WO2021227994A1 - 一种采用血管紧张素转化酶ii（ace2）检测冠状病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到利用配体-受体相互作用，即冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与血管紧张素转化酶II(ACE2)的强结合作用，对冠状病毒颗粒以及其刺突蛋白或者任何含RBD的刺突蛋白片段进行检测或定量分析的方法。作为传统免疫分析方法中所必须的抗体的替代物，ACE2可用于包被固相表面以捕获或富集被测物，它也可以与参与信号产生的标记物相偶联。取决于被测物性质和信号模式，ACE2可以单独作为被测物识别体使用，也可以与抗体联合使用。
Description
本发明属于冠状病毒检测方法领域。
2019年底爆发的，并确定为由一种新型冠状病毒引起的肺炎被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)命名为COVID-19。病毒在全球范围的快速传播及其引起的数百万人的感染以及数十万人的死亡成为人类历史上的又一起重大公共卫生事件。由于COVID-19的病原体与2003年爆发的急性呼吸窘迫综合征(SARS)的病原体SARS-CoV病毒属于同一家族(beta冠状病毒属，基因组为线性单股正链RNA)，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses)将其命名为SARS-CoV-2。在过去已知的六种病毒，即，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV，以及引发中东呼吸综合征MERS-CoV之后，成为第七种可以感染人的冠状病毒。
SARS-CoV-2的包膜直径约85纳米，其冠状刺突蛋白(Spike蛋白，简称为S蛋白，见图一)约20纳米长。大量的研究已经证明，SARS-CoV-2与SARS的病原体SARS-CoV一样，是通过S蛋白结合相同的受体-血管紧张素转化酶II(ACE2)，并在跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)的协助下，而入侵人体细胞的。S蛋白是个三聚体，由S1和S2两个亚基组成。S1亚基形成冠状刺突的顶部，而S2亚基锚定(anchored)在病毒包膜上。S1亚基上的受体结合域RBD(receptor binding domain，RBD，见图一右边)与人体细胞表面受体ACE2结合后，由于蛋白酶TMPRSS2的作用，S蛋白的特定位点被切开，导致病毒包膜与细胞膜的融合，从而让病毒进入细胞，受体结合域RBD由223个氨基酸组成，分子量为25kDa。
ACE2由805个氨基酸组成，其分子量为91kDa。它在人体的几乎所有器官,如口鼻粘膜、鼻咽、肺、胃、小肠、结肠、皮肤、淋巴结、胸腺、骨髓、脾、肝、肾、脑以及睾丸等的内皮细胞和平滑肌细胞上均有表达，并在肺部组织和小肠组织表达最丰富。ACE2可以从细胞表面裂解，以可溶性酶的形式存在于人体内，但可溶性ACE2的生理意义目前尚不清楚。2003年SARS发生后，ACE2被确认为SARS-CoV进入人体并进攻人体其它器官的靶点。SARS-CoV-2的基因序列与SARS-CoV有较高的相似度，但就配体-受体结合能力讲，SARS-CoV-2和SARS-CoV有所不同。对SARS-CoV-2的RBD与ACE2的结合动力学研究表明，其与ACE2结合的平衡解离常数为K
D＝4.674×10
-9M或14.7×10
-9M。这一量级的平衡解离常数表明SARS-CoV-2与ACE2的结合能力比SARS-CoV与ACE2 的结合约强十倍。这一超强的配体(RBD)-受体(ACE2)结合能力从一定程度地解释了SARS-CoV-2的更快速传播和更大的危害。另一方面，这一超强的配体-受体结合能力也为病毒检测和COVID-19的诊断和预后提供了新的思路。
自COVID-19爆发以来，用于COVID-19病原学诊断的技术手段是基于病毒的核酸检测和人体免疫反应产生的抗体的检测。前者通过咽拭子或鼻拭子采集人体呼吸道(鼻腔或者咽部)分泌物作为样本进行病毒核酸特异基因检测和病毒基因组测序，而后者通过采集血液标本检测血液中由于病毒感染而可能产生的抗体(IgM、IgA和IgG)。由于采样方法、采样时间以及检测技术本身在特异性和敏感性方面的局限，目前任何一种单一检测方法都不能对病毒本身、人体是否感染以及感染后的状况作出全面和百分之百正确的判断，给疾病的防控和病人的预后带来不便。随着感染和病患人数的进一步快速上升以及对SARS-CoV-2在未来可能与人类长期共存的担忧的加剧，发展多种技术手段进行诊断和分析是一件即紧迫又具有长期价值的事情。
对比针对由病原体引起的传染性疾病的长期实践以及目前面临COVID-19大流行时的应对措施，一个明显的技术短缺是对病毒抗原(antigen)物质(如S蛋白和其片段)以及病毒粒子或病毒体(virion)本身的检测。这种状况与针对SARS-CoV-2的、兼具高亲和性和高选择性的特异性抗体的缺失有关。
对比通常的抗体-抗原反应结合常数(或平衡解离常数)，我们发现，人体ACE2受体与SARS-CoV-2的S蛋白的结合能力与大多数抗体-抗原反应相当，它可以替代抗体，作为基于生物亲和性原理的生物分析方法中的被测物识别体(recognition partner)用于捕获病毒抗原或病毒粒子，或者与已经捕获(或者固定于固相表面)的病毒抗原或病毒粒子结合。因此，基于生物亲和性原理和ACE2与SARS-CoV-2的S蛋白的高亲和性，本发明披露一种采用ACE2替代传统免疫分析中的抗体建立病毒抗原物质以及病毒粒子或病毒体本身的检测方法。
发明内容
基于生物亲和性原理的生物分析方法广泛应用于科学研究、临床诊断、药物研发以及环境与食品监控等领域。基于被测体系(来自人体、动物体、环境、食物或科学研究中制备的标本或样本)和被测物(化学物质、生物活性物质、遗传性物质、微生物体、生物组织等) 的性质的不同，检测体系的构造和检测信号的模式有很多。但其基本的、共性的做法包括选择一个或多个可与被测体系中的被测物特异性结合的识别体(化学物质、生物活性物质、遗传性物质、微生物体、生物组织等)，并利用被测物和识别体在人为设定的环境(液相、气相或固相表面)条件下特异性结合而形成检测体系。
在应用于核酸检测的各种分子诊断技术中，识别体是可与被测核酸系列(部分或全部)互补的核酸，而在免疫分析中，识别体是用于检测抗原的抗体以及用于检测抗体的抗原。高灵敏度和高特异性的生物分析要求识别体对被测物具有高的结合能力以及高的选择性。如果结合能力高，被测物能够被检测出来的量或浓度就低；而如果选择性高，样本中的其它非被测物被误作为被测物的可能性就低。因此，在发展分析或检测方法时，选择被测物的识别体是决定该方法的分析性能的重要因素。
被测物的识别体(一个或多个)确定以后，可以建立基于各种各样信号模式的检测方法。所谓“信号模式”中的信号可以来自于标记在识别体(在某些情况下，也可以是体系中人为添加的外加被测物)上的标记物(label)或标记物在人为设定的环境中参与物理、化学反应或生物化学反应而产生的信号。在某些情况下，“信号模式”中的信号也可以是直接来自于被测物与识别体的特异性结合这一事件引起的物理化学信号变化。前者被称为基于标记的生物亲和性分析，后者被称为非标记生物亲和性分析。图二是在免疫分析中常见的一些基于标记和非标记的检测方法。
非标记生物亲和性分析方法(如基于表面等离子体共振、光学干涉、石英晶体表面质量变化等信号检测原理的各种方法)主要用于生命科学研究和药物开发(研究药物分子与靶标蛋白的相互作用)领域。利用大量抗体和抗原相结合聚集成大颗粒引起光散射效应变化而进行的生物分析可视为非标记生物亲和性分析方法在临床医学领域应用的一个例子(图二)。
但在临床免疫分析中，绝大多数的方法所检测的信号来自于标记物或标记物参与在人为设定的环境中的物理、化学或生物化学反应过程时产生的信号。在标记物是放射性同位素(如在放射免疫分析中)、纳米金颗粒(如在侧向流免疫层析法中)或磁性物质颗粒(如在侧向流免疫层析法中)等情况时，被检测的信号(放射性强度、颜色或磁性强度)来自于标记物本身。而在标记物是荧光或磷光物质(如量子点、稀土长寿命磷光分子或微球、荧光分子或微球等)、化学发光物质、电化学发光物质以及酶等情况下，信号自于标记物经历物理过程(如外部光激发)、化学反应过程(如没有酶参与的化学发光)、电化学反应过程(如电化学发光)以及生物化学反应过程(有酶参与的化学发光)时产生的信号。图三列出了在临床免疫分析中 常见的、以发光信号为检测信号模式的方法中参与发光过程的标记物和关键物质(图三虚线框内)。
上述所有用于临床医学、生命科学研究和药物研发的分析方法(图二和图三)在过去都已很好地建立起来，并在具体的相关领域有不同程度的应用。本发明的重点不在于对这些方法或原理中的信号产生机制或信号检测原理进行改进。
本发明的重点在于改变临床免疫分析中的被测物识别体，并将其应用于上述检测方法。不同于传统上基于抗体-抗原反应构造的检测体系，本发明采用具有高亲和性的ACE2受体构建SARS-CoV-2病毒和其抗原检测体系。严格地讲，当采用ACE2(而不是抗体)作为样本中的被测物(S蛋白的RBD)识别体时，本发明涉及的分析方法已经不是免疫分析了。但在本发明的某些实施例中，ACE2和抗体可以共同作为被测物识别体，用于SARS-CoV-2的抗原物质和病毒粒子的检测。
作为基于生物亲和性原理的分析方法中SARS-CoV-2的S蛋白RBD识别体，本发明披露了使用ACE2作为被测物识别体替代常规免疫分析方法中的抗体的实施例。这些实施例不受样本或标本类型限制，既包括鼻/咽拭子样本、唾液、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、血液、尿液、眼泪等常规临床标本，也包括气溶胶、空气、粉尘以及从固相表面通过擦拭或淋洗而收集或富集的样本。
传统上基于抗体-抗原反应构造的免疫分析大多数是非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)。在非均相免疫分析体系和程序中，涉及到固相表面(孔底或内壁、反应器内壁、磁微粒表面等)参与捕获被测物或被测物与识别体形成的复合物的环节，这一环节具有捕获、富集、分离等多个功能。均相免疫分析(homogeneous immunoassay)不涉及固相表面的参与，在某些应用中具有优势。免疫分析一般限于抗原和抗体的检测，其用于冠状病毒颗粒的直接检测还未见披露。与一般的抗原(蛋白，多肽或小分子等)有所不同，SARS-CoV和SARS-CoV-2的表面结构上的众多刺突(S蛋白)提供了可供受体ACE2与之结合的多个位点,这些众多的S蛋白的RBD的存在为在非均相和均相两种情况下仅应用ACE2作为识别体提供了可能。
在传统免疫分析中，依据被测物分子的大小不同和抗原-抗体结合方式，发展起了夹心法(sandwich assay)和竞争法(competitive assay)。同样地，仅采用ACE2或联合使用ACE2和抗体也能有效地建立夹心法(sandwich assay)和竞争法。如果被测物是病毒颗粒，由于其表面众多的刺突(S蛋白)位点，ACE2可以同时替代传统免疫分析中的针对不同抗原结合位点的两种抗体(比如非均相免疫分析中的捕获抗体和信号抗体)。
在第一类实施例中，通过化学偶联或吸附反应,ACE2被固载(immobilizd)或锚定(anchored)在固相表面形成一个抗原捕获层，其具有捕获样本中含RBD的抗原(含RBD的S蛋白或含RBD的S蛋白片段等)以及冠状病毒粒子的能力。借助于通常的非标记生物亲和性分析方法(如图二但不限于其所示的那些方法)，被捕获的抗原或SARS-CoV-2病毒粒子能够通过各种信号被检测出来。
在第二类实施例(竞争法检测抗原)中，通过化学偶联或吸附反应,ACE2被固载(immobilizd)或锚定(anchored)在固相表面形成一个抗原捕获层，其具有捕获样本中含RBD的抗原(含RBD的S蛋白或含RBD的S蛋白片段等)的能力。在被测样本中加入经过标记物(能产生或参与产生信号的物质，如纳米胶体金颗粒、乳胶颗粒以及图三中的那些物质等)标记的含RBD的S蛋白或其片段，当被测样本中存在含RBD的抗原(含RBD的S蛋白或含RBD的S蛋白片段等)时，人为添加的、标记后的抗原将与样本中存在的被测抗原竞争结合固相表面的ACE2。最终，检测标记物产生或参与产生的信号就能获得被测抗原的定量信息，信号的大小与被测抗原的量成反比关系，在被测样本中不存在含RBD的抗原物质时，所检测到的信号最强。一种利用固体颗粒(如磁微粒)作为固相，并在其表面形成ACE2，用于构建竞争法反应和检测体系的示意如图四。
在第三类实施例(夹心法检测抗原)中，通过化学偶联或吸附反应,ACE2被固载(immobilizd)或锚定(anchored)在固相表面形成一个抗原捕获层，其具有捕获样本中含RBD的抗原(含RBD的S蛋白或含RBD的S蛋白片段等)的能力。选择一个抗体结合位点不与RBD重合，同时也不影响ACE2与RBD结合的抗体，依据检测信号的模式，对其进行标记。标记后的抗体和位于固相表面的ACE2与被测抗原物质形成夹心结构(如图五A所示)。同样是夹心法，也可以对ACE2进行标记，而让抗体(该抗体不影响ACE2于RBD结合)在固相表面形成一个抗原捕获层(如图五B所示)。最终，检测标记物产生或参与产生的信号就能获得被测抗原的定量信息，信号的大小与被测抗原的量成正比关系，在被测样本中 不存在含RBD的抗原物质时，所检测到的信号最弱。这种在不含被测物的样本中检测到的弱信号由非特异性吸附所产生。
在第四类实施例中，被测物是病毒颗粒。由于病毒颗粒表面众多的刺突(S蛋白)位点，ACE2可以同时作为捕获病毒颗粒的识别体和作为被标记的识别体，它们分别结合位于病毒颗粒表面的不同RBD(如图六A所示)。另外，ACE2也可以与抗体联合使用(如图六B和C所示)。在这种检测病毒颗粒的应用中，由于与ACE2联合使用的抗体不与同一个冠状刺突相结合，抗体的选择更加灵活。
在第五类实施例中，被测物病毒颗粒在一种类似于均相免疫分析的状况下被检测。之所以称之为“类似于均相免疫分析”，是因为冠状病毒颗粒直径在100纳米左右，其分散于液相时的溶液体系也许不能严格地称之均相溶液，但为了简化描述，该发明仍然使用“均相反应”或“均相检测”来描述该实施例。图七描述了三种采用ACE2实现基于荧光共振能量转移(
resonance energy transfer,或fluorescence resonance energy transfer，FRET)的均相检测方式或基于单线态氧(1ΔgO2)实现类似于LOCI(luminescent oxygen channeling immunoassay)的均相检测方式。在两种均相检测方法中，都涉及到采用两种标记物对两个识别体进行标记。在基于FRET的均相检测中，接受入射光的荧光标记物称为供体，另一个发出被检测光(荧光磷光)的标记物称为受体；而在基于单线态氧(1ΔgO2)的均相检测中，接受入射光的标记物称为光敏剂，而另一个发出被检测荧光的标记物称为发光物。图七A描述了只用ACE2作为被测物识别体的情况，其中一个是供体(或光敏剂)标记的ACE2，另一个是被受体(或发光物)标记的ACE2。图七B描述了联合采用ACE2和抗体的情况，其中，ACE2被供体(或光敏剂)标记，而抗体被受体(或发光物)标记。图七B中的标记方式也可以反过来，即，ACE2被受体(或发光物)标记，而抗体被供体(或光敏剂)标记，如图七C显示的S蛋白均相检测中的标记方式。
以上实施例可以在自动化的检测系统上实现，也可以在快速检测平台技术(如侧向流免疫层析)上实现。图八和图九显示了如何在侧向流免疫层析方法中联合使用ACE2和抗体。侧向流免疫层析大量用于快速检测，该方法为直接快速检出病毒颗粒提供便利。
上述采用ACE2作为被测物识别体的应用实施例并不是ACE2可以应用的全部情况，但通过这些实施例，本发明的精髓得以体现。
值得指出的是，由于ACE2是SARS-CoV和SARS-CoV-2的共同受体，其在识别病原体或不同病原体的抗原时不具有高度选择性或特异性，当超过一种冠状病毒流行时，非SARS-CoV-2引起的感染或一个以上病原体引起的并发感染会使得检测结果存疑，但这种情况并不多见。同时，由于以下几个原因，采用ACE2作为识别体的病毒粒子和抗原(含RBD的S蛋白或含RBD的S蛋白片段等)检测方法仍然具有临床意义和流行病学调查的价值，至少可以在核酸检测和抗体检测不能确诊时作为辅助确诊的手段，第一，在某个特定时期流行或爆发的传染病往往与单一病原体有关，第二，十几年前发生的SARS已经多年没有发生；第三，ACE2与SAR-CoV的结合很弱。
图1是冠状病毒简化结构及其刺突蛋白与ACE2的受体结合域示意图。
图2是基于不同检测信号的常规免疫分析方法。
图3是用于常规免疫分析方法中的发光标记物和反应体系。
图4是竞争法中采用ACE2作为被测物识别体。
图5是联合采用ACE2和抗体检测S蛋白的夹心法。
图6是单独采用ACE2以及联合采用ACE2和抗体检测病毒粒子的方法。
图7是ACE2用在涉及能量转移(FRET)或单线态氧(
1Δ
gO
2)的均相反应方法。
图8在侧向流免疫层析方法中应用ACE2包覆固体颗粒检测S蛋白。
图9在侧向流免疫层析方法中应用ACE2在检测线上检测S蛋白
图10是用ACE2作为被测物识别体在竞争法中检测S1蛋白。
1.用电中性钌配位化合物(Electronically Neutral Ruthenium complex,NRC)标记重组人源ACE2(rhACE2)
美国专利US10203333和中国专利ZL 201480045420.X披露了若干有助于降低非特异吸附并在电化学发光条件下表现出更强的发光信号的标记物，本实施例选用其中的一个电中性钌配位化合物，Ru(2,2’-bipyridine)(bathophenanthrolinedisulfonate)[4-(2,2'-bipyridin-4-yl)butanoic acid](简称NRC16)，用作发光标记物。
将100μg(1.1nmol)的rhACE2溶解在500μL 0.01M PBS(pH 7.4)缓冲液中。采用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide盐酸盐)和sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide钠盐)按标准的程序在2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)中对NRC16上的羧基进行活化。按设定的标记反应比例,即rhACE2与NRC16的反应浓度摩尔比[rhACE2]:[NRC16]＝1:5，将活化后的NRC16的MES溶液(含5.5nmol NRC16)加入rhACE2的PBS缓冲液中。反应一小时后，采用凝胶层析柱分离得到NRC16标记的ACE2衍生物(简称NRC16-rhACE2)。
实际的标记比例，即在标记后的产物中rhACE2与NRC16的摩尔比可以通过蛋白定量分析(BCA法)和NRC16在454nm的吸收来确定(见ACS Omega 2020,5,32591-32596)。
2.用生物素标记ACE2
采用NHS-PEG4-Biotin(MW 588.67kDa)作为生物素标记试剂，并设定标记反应的反应浓度摩尔比[rhACE2]:[NHS-PEG4-Biotin]＝1:10。将100μg(1.1nmol)的rhACE2溶解在500μL 0.01M PBS(pH 7.4)缓冲液中。然后加入11μL 1mM的NHS-PEG4-biotin PBS溶液。反应一小时后，采用凝胶层析柱分离得到生物素标记的ACE2衍生物(简称Bio-rhACE2)。产物的生物素结合能力采用文献(ACS Omega 2020,5,32591-32596)中描述的方法来评价。
3.用NRC16标记含SARS-CoV-2 RBD蛋白
将100μg(3.7nmol)的RBD蛋白(分子量26.5kDa)溶解在500μL 0.01M PBS(pH 7.4)缓冲液中。采用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide盐酸盐)和sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide钠盐)按标准的程序在2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液 (MES缓冲液)中对NRC16上的羧基进行活化。按设定的标记反应比例,即RBD蛋白与NRC16的反应浓度摩尔比[RBD]:[NRC16]＝1:5，将活化后的NRC16的MES溶液(含18.5nmol NRC16)加入RBD蛋白的PBS缓冲液中。反应一小时后，采用凝胶层析柱分离得到NRC16标记的RBD蛋白(简称NRC16-RBD)。
4.用竞争法检测S1蛋白
采用NRC16-RBD，Bio-rhACE2和链霉亲和素包覆的磁珠(直径2.8μm)在全自动电化学发光免疫分析仪检测PBS中的S1蛋白(分子量76.5kDa)。首先用0.01M PBS(pH 7.4)缓冲液稀释配制以下浓度的试剂和被测物S1蛋白的各种浓度的溶液:NRC16-RBD(2.0μg/mL),Bio-rhACE2(3.0μg/mL),磁珠(0.6mg/mL),S1蛋白(1.0ng/mL,10ng/mL,100ng/mL,1.0μg/mL)。将配制好的NRC16-RBD，Bio-rhACE2和磁珠各5.0mL分别装载上全自动电化学发光免疫分析仪上预设的试剂仓位，而不同浓度的S1蛋白溶液载入样本位。
孵育反应分两步进行。首先，仪器取样针将试剂NRC16-RBD和Bio-rhACE2(各50μL)与50μL S1蛋白样本在孵育杯中混匀并在摄氏37度的孵育位反应5分钟，然后在此反应体系中加入50μL磁珠悬浮液，混匀并继续在摄氏37度的孵育位反应10分钟。待第一个孵育反应结束后，全自动分析仪自动按顺序从孵育位上的所有反应体系汲取150μL溶液，并注入电化学反应流动池进行电化学发光检测。得到的无量纲发光强度值由仪器输出结果。
图十是竞争法检测S1蛋白的浓度信号关系图。图中虚线箭头指示，当增加与样本S1蛋白竞争的NRC16-RBD的浓度时，发光信号增强，而在降低NRC16-RBD的浓度时，发光信号减弱。
这种对S1蛋白的检测同样可用于表面含S1蛋白的病毒颗粒或(在科研中使用的)假病毒(pseudovirus)颗粒的检测。
5.用生物素标记的ACE2和NRC16标记的ACE2检测唾液中的病毒颗粒
由于病毒颗粒表面众多的刺突(S蛋白)位点，这个实施例显示如何用生物素标记的ACE2衍生物Bio-rhACE2(3.0μg/mL)和NRC16标记的ACE2衍生物NRC16-rhACE2(2.0μg/mL)分别作为捕获病毒颗粒的识别体和被标记的识别体来检测病毒颗粒。
将配制好的Bio-rhACE，NRC16-rhACE2，和磁珠(0.6mg/mL)各5.0mL分别装载上全自动电化学发光免疫分析仪上预设的试剂仓位，PBS缓冲溶液(作为已知的不含病毒颗粒的对照)和唾液样本溶液载入样本位。孵育反应分两步进行。首先，仪器取样针将50μL Bio-rhACE与50μL磁珠悬浮液在孵育杯中混匀并在摄氏37度的孵育位上反应10分钟， 然后加入50μL样本和NRC16-rhACE2，并继续在摄氏37度的孵育位上反应10分钟。待第一个PBS对照样本孵育结束后，全自动分析仪自动按顺序从孵育位上的所有反应体系汲取150μL溶液，并注入电化学反应流动池进行电化学发光检测。测试结果表明，PBS对照样本与五个唾液样本具有非常接近的，可认为来自于非特异性吸附的弱信号。唾液样本可视为阴性样本。
6.采用表面含有羧基的磁珠制备ACE2包覆的磁珠
在上述具体实施方式4和5中，涉及到采用生物素标记的ACE2衍生物和链霉亲和素包覆的磁珠分别作为反应组份在分析程序中被添加到反应体系中。另外一种实施方式涉及到事先制备ACE2包覆的磁珠，以便其在分析程序中直接使用。一种具体操作步骤如下：
a.将磁珠(粒径范围在1.0～4.5μm，30mg/mL)悬浮混匀，使用1mL的25mM MES(pH 5.0)缓冲液清洗磁珠，并旋转混合10分钟，随后进行磁分离。重复清洗磁珠2-3次。
b.添加600μg ACE2(浓度为1mg/mL，添加600μL)到磁珠里(ACE2与磁珠包被比例为0.02mg:1mg)，室温下低速旋转混匀反应30分钟。
c.用100mM MES,pH 5.0缓冲液配制100mg/mL的EDC溶液，现配现用。
d.将300μL的EDC(即3mg)加入到磁珠和ACE2的反应溶液中混匀，补加100μL的25mM MES,pH 5.0缓冲液至最终体积为1mL(使得磁珠反应浓度为30mg/mL)，4℃下低速旋转混匀反应2小时。
e.封闭和清洗已包被磁珠：将已包被ACE2的磁珠与50mM Tris、pH 7.4室温下低速旋转混匀反应15分钟，或与50mM乙醇胺在PBS、pH 8.0室温下低速旋转混匀反应60分钟，以封闭多余活性反应基团。使用1mL的PBS或50mM的Tris清洗已包被ACE2的磁珠四次。洗涤过程中可添加0.1％的Tween-20或Triton X-100以减少非特异性结合，之后添加0.1％-0.5％的BSA或脱脂奶粉，最后将磁珠重悬到PBS或Tris缓冲液中至所需浓度。
上述方法也可用于制备ACE2包覆的、由其它材质组成的固体颗粒(如粒径在50nM–10μM胶乳微粒以及量子点等)。
Claims (14)
- 一种采用血管紧张素转化酶2(ACE2)检测冠状病毒粒子或其结构组成蛋白的方法，该方法包括以下步骤：a.让经过预处理或未经预处理的、可能含有冠状病毒或其结构组成蛋白的样本(液相、固相或气相)与含有ACE2衍生物的液相或位于固相表面的ACE2互相接触；b.检测上述物质接触时产生的物理信号或接触后体系内其它物质通过物理、化学或生物化学反应产生的信号；c.通过对上述信号的分析处理，获得样本中是否存在或者存在多少冠状病毒或其结构组成蛋白的定性或定量信息。所述的结构组成蛋白是冠状病毒粒子表面的刺突蛋白，或包含其受体结合域(RBD)的刺突蛋白结构中的一部分；所述的固相是包括但不限于各种单一或复合材质的固体颗粒、容器、平板、纤维织物、光纤等材料或器物；所述的固相表面是这些材料或器物的表面或端面；所述的ACE2是包括但不限于来自人体、动物体、微生物体或通过生物工程而获得的、能与冠状病毒刺突蛋白的受体结合域(RBD)相结合的生物大分子，或该生物大分子相互交联、聚合或聚集在一起而形成的分子量更大的ACE2生物大分子复合物；所述的ACE2衍生物是ACE2或分子量更大的ACE2生物大分子复合物与其它功能性化学物质(或基团)、生物活性物质(如酶、抗体或抗体的结构片段等)、固体颗粒而形成的复合物；这些物质包括但不限于生物偶联基团(如生物素等)、可显色的物质(如纳米金颗粒、石墨颗粒)、荧光磷光物质(如量子点、稀土长寿命磷光分子或微球、荧光分子或微球等)、可参与化学发光反应的物质、可参与电化学反应的物质、可参与能量转移的物质以及可参与催化反应的酶等；所述的位于固相表面的ACE2是通过共价键、吸附、或配体-受体相互作用或抗原-抗体相互作用而形成于固相表面或者包覆固相表面的ACE2或在固相表面相互交联、聚合或聚集在一起而形成的分子量更大的ACE2生物大分子复合物；该固相表面可以全部，也可以部分被ACE2包覆；优选地，其中所述的冠状病毒为COVID-9病原体SARS-CoV-2；优选地，其中所述的接触时产生的物理信号或接触后体系内其它物质通过物理、化学或生物化学反应产生的信号为发光、反射或散射光信号，更优选为发光(luminescence)信号或为电信号(电流、电压、阻抗、复阻抗、频率)。
- 根据权利要求1所述的方法，其中经过预处理的、含有冠状病毒或其结构组成蛋白的液相样本的预处理方法包括人为添加标记后的刺突蛋白，其标记物为生物偶联基团(如生物素等)、可显色的物质(如纳米金颗粒、石墨颗粒)、荧光磷光物质(如量子点、稀土长寿命磷光分子或微球、荧光分子或微球等)、可参与化学发光反应的物质、可参与电化学反应的物质以及酶等；优选地，所述标记物是纳米金颗粒、化学发光化合物、金属配位化合物或有机金属化合物，优选稀土、钌和铱的金属配位化合物或有机金属化合物。
- 根据权利要求1所述的方法，其中经过预处理的、含有冠状病毒或其结构组成蛋白的固相样本的预处理方法包括采用ACE2将冠状病毒或其结构组成蛋白固定在固相表面的方法。
- 根据权利要求1所述的方法，其中经过预处理的、含有冠状病毒或其结构组成蛋白的固相样本的预处理方法包括采用抗体将冠状病毒或其结构组成蛋白固定在固相表面的方法。
- 根据权利要求1所述的方法，其中ACE2衍生物可以是单独一种ACE2衍生物。
- 根据权利要求1所述的方法，其中ACE2衍生物也可以是两种或多种不同的ACE2衍生物，它们可以同时，也可以先后与冠状病毒粒子结合以形成{ACE2衍生物(a)/病毒粒子/ACE2衍生物(b)}复合物。
- 根据权利要求1所述的方法，其中ACE2衍生物是单独一种时，在其与被测物形成{ACE2衍生物/被测物}复合物后，一种或多种位于固相表面的ACE2可用于在固相表面形成{ACE2衍生物/病毒粒子/ACE2}复合物。
- 根据权利要求1所述的方法，其中当ACE2衍生物是单独一种时，一种或多种针对冠状病毒或其结构组成蛋白的标记过的抗体可用于形成{ACE2衍生物/被测物/抗体}复合物；用于标记该抗体的标记物为生物偶联基团(如生物素等)、可显色的物质(如纳米金颗粒、石墨颗粒)、荧光磷光物质(如量子点、稀土长寿命磷光分子或微球、荧光分子或微球等)、可参与化学发光反应的物质、 可参与电化学反应的物质以及酶等。
- 根据权利要求1所述的方法，其中当ACE2衍生物是一种时，在其与被测物形成{ACE2衍生物/被测物}复合物后，一种或多种位于固相表面的、针对冠状病毒或其结构组成蛋白的抗体可用于在固相表面形成{ACE2衍生物/被测物/抗体}复合物。
- 根据权利要求1所述的方法，其中所述的部分被ACE2包覆的固相表面可以是ACE2形成于固相表面的线宽)为0.1–2mm的直线或曲线线条，也可以是面积为1-10mm 2的斑点或圆环。
- 一种表面被ACE2全部或部分包覆的单一或复合材质的固体颗粒，其直径在50纳米到10微米之间。
- 一种表面或端面被ACE2全部或部分包覆的容器、平板、纤维织物、光纤等材料或器物。
- 根据权利要求11，所述固体颗粒为磁性颗粒。
- 根据权利要求12，所述纤维织物为用于侧向流免疫层析技术的膜。。
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