CN112986580B - 一种新型冠状病毒中和抗体检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种新型冠状病毒中和抗体检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种新型冠状病毒中和抗体检测检测方法及试剂盒,所述微流控芯片的标记区标记有能与SARS‑CoV‑2抗原结合的竞争性物质,所述T检测区包被有能与SARS‑CoV‑2抗原结合的捕获性物质,所述C检测区包被有用于质控作用的抗原或抗体,所述样本加样管内预先干燥有纳米颗粒标记的SARS‑CoV‑2抗原。本发明通过体外构建新型冠状病毒空间模型及细胞表面受体空间模型,创新性的实现中和抗体在模拟间接竞争模式下,中和抗体含量的快速检测,同时能够真实有效的评估中和抗体中和新型冠状病毒的能力。本试剂盒具有准确度高、灵敏度高、特异性好、重复性好等特点,可用于新型冠状病毒中和抗体的批量、快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及免疫荧光检测技术领域,尤其是涉及一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法。
背景技术
人体接种疫苗后可通过免疫应答产生保护性抗体,即中和抗体,对中和抗体进行滴度测定,可以判断疫苗的临床疗效。因此对中和抗体的检测,可应用于疫苗的研发评价,以及疫苗研发成功后,正式应用于大众后,对个体自身免疫效果的评价。另外,对于治愈后的新冠患者检测,可以判断是否存在再次感染的风险。因此,对于中和抗体的检测决定了是否可以更安全地重返工作岗位或参加更多的社交活动。
SARS-CoV-2表面棘突S蛋白(spike protein)是冠状病毒表面重要的受体结合位点,其可与细胞表面病毒特异性受体结合、介导病毒外膜与细胞融合、病毒吸附及穿膜;冠状病毒S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)可使病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme2,ACE2)结合,并使病毒进入宿主细胞。当SARS-CoV-2在侵入机体时,会刺激机体产生具有保护作用的中和抗体,专门阻止病原微生物进入细胞,防止感染大部分中和抗体,如2M-10B11和ACE2-fc以S蛋白的RBD为靶点,并阻断其与ACE2结合,表现出中和活性。
西湖大学研究团队发现AXL是新冠病毒感染人类呼吸系统的潜在受体,研究团队发现新冠病毒在人类呼吸系统中可能存在其他重要受体。研究团队证明肺细胞上的AXL蛋白与新冠病毒刺突蛋白相结合,并在细胞膜上存在强共定位。且与呼吸系统上皮细胞结合强度排名前三的候选受体分别为:AXL蛋白、EGFR蛋白和LDLR蛋白。
目前已经建立的冠状病毒中和抗体检测方法有双抗原夹心法、间接法和竞争法。其中双抗原夹心法与间接法检测的是总抗体含量,不能针对性反应样本中的中和抗体含量。例如,目前已公开专利中,竞争法检测中和抗体含量多为常规竞争的方式。授权公告号为CN111781354B的已授权专利公开了一种新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒。现有技术多为:标记抗原,包被受体蛋白,样本中的中和抗体与受体蛋白直接竞争抗原,通过结合的数量反应中和抗体的含量。该方法提供的主要为直接并同时竞争的内环境,存在的问题有:对于低滴度的中和抗体,竞争优势不显著,灵敏度较低,对于较高滴度的中和抗体,竞争梯度小,容易造成检测结果偏差大等问题。同时目前已知的免疫学检测中,中和抗体检测均为通过抗体浓度或数量的结合,反应中和抗体的浓度,同时现有技术多用于酶免、胶体金法等试剂盒的检测,采用微流控免疫荧光法实现快速检测,目前未见到。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法,本试剂盒通过体外构建新型冠状病毒空间模型及细胞表面受体空间模型,创新性的实现中和抗体在模拟间接竞争模式下,中和抗体含量的快速检测,同时能够真实有效的评估中和抗体中和新型冠状病毒的能力。本方法及试剂盒具有灵敏度高、特异性好、准确度高、重复性好等特点,可用于新型冠状病毒中和抗体的批量、快速检测。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,包括微流控芯片卡及样本加样管,所述微流控芯片卡上分别设有标记区、T检测区和C检测区,其中,所述标记区用信号粒子标记有能与SARS-CoV-2抗原结合的竞争性物质,所述T检测区包被有能与SARS-CoV-2抗原结合的捕获性物质,所述C检测区包被有用于质控作用的与标记区标记的竞争性物质特异性反应的抗原或特异性识别竞争性物质的抗体,所述样本加样管内预先干燥有纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原。
所述微流控芯片卡内部结构是本发明技术方案实现的重要组成部分。所述微流控芯片包括固定连接的基片和盖片,基片沿样本流动方向分别为加样区、标记区、检测区和废液区。样本经加样孔流经标记区后与荧光微球标记物结合,然后进入检测区发生免疫反应,最终流入废液槽后终止反应。
所述微流控芯片卡,加样后只需4min可完成免疫反应,反应时间快,且4-20分钟检测结果稳定,样本重复性好,精密度高。
通过创造优先竞争的方式,更有利于竞争的形成,可显著增加检测的灵敏度及线性梯度。
优选地,所述SARS-CoV-2抗原包括S蛋白全长片段或S蛋白部分片段,优选S-RBD蛋白。新型冠状病毒入侵宿主是通过表面的S蛋白与宿主细胞结合,而最主要的功能位点是S蛋白上的受体结合域,即S-RBD,S-RBD蛋白直接与中和抗体结合,亲和力更高。
所述SARS-CoV-2抗原能够与样本中的SARS-CoV-2中和抗体特异性的结合。
优选地,所述SARS-CoV-2抗原预偶联生物素后再标记纳米颗粒或直接标记纳米颗粒,所述纳米颗粒包括纳米金、纳米银、纳米锌、纳米碳、纳米硒的至少一种,优选纳米金。纳米金颗粒目前研究最成熟,成本低易获取。
优选地,所述SARS-CoV-2抗原含有带标签的肽段,所述标签包括His标签、MFc标签、Flag标签、HA标签的至少一种。
优选地,所述信号粒子包括荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒的至少一种,其中荧光粒子包括荧光素填充微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球的至少一种,所述信号物质粒径在100-1000nm范围内;所述竞争性物质为与纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原特异性反应的受体蛋白,所述受体蛋白包括ACE2蛋白、AXL蛋白、EGFR蛋白或LDLR蛋白的至少一种,优选ACE2蛋白或AXL蛋白,标记浓度优选0.05-0.5mg/ml。ACE2是新型冠状病毒感染人体,进入细胞的重要靶点,AXL是新冠病毒感染人类呼吸系统的潜在受体,均能与S-RBD蛋白有很高的结合强度。
所述受体蛋白可与样本中的中和抗体共同竞争胶体金标记的SARS-CoV-2抗原。
优选地,所述捕获性物质可与SARS-CoV-2抗原直接结合,包括与SARS-CoV-2抗原特异性反应的受体蛋白,所述受体蛋白包括ACE2蛋白、AXL蛋白、EGFR蛋白或LDLR蛋白的一种,优选ACE2蛋白或AXL蛋白,包被浓度优选5-80μg/ml。
优选地,所述捕获性物质可与SARS-CoV-2抗原间接结合,包括链霉亲和素或生物素,优选链霉亲和素,包被浓度优选10-100μg/ml,链霉亲和素与SARS-CoV-2抗原上预偶联的生物素发生特异性反应。抗原与生物素偶联质量浓度比例为10:1。
优选地,所述捕获性物质可与SARS-CoV-2抗原间接结合,包括标签抗体,包被浓度优选5-80μg/ml,标签抗体与SARS-CoV-2抗原上含有的标签肽段特异性反应。
所述捕获性物质均通过预偶联生物素,可与微流控芯片内预包被的链霉亲和素或亲和素(优选链霉亲和素)特异性结合而被固定于检测区。
优选地,所述C检测区包被的抗原包括S蛋白全长片段或S蛋白部分片段,优选S-RBD蛋白,包被浓度优选2-80μg/ml;所述C检测区包被的抗体包括ACE2蛋白抗体、AXL蛋白抗体、EGFR蛋白抗体或LDLR蛋白抗体的一种,优选ACE2蛋白抗体或AXL蛋白抗体,包被浓度优选2-80μg/ml。
所述C检测区包被物质,通过预偶联生物素,可与微流控芯片内预包被的链霉亲和素或亲和素(优选链霉亲和素)特异性结合而被固定于检测区。无论样本中是否有中和抗体,C检测区均可检测到信号值。
本发明的另一目的在于提供一种新型冠状病毒中和性抗体免疫荧光检测方法,其采用微流控芯片或层析试纸,包括以下步骤:
步骤一:将血清或血浆样本与纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原混合,形成中和抗体-抗原-纳米颗粒的混合样本;
步骤二:使步骤一得到的混合样本流经标记有能与SARS-CoV-2抗原结合的竞争性物质的区域,未结合的纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原再与区域内信号粒子标记的竞争性物质反应特异性结合,形成信号粒子-竞争性物质-抗原-纳米颗粒的复合物;
使复合物流经包被有能和SARS-CoV-2抗原结合的捕获性物质的T检测区,捕获性物质直接或间接的与SARS-CoV-2重组抗原结合,形成信号粒子-竞争性物质-抗原(纳米颗粒标记)的复合物-捕获性物质。样本继续流经包被有与标记区标记的竞争性物质特异性反应的抗原或特异性识别竞争性物质的抗体的C检测区,用信号粒子标记的过量的未参与反应的竞争性物质与C检测区物质结合,形成抗原或抗体-竞争性物质-信号粒子;
步骤三:检测T检测区和C检测区的信号值,分别记为T信号值和C信号值,计算T信号值/C信号值的比值即为检测结果。
本发明中,检测结果采用T信号值/C信号值的比值法进行计算,检测结果与样本中中和抗体浓度呈负相关,该方法可消除系统内误差,极大地提高检测结果的精密度及准确度。
工作原理:
将血清或血浆样本加入样本加样管后,样本与样本加样管内预干燥的纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原混合,形成中和抗体-抗原-纳米颗粒的混合样本;其中纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原,在空间结构上形成以纳米颗粒为核心,SARS-CoV-2抗原排列在纳米颗粒外表面的冠状颗粒构象。纳米颗粒与抗原(蛋白)主要以静电结合的方式结合,抗原与其结合后进行干燥,可提高蛋白物质的稳定性,同时也不影响蛋白与受体蛋白结合的亲和力。
将混合样本加入到微流控芯片卡的加样区,当混合样本在毛细作用力下流入标记区时,未结合的纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原再与荧光粒子标记的受体蛋白特异性结合,形成荧光粒子-受体蛋白-抗原-纳米颗粒的复合物;其中荧光粒子标记的受体蛋白,在空间结构上形成以荧光粒子为核心,受体蛋白有序结合在荧光粒子的外表面,形成类似细胞的膜表面结构。
复合物流动至检测区,与T检测区包被的捕获性物质结合,捕获性物质直接或间接的与复合物中的SARS-CoV-2抗原结合,形成信号粒子-竞争性物质-抗原(纳米颗粒标记)的复合物-捕获性物质。样本中中和抗体浓度越高,T检测点捕获的含信号粒子复合物越少,T位点的信号值越低,反之亦然,样本中中和抗体的浓度与荧光信号值成反比例关系。标记区用荧光粒子标记的过量的未参与反应的受体蛋白流动至C检测区,形成受体蛋白抗体-受体蛋白-荧光粒子;
检测T检测区和C检测区的信号值,分别记为T信号值和C信号值,采用T信号值/C信号值的比值法计算检测结果,检测结果与样本中中和抗体浓度呈负相关。
相对于现有技术,本发明所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法具有以下有益效果:
(1)本发明所述的试剂盒通过体外构建新型冠状病毒空间模型及细胞表面受体空间模型的反应方式,不仅能够实现中和抗体含量的快速检测,还创新性的实现了中和抗体中和新型冠状病毒能力的真实有效评估。本试剂盒具有准确度高、灵敏度高、特异性好、重复性好等特点,可用于新型冠状病毒中和抗体的批量、快速检测。
(2)本发明利用微流控免疫荧光技术定量测定人血清或血浆中新冠病毒中和抗体的含量。本发明试剂盒通过构建间接竞争的方法,创造样本的中和抗体与抗原的优势竞争,提高竞争优势,扩大竞争梯度及线性范围,提高新型冠状病毒中和抗体检测的灵敏度、拓宽优势竞争的检测范围及竞争梯度。实现新型冠状病毒中和抗体准确快速检测的目的。
(3)本发明中创新性的引用纳米颗粒标记抗原的方法,利用纳米颗粒与抗原(蛋白)静电结合的方式,一方面与抗原结合后进行干燥,可提高蛋白物质的稳定性,另一方面不影响蛋白与荧光标记受体蛋白的亲和力,该方法为创造优势间接竞争提供了有利的基础。
(4)本发明所述的竞争性物质不仅涉及受体蛋白ACE2,还包括最新研究进展中参与新冠感染的新受体蛋白,如AXL蛋白等。可为新型冠状病毒中和抗体检测试剂提供新的思路及方向。
(5)本发明采用T信号值/C信号值的比值法进行计算,该方法可消除系统内误差,极大地提高检测结果的精密度及准确度。使精准检测助推精准医疗。
(6)本发明提供的试剂盒还可用于判断接种新型冠状病毒疫苗后,体内中和抗体产生水平,有助于判断是否存在暴露及感染的风险。该试剂盒还可用于检测普通人群或治愈患者体内中中和抗体的含量,有助于判断是否存在再次感染的风险。
(7)本发明提供的试剂盒,利用微流控免疫荧光技术,采用创新性的间接竞争法,检测新型冠状病毒中和抗体含量,反应时间快,加样后只需4min可完成免疫反应,检测便捷,灵敏度高,线性范围广,且4-20分钟检测结果稳定,产品重复性好,精密度高。
(8)该方法灵活可靠,实际可行,只需在二级生物安全实验室就可完成。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明实施例1和对比例1试剂检测的线性曲线图;
图2为本发明实施例2和对比例1试剂检测的线性曲线图;
图3为本发明实施例3和对比例1试剂检测的线性曲线图;
图4为本发明所述样本加样管内、微流控芯片卡的标记区、T检测区和C检测区上的物质的结构示意图。
具体实施方式
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例一:新型冠状病毒中和抗体微流控免疫荧光检测试剂盒的制备
1材料和仪器
1.1新冠SRBD蛋白、ACE2受体蛋白,购自深圳市菲鹏生物股份有限公司;
1.2链霉亲和素、EZ-link生物素购自Sigma;
1.3荧光免疫分析仪(F10pro),天津中新科炬生物制药股份有限公司生产并提供。
2.试剂盒包括如下组分:胶体金标记的SARS-CoV-2S-RBD抗原、荧光粒子标记的受体蛋白ACE2、T检测区包被受体蛋白ACE2、C检测区包被S-RBD蛋白。
2.1胶体金标记SARS-CoV-2S-RBD抗原
取胶体金溶液100mL,用0.2M K2C03溶液调解PH至8.0,加入终浓度为0.01mg/mL S-RBD抗原,搅拌反应1h,加入质量浓度为1%的酪蛋白进行封闭30min,离心去上清,加入工作液定容至45mL,形成储备液备用。取样本管,分装储备液0.02ml/支加入样本管底部,于低温低湿箱内干燥24h。(温度设置:15%±3;湿度设置:20%±3)
工作液配方为:pH值9.5-10.0的100mM Tris含有5%蔗糖、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、0.06%柠檬酸、1%Tween-20、0.05%ProClin 300。
2.2荧光粒子标记受体蛋白ACE2
取活化的荧光粒子1mL,加入终浓度为0.1mg/mL受体蛋白ACE2,20min后离心去上清,加入0.01M PBS定容至1mL,加入质量浓度为1%的酪蛋白进行封闭10min,离心取上清,加入含0.1%Tween、1%糖的0.1mLPBS缓冲液定容,储存备用。
2.3检测位点原料制备
取受体蛋白ACE2、S-RBD蛋白及EZ-LINK生物素。受体蛋白ACE2、S-RBD蛋白分别与生物素的质量浓度比例按10:1各自混合,4℃0.01M PBS透析过夜后,于紫外分光光度计分别测定蛋白浓度。分别形成生物素化的ACE2蛋白和生物素化的S-RBD蛋白。
2.4 T检测区包被受体蛋白ACE2
取生物素化的ACE2蛋白,分别用0.01MPBS稀释为终浓度20μg/mL,形成T检测区包被液。
2.5C检测区包被S-RBD蛋白取生物素化的SRBD蛋白,用0.01MPBS稀释为终浓度20μg/mL,形成C检测区包被液。
2.3芯片制作
取终浓度5mg/mL链霉亲和素溶液,分别点样于微流控基片T、C相应的位点,常温高湿孵育1h,用0.01M PBS冲洗,晾干。
分别将荧光粒子标记溶液、T检测区包被液、C检测区包被液点样于干燥后的微流控基片相应位置,常温干燥后,取盖片压合固定于基片上。
3检测方法
3.1灵敏度及线性检测
按照本发明建立的方法制作成品试剂。用含质量浓度为1%糖的0.1mLPBS缓冲液稀释新冠病毒中和抗体纯品,浓度分别为0.005μg/ml、0.04μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml,分别记为P1-P7。每个浓度点重复测定3次取平均值,分别记录T线信号值、C线信号、T/C比值,以现有竞争方法制成的成品芯片为对照,检测P1-P7,方法同上。并以新冠病毒中和抗体标准液浓度为横坐标,以T/C值为纵坐标,用四参数拟合方程:y=(A-D)/[1+(X/C)^B]+D,其中,A:曲线上渐近线估值;D:曲线下渐近线估值;B:曲线的斜率;C:T/C值。绘制新冠病毒中和抗体现有技术与本实施例中提供技术的对比线性图。
3.2准确度的检测
采用本实施例中提供的技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,对P2,P3和P5进行测定,每个浓度测5次,其检测结果与标定值的相对偏差。
3.3精密度检测
采用本实施例中提供的技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,对P5进行测定,至少重复10次,计算均值和CV。
4检测结果
4.1灵敏度及线性检测结果
见图1,结果表明:采用改进技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒测得曲线的四参数分别为A=3.61362;B=0.42376;C=2.95406;D=-1.10509;r2=0.99996。采用现有技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A=2.59952;B=1.22361;C=0.21537;D=0.89751;r2=0.99115。与现有技术对比,改进技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒线性梯度明显优于现有技术。改进技术灵敏度高,可达0.005μg/mL,远高于现有技术的灵敏度,而且改进技术检测范围达到0.005μg/mL-20μg/mL,检测范围宽,适用性更强。
4.2准确度检测结果
表1本实施例中提供技术制备试剂盒的准确度检测结果
结果显示:采用本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,测定各浓度标准液的均值与理论值相对偏差均小于5%,表明本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒准确度高。
4.3精密度检测结果
表2本实施例中提供技术制备试剂盒的精密度检测结果
本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,测定标准液精密度结果显示,采用T/C比值法计算检测结果小于5%,精密度好,表明采用T/C比值法计算检测结果可使得试剂的精密性显著提高。
实施例二:新型冠状病毒中和抗体微流控免疫荧光检测试剂盒的制备
1材料和仪器
1.1新冠SRBD蛋白、ACE2受体蛋白,购自深圳市菲鹏生物股份有限公司;
1.2链霉亲和素、EZ-link生物素购自Sigma;。
1.3荧光免疫分析仪(F10pro),天津中新科炬生物制药股份有限公司生产并提供。
2.试剂盒包括如下组分:胶体金标记SARS-CoV-2生物素化的S-RBD抗原、荧光粒子标记的受体蛋白ACE2、T检测区包被链霉亲和素、C检测区包被ACE2蛋白的抗体。
2.1胶体金标记SARS-CoV-2生物素化的S-RBD抗原
取S-RBD蛋白及EZ-LINK生物素。S-RBD蛋白分别与生物素的质量浓度比例按10:1各自混合,4℃0.01M PBS透析过夜后,于紫外分光光度计分别测定蛋白浓度。形成生物素化的S-RBD蛋白。
取胶体金溶液100mL,用0.2M K2C03溶液调解PH至8.0,加入终浓度为0.01mg/mL生物素化S-RBD抗原,搅拌反应1h,加入质量浓度为1%的酪蛋白进行封闭30min,离心去上清,加入工作液定容至45mL,形成储备液备用。取样本管,分装储备液20μl/支加入样本管底部,于低温低湿箱内干燥24h。(温度设置:15%±3;湿度设置:20%±3)
工作液配方为:pH值9.5-10.0的100mM Tris含有5%蔗糖、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、0.06%柠檬酸、1%Tween-20、0.05%ProClin 300。
2.2荧光粒子标记受体蛋白ACE2
取活化的荧光粒子1mL,加入终浓度为0.1mg/mL受体蛋白ACE2,20min后离心去上清,加入0.01M PBS定容至1mL,加入质量浓度为1%的酪蛋白进行封闭10min,离心取上清,加入含0.1%Tween、1%糖的0.1mLPBS缓冲液定容,储存备用。
2.3检测位点原料制备
取ACE2蛋白抗体及EZ-LINK生物素,ACE2蛋白抗体与生物素的质量浓度比例按10:1混合,4℃0.01M PBS透析过夜后,于紫外分光光度计分别测定蛋白浓度。形成生物素化的ACE2蛋白抗体。
2.4 T检测区包被链霉亲和素
取链霉亲和素及EZ-LINK生物素,分别用含有1%糖的0.01MPBS溶液稀释后,按摩尔浓度1:4比例混合,其中加入链霉亲和素的终浓度为50μg/mL,混匀后形成T检测区包被液。
2.5 C检测区包被ACE2蛋白的抗体取生物素化的ACE2蛋白抗体,用0.01MPBS稀释为终浓度20μg/mL,形成C检测区包被液。
2.3芯片制作
取终浓度5mg/mL链霉亲和素溶液,分别点样于微流控基片T、C相应的位点,常温高湿孵育1h,用0.01M PBS冲洗,晾干。
分别将荧光粒子标记溶液、T检测区包被液、C检测区包被液点样于干燥后的微流控基片相应位置,常温干燥后,取盖片压合固定于基片上。
3检测方法
3.1灵敏度及线性检测
按照本发明建立的方法制作成品试剂。用含质量浓度为1%糖的0.1mLPBS缓冲液稀释新冠病毒中和抗体纯品,浓度分别为0.005μg/ml、0.04μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml,分别记为P1-P7。每个浓度点重复测定3次取平均值,分别记录T线信号值、C线信号、T/C比值,以现有竞争方法制成的成品芯片为对照,检测P1-P7,方法同上。并以新冠病毒中和抗体标准液浓度为横坐标,以T/C值为纵坐标,用四参数拟合方程:y=(A-D)/[1+(X/C)^B]+D,其中,A:曲线上渐近线估值;D:曲线下渐近线估值;B:曲线的斜率;C:T/C值。绘制的新冠病毒中和抗体现有技术与本实施例中提供技术对比线性图。
3.2准确度的检测
采用本实施例中提供的技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,对P2,P3和P5进行测定,每个浓度测5次,其检测结果与标定值的相对偏差。
3.3精密度检测
采用本实施例中提供的技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,对P5进行测定,至少重复10次,计算均值和CV。
4检测结果
4.1灵敏度及线性检测结果
见图2,结果表明:采用改进技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒测得曲线的四参数分别为A=3.40062;B=0.44667;C=2.52082;D=-0.87833;r2=0.99994。采用现有技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A=2.59952;B=1.22361;C=0.21537;D=0.89751;r2=0.99115。与现有技术对比,改进技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒线性梯度明显优于现有技术。改进技术灵敏度高,可达0.005μg/mL,远高于现有技术的灵敏度,而且改进技术检测范围达到0.005μg/mL-20μg/mL,检测范围宽,适用性更强。
4.2准确度检测结果
表3本实施例中提供技术制备试剂盒的准确度检测结果
结果显示:采用本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,测定各浓度标准液的均值与理论值相对偏差均小于5%,表明本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒准确度高。
4.3精密度检测结果
表4本实施例中提供技术制备试剂盒的精密度检测结果
序号 | T | C | T/C |
1 | 141343 | 145639 | 0.97 |
2 | 95627 | 106798 | 0.90 |
3 | 82319 | 84137 | 0.98 |
4 | 95283 | 99398 | 0.96 |
5 | 81990 | 84281 | 0.97 |
6 | 92305 | 94801 | 0.97 |
7 | 97565 | 109554 | 0.89 |
8 | 89045 | 92804 | 0.96 |
9 | 100651 | 107953 | 0.93 |
10 | 88451 | 87197 | 1.01 |
均值 | 96458 | 101256 | 0.95 |
SD | 16935 | 18287 | 0.04 |
CV | 17.56% | 18.06% | 4.02% |
本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,测定标准液精密度结果显示,采用T/C比值法计算检测结果小于5%,精密度好,表明采用T/C比值法计算检测结果可使得试剂的精密性显著提高。
实施例三:新型冠状病毒中和抗体微流控免疫荧光检测试剂盒的制备
1材料和仪器
1.1新冠SRBD蛋白(含His标签肽段)、AXL受体蛋白,购自深圳市菲鹏生物股份有限公司;
1.2链霉亲和素、EZ-link生物素购自Sigma;
1.3荧光免疫分析仪(F10pro),天津中新科炬生物制药股份有限公司生产并提供。
2.试剂盒包括如下组分:胶体金标记的SARS-CoV-2S-RBD抗原(含His标签肽段)、荧光粒子标记的受体蛋白AXL、T检测区包被His标签抗体、C检测区包被S-RBD蛋白。
2.1胶体金标记SARS-CoV-2S-RBD抗原(含His标签肽段)
取胶体金溶液100mL,用0.2M K2C03溶液调解PH至8.0,加入终浓度为0.01mg/mL S-RBD抗原(含标签肽段),搅拌反应1h,加入质量浓度为1%的酪蛋白进行封闭30min,离心去上清,加入工作液定容至45mL,形成储备液备用。取样本管,分装储备液0.02ml/支加入样本管底部,于低温低湿箱内干燥24h。(温度设置:15%±3;湿度设置:20%±3)
工作液配方为:pH值9.5-10.0的100mM Tris含有5%蔗糖、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、0.06%柠檬酸、1%Tween-20、0.05%ProClin 300。
2.2荧光粒子标记受体蛋白AXL
取活化的荧光粒子1mL,加入终浓度为0.1mg/mL受体蛋白AXL,20min后离心去上清,加入0.01M PBS定容至1mL,加入质量浓度为1%的酪蛋白进行封闭10min,离心取上清,加入含0.1%Tween、1%糖的0.1mLPBS缓冲液定容,储存备用。
2.3检测位点原料制备
取HIS标签抗体、S-RBD蛋白及EZ-LINK生物素。His标签抗体与S-RBD蛋白分别与生物素的质量浓度比例按10:1各自混合,4℃0.01M PBS透析过夜后,于紫外分光光度计分别测定蛋白浓度。分别形成生物素化的HIS标签抗体和生物素化的S-RBD蛋白。
2.4 T检测区包被His标签抗体
取生物素化的His标签抗体,分别用0.01MPBS稀释为终浓度20μg/mL,形成T检测区包被液。
2.5C检测区包被S-RBD蛋白取生物素化的SRBD蛋白,用0.01MPBS稀释为终浓度20μg/mL,形成C检测区包被液。
2.3芯片制作
取终浓度5mg/mL链霉亲和素溶液,分别点样于微流控基片T、C相应的位点,常温高湿孵育1h,用0.01M PBS冲洗,晾干。
分别将荧光粒子标记溶液、T检测区包被液、C检测区包被液点样于干燥后的微流控基片相应位置,常温干燥后,取盖片压合固定于基片上。
3检测方法
3.1灵敏度及线性检测
按照本发明建立的方法制作成品试剂。用含质量浓度为1%糖的0.1mLPBS缓冲液稀释新冠病毒中和抗体纯品,浓度分别为0.005μg/ml、0.04μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml,分别记为P1-P7。每个浓度点重复测定3次取平均值,分别记录T线信号值、C线信号、T/C比值,以现有竞争方法制成的成品芯片为对照,检测P1-P7,方法同上。并以新冠病毒中和抗体标准液浓度为横坐标,以T/C值为纵坐标,用四参数拟合方程:y=(A-D)/[1+(X/C)^B]+D,其中,A:曲线上渐近线估值;D:曲线下渐近线估值;B:曲线的斜率;C:T/C值。绘制的新冠病毒中和抗体现有技术与本实施例中提供技术对比线性图。
3.2准确度的检测
采用本实施例中提供的技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,对P2,P3和P5进行测定,每个浓度测5次,其检测结果与标定值的相对偏差。
3.3精密度检测
采用本实施例中提供的技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,对P5进行测定,至少重复10次,计算均值和CV。
4检测结果
4.1灵敏度及线性检测结果
见图3,结果表明:采用改进技术制备新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒测得曲线的四参数分别为A=4.23333;B=0.33173;C=11.13292;D=-2.73783;r2=0.99936。采用现有技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A=2.59952;B=1.22361;C=0.21537;D=0.89751;r2=0.99115。与现有技术对比,改进技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒线性梯度明显优于现有技术。改进技术灵敏度高,可达0.005μg/mL,远高于现有技术的灵敏度,而且改进技术检测范围达到0.005μg/mL-20μg/mL,检测范围宽,适用性更强。
4.2准确度检测结果
表5本实施例中提供技术制备试剂盒的准确度检测结果
结果显示:采用本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,测定各浓度标准液的均值与理论值相对偏差均小于5%,表明本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒准确度高。
4.3精密度检测结果
表6本实施例中提供技术制备试剂盒的精密度检测结果
本实施例中提供技术制备的新型冠状病毒中和抗体微流控试剂盒,测定标准液精密度结果显示,采用T/C比值法计算检测结果小于5%,精密度好,表明采用T/C比值法计算检测结果可使得试剂的精密性显著提高。
实施例四:新型冠状病毒中和抗体微流控免疫荧光检测试剂盒抗体中和能力的对比研究
1材料和仪器
1.1新型冠状病毒中和抗体微流控免疫荧光检测试剂盒,本公司生产;
1.2荧光免疫分析仪(F10pro),天津中新科炬生物制药股份有限公司生产并提供。
2方法
采用62例临床样本进行验证,以细胞培养中和试验为对照,分别对现有技术及本发明提供试剂盒进行检测。结果如下。
3结果
3.1细胞培养中和试验与本试剂盒检测结果
表7对照试剂和临床考核试剂配对检测结果
注:A、B、C、D分别表示配对检测的四种结果
表8检测数据基础统计结果
编号 | 数值比 | 百分率(95%可信区间) |
阳性符合率 | 27/28 | 96.43%(81.65%~99.91%) |
阴性符合率 | 34/34 | 100.00%(89.72%~100.00%) |
阳性预期值 | 27/27 | 100.00%(87.23%~100.00%) |
阴性预期值 | 34/35 | 97.14%(85.08%~99.93%) |
总符合率 | 61/62 | 98.39%(91.34%~99.96%) |
表9 Kappa一致性检验统计结果
编号 | 统计值 |
Kappa值 | 0.9673,一致性较好 |
检验结果 | P<0.05 |
3.2细胞培养中和试验与Elisa试剂盒检测结果
表10对照试剂和临床考核试剂配对检测结果
注:A、B、C、D分别表示配对检测的四种结果
表12检测数据基础统计结果
编号 | 数值比 | 百分率(95%可信区间) |
阳性符合率 | 22/28 | 78.57%(59.05%~91.70%) |
阴性符合率 | 30/34 | 88.24%(72.55%~96.70%) |
阳性预期值 | 22/26 | 84.62%(65.13%~95.64%) |
阴性预期值 | 30/36 | 83.33%(67.19%~93.63%) |
总符合率 | 52/62 | 83.87%(72.33%~91.98%) |
表13Kappa一致性检验统计结果
编号 | 统计值 |
Kappa值 | 0.6723,有一定的一致性 |
检验结果 | P<0.05 |
以上结果显示:本发明提供试剂盒与细胞培养中和试验对比结果中,阳性符合率96.43%,阴性符合率100.00%,Kappa值为0.9673,Elisa试剂盒与细胞培养中和试验对比结果中,阳性符合率78.57%,阴性符合率88.24%,Kappa值为0.6723。数据表明,与对照组相比,本发明提供试剂盒检测结果一致性高于Elisa试剂检测结果,表明本发明提供的试剂盒,抗体检测结果准确性高,同时中和抗体中和病毒的能力与细胞培养试验接近,通过本发明构建体外模型的反应方式更能有效评估中和抗体的含量。
注:实施例一-四所述的现有技术采用授权公开号为CN111781354B的专利公开的试剂盒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征在于:包括微流控芯片卡及样本加样管,所述微流控芯片卡上分别设有标记区、T检测区和C检测区,其中,所述标记区用信号粒子标记有能与SARS-CoV-2抗原结合的竞争性物质,所述T检测区包被有能与SARS-CoV-2抗原结合的捕获性物质,所述C检测区包被有用于质控作用的与标记区标记的竞争性物质特异性反应的抗原或特异性识别竞争性物质的抗体,所述样本加样管内预先干燥有纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原,
所述SARS-CoV-2抗原预偶联生物素后再标记纳米颗粒或直接标记纳米颗粒,所述纳米颗粒包括纳米金、纳米银、纳米锌、纳米碳、纳米硒的至少一种,所述SARS-CoV-2抗原含有带标签的肽段,所述标签包括His标签、MFc标签、Flag标签、HA标签的至少一种。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征在于:所述SARS-CoV-2抗原包括S蛋白全长片段或S蛋白部分片段。
3.根据权利要求1或2所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征在于:所述纳米颗粒为纳米金。
4.根据权利要求1或2所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征在于:所述信号粒子包括荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒的至少一种,其中荧光粒子包括荧光素填充微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球的至少一种,所述信号物质粒径在100-1000nm范围内;所述竞争性物质为可与纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原结合的受体蛋白,所述受体蛋白包括ACE2蛋白、AXL蛋白、EGFR蛋白或LDLR蛋白的至少一种。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征在于:所述捕获性物质可与SARS-CoV-2抗原直接结合,包括与SARS-CoV-2抗原特异性反应的受体蛋白,所述受体蛋白包括ACE2蛋白、AXL蛋白、EGFR蛋白或LDLR蛋白的一种。
6.根据权利要求4所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征在于:所述捕获性物质可与SARS-CoV-2抗原间接结合,包括链霉亲和素或生物素,链霉亲和素与纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原上预偶联的生物素发生特异性反应。
7.根据权利要求4所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征在于:所述捕获性物质可与SARS-CoV-2抗原间接结合,包括标签抗体,标签抗体与纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原上含有的标签肽段特异性反应。
8.根据权利要求1或2所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒,其特征在于:所述C检测区包被的抗原包括S蛋白全长片段或S蛋白部分片段,所述C检测区包被的抗体包括ACE2蛋白抗体、AXL蛋白抗体、EGFR蛋白抗体或LDLR蛋白抗体的一种。
9.新型冠状病毒中和性抗体免疫荧光检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:将血清或血浆样本与纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原混合,形成中和抗体-抗原-纳米颗粒的混合样本;
步骤二:使步骤一得到的混合样本流经标记有能与SARS-CoV-2抗原结合的竞争性物质的区域,未结合的纳米颗粒标记的SARS-CoV-2抗原再与区域内信号粒子标记的竞争性物质反应特异性结合,形成信号粒子-竞争性物质-抗原-纳米颗粒的复合物;
使复合物流经包被有能和SARS-CoV-2抗原结合的捕获性物质的T检测区,捕获性物质直接或间接的与复合物中的SARS-CoV-2重组抗原结合,形成信号粒子-竞争性物质-抗原-纳米颗粒的复合物-捕获性物质;
样本继续流经包被有与标记区标记的竞争性物质特异性反应的抗原或特异性识别竞争性物质的抗体的C检测区,用信号粒子标记的过量的未参与反应的竞争性物质与C检测区物质结合,形成抗原或抗体-竞争性物质-信号粒子;
步骤三:检测T检测区和C检测区的信号值,分别记为T信号值和C信号值,计算T信号值/C信号值的比值即为检测结果。
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