垫处理液为含PVP40的质量浓度为1%、BSA的质量浓度为1.0%、NaCl的质量浓度为1.5%、NaN3的体积浓度为0.05%、Tween-20体积浓度为0.05%、P-RBC终浓度为0.2mg/mL的pH为8.0的0.1M Tris缓冲液;样品垫的处理方法如下,将样品垫处理液以30mL/25cm*30cm的量,涂布玻璃纤维纸,置于干燥房(温度:30℃~40℃,相对湿度<30%)干燥12h~24h。
所述P-RBC,本实施例中选择处理浓度为0.2mg/mL,可起到拦截血液样本中的红细胞的作用。
(六)胶体金试纸条和卡的制备
将制备好的硝酸纤维素膜(预先贴于PVC板上)取出置于干燥房中,将PVC板其中一端的油纸揭掉,然后将吸水垫贴于其上并压硝酸纤维素膜1mm。然后再将PVC板另一端的油纸揭掉,然后将结合垫压膜1mm贴于PVC板上、然后再将白金垫压结合垫1mm贴于PVC板上、最后将样品垫压白金垫1mm贴于PVC板上。从而制备成新型冠状病毒中和抗体检测试剂大板。将该大板用切条机切条后,装入常规的金标盒中组装成新型冠状病毒中和抗体检测试剂卡。所述检测试纸条中所述样品垫沿待检测样品流动方向的长度为23mm,所述白金垫沿待检测样品流动方向的长度为5mm,结合垫的长度也为5mm,所述硝酸纤维素膜沿待检测样品流动。
实施例二:本发明中白金垫中RBD(His-Tag)使用浓度
用含0.5%BSA、0.5%Tween 20、10%蔗糖的20mMPBS溶液稀释新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白(2019-nCoV S Protein RBD(C-6His)(上海近岸,DRA36)),将其工作浓度分别稀释至0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL、3.0μg/mL、3.5μg/mL、4.0μg/mL、4.5μg/mL、5.0μg/mL、5.5μg/mL、6.0μg/mL,将稀释后的RBD蛋白溶液按1mL/5cm*5cm的量涂布到玻璃纤维纸上,置于干燥房(温度:30℃~40℃,相对湿度<30%)干燥12h~24h,得到白金垫,按顺序从1-13分别对其进行编号。
参考实施例一,制备其他半成品,并组装成检测试剂卡。然后将不同浓度白金垫制备的试剂卡分别检测新型冠状病毒中和抗体阴性样本(经过中和抗体检测金标准的空斑减少中和试验(PRNT)确认过的样本)以及菲鹏生物的新型冠状病毒中和抗体质控品(货号:ncov-PS-GonAbG3)。
结果如下表所示。通过与胶体金标准色板对比,分别对C、T线的显色进行判读,B表示不显色,C1-C9编号越大表示显色深度越浅。然后再对C、T线的显色进行比较,T≥C判为阴性,T<C判为阳性,具体结果解释参考实施例三。
从上述结果可以看出,当白金垫中RBD的浓度过低(≤0.2μg/mL)或过高(≥5.5μg/mL)时均会出现检测阴性样本而误判成阳性结果的现象。出现这种现象可能的原因是,当白金垫中RBD浓度过低(≤0.2μg/mL)时,T线上的ACE2无法结合足够的抗组氨酸标签抗体与RBD结合后的复合物,从而导致T线无信号,出现即便是检测阴性样本也被误判为阳性的情况。当白金垫中RBD浓度过高(≥5.5μg/mL)时,会存在大量游离的未与抗组氨酸标签抗体结合的RBD,随着层析作用会被T线上的ACE2捕获,从而阻碍抗组氨酸标签抗体与RBD结合后的复合物与T线上ACE2的结合,从而导致T线无信号或信号减弱,出现即便是检测阴性样本也被误判为阳性的情况。由此可知,白金垫中RBD的浓度为0.5-5.0μg/mL时,整个体系是正常工作的。
当白金垫中RBD的浓度为1.0-3.0μg/mL时,检测125ng/mL的中和抗体质控品,其显色与阴性样本的显色差异≥4个色度,当白金垫中RBD的浓度为0.5μg/mL或3.5-5.0μg/mL时,检测125ng/mL的中和抗体质控品,其显色与阴性样本的显色差异≥2个色度。
当白金垫中RBD的浓度为1.5-2.5μg/mL时,检测62.5ng/mL的中和抗体质控品,其显色与阴性样本的显色差异≥2个色度,当白金垫中RBD的浓度为0.5-1.0μg/mL或3.0-5.0μg/mL时,检测62.5ng/mL的中和抗体质控品,其显色与阴性样本的显色无差异,会被判为阴性结果。由此可知当白金垫中RBD的浓度为1.5-2.5μg/mL时,可提高检测灵敏度。
综合考虑,白金垫中新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白溶液的工作浓度可以为:0.5μg/mL-5.0μg/mL,优选为1.0μg/mL-3.0μg/mL,更优选为1.5μg/mL-2.5μg/mL。
实施例三:本发明试剂盒的操作步骤及结果解释
1.测试之前,检测试剂、样本稀释液和待测样本及其他检测用材料等均需要平衡至室温。
2.沿铝箔袋撕口打开将测试卡取出,平放。
3.加样检测
①血清/血浆:用一次性滴管将100μL血清或血浆样本加入加样孔中。
②全血:用一次性滴管将100μL指尖/静脉全血样本加入到加样孔中,然后滴加1滴样本稀释液。样本稀释液为含PVP40的质量浓度为1.0%、NaCl的质量浓度为0.85%、NaN3的体积浓度为0.05%、Tween-20体积浓度为0.3%的pH为8.0的0.1M Tris缓冲液。
4.随着测试的进行,将会看到紫色在测试卡的视读窗口中移动。
5.等待15分钟,然后判读结果。
检测结果的解释:
1.阳性结果:在检测线(T)和质控线(C)上都出现了色带,但是检测线(T)的显色比质控线(C)的显色浅,或者仅可见质控线。这表明样品中2019-nCoV中和抗体的阳性结果,如图4A所示。
2.阴性结果:在检测线(T)和质控线(C)处各出现一条红色反应线,且检测线(T)显色等于或深于质控线(C)显色。这表明2019-nCoV中和抗体的浓度为零或低于测试的最低检出限,如图4B所示。
3.无效结果:当质控线(C)无红色线出现时,无论测试线(T)的是否显色,结果均判为无效。此时表明可能未正确遵循测试指示。需特别注意样品量是否足够。建议重新测试,如图4C所示。
实施例四:常规的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备
(一)、胶体金的制备
参考实施例一中的制备方法,同实施例一。
(二)胶体金标记RBD和兔IgG及结合垫的制备
取制备好的胶体金溶液10mL,按10μL/mL的比例加入0.1M K2CO3溶液,混匀后再加入20μg/mL RBD,混匀,反应10-15min。然后再加入20μL/mL的5%BSA进行封闭,混匀,反应10-15min。4500g,离心20min,弃上清,沉淀用含0.5%BSA、0.5%Tween 20、10%蔗糖的20mMPBS溶液重悬,重悬至1mL溶液中,得到胶体金标记的RBD结合物。用同样的步骤制备胶体金标记的兔IgG结合物,并用上述重悬液将RBD的结合物和兔IgG的结合物分别按10%、1.0%的比例稀释得到结合物工作液,将该结合物工作液按1mL/5cm*5cm的量涂布到经过结合垫处理液处理过的玻璃纤维纸上,置于50℃烘箱烘干得到结合垫。
(三)硝酸纤维素膜的制备
参考实施例一中的制备方法,同实施例一。
(四)样品垫的处理
参考实施例一中的制备方法,同实施例一。
(五)胶体金试纸条和卡的制备
将制备好的硝酸纤维素膜(预先贴于PVC板上)取出置于干燥房中,将PVC板其中一端的油纸揭掉,然后将吸水垫贴于其上并压硝酸纤维素膜1mm。然后再将PVC板另一端的油纸揭掉,然后将结合垫压膜1mm贴于PVC板上、然后再将白金垫压结合垫1mm贴于PVC板上、最后将样品垫压白金垫1mm贴于PVC板上。从而制备成新型冠状病毒中和抗体检测试剂大板。将该大板用切条机切条后,装入常规的金标盒中组装成新型冠状病毒中和抗体检测试剂卡。常规的新型冠状病毒中和抗体检测试剂条的结构如图3所示。
该方法制备的常规的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒其原理如下:检测时,在检测试剂卡的加样孔加入待测样本,当样本中不含新型冠状病毒中和抗体时,胶体金标记的RBD会与T线上的ACE2结合显色,T线显色不弱于C线,此时结果为阴性。而当样本中含新型冠状病毒中和抗体时,新型冠状病毒中和抗体会与ACE2竞争结合RBD,从而抑制T线的显色,T线显色弱于C线或T线不显色,此时结果为阳性。
实施例五:本发明的试剂盒与常规的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的性能对比
参考实施例一的制备方法,制备本发明的试剂盒。
参考实施例四的方法,制备常规的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒。
采用两种试剂盒同时检测新型冠状病毒中和抗体阳性和阴性样本(经过中和抗体检测金标准的空斑减少中和试验(PRNT)确认过的样本),结果如下表所示。通过与胶体金标准色板对比,分别对C、T线的显色进行判读,B表示不显色,C1-C9编号越大表示显色深度越浅。然后再对C、T线的显色进行比较,T≥C判为阴性,T<C判为阳性,具体结果解释参考实施例三。
从上述检测结果可以看出,与常规的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒相比,本发明的试剂盒(试纸条)可以显著提高阳性样本的检出率,且无假阳,表明本发明的试剂盒其检测灵敏度是高于常规的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒。
实施例六:本发明的试剂盒与常规竞争法检测中和抗体的试剂盒在检测灵敏度上的对比。
参考实施例一的制备方法,制备本发明的试剂盒1,同时参考实施例四的制备方法制备常规检测试剂盒2。
参考实施例一的制备方法制备试剂盒3,唯一不同的是原白金垫中RBD的使用浓度为4.0μg/mL的使用浓度。
参考将试剂盒1中试纸条的制备方法,不同的是将试剂盒1中白金垫中所用的材料由含组氨酸标签的RBD换成含mFc标签的RBD,同时将抗组氨酸标签的抗体换成羊抗鼠IgG多克隆抗体,其他制备方法及相关材料的使用浓度和试剂盒1的制备方法一致,从而制备成试剂盒4。
将4种试剂盒同时检测新型冠状病毒中和抗体阳性和阴性样本(经过中和抗体检测金标准的空斑减少中和试验(PRNT)确认过的样本)和菲鹏生物的新型冠状病毒中和抗体质控品(货号:ncov-PS-GonAbG3),对其检测灵敏度进行比较。其检测结果如下表所示:
从上述检测结果可以看出,采用本发明实施例1所述试纸条,可将检测灵敏度由常规检测试剂盒(试剂盒2)的500ng/mL提高到62.5ng/mL,其最低检出限提高了8倍。
而试剂盒3,采用的白金垫其RBD使用浓度为4.0μg/mL时,其检测灵敏度由常规竞争法检测试剂盒(试剂盒2)的500ng/mL提高到125ng/mL,其最低检出限提高了4倍,检测灵敏度虽有所提高,但仍差于本发明的的试剂盒1,由此可见合适的RBD使用浓度对于本发明提高检测灵敏度是至关重要的。
而按照采用羊抗鼠IgG多克隆抗体而非抗组氨酸标签的抗体时(试剂盒4),其检测灵敏度由常规检测试剂盒(试剂盒2)的500ng/mL提高到250ng/mL,其最低检出限提高了2倍,检测灵敏度虽有所提高,但仍差于本发明的的试剂盒1,这可能是因为羊抗鼠IgG多克隆抗体与含mFc标签的RBD的结合效率低于抗组氨酸标签抗体与含His标签的RBD的结合效率,也有可能是试剂盒4中含mFc标签的RBD的合适的使用浓度与试剂盒1中含His标签的RBD的使用浓度不一致导致的。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.一种新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,包括PVC底板和依次相互搭接地设置其上的样品垫、白金垫、结合垫、硝酸纤维素膜、以及吸水垫,其中,所述结合垫上固定有胶体金标记的抗组氨酸标签的抗体和胶体金标记的兔IgG,所述硝酸纤维素膜上设有包被血管紧张素转换酶2的检测线、以及包被羊抗兔IgG多克隆抗体的对照线,所述白金垫为固定有带组氨酸标签的新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白的玻璃纤维纸。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,所述白金垫的制备包括:将工作浓度为0.5μg/mL-5.0μg/mL的所述新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白溶液按0.8-1.2mL/5cm×5cm的量涂布到玻璃纤维纸上,干燥,即得。
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,按0.9-1.1mL/5cm×5cm的量涂布到玻璃纤维纸上。
4.根据权利要求2或3所述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,所述新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域重组蛋白溶液的工作浓度为1.0μg/mL-3.0μg/mL,更优选为1.5μg/mL-2.5μg/mL。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,
所述检测线上包被的血管紧张素转换酶2的浓度为0.2mg/mL-1.5mg/mL,所述质控线上包被的羊抗兔IgG多克隆抗体的浓度为0.5mg/mL-1.5mg/mL。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,
所述检测线上包被的血管紧张素转换酶2的浓度为0.8-1.2mg/mL,质控线上包被的羊抗兔IgG多克隆抗体的浓度为0.8-1.2mg/mL。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,
所述胶体金粒径为20nm-100nm,优选为20-50nm。
8.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,
胶体金标记时,所述胶体金与所述抗组氨酸标签的抗体和兔IgG用量比为:每毫升万分之四的胶体金溶液中分别加入10μg-20μg的抗组氨酸标签的抗体或兔IgG。
9.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试纸条,其特征是,
所述样品垫经过处理液处理,所述处理液包括:含PVP40的质量浓度为0.8-1.2%、BSA的质量浓度为0.8-1.2%、NaCl的质量浓度为1.4-1.6%、NaN3的体积浓度为0.04-0.06%、Tween-20体积浓度为0.04-0.06%、P-RBC终浓度为0.1-0.2mg/mL,pH为8.0的0.1M Tris缓冲液。
10.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征是,包括有装在金标盒中的权利要求1-9所述的检测试纸条。
11.根据权利要求10所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征是,所述试剂盒还包括样本稀释液,所述样本稀释液为含PVP40的质量浓度为0.8-1.2%、NaCl的质量浓度为0.6-1.0%、NaN3的体积浓度为0.04-0.06%、Tween-20体积浓度为0.2-0.5%的pH为8.0的0.1M Tris缓冲液。
12.根据权利要求10或11所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征是,所述试剂盒还包括处理液,所述处理液包括:含PVP40的质量浓度为0.8-1.2%、BSA的质量浓度为0.8-1.2%、NaCl的质量浓度为1.4-1.6%、NaN3的体积浓度为0.04-0.06%、Tween-20体积浓度为0.04-0.06%、P-RBC终浓度为0.1-0.2mg/mL,pH为8.0的0.1M Tris缓冲液。
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