WO2021169664A1 - 新型冠状病毒抗原及其检测用途 - Google Patents
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Abstract
提供了对2019-nCoV特异性的IgM抗体和总抗体的方法以及确定受试者是否患有2019-nCoV感染的方法，以及用于上述检测的病毒抗原及试剂盒。
Description
本发明涉及病毒学检测领域。具体而言，本发明提供了对2019-nCoV特异性的IgM抗体及总抗体进行测定的方法、以及确定受试者是否患有2019-nCoV感染的方法，以及用于上述检测的病毒抗原及试剂盒。
“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-nCov”。SARS-CoV-2、新型冠状病毒、2019-nCov三者具有相同的含义，在本文中可互换使用。2019-nCoV属于冠状病毒属，冠状病毒是一种包膜的单链RNA病毒，可感染野生动物、宠物，畜群和人类。
冠状病毒属于尼多病毒目冠状病毒科，病毒粒子呈球形或不规则形，有囊膜，大小为80-120nm。该病毒一般包括纤突蛋白(Spike，S)、小包膜蛋白(Envelope，E)、囊膜蛋白(Membrance，M)、核蛋白(Nucleocapsid，N)。根据基因组的结构特点，目前将冠状病毒分为4个属，即α、β、γ和δ。2019-nCoV病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。S蛋白是冠状病毒感染细胞的关键蛋白，携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是惟一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；含有宿主细胞受体识别位点，在决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用。决定病毒的致病性，是病毒毒力的主要决定部分。
现阶段的研究表明，2019-nCoV病毒可通过飞沫、接触和粪口传播，潜伏期一般为3-7天，最长可达21天。其临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。重型病例多在一周后出现呼吸困难、严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重型、危重型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多数在1周后恢复。虽然2019-nCoV病毒致死率不及禽流感和中东MERS病毒，但其传播力非常强。
目前，对2019-nCoV病毒的检测手段主要是荧光PCR法等核酸检测手段，但核酸检测成本较高、操作复杂，整个检测流程耗时2小时以上，而且存在感染人和容易 扩散的风险，需要在生物安全二级以上实验室进行检测，难以满足大规模筛查的需求。因此急需研制安全、高效、便捷的2019-nCoV抗体检测方法。免疫学检测具有较高的敏感性和特异性，且结果易于分析，在流感的控制、扑灭和检疫中用途很大。同时，有报道指出，在SARS病毒感染后出现发烧症状的前10天内使用RT-PCR技术便可检测病人是否感染病毒，但在发病后期使用RT-PCR技术往往会出现假阴性结果，此时血清学检测技术结果更准确。因此，开发能够用于2019-nCoV病毒抗体检测的试剂盒更能便捷有效地对大量血清抗体进行检测。
发明内容
本申请的发明人经过大量的研究后出人意料地发现了特别适用于检测2019-nCoV(SARS-CoV-2)的病毒抗原。基于此，本发明成功地建立了用于测定针对2019-nCoV(SARS-CoV-2)特异性的IgM抗体和总抗体、以及用于确定受试者是否患有2019-nCoV(SARS-CoV-2)感染的方法，该方法重复性好，特异性强，灵敏度高。
病毒抗原多肽
在第一方面，本发明提供了一种分离的多肽，其包含选自下列的氨基酸序列或由其组成：
(i)SEQ ID NO：1所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
本发明还提供了一种融合蛋白，其包含本发明的分离的多肽和另外的多肽。
在某些实施方案中，所述另外的多肽任选地通过接头连接于本发明的多肽的N端或C端。
在某实施方案中，所述另外的多肽选自蛋白标签。在某些实施方案中，所述蛋白标签是本领域熟知的，其实例包括但不限于His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP或Fc等，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，纯化、检测、示踪、增溶或蛋白酶保护等)选择合适的蛋白标签。
本发明的多肽或融合蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方 法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法产生。
因此，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码如上所述的分离的多肽或融合蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
本发明还提供了制备如上所述的分离的多肽或融合蛋白的方法，其包括，在允许所述分离的多肽或融合蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述多肽或融合蛋白。
特别地，可以将本发明的多肽或融合蛋白连接其他功能性单元。
在一个实施方案中，本发明的分离的多肽或融合蛋白带有可检测的标记。
在本文中，“可检测的标记”可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法、免疫胶体金技术等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，
3H、
125I、
35S、
14C或
32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，
)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着 色标记物来检测。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头将如上所述的可检测的标记连接至所述分离的多肽或融合蛋白，以降低潜在的位阻。
在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、胶体金或生物素。在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或胶体金。
在另一个实施方案中，所述分离的多肽或融合蛋白连接于固相载体表面，或者可被用于与固相载体连接。
在本文中，所述的固相载体包括由聚合物材料(例如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素)制成或包被的凹孔平板、试管、珠粒(例如乳胶颗粒)或薄膜(例如硝酸纤维素膜)，或由功能基团(例如氨基、羧基、生物素或亲和素)预包被的磁珠。在某些实施方案中，所述固相载体选自磁珠、微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或硝酸纤维素膜。
将蛋白或多肽包被于固相载体上的方法是本领域熟知的，例如物理吸附、通过氨基化或羧基化表面实现的共价偶联或通过亲和素-生物素系统、聚赖氨酸预包被表面、蛋白A或蛋白G预包被表面实现的介导结合。
因此，为实现本发明的分离的多肽或融合蛋白与固相载体的连接，本发明的分离的多肽或融合蛋白可带有可与固相载体连接的修饰基团。在此情况下，所述固相载体表面带有与修饰基团相应的连接基团。在某些实施方案中，所述修饰基团是生物素或亲和素，相应地，所述固相载体表面带有结合生物素的亲和素或结合亲和素的生物素。
作为另一种选择，本发明的分离的多肽或融合蛋白也可以不带有所述修饰基团，而直接在包被缓冲液(例如，碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或硼酸盐缓冲液)的存在下被包被于固相载体表面。
本发明的另一目的是提供本发明的分离的多肽的应用。
检测2019-nCoV IgM抗体
作为一种选择，本发明的分离的多肽或融合蛋白可用于测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体。
IgM是机体中抗原刺激后出现最早的抗体，因此通常可以作为感染性疾病的早期 诊断指标，并且也是区别新近感染与既往感染的有力证据。由于血清中针对某一抗原的特异性IgM常与特异性IgG同时存在，为避免后者对IgM测定的干扰，多采用捕获法对特异性IgM抗体进行检测，也即先捕获所有血清IgM以去除IgG，随后再测定特异性IgM。
因此，本发明第一方面所述的分离的多肽或融合蛋白可作为检测试剂对被捕获的IgM抗体进行特异性检测，从而通过捕获法来实现对2019-nCoV IgM抗体的测定。通过捕获法来测定样品中的特异性IgM抗体水平是本领域技术人员熟知的。在此类测定中，“捕获试剂”首先与样品中的IgM抗体形成免疫复合物，随后通过“检测抗原”对被捕获的抗体进行检测。
因此，在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含检测试剂，所述检测试剂选自带有可检测的标记的本发明的多肽或融合蛋白。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含捕获试剂，所述捕获试剂选自能够特异性结合IgM的试剂。
在某些实施方案中，所述能够特异性结合IgM的试剂选自抗-IgM(μ链)抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗-IgM抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗-IgM抗体或其抗原结合片段可以是多克隆抗体。在某些示例性实施方案中，所述抗-IgM抗体或其抗原结合片段可以是鼠抗人IgM单克隆抗体或多克隆抗体、羊抗人IgM单克隆抗体或多克隆抗体、兔抗人IgM单克隆抗体或多克隆抗体等等。
在某些实施方案中，所述能够特异性结合IgM的试剂连接于固相载体表面，或者可被用于与固相载体连接。
为实现能够特异性结合IgM的试剂与固相载体的连接，所述能够特异性结合IgM的试剂可带有可与固相载体连接的修饰基团。在此情况下，所述固相载体表面带有与修饰基团相应的连接基团。在某些实施方案中，所述修饰基团是生物素或亲和素，相应地，所述固相载体表面带有结合生物素的亲和素或结合亲和素的生物素。
作为另一种选择，所述能够特异性结合IgM的试剂也可以不带有所述修饰基团，而直接在包被缓冲液(例如，碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或硼酸盐缓冲液)的存在下被包被于固相载体表面。
因此，在某些实施方案中，所述试剂盒可进一步包含用于将所述能够特异性结合IgM的试剂包被于所述固相载体上的包被试剂，例如包被缓冲液(例如，碳酸盐缓冲 液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或硼酸盐缓冲液)。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含固相载体。在某些实施方案中，所述固相载体选自磁珠、微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或硝酸纤维素膜。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用所述捕获试剂和检测试剂来测定来自受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体，并任选地确定所述受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的说明书。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或装置：(i)用于收集或贮存来自受试者的样品的装置(例如采血装置)；(ii)用于进行所述测定所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，封闭液，阳性对照样品，阴性对照样品，用于测定可检测的标记的试剂)；(iii)用于将能够特异性结合IgM的试剂连接于固相载体表面的包被液。
在某些示例性实施方案中，所述测定是酶联免疫法，所述用于进行所述测定所需的其他试剂包含选自下列的一项或多项：阳性对照样品、阴性对照样品(例如含有BSA的缓冲液)、含不低于2.5％表面活性剂的浓缩洗涤液、含过氧化物不低于0.3g/L的显色剂A、含TMB不低于0.2g/L的显色剂B以及含浓度不高于2mol/L硫酸的终止液。
在第三方面，本发明提供了用于测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体的方法，所述测定以捕获法形式进行，其包括：
(1)将所述样品与捕获试剂接触，以获得免疫复合物；所述捕获试剂选自能够特异性结合IgM的试剂；
(2)使用检测试剂并通过免疫学检测来测定步骤(1)获得的免疫复合物(测定所述复合物的存在或其量)；所述检测试剂选自第一方面所述的分离的多肽或融合蛋白。
在本文中，术语“免疫学检测”是指，利用抗原-抗体之间的特异性相互作用/结合亲和力来进行的测定，其一般可用于检测特定抗原或者抗体在样品中的存在或水平。此类免疫学检测是本领域技术人员公知的，包括但不限于，酶免疫测定法(EIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、Western印迹法、免疫比浊法、表面等离子共振法、免疫胶体金技术(ICG)、免疫层析法等。
在某些实施方案中，所述免疫学检测选自酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发 光免疫分析法、荧光免疫分析法、放射免疫测定法、或免疫胶体金技术(ICG)。
在某些实施方案中，所述方法用于测定所述样品中对2019-nCoV特异性的IgM抗体的存在。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，所述检测试剂带有可检测的标记，通过测定所述可检测的标记而实现免疫学检测。
在某些实施方案中，所述方法还包括：(3)将步骤(2)获得的检测值与预定的临界值(cut-off value)进行比较。在某些实施方案中，如果所述检测值不低于该临界值的话，则判断所述样品为2019-nCoV特异性IgM抗体阳性。
在某些实施方案中，所述样品是血液样品，例如全血、血浆或血清。
在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者处于患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的风险中。
在某些实施方案中，所述捕获试剂连接于固相载体表面。
在某些实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法任选地还包含将所述捕获试剂包被于固相载体表面的步骤。在此类实施方案中，所述捕获试剂可以带有可与固相载体连接的修饰基团，也可以不带有修饰基团(而直接被包被于固相载体表面)。
在第四方面，本发明提供了用于确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的方法，其包括：
(i)通过第三方面所述的方法来测定来自所述受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体的水平；和，
(ii)将所述水平与参考值比较，以判断所述受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，所述参考值可以包括阴性参考值，阴性参考值是指来源于未患2019-nCoV感染的对象或健康人(例如，没有可检测到的疾病、和/或没有病毒感染或2019-nCoV感染历史的对象)的相应水平值，或者，通过上述方法对来源于未患2019-nCoV感染的对象或健康人的样品进行检测后获得的值。当与阴性参考值进行比较时，如果步骤(i)获得的水平高于该参考值的话，则判断所述受试者患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，所述参考值可以包括阳性参考值，阳性参考值是指来源于已知患有2019-nCoV感染的对象或患者的相应水平值，或者，通过上述方法对来源于已 知患有2019-nCoV感染的对象或患者的样品进行检测后获得的值。当与阳性参考值进行比较时，如果步骤(i)获得的水平不低于该参考值的话，则判断所述受试者患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，所述方法包括：
(i)通过第三方面所述的方法来测定来自所述受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体的存在；和，
(ii)当检测到所述IgM抗体的存在时，判断所述受试者患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，基于所述样品的检测值(例如吸光度)与预定的临界值的比较，来自受试者的样品被判定为2019-nCoV特异性IgM抗体阳性时，则判断所述受试者患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染(例如，新近感染)。
在某些实施方案中，所述样品是血液样品，例如全血、血浆或血清。
在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者处于患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的风险中。
在某些实施方案中，所述方法还包括：
在步骤(i)之前，提供来自所述受试者的样品；和/或
在步骤(ii)之后，给被判断为患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的受试者施用治疗有效量的可治疗新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的抗病毒疗法(例如抗病毒药物，例如洛匹那韦、利托那韦、干扰素α、阿比多尔、利巴韦林、达芦那韦、考比司他、瑞德西韦、巴洛沙韦酯、法匹拉韦、氯喹、羟氯喹等)。
在第五方面，本发明提供了第一方面所述的分离的多肽或融合蛋白在制备用于测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体或用于确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的试剂盒中的用途。
在某些实施方案中，所述分离的多肽或融合蛋白带有可检测的标记。
在某些实施方案中，所述样品是血液样品，例如全血、血浆或血清。
在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者处于患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的风险中。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含能够特异性结合IgM的试剂，例如抗-IgM抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述能够特异性结合IgM的试剂连接于固相载体表面，或者带有可与固相载体连接的修饰基团(例如生物素或亲和素)。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过第三方面所述的方法来测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过第四方面所述的方法来确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
检测2019-nCoV总抗体
作为另一种选择，本发明的分离的多肽可用于测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的总抗体。所述总抗体是指所述样品中对2019-nCoV特异性的所有抗体，而不限于其中的任何一类，因此包括IgM、IgG、IgA等。
因此，本发明第一方面所述的分离的多肽或融合蛋白可作为捕获试剂捕获样品中的抗2019-nCoV抗体，并亦可作为检测试剂对被捕获的抗2019-nCoV抗体进行检测，从而通过双抗原夹心法来实现对2019-nCoV总抗体的测定。通过双抗原夹心法来测定样品中的特异性抗体水平是本领域技术人员熟知的。在此类测定中，“捕获抗原”、“检测抗原”使得样品抗体在两种特异性抗原之间形成桥，因此，两种抗原通常是相同的、或具有相同的核心表位、或具有免疫交叉反应性，使得一种抗体能够结合两种抗原。
在第六方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含检测试剂，所述检测试剂选自带有可检测的标记的本发明的多肽或融合蛋白。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含捕获试剂，所述捕获试剂选自第一方面所述的分离的多肽或融合蛋白。
在某些实施方案中，所述检测试剂和捕获试剂中所包含的多肽序列(例如第一方面中所述的抗原多肽)相同或基本相同。所述基本相同是指，所述检测试剂和捕获试剂中所包含的两个多肽序列彼此之间相异仅在于一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者彼此之间具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且两个多肽序列均能够被抗2019-nCoV抗体识别并结合。
在某些实施方案中，所述捕获试剂连接于固相载体表面，或者可被用于与固相载体连接。
为实现捕获试剂与固相载体的连接，所述捕获试剂可带有可与固相载体连接的修饰基团。在此情况下，所述固相载体表面带有与修饰基团相应的连接基团。在某些实施方案中，所述修饰基团是生物素或亲和素，相应地，所述固相载体表面带有结合生物素的亲和素或结合亲和素的生物素。
作为另一种选择，所述捕获试剂也可以不带有所述修饰基团，而直接在包被缓冲液(例如，碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或硼酸盐缓冲液)的存在下被包被于固相载体表面。
因此，在某些实施方案中，所述试剂盒可进一步包含用于将所述捕获试剂包被于所述固相载体上的包被试剂，例如包被缓冲液(例如，碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或硼酸盐缓冲液)。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含固相载体。在某些实施方案中，所述固相载体选自磁珠、微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或硝酸纤维素膜。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用所述捕获试剂和检测试剂来测定来自受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体(即，总抗体)，并任选地确定所述受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的说明书。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或装置：(i)用于收集或贮存来自受试者的样品的装置(例如采血装置)；(ii)用于进行所述测定所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，封闭液，阳性对照样品，阴性对照样品，用于测定可检测的标记的试剂)；(iii)用于将捕获试剂连接于固相载体表面的包被液。
在某些示例性实施方案中，所述测定是酶联免疫法，所述用于进行所述测定所需的其他试剂包含选自下列的一项或多项：阳性对照样品、阴性对照样品(例如含有BSA的缓冲液)、含不低于2.5％表面活性剂的浓缩洗涤液、含过氧化物不低于0.3g/L的显色剂A、含TMB不低于0.2g/L的显色剂B以及含浓度不高于2mol/L硫酸的终止液。
在第七方面，本发明提供了用于测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体(即，总抗体)的方法，所述测定以双抗原夹心法形式进行，其包括：
(1)将所述样品与捕获试剂接触，以获得免疫复合物；所述捕获试剂选自第一方面 所述的分离的多肽或融合蛋白；
(2)使用检测试剂并通过免疫学检测来测定步骤(1)获得的免疫复合物(测定所述复合物的存在或其量)；所述检测试剂选自第一方面所述的分离的多肽或融合蛋白。
在某些实施方案中，所述方法用于测定所述样品中对2019-nCoV特异性的抗体的存在。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，所述检测试剂带有可检测的标记，通过测定所述可检测的标记而实现免疫学检测。
在某些实施方案中，所述免疫学检测选自酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、放射免疫测定法、或免疫胶体金技术(ICG)。
在某些实施方案中，所述方法还包括：(3)将步骤(2)获得的检测值与预定的临界值(cut-off value)进行比较。在某些实施方案中，如果所述检测值不低于该临界值的话，则判断所述样品为2019-nCoV特异性抗体阳性。
在某些实施方案中，所述样品是血液样品，例如全血、血浆或血清。
在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者处于患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的风险中。
在某些实施方案中，所述捕获试剂连接于固相载体表面。
在某些实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法任选地还包含将所述捕获试剂包被于固相载体表面的步骤。在此类实施方案中，所述捕获试剂可以带有可与固相载体连接的修饰基团，也可以不带有修饰基团(而直接被包被于固相载体表面)。
在第八方面，本发明提供了用于确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的方法，其包括：
(i)通过第七方面所述的方法来测定来自所述受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体(即，总抗体)的水平；和，
(ii)将所述水平与参考值比较，以判断所述受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，所述参考值可以包括阴性参考值，阴性参考值是指来源于未患2019-nCoV感染的对象或健康人(例如，没有可检测到的疾病、和/或没有病毒感染或2019-nCoV感染历史的对象)的相应水平值，或者，通过上述方法对来源于未患2019-nCoV感染的对象或健康人的样品进行检测后获得的值。当与阴性参考值进行比 较时，如果步骤(i)获得的水平高于该参考值的话，则判断所述受试者患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，所述参考值可以包括阳性参考值，阳性参考值是指来源于已知患有2019-nCoV感染的对象或患者的相应水平值，或者，通过上述方法对来源于已知患有2019-nCoV感染的对象或患者的样品进行检测后获得的值。当与阳性参考值进行比较时，如果步骤(i)获得的水平不低于该参考值的话，则判断所述受试者患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，所述方法包括：
(i)通过第七方面所述的方法来测定来自所述受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体的存在；和，
(ii)当检测到所述抗体的存在时，判断所述受试者患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，基于所述样品的检测值(例如吸光度)与预定的临界值的比较，来自受试者的样品被判定为2019-nCoV特异性抗体阳性时，则判断所述受试者患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
在某些实施方案中，所述样品是血液样品，例如全血、血浆或血清。
在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者处于患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的风险中。
在某些实施方案中，所述方法还包括：
在步骤(i)之前，提供来自所述受试者的样品；和/或
在步骤(ii)之后，给被判断为患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的受试者施用治疗有效量的可治疗新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的抗病毒疗法(例如抗病毒药物，例如洛匹那韦、利托那韦、干扰素α、阿比多尔、利巴韦林、达芦那韦、考比司他、瑞德西韦、巴洛沙韦酯、法匹拉韦、氯喹、羟氯喹等)。
在第九方面，本发明提供了第一方面所述的分离的多肽或融合蛋白在制备用于测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体(即，总抗体)或用于确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的试剂盒中的用途。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含捕获试剂和检测试剂，其中所述捕获试剂选自第一方面所述的分离的多肽或融合蛋白，所述检测试剂选自带有可检测标记的分离 的多肽或融合蛋白。
在某些实施方案中，所述捕获试剂连接于固相载体表面，或者带有可与固相载体连接的修饰基团(例如生物素或亲和素)。
在某些实施方案中，所述样品是血液样品，例如全血、血浆或血清。
在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者处于患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的风险中。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过第七方面所述的方法来测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体(即总抗体)。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过第八方面所述的方法来确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
本发明首次发现了特别适用于检测2019-nCoV的病毒抗原，基于此，本发明进一步成功地建立了用于测定针对2019-nCoV特异性的IgM抗体和总抗体、以及用于确定受试者是否患有2019-nCoV感染的方法及试剂盒。与其他病毒抗原序列相比，基于本发明的病毒抗原序列的检测方法及试剂盒可显著提高2019-nCoV抗体的检测效率，重复性好，特异性强，灵敏度高，对2019-nCoV感染的筛查具有重要临床意义，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
图1：胶体金法的检测结果判定示意图。
序列信息
实施例1：用于测定2019-nCoV IgM抗体的检测试剂盒及方法(酶联免疫法)
1.1检测试剂盒的制备
检测试剂盒包含：包被有抗人IgM的96孔酶标板、辣根过氧化物酶标记的2019-nCoV-Ag酶标试剂、PBS缓冲液、含2019-nCoV-IgM阳性原料的阳性对照、阴性对照、含不低于2.5％表面活性剂的浓缩洗涤液、含过氧化物不低于0.3g/L的显色剂A、含TMB不低于0.2g/L的显色剂B以及含浓度不高于2mol/L硫酸的终止液。
阴性对照：BSA 0.5g/L，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na
2HPO
4 4.3mmol/L，KH
2PO
4 1.4mmol/L。
浓缩洗涤液：TWeen-20 30ml/L，NaCl 2mol/L，KCl 54mmol/L，Na
2HPO
4 80mmol/L，KH
2PO
4 28mmol/L。
显色液A：醋酸钠27.2g/L，柠檬酸3.2g/L，30％双氧水0.6ml/L。
显色液B：乙二胺四乙酸二钠0.4g/L,柠檬酸2g/L,甘油100ml/L,0.3g/L TMB。
终止液：硫酸2mol/L。
抗人IgM的96孔酶标板的制备：
1.将鼠抗人IgM(μ链)(北京万泰生物药业股份有限公司)用1×PBS缓冲液配制成包被液。在载体板材中100ul/孔放置2-8℃过夜。
2.用200/孔含0.1％BSA的PBS缓冲液2-8℃封闭过夜。
3.弃掉封闭液，在干燥环境晾干。放入干燥剂铝箔袋封装。
辣根过氧化物酶标记的2019-nCoV-Ag酶标试剂的制备：
1.将包含SEQ ID NO：1和蛋白标签的2019-nCoV-Ag融合蛋白透析到CB(pH9.6，50mM)中，换液2次以上。
2.配置HRP的ddH
2O溶液和NaIO
4的ddH
2O溶液。
3.将NaIO
4溶液与HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min。
4.将乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min。
5、将氧化好的HRP直接加入到已透析充分的病毒抗原蛋白中。
6、继续透析到CB(pH9.6，50mM)中，换液2次以上。
7、加入NaBH
4到其中，4℃静置2小时。
8、1×PBS缓冲液过夜，标记液中加入等体积比50％的甘油，混匀后置于-20℃保存。
1.2检测方法
1.配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。
2.编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。(用双波长检测时，可不设空白对照孔)。
3.加稀释液：每孔加入样品稀释液100μl，阴、阳性对照孔和空白孔除外。
4.加样：分别在相应孔中加入血清或血浆样品10μl，阴、阳性对照各100μl，轻轻振荡混匀。
5.温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。
6.洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
7.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
8.温育：操作同5。
9.洗板：操作同6。
10.显色：每孔加入显色剂A、B液各50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟。
11.测定：每孔加终止液50μl，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处(或用双波长450nm/600～650nm检测)，用空白孔调零点后测定各孔A值。
检测结果的判定：
1.阴性对照的正常范围：阴性对照孔A值≤0.1(若有一孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复实验)。
2.阳性对照的正常范围：阳性对照孔A值≥0.8。
3.临界值(CUTOFF)计算：临界值＝阴性对照孔A值均值
(阴性对照孔低于0.05者以0.05计算)。阳性判定：样品A值≥临界值(CUTOFF)者为2019- nCoV-IgM抗体阳性；阴性判定：样品A值＜临界值(CUTOFF)者为2019-nCoV-IgM抗体阴性。
1.3检测性能评价
(1)将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自湖北地区的49例确诊病例及2例阴性病例进行血浆样本2019-nCoV IgM抗体的检测。在49例确诊病例中，44例病例分别收集1份血浆样本，5份病例分别收集两个不同时期2份血浆样本，所以本次试验确诊病例收集的血浆样本共54份。考核试剂检出47例阳性病例，考核试剂与确诊病例相比较的检出率为95.92％(47/49)。在2例阴性病例中，包含1例受试者的1份样本及1例受试者两个不同时期的2份样本，共3份阴性样本。考核试剂检测3份阴性样本的结果均为阴性。
(2)将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自浙江地区的81例新型冠状病毒感染肺炎确诊病例的不同发病时间312份血清样本及300例其它病例的300份血清样本进行2019-nCoV IgM抗体的检测。
将考核试剂的检测结果与临床确诊/排除结果进行列联表分析(列四格表)，进行Kappa一致性检验。结果显示，考核试剂的灵敏度为91.36％(95％置信区间为83.00％-96.45％),特异性为100.00％(95％置信区间为96.38％-100.00％)，准确度为98.16％(95％置信区间为96.25％-99.26％)，Kappa值0.94，一致性强度为最强。
(3)不同发病时间样本的检测结果分析：
将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自广东地区的新型冠状病毒感染肺炎确诊病例的不同发病时间的血浆样本进行2019-nCoV IgM抗体的检测，并将检测结果与(2)中不同发病时间样本的检测结果合并，结果如下表所示。
表2：不同发病时间样本的检测情况
由上表可以看出，考核试剂在发病早期(第7天前)检出率为15％-40％，随着发病时间的推移，发病7天后可达40％-80％，发病15天后可达80％-95％。按照不同的发病时间分段，在发病极早期(≤3天)和早期(4-7天)，分别有5例和13例患者核酸检测阴性，考核试剂可以检出其中的2例(40％)和6例(46％)；在发病中期(8-14天)和后期(≥15天)，核酸检测阴性的患者分别有29例和23例，考核试剂可分别检出24例和21例。
上述结果表明，基于酶联免疫法IgM抗体检测可用于2019-nCoV感染的筛查，且对核酸检测具有良好的互补作用。
实施例2：用于测定2019-nCoV总抗体的检测试剂盒及方法(酶联免疫法)
2.1检测试剂盒的制备
检测试剂盒包含：包被有包含SEQ ID NO：1和蛋白标签的2019-nCoV-Ag融合蛋白的96孔酶标板、辣根过氧化物酶标记的2019-nCoV-Ag酶标试剂、PBS缓冲液、含2019-nCoV抗体阳性原料的阳性对照、阴性对照、含不低于2.5％表面活性剂的浓缩洗涤液、含过氧化物不低于0.3g/L的显色剂A、含TMB不低于0.2g/L的显色剂B以及含浓度不高于2mol/L硫酸的终止液。
阴性对照：BSA 0.5g/L，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na
2HPO
4 4.3mmol/L，KH
2PO
4 1.4mmol/L。
浓缩洗涤液：TWeen-20 30ml/L，NaCl 2mol/L，KCl 54mmol/L，Na
2HPO
4 80mmol/L，KH
2PO
4 28mmol/L。
显色液A：醋酸钠27.2g/L，柠檬酸3.2g/L，30％双氧水0.6ml/L。
显色液B：乙二胺四乙酸二钠0.4g/L，柠檬酸2g/L，甘油100ml/L，0.3g/L TMB。
终止液：硫酸2mol/L。
包被有2019-nCoV-Ag的96孔酶标板的制备：
1.将包含SEQ ID NO:1和蛋白标签的2019-nCoV抗原融合蛋白(厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心)用1×PBS缓冲液配制成包被液。在载体板材中100ul/孔放置2-8℃过夜。
2.用200/孔含0.1％BSA的PBS缓冲液2-8℃封闭过夜。
3.弃掉封闭液，在干燥环境晾干。放入干燥剂铝箔袋封装。
辣根过氧化物酶标记的2019-nCoV-Ag酶标试剂的制备：
1.将包含SEQ ID NO:1和蛋白标签的2019-nCoV抗原融合蛋白透析到CB(pH9.6，50mM)中，换液2次以上。
2.配置HRP的ddH
2O溶液和NaIO
4的ddH
2O溶液。
3.将NaIO
4溶液与HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min。
4.将乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min。
5、将氧化好的HRP直接加入到已透析充分的病毒抗原蛋白中。
6、继续透析到CB(pH9.6，50mM)中，换液2次以上。
7、加入NaBH
4到其中，4℃静置2小时。
8、1×PBS缓冲液过夜，标记液中加入等体积比50％的甘油，混匀后置于-20℃保存。
2.2检测方法
1.配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。
2.编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。(用双波长检测时，可不设空白对照孔)。
3.加样：分别在相应孔中加入待测样品100μL，阴、阳性对照各50μL。
4.温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。
5.洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
7.温育：操作同4。
8.洗板：操作同5。
9.显色：每孔加入显色剂A、B液各50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟。
10.测定：每孔加终止液50μl，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处(或用双波长450nm/600～650nm检测)，用空白孔调零点后测定各孔A值。
检测结果的判定：
1.阴性对照的正常范围：阴性对照孔A值≤0.1(若有一孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复实验)。
2.阳性对照的正常范围：阳性对照孔A值≥0.19。
3.临界值(CUTOFF)计算：临界值＝0.16+阴性对照孔A值均值(阴性对照孔低于0.03者以0.03计算)。阳性判定：样品A值≥临界值(CUTOFF)者为2019-nCoV抗体阳性；阴性判定：样品A值＜临界值(CUTOFF)者为2019-nCoV-抗体阴性。
2.3检测性能评价
(1)将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自湖北地区的49例确诊病例进行血浆样本2019-nCoV总抗体的检测。
在49例确诊病例中，44例病例分别收集1份血浆样本，5例病例分别收集两个不同时期2份血浆样本，所以本次试验确诊病例收集的血浆样本共54份。考核试剂检出49例阳性病例，考核试剂与确诊病例相比较的检出率为100.00％(49/49)。其中1例受试者两个不同时期的2份样本考核试剂检测结果为1份阴性、1份阳性，将此结果判为考核试剂检测阳性结果。
(2)将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自浙江地区的81例新型冠状病毒感染肺炎确诊病例的不同发病时间312份血清样本及300例其它病例的300份血清样本进行2019-nCoV总抗体的检测。
将考核试剂的检测结果与临床确诊/排除结果进行列联表分析(列四格表)，进行Kappa一致性检验。结果显示，考核试剂的灵敏度为96.30％(95％置信区间为89.56％-99.23％),特异性为100％(95％置信区间为96.38％-100.00％)，准确度为 99.21％(95％置信区间为99.72％-99.84％)，Kappa值0.98，一致性强度为最强。
(3)不同发病时间样本的检测情况：
将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自广东地区的新型冠状病毒感染肺炎确诊病例的不同发病时间的血浆样本进行2019-nCoV总抗体的检测，并将检测结果与(2)中不同发病时间样本的检测结果合并，结果如下表所示。
表3：不同发病时间样本的检测情况
考核试剂在发病早期(第7天前)检出率为20％-50％，发病12天后超过90％，发病15天后几乎100％检出。按照不同的发病时间分段，在发病极早期(≤3天)和早期(4-7天)，分别有5例和13例患者核酸检测阴性，考核试剂可以检出其中的2例(40％)和6例(46％)；在发病中期(8-14天)和后期(≥15天)，核酸检测阴性的患者分别有29例和23例，考核试剂均可检出，检测阳性率高达100％。
上述结果表明，基于酶联免疫法的总抗体检测可用于2019-nCoV感染的筛查，且对核酸检测具有良好的互补作用。
实施例3：用于测定2019-nCoV IgM抗体的检测试剂盒及方法(胶体金法)
3.1检测试剂盒的制备
检测试剂盒包含：金标新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原的玻璃纤维、包被有抗-人IgM(抗μ链)的硝酸纤维素膜、玻璃纤维、塑料背衬、含磷酸盐缓冲液样本稀释液等组成。
样本稀释液：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na
2HPO
4 4.3mmol/L，KH
2PO
4 1.4mmol/L。
包被有抗-人IgM(抗μ链)的硝酸纤维素膜的制备：
1检测线包被原料鼠抗人IgM(μ链)(北京万泰生物药业股份有限公司)采用PBS缓冲液配制成检测线包被液；对照线包被原料采用PBS缓冲液配制成对照线包被液。
2.取检测线包被液在硝酸纤维素膜上包被检测线；取对照线包被液在硝酸纤维素膜上包被对照线。
3.将包被好的硝酸纤维素膜充分干燥装入铝箔袋内，机器封口。
金标新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原的玻璃纤维的制备：
1.将金标原料包含SEQ ID NO:1和蛋白标签的2019-nCoV抗原融合蛋白(厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心)与胶体金溶液混合，加入封闭液封闭后获得金标溶液。
2.将金标溶液加至玻璃纤维上，充分干燥后装入铝箔袋内，机器封口。
3.2检测方法
室温下，在检测卡加样孔处加入10μL血清或血浆待测样本，之后滴加2滴样本稀释液，平置于台面上，加样后15分钟观察结果。
检测结果的判定如图1所示。A：对照线显色，且检测线也显色，结果判定为阳性。B：对照线显色，而检测线不显色，结果判定为阴性。C：对照线不显色，此情况下无论检测线是否显色，均判为无效实验，需重复实验。
3.3检测性能评价
(1)将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自湖北地区的49例确诊病例及5例阴性病例进行血浆样本2019-nCoV IgM抗体的检测。
在49例确诊病例中，44例病例分别收集1份血浆样本，2份病例分别收集两个不 同时期2份血浆样本，所以本次试验收集确诊病例的血浆样本共40份。考核试剂检出45例阳性病例，考核试剂与确诊病例相比较的检出率为91.84％(45/49)。在5例阴性病例中，包含3例受试者3份样本及1例受试者两个不同时期的2份样本，共5份阴性样本。考核试剂检测5份阴性样本的结果均为阴性。
(2)将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自浙江地区的90例新型冠状病毒感染肺炎确诊病例的不同发病时间312份血清样本和49份全血样本，及308例其它病例的209份血清样本和99份全血样本进行2019-nCoV IgM抗体的检测。
将考核试剂的检测结果与临床确诊/排除结果进行列联表分析(列四格表)，进行Kappa一致性检验。结果显示，考核试剂的灵敏度为93.33％(95％置信区间为86.05％-97.51％),特异性为98.70％％(95％置信区间为96.71％-99.65％)，准确度为97.49％(95％置信区间为95.43％-98.79％)，Kappa值0.93，一致性强度为最强。
对(2)中检测结果按不同发病时间进行分析，结果如下表所示。
表4：不同发病时间样本的检测情况
从不同发病时间的样本检测情况来看，随着发病时间的推移，发病10天后考核试剂的检出率迅速上升，13天后可达80％-90％。以上结果表明，基于胶体金法的IgM抗体检测亦可用于2019-nCoV感染的筛查。
实施例4：用于测定2019-nCoV总抗体的检测试剂盒及方法(胶体金法)
4.1检测试剂盒的制备
检测试剂盒包含：由含金标2019-nCoV Ag的玻璃纤维、包被有2019-nCoV Ag的硝酸纤维素膜、玻璃纤维、塑料背衬、含磷酸盐缓冲液样本稀释液等组成等组成。
样本稀释液：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na
2HPO
4 4.3mmol/L，KH
2PO
4 1.4mmol/L。
包被有2019-nCoV Ag的硝酸纤维素膜的制备：
1、检测线包被原料包含SEQ ID NO:1和蛋白标签的2019-nCoV抗原融合蛋白采用PBS缓冲液配制成检测线包被液；对照线包被原料采用PBS缓冲液配制成对照线包被液。
2、取检测线包被液在硝酸纤维素膜上包被检测线；取对照线包被液在硝酸纤维素膜上包被对照线。
3、将包被好的硝酸纤维素膜充分干燥装入铝箔袋内，机器封口。
金标新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原的玻璃纤维的制备：
1、将金标原料包含SEQ ID NO:1和蛋白标签的2019-nCoV抗原融合蛋白(厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心)与胶体金溶液混合，加入封闭液封闭后获得金标溶液。
2、将金标溶液加至玻璃纤维上，充分干燥后装入铝箔袋内，机器封口。
4.2检测方法
室温下，在检测卡加样孔处加入10μL血清或血浆待测样本，之后滴加2滴样本稀释液，平置于台面上，加样后15分钟观察结果。
检测结果的判定如图1所示。A：对照线显色，且检测线也显色，结果判定为阳性。B：对照线显色，而检测线不显色，结果判定为阴性。C：对照线不显色，此情况下无论检测线是否显色，均判为无效实验，需重复实验。
4.3检测性能评价
(1)将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自湖北地区的49例确诊病例及1例阴性病例进行血浆样本2019-nCoV总抗体的检测。
在49例确诊病例中，44例病例分别收集1份血浆样本，5份病例分别收集两个不 同时期2份血浆样本，所以本次试验收集的确诊病例血浆样本共54份。考核试剂检出48例阳性病例，考核试剂与确诊病例相比较的检出率为97.96％(48/49)。其中，1例受试者两个不同时期的2份样本考核试剂检测结果为1份阴性、1份阳性，将此结果判为考核试剂检测阳性结果。阴性样本包括1例阴性病例的1份阴性样本，考核试剂检测结果为阴性。
(2)将上述检测试剂盒作为考核试剂对来自浙江地区的90例新型冠状病毒感染肺炎确诊病例的不同发病时间312份血清样本和49份全血样本，及308例其它病例的209份血清样本和99份全血样本进行2019-nCoV总抗体的检测。
将考核试剂的检测结果与临床确诊/排除结果进行列联表分析(列四格表)，进行Kappa一致性检验。结果显示，考核试剂的灵敏度为100.00％(95％置信区间为95.98％-100.00％),特异性为96.75％(95％置信区间为94.11％-98.43％)，准确度为97.49％(95％置信区间为95.43％-98.79％)，Kappa值0.93，一致性强度为最强。
对(2)中检测结果按不同发病时间进行分析，结果如下表所示。
表5：不同发病时间样本的检测情况
从不同发病时间的样本检测情况来看，考核试剂在发病早期(第7天前)检出率为40％-60％，随着发病时间的推移，发病10天后超过90％。以上结果表明，基于胶 体金法的总抗体检测亦可用于2019-nCoV感染的筛查。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (22)
- 分离的多肽，其包含选自下列的氨基酸序列或由其组成：(i)SEQ ID NO：1所示的序列；(ii)与SEQ ID NO：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
- 权利要求1所述的分离的多肽，其带有可检测的标记；优选地，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、胶体金或生物素。
- 权利要求1所述的分离的多肽，其结合于固相载体表面，或者带有可与固相载体结合的修饰基团；优选地，所述修饰基团是生物素或亲和素；优选地，所述固相载体选自磁珠、微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或硝酸纤维素膜。
- 融合蛋白，其包含权利要求1所述的分离的多肽和另外的多肽；优选地，所述另外的多肽任选地通过接头连接至权利要求1所述的分离的多肽的N端或C端；优选地，所述另外的多肽选自蛋白标签，例如His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP或Fc。
- 权利要求4所述的融合蛋白，其带有可检测的标记；优选地，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、胶体金或生物素。
- 权利要求4所述的融合蛋白，其结合于固相载体表面，或者带有可与固相载体结合的修饰基团；优选地，所述修饰基团是生物素或亲和素；优选地，所述固相载体选自磁珠、微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或硝酸纤维素膜。
- 分离的核酸分子，其包含编码权利要求1所述的分离的多肽或权利要求4所述的融合蛋白的核苷酸序列。
- 载体，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子。
- 宿主细胞，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子或权利要求8所述的载体。
- 试剂盒，其包含权利要求1-3任一项所述的分离的多肽或权利要求4-6任一项所述的融合蛋白。
- 权利要求10所述的试剂盒，其包含检测试剂，所述检测试剂选自权利要求2所述的分离的多肽或权利要求5所述的融合蛋白。
- 权利要求11所述的试剂盒，其还包含捕获试剂，所述捕获试剂选自能够特异性结合IgM的试剂；优选地，所述能够特异性结合IgM的试剂选自抗-IgM抗体或其抗原结合片段；优选地，所述能够特异性结合IgM的试剂结合于固相载体表面，或者带有可与固相载体结合的修饰基团(例如生物素或亲和素)；优选地，所述固相载体选自磁珠、微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或者硝酸纤维素膜；优选地，所述试剂盒还包含使用所述捕获试剂和检测试剂来测定来自受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体，并任选地确定所述受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的说明书。
- 权利要求11所述的试剂盒，其还包含捕获试剂，所述捕获试剂选自权利要求1所述的分离的多肽或权利要求4所述的融合蛋白；优选地，所述捕获试剂选自权利要求3所述的分离的多肽或权利要求6所述的融合蛋白；优选地，所述试剂盒还包含使用所述捕获试剂和检测试剂来测定来自受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体，并任选地确定所述受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的说明书。
- 权利要求10-13任一项所述的试剂盒，其还包含一种或多种选自下列的试剂或装置：(i)用于收集或贮存来自受试者的样品的装置(例如采血装置)；(ii)用于进行所述测定所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，封闭液，阳性对照样品，和/或阴性对照样品)。
- 权利要求1-3任一项所述的分离的多肽或权利要求4-6任一项所述的融合蛋白在制备用于测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体和/或用于确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的试剂盒中的用途；优选地，所述样品是血液样品，例如全血、血浆或血清；优选地，所述受试者是人。
- 权利要求15所述的用途，其中，所述试剂盒包含检测试剂和捕获试剂，所述检测试剂选自权利要求2所述的分离的多肽或权利要求5所述的融合蛋白，所述捕获试剂选自能够特异性结合IgM的试剂；优选地，所述能够特异性结合IgM的试剂选自抗-IgM抗体或其抗原结合片段；优选地，所述能够特异性结合IgM的试剂结合于固相载体表面；优选地，所述固相载体选自磁珠、微量滴定板(例如微孔板或酶标板)或硝酸纤维素膜。
- 权利要求16所述的用途，其中，所述试剂盒通过下述方法来测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体：(1)将所述样品与所述捕获试剂接触，以获得免疫复合物；(2)使用所述检测试剂并通过免疫学检测来测定步骤(1)获得的免疫复合物；优选地，所述免疫学检测选自酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、放射免疫测定法、或免疫胶体金技术。
- 权利要求17所述的用途，其中，所述试剂盒通过下述方法来确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染：(i)通过权利要求17中所述的方法来测定来自所述受试者的样品中对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的IgM抗体的水平；和，(ii)将所述水平与参考值比较，以判断所述受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
- 权利要求1-3任一项所述的分离的多肽或权利要求4-6任一项所述的融合蛋白在制备用于测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体和/或用于确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的试剂盒中的用途；优选地，所述样品是血液样品，例如全血、血浆或血清；优选地，所述受试者是人。
- 权利要求19所述的用途，其中，所述试剂盒包含捕获试剂和检测试剂，其中所述捕获试剂选自权利要求3所述的分离的多肽或权利要求6所述的融合蛋白，所述检测试剂选自权利要求2所述的分离的多肽或权利要求5所述的融合蛋白。
- 权利要求20所述的用途，其中，所述试剂盒通过下述方法来测定来自受试者的样品中的对新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性的抗体：(1)将所述样品与所述捕获试剂接触，以获得免疫复合物；(2)使用所述检测试剂并通过免疫学检测来测定步骤(1)获得的免疫复合物；优选地，所述免疫学检测选自酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、放射免疫测定法、或免疫胶体金技术。
- 权利要求21所述的用途，其中，所述试剂盒通过下述方法来确定受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染：(i)通过权利要求21中所述的方法来测定来自所述受试者的样品中对新型冠状病毒 (2019-nCoV)特异性的抗体的水平；和，(ii)将所述水平与参考值比较，以判断所述受试者是否患有新型冠状病毒(2019-nCoV)感染。
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