CN112946261A - 一种基于三聚体s蛋白rbd-ace2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒 - Google Patents

一种基于三聚体s蛋白rbd-ace2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于三聚体S蛋白RBD‑ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，该试剂盒利用ELISA竞争法，在准确性和重复性方面提供了可靠的结果，只需在二级生物安全实验室就可完成。其先将His抗体包被于微孔板中，再连接具有三聚体结构的S蛋白RBD(His标签)，使得RBD(His标签)更加均匀并整齐地包被在微孔板中，提高了试剂盒的灵敏度和特异性，并且操作简单、结果重复性好、干扰因素少。该试剂盒可有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标；提高新冠检出率，弥补核酸检测假阴性带来的漏检；检测新冠康复病人体内中和抗体含量，以判断是否可以复工复产及是否存在再次感染风险。

Description

一种基于三聚体S蛋白RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗 体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体地，涉及一种基于三聚体S蛋白RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新型β冠状病毒(β-coronavirus)，来自Sarbecovirus 亚属，圆形或椭圆形，直径60～140nm，电镜下呈皇冠样形状。SARS-CoV-2的S蛋白(spike protein)的受体结合域(receptor binding domain，RBD)可与人体ACE2蛋白相互作用，从而导致肺内部宿主细胞的内吞及病毒的复制。同时，RBD也是中和抗体主要靶点。S蛋白在病毒表面以同源三聚体形式存在，研究人员发现，S蛋白的构象形式很不稳定，即使不与宿主细胞受体ACE2结合，也会自发出现构象改变，这对疫苗开发和中和性抗体筛选带来巨大的挑战。因此获得三聚体形式、性质稳定、构象均一的S蛋白成为成功开发疫苗、中和性抗体以及血清学检测试剂盒的关键因素。
新型冠状病毒中和抗体(NAb)是新型冠状病毒肺炎患者及新冠疫苗注射者体内产生的一种抗体。中和抗体通常是针对S蛋白产生的，病毒表面的S蛋白(spike protein)的受体结合域(receptor binding domain，RBD)对病毒进入细胞表现出直接中和活性，是中和抗体(Abs) 的主要靶点，阻止了刺突蛋白对表面ACE2受体的有效结合。因此，中和抗体的检测可判断人体是否具有抵抗这种病毒感染的能力，同时能够有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标。
抗体检测主要包括病毒中性化试验(cVNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和侧流试验 (LFA)快速试验。病毒中性化试验(cVNT)可检测病人血液中的中和抗体，但需要在三级生物安全实验室中检测，较为繁琐费时。酶联免疫吸附试验(ELISA)和侧流试验(LFA)快速试验，检测总结合抗体，无法区分总结合抗体和中和抗体。因此，便捷高效的中和抗体检测试剂盒的开发具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种基于三聚体S蛋白 RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，该试剂盒利用ELISA竞争法，在准确性和重复性方面提供了可靠的结果，只需在二级生物安全实验室就可完成。其检测灵敏度高、特异性强、操作简单、结果重复性好、干扰因素少。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明先将His抗体包被于微孔板中，再连接带有His标签三聚体结构的RBD，使得三聚体结构的RBD更加均匀整齐地包被在微孔板中，且稳定的三聚体结构可以更好地识别中和抗体，待测血清加入微孔板中，若血清中含有中和抗体，则可与微孔板中的RBD 结合，后续加入生物素标记的ACE2蛋白竞争结合RBD，洗净后加入链霉亲和素-HRP并进行后续显色反应，在450/630nm处测得吸光度值，以此计算中和抗体的抑制率，判断血清或者血浆中是否存在新冠病毒中和抗体及其含量的高低，其原理及操作示意图如图1。
因此本发明要求保护一种基于三聚体S蛋白RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，含有包被了SARS-CoV-2RBD的固相载体、生物素标记的ACE2蛋白，所述SARS-CoV-2RBD为具有三聚体结构的S蛋白RBD。
优选地，所述固相载体为酶标版。
生物素标记的ACE2蛋白能够与链霉亲和素结合
优选地，所述SARS-CoV-2RBD带有His标签。
优选地，所述包被了SARS-CoV-2RBD的固相载体的制备方法为：先将His抗体包被于微孔板中，再连接带有His标签的三聚体S蛋白RBD，使得RBD更加均匀整齐包被在微孔板中。
优选地，所述试剂盒还含有阳性对照品、阴性对照品、样品稀释液、酶标二抗、显色液、终止液、洗涤液。
更优选地，所述酶标二抗为链霉亲和素-HRP。
更优选地，所述显色液：含2mg/ml TMB、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、0.75％(v/v)过氧化氢。
更优选地，所述样本稀释液为含0.2％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4。
更优选地，所述终止液为含2mol/L H2SO4。
更优选地，所述洗涤液为含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液。
更优选地，所述阳性对照品为注射新冠疫苗后高表达中和抗体者血清。
更优选地，所述阴性对照品为未感染过新冠病毒及其他冠状病毒，且未接种过新冠疫苗的健康体检者血清的混合物。
最优选地，一种基于三聚体S蛋白RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，含有以下组分：
1、包被了SARS-CoV-2RBD(400ng/孔)的固相载体(96孔板或48孔板)，所述 RBD带有His标签，先将His抗体包被于固相载体中，再连接带有His标签的三聚体S蛋白RBD；
2、生物素标记的ACE2蛋白；
3、阳性对照品：注射新冠疫苗后高表达中和抗体者血清；
4、阴性对照品：未感染过新冠病毒及其他冠状病毒，且未接种过新冠疫苗的健康体检者血清的混合物；
5、酶标二抗：HRP-链霉亲和素；
6、显色液：含2mg/ml3,3,5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)、50mmol/L磷酸氢二钠、 24.3mmol/L柠檬酸、0.75％(v/v)过氧化氢；
7、终止液：含2mol/L H2SO4；
8、样本稀释液：含0.02％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4；
9、洗涤液：含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液。
二、使用方法
1、样本孵育：将100μl待测血清(以及阳性对照和阴性对照)加入到包被有 SARS-CoV-2RBD的微孔板中进行反应，37℃孵育60min。
3、ACE2蛋白竞争性结合：甩干微孔板中的样本后，不经洗涤，加入100μl/孔ACE2蛋白(0.02ng/μl)进行竞争性结合，37℃孵育30min。
4、与酶标二抗反应：洗板后，每孔加入100μl链霉亲和素-HRP进行反应，37℃条件下反应30min。
4、TMB显色：彻底洗板后，每孔加入100μl底物显色液，37℃避光显色15～20min。
5、终止：加入终止液50μl，酶标仪测定450/630nM处吸光值，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。
6、计算抑制率：抑制率＝(1-待测OD值/阴性对照OD值)×100％。
三、结果判读
抑制率高于30％，则样本中存在中和抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种基于三聚体S蛋白RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，该试剂盒利用ELISA竞争法，针对新冠病毒刺突可溶性外膜结构域(Spike)上高免疫原性受体结合结构域(RBD)的特异性检测中和抗体。
该试剂盒理论可靠，实际可行，在准确性和重复性方面提供了可靠的结果，只需在二级生物安全实验室就可完成。本发明的免疫分析技术灵敏度高、特异性强、操作简单、结果重复性好、干扰因素少。该试剂盒可用于有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标；可提高新冠检出率，一定程度上弥补核酸检测假阴性带来的漏检问题；还可用于检测新冠康复病人体内中和抗体含量，以判断是否可以复工复产及是否存在再次感染风险。
附图说明
图1为一种基于三聚体S蛋白RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒原理及操作示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种基于三聚体S蛋白RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒
一、组成
1、包被了三聚体结构的S蛋白RBD(GenScript Z03483)(400ng/孔)的固相载体(96孔板或48孔板)，其中，SARS-CoV-2RBD带有His标签，先将His抗体包被于固相载体中，再通过His抗体将RBD包被于固相载体上；
2、生物素标记的ACE2蛋白
3、阳性对照品：注射新冠疫苗后高表达中和抗体者血清；
4、阴性对照品：20个18周岁以上的未感染过新冠病毒及其他冠状病毒，且未接种过新冠疫苗的健康体检者血清的混合物；
5、酶标二抗：HRP-链霉亲和素；
6、显色液：含2mg/ml3,3,5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、0.75％(v/v)过氧化氢；
7、终止液：含2mol/L H2SO4；
8、样本稀释液：含0.02％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4；
9、洗涤液：含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液。
二、使用方法
1、样本孵育：将100μl待测血清(以及阳性对照和阴性对照)加入到包被有SARS-CoV-2 RBD的微孔板中进行反应，37℃孵育60min。
3、ACE2蛋白竞争性结合：甩干微孔板中的样本后，不经洗涤，加入100μl/孔ACE2蛋白(0.02ng/μl)进行竞争性结合，37℃孵育30min。
4、与酶标二抗反应：洗板后，每孔加入100μl链霉亲和素-HRP进行反应，37℃条件下反应30min。
4、TMB显色：彻底洗板后，每孔加入100μl底物显色液，37℃避光显色15min。
5、终止：加入终止液50μl，酶标仪测定450/630nM处吸光值，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。
6、计算抑制率：抑制率＝(1-待测OD值/阴性对照OD值)×100％。
三、结果判读
抑制率高于30％，则样本中存在中和抗体。
实施例2疫苗注射者血液样本的检测
一、实验方法
1、为检验本试剂盒在疫苗注射者中的检测效果，使用实施例1的试剂盒检测临床样本。本实施例纳入了8位疫苗接种者，与此同时还纳入了18例健康者作为对照。
二、实验结果
检测结果见表1，8位疫苗接种者抑制率均大于30％，本试剂盒可检测血清中的中和抗体。
表1：
Figure BDA0002899107470000051
Figure BDA0002899107470000061
实施例3新冠康复者血液样本的检测
一、实验方法
1、为检验本试剂盒在新冠康复患者中的检测效果，使用实施例1的试剂盒检测临床样本。本实施例纳入了12位新冠康复患者。
二、实验结果
检测结果见表2，12位新冠康复患者。抑制率均大于30％，本试剂盒可检测血清中的中和抗体。
表2：
Figure BDA0002899107470000062
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于三聚体S蛋白RBD-ACE2结合竞争的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，含有包被了SARS-CoV-2RBD的固相载体、生物素标记的ACE2蛋白。
2.根据权利要求1所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述SARS-CoV-2RBD带有His标签。
3.根据权利要求2所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述包被了SARS-CoV-2RBD的固相载体的制备方法为：先将His抗体包被于固相载体中，再连接带有His标签三聚体结构的S蛋白RBD。
4.根据权利要求1到3任一所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照品、阴性对照品、样品稀释液、酶标二抗、显色液、终止液、洗涤液。
5.根据权利要求4所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为链霉亲和素-HRP。
6.根据权利要求4所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述显色液：含2mg/ml TMB、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、0.75％(v/v)过氧化氢。
7.根据权利要求4所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为含0.2％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4。
8.根据权利要求4所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为含2mol/L H2SO4。
9.根据权利要求4所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液。
10.根据权利要求4所述的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为注射新冠疫苗后高表达中和抗体者血清；所述阴性对照品为未感染过新冠病毒及其他冠状病毒，且未接种过新冠疫苗的健康体检者血清的混合物。
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