JP2002202307A - イムノクロマトグラフ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 迅速且つ簡便であって、しかも、従来公知の
イムノクロマトグラフ法よりも更に高感度なイムノクロ
マトグラフ法を提供する。 【解決手段】 分析対象物及びそれと特異的に結合する
抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免
疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマ
トグラフ法において、金属コロイド標識及び金属硫化物
標識からなる群から選んだ標識に金属イオン及び還元剤
を接触させ、前記還元剤による前記金属イオンの還元に
より生じた金属粒子を前記標識に沈着させ、前記固定化
免疫複合体上の前記沈着物を分析する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規のイムノクロ
マトグラフ法に関する。本発明のイムノクロマトグラフ
法によれば、被検試料中の分析対象物を免疫学的に捕捉
すると同時に、あるいは、捕捉した後、分析対象物を高
感度に分析することができる。本明細書における「分
析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検
出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定
する「測定」とが含まれる。

【０００２】

【従来の技術】天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の
生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用
するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的
及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分
析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特
異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要
する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡
便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法
は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便で
あることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分
野に徐々に普及してきた。しかし、９６穴プレートを用
いた酵素免疫測定法やラテックス凝集法のような従来の
免疫学的測定法は、必ずしも測定の迅速簡便性又は検出
感度を満たすものではなかった。

【０００３】近年、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを指標と
する妊娠診断薬に用いられたことから、測定の迅速簡便
性を満たす方法として脚光を浴びている免疫学的測定法
に、イムノクロマトグラフ法がある。例えば、サンドイ
ッチ法を利用したイムノクロマトグラフ法では、分析対
象物（例えば、抗原）に特異的に結合する第１抗体を特
定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体（例えば、ガラ
ス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロース膜など）中に、
分析対象物と特異的に結合する標識化第２抗体と、分析
対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性
薄膜状支持体の第１抗体を固定した領域上で、分析対象
物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色など
の信号を検出し、分析対象物を測定することができる。
なお、前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク
質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子
を使用することができる。このイムノクロマトグラフ法
は、分析対象物を含む可能性のある検体溶液を滴下した
後、約５〜１０分間静置するだけで測定結果が得られる
迅速且つ簡便な方法である上、分析対象物の検出感度も
酵素免疫測定法に匹敵するほど高感度である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、前記の天然
物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環
境汚染物質は、こうしたイムノクロマトグラフ法におけ
る従来の検出法では検出できない極微量で作用する物質
が多く、それらの迅速、簡便、且つ高感度の検出法の開
発が不可欠である。従来、展開の手段を工夫した技術
（特開平１−３２１６９号公報及び特開平４−２９９２
６２号公報）、着色粒子を工夫した技術（特開平５−１
０９５０号公報及び特開平５−１３３９５６号公報）、
展開部材を工夫した技術（特開平７−３１８５６０号公
報）、アビジン−ビオチン結合を利用した技術（特開平
１０−６８７３０号公報）、及び酵素免疫法を利用した
技術（特開平１１−６９９９６号公報）等、高感度化を
目指した数多くの改良技術が開示されているが、いまだ
満足することのできる技術は提供されていないのが実情
である。従って、本発明の課題は、迅速且つ簡便であっ
て、しかも、従来公知のイムノクロマトグラフ法よりも
更に高感度なイムノクロマトグラフ法を提供することに
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
る、分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗
原による免疫反応を利用し、固定化された免疫複合体に
由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフ法
において、金属コロイド標識及び金属硫化物標識からな
る群から選んだ標識に金属イオン及び還元剤を接触さ
せ、前記還元剤による前記金属イオンの還元により生じ
た金属粒子を前記標識に沈着させ、前記固定化免疫複合
体上の前記沈着物を分析することを特徴とする、前記イ
ムノクロマトグラフ法により解決することができる。

【０００６】本明細書において、「イムノクロマトグラ
フ法」とは、特に限定されるものではないが、例えば、
その工程中にクロマトグラフ法（特には、薄層クロマト
グラフ法又はペーパークロマトグラフ法）を用いる工程
を含み、１又は複数の抗原抗体反応の少なくとも一部を
クロマトグラフ用の薄膜状支持体上で展開しながら実施
する免疫学的分析法を挙げることができる。なお、本明
細書において、「薄膜状支持体」は、固定相を意味し、
例えば、薄層クロマトグラフ法では、支持板（例えば、
ガラス板、アルミニウム板、又はプラスチック板）に固
着させた薄層を意味し、ペーパークロマトグラフ法で
は、濾紙を意味する。

【０００７】

【発明の実施の形態】一般に、イムノクロマトグラフ法
においては、少なくとも分析対象物と固定化抗体又は抗
原と標識とを含む免疫複合体を不溶性薄膜状支持体上
（又は前記支持体内）に形成させ、その免疫複合体に由
来する標識の信号を分析する。本発明方法によれば、標
識として金属コロイド標識又は金属硫化物標識（以下、
金属コロイド標識と金属硫化物標識とを併せて、金属系
標識と称することがある）を用いるイムノクロマトグラ
フ法において、前記金属系標識の信号を増幅あるいは増
感させることができる。具体的には、前記免疫複合体の
形成過程において、あるいは前記免疫複合体の形成後
に、還元剤及び金属イオンを接触させ、還元剤によって
金属イオンを還元して金属粒子を生成させると、その金
属粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に
沈着するので、前記金属系標識が増幅され、分析対象物
の分析を高感度に実施することができる。従って、本発
明のイムノクロマトグラフ法は、還元剤による金属イオ
ンの還元作用により生じた金属粒子を用いて、免疫複合
体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅され
た信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来
公知のイムノクロマトグラフ法をそのまま適用すること
ができる。

【０００８】本発明のイムノクロマトグラフ法として
は、抗原抗体反応の実施順序、固定化及び標識化する対
象化合物、標準化合物の使用の有無、並びに使用する抗
体の数などに応じて種々の方式が存在する。なお、本明
細書において「標準化合物」とは、分析対象化合物に相
当する化合物を意味する。例えば、被検試料中のラクト
フェリンを分析する場合には、市販のラクトフェリンを
使用することができ、被検試料中のオカダ酸を分析する
場合には、市販のオカダ酸を使用することができる。

【０００９】本発明によるイムノクロマトグラフ法の具
体的態様としては、例えば、 （１）分析対象物（抗原）を含む可能性のある被検試料
と、標識を有する既知量の標準化合物（以下、標識化標
準化合物と称する）とを展開させながら接触させる工
程； （２）前記工程（１）と同時又は前記工程（１）の終了
後に、前記分析対象物に対して特異性を有すると共に適
当な不溶性薄膜状支持体上に固定させた抗体に、前記標
識化標準化合物を展開させながら接触させる工程； （３）前記固定化抗体と結合した標識化標準化合物と、
前記固定化抗体と結合していない標識化標準化合物とを
分離する工程；及び （４）前記固定化抗体と結合した標識化標準化合物の標
識に、金属イオン及び還元剤を接触させることにより、
前記還元剤による前記金属イオンの還元により生じた金
属粒子を前記標識に沈着させ、生じた前記沈着物を分析
する工程を含む、イムノクロマトグラフ法を挙げること
ができる。 この方法は、通常、抗体固定化競合法（直接的競合法及
び間接的競合法を含む）と呼ばれる方法に、本発明のイ
ムノクロマトグラフ法を適用したものである。なお、前
記態様は、前記工程（４）において金属イオン及び還元
剤を接触させる態様であるが、本発明のイムノクロマト
グラフ法においては、前記工程（１）〜（３）において
金属イオン及び還元剤を接触させることもできる。

【００１０】また、本発明によるイムノクロマトグラフ
法の別の具体的態様としては、例えば、 （１）分析対象物（抗原）に対して特異性を有すると共
に標識を有する既知量の抗体（以下、標識化抗体と称す
る）と、分析対象物を含む可能性のある被検試料とを、
展開させながら、あるいは、展開前に、接触させる工
程； （２）前記工程（１）と同時又は前記工程（１）の終了
後に、適当な不溶性薄膜状支持体上に固定させた既知量
の標準化合物（以下、固定化標準化合物と称する）に、
前記標識化抗体を展開させながら接触させる工程； （３）前記固定化標準化合物と結合した標識化抗体と、
前記固定化標準化合物と結合していない抗体とを分離す
る工程；及び （４）固定化標準化合物と結合した標識化抗体の標識
に、金属イオン及び還元剤を接触させることにより、前
記還元剤による前記金属イオンの還元により生じた金属
粒子を前記標識に沈着させ、生じた前記沈着物を分析す
る工程を含む、イムノクロマトグラフ法を挙げることが
できる。 この方法も、通常、抗原固定化競合法（直接的競合法及
び間接的競合法を含む）と呼ばれる方法に、本発明のイ
ムノクロマトグラフ法を適用したものである。なお、前
記態様は、前記工程（４）において金属イオン及び還元
剤を接触させる態様であるが、本発明のイムノクロマト
グラフ法においては、前記工程（１）〜（３）において
金属イオン及び還元剤を接触させることもできる。

【００１１】本発明によるイムノクロマトグラフ法の更
に別の具体的態様としては、例えば、 （１）分析対象物（抗原）に対して特異性を有する第１
抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体上に固定させる工
程； （２）前記分析対象物を含む可能性のある被検試料を、
前記固定化第１抗体に接触させる工程； （３）前記分析対象物に対して前記第１抗体とは異なる
部位で結合すると共に標識を有する第２抗体を、過剰量
で、前記工程（２）より以前に、同時に、あるいは、終
了後に接触させる工程；及び （４）固定化第１抗体と分析対象物との免疫複合体に結
合した第２抗体上の標識に、金属イオン及び還元剤を接
触させることにより、前記還元剤による前記金属イオン
の還元により生じた金属粒子を前記標識に沈着させ、生
じた前記沈着物を分析する工程を含む、イムノクロマト
グラフ法を挙げることができる。 この方法は、通常、サンドウィッチ法と呼ばれる方法
に、本発明のイムノクロマトグラフ法を適用したもので
ある。なお、前記態様は、前記工程（４）において金属
イオン及び還元剤を接触させる態様であるが、本発明の
イムノクロマトグラフ法においては、前記工程（３）に
おいて金属イオン及び還元剤を接触させることもでき
る。

【００１２】本発明によるイムノクロマトグラフ法の更
に別の具体的態様としては、例えば、 （１）分析対象物（抗体）に対して特異的に結合する抗
原を、適当な不溶性薄膜状支持体上に固定させる工程； （２）前記分析対象物を含む可能性のある被検試料を、
前記固定化抗原に接触させる工程； （３）前記分析対象物に対して特異性を有すると共に標
識を有する第２抗体を、過剰量で、前記工程（２）より
以前に、同時に、あるいは、終了後に接触させる工程；
及び （４）固定化抗原と分析対象物との免疫複合体に結合し
た第２抗体上の標識に、金属イオン及び還元剤を接触さ
せることにより、前記還元剤による前記金属イオンの還
元により生じた金属粒子を前記標識に沈着させ、生じた
前記沈着物を分析する工程を含む、イムノクロマトグラ
フ法を挙げることができる。この方法は、通常、固定抗
原法と呼ばれる方法に、本発明のイムノクロマトグラフ
法を適用したものである。なお、前記態様は、前記工程
（４）において金属イオン及び還元剤を接触させる態様
であるが、本発明のイムノクロマトグラフ法において
は、前記工程（３）において金属イオン及び還元剤を接
触させることもできる。また、本発明は、その他公知の
イムノクロマトグラフ法に広く応用することができる。

【００１３】本発明のイムノクロマトグラフ法では、分
析対象物（抗原又は抗体）と特異的に結合する抗体若し
くは抗原、又は標準化合物を標識するのに用いる標識と
して、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いる。
前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通
常のイムノクロマトグラフ法に用いることができる標識
である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイ
ド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、
又は銀コロイドを挙げることができ、金属硫化物標識と
しては、例えば、鉄、銀、鉛、銅、カドミウム、ビスマ
ス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げること
ができる。本発明のイムノクロマトグラフ法において
は、これらの金属コロイド標識及び／又は金属硫化物標
識の１又はそれ以上を標識として用いることができる。

【００１４】本発明のイムノクロマトグラフ法におい
て、標識の信号増幅に使用することのできる金属イオン
としては、還元により生じる金属粒子が標識を核として
沈着することのできる金属イオンである限り、特に限定
されるものではないが、例えば、銀イオン、白金イオ
ン、又は金イオンを挙げることができる。本発明のイム
ノクロマトグラフ法では、前記銀イオンとしては、例え
ば、硝酸銀、酢酸銀、又は乳酸銀を、液状（例えば、銀
イオンの水溶液又は水性有機溶液）又は固体状で使用す
ることができる。

【００１５】本発明のイムノクロマトグラフ法におい
て、標識の信号増幅に使用することのできる還元剤とし
ては、前記金属イオンを還元して金属粒子を発生するこ
との可能な還元剤である限り、特に限定されるものでは
ないが、例えば、ハイドロキノン又はその誘導体（例え
ば、ブロモハイドロキノン）を挙げることができる。

【００１６】本発明のイムノクロマトグラフ法では、還
元剤による金属イオンの還元により生じた金属粒子が、
前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識を核として沈
着する反応を利用することにより、標識の信号増幅を実
施する。なお、前記反応それ自体は、公知の方法［例え
ば、Ｄａｎｓｃｈｅｒ及びＮｏｒｇａａｒｄの方法
（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３
１，１３９４，１９８３）、Ｈｏｌｇａｔｅらの方法
（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３
１，９３８，１９８３）、藤森らの方法（Ａｒｃｈ．Ｈ
ｉｓｔｏｌ．Ｊａｐ．，４８，４４９，１９８５）、中
村らの方法（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍａｌ．Ｊ．，１７，４
７，１９８５）、Ｄａｎｓｃｈｅｒの方法（Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７１，１，１９８１）、Ｓｋｕｔ
ｅｌｓｋｙらの方法（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ．，８６，２９１，１９８７）、Ｈａｃｋｅｒらの方
法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，２１
３，１９８８）、Ｓｃｏｐｓｉ及びＬａｒｓｓｏｎの方
法（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８２，３２１，１
９８５）、Ｍｏｅｒｅｍａｎｓらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４，３５３，１９８３）］
である。

【００１７】本発明のイムノクロマトグラフ法では、特
に限定されるものではないが、例えば、ｐＨ３〜４のｐ
Ｈ調節剤（例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、又は
乳酸緩衝液）中で、保護コロイド（例えば、アラビアゴ
ム）の共存下あるいは非共存下で、金属イオン［特に
は、銀イオン（例えば、硝酸銀、酢酸銀、又は乳酸銀］
の還元剤（例えば、ハイドロキノン又はブロモハイドロ
キノン）による還元作用で生じる金属粒子（例えば、銀
粒子）を前記免疫複合体上の標識を核として沈着させ、
前記免疫複合体上の沈着物を分析することができる。

【００１８】前記沈着物の分析方法は、特に限定される
ものではないが、例えば、目視により、あるいは、反射
光を適当な測定装置（例えば、反射光測定装置又はスキ
ャナー等）で分析することにより実施することができ
る。

【００１９】本発明のイムノクロマトグラフ法では、標
識と金属イオン及び還元剤とを接触させる方法の具体的
態様は特に限定されるものではないが、例えば、被検試
料を展開した後に、免疫複合体上の標識に対して、金属
イオン及び還元剤の両方を含む溶液を添加することもで
きるし、あるいは、金属イオン溶液と還元剤溶液とを同
時又は順に添加することもできる。あるいは、標識化標
準化合物、標識化抗体、若しくは標識化第２抗体、又は
被検試料を含む溶液に、予め金属イオン及び還元剤を更
に添加した溶液を用いて、薄膜状支持体上で同時に展開
させることもできる。更には、被検試料を展開した後
に、金属イオン及び還元剤を含む溶液を展開させること
もできる。

【００２０】本発明のイムノクロマトグラフ法で分析す
ることのできる被検試料としては、分析対象物を含む可
能性のある試料である限り、特に限定されるものではな
く、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の
体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、
尿、膿、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、
臓器、組織、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥
体を挙げることができる。

【００２１】本発明のイムノクロマトグラフ法では、前
記被検試料をそのままで、あるいは、前記被検試料を適
当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形
で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得ら
れる希釈液の形で、用いることができる。前記抽出用溶
媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒
（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるい
は、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を
実施することができる水混和性有機溶媒を用いることも
でき、有機溶媒と水との混合物が好ましい。前記水混和
性有機溶媒としては、例えば、アルコール化合物（例え
ば、炭素原子１〜３個の低級アルコール；特には、メチ
ルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコ
ール、又はイソプロピルアルコール）、ケトン化合物
（例えば、炭素原子２〜４個の低級脂肪族ケトン；特に
は、メチルエチルケトン又はアセトン）、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、若しくはジオキサン、又はこれらの
混合物を挙げることができ、分析対象物の種類に応じて
適宜選択することができる。

【００２２】本発明のイムノクロマトグラフ法において
は、分析対象物に対して特異性を有する抗体（サンドウ
ィッチ法では、抗原決定基が相互に異なる第１抗体及び
第２抗体）として、特に限定されるものではないが、例
えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清か
ら調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリ
ン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓
細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル
抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）
₂、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができ
る。これらの抗体の調製は、常法により行なうことがで
きる。

【００２３】本発明のイムノクロマトグラフ法に使用す
ることのできるイムノクロマトグラフ用小片としては、
通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイ
ムノクロマトグラフ用小片である限り、特に限定される
ものではなく、例えば、図１に模式的に示すイムノクロ
マトグラフ用小片を用いることができる。図１に示すイ
ムノクロマトグラフ用小片１０は、展開方向（図１にお
いて矢印Ａで示す方向）の上流から下流に向かって、試
料添加パッド１、標識化物質保持パッド２、固定化メン
ブレン３、及び吸収パッド４がこの順に、粘着シート５
上に配置されている。

【００２４】前記固定化メンブレン３は、分析対象物と
特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である
検出ゾーン３ａを有し、所望により、コントロール用抗
体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン
３ｂを更に有する。前記標識化物質保持パッド２は、標
識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸
収パッドに塗布した後、それを乾燥することにより調製
することができる。また、前記試料添加パッド１は、例
えば、適当な支持体（例えば、グラスファイバーパッ
ト）を適当な溶液（例えば、０．５％ショ糖、０．２％
Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．１％ポリビニールアルコール
を含む水溶液）に浸し、乾燥することにより調製するこ
とができる。

【００２５】以下、本発明のイムノクロマトグラフ法に
ついて、その具体的な実施態様である抗体固定化競合法
（抗体固定化直接的競合法及び抗体固定化間接的競合法
を含む）、抗原固定化競合法（抗原固定化直接的競合法
及び抗原固定化間接的競合法を含む）、サンドウィッチ
法、及び固定抗原法にそれぞれ適用した各態様に基づい
て、順に説明する。

【００２６】本発明のイムノクロマトグラフ法を抗体固
定化競合法に適用した態様（以下、単に、抗体固定化競
合法と称する）では、特に限定されるものではないが、
例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施する
ことができる。まず、分析対象物（抗原）に対して特異
性を有する抗体を、先に述べた方法により予め調製して
おき、その抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体（例え
ば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロース膜等）
上に固定しておく。また、標準化合物を、金属コロイド
標識又は金属硫化物標識を用いて、予め標識化してお
く。分析対象物（抗原）を含む可能性のある被検試料
（又はその抽出液）と、前記標識化標準化合物とを展開
させながら接触させ、それと同時に、あるいは、その終
了後に、前記固定化抗体に、前記標識化標準化合物を展
開させながら接触させると、その被検試料中に分析対象
物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗
原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうこと
ができる。

【００２７】抗体固定化間接的競合法では、被検試料と
既知量の標識化標準化合物（すなわち、標識化抗原）と
を接触させた後、前記固定化抗体と接触させる。従っ
て、被検試料に由来する分析対象物と結合していない固
定化抗体が、標識化標準化合物と結合する。一方、抗体
固定化直接的競合法では、被検試料と既知量の標識化標
準化合物（すなわち、標識化抗原）との接触と同時に、
前記固定化抗体と接触させる。従って、既知量の標識化
標準化合物と、被検試料に由来する未知量の分析対象物
とが、拮抗的に固定化抗体と結合する。

【００２８】抗体固定化競合法（抗体固定化直接的競合
法及び抗体固定化間接的競合法を含む）では、前記不溶
性薄膜状支持体上の固定化抗体と、標識化標準化合物
（すなわち、標識化抗原）との反応が終了した後、固定
化抗体と結合した標識化標準化合物と、固定化抗体と結
合しなかった標識化標準化合物とを分離し、続いて、例
えば、不溶性薄膜状支持体における固定化抗体を固定し
た領域に、金属イオン及び還元剤を滴下することによ
り、固定化抗体と結合した標識化抗原の標識からの信号
を増幅する。あるいは、標識化標準化合物に金属イオン
及び還元剤を添加し、同時に薄膜状支持体に添加するこ
とにより、固定化抗体と結合した標識化標準化合物の標
識からの信号を増幅する。前記分離は、例えば、緩衝液
による洗浄によって行なうことができる。

【００２９】本発明のイムノクロマトグラフ法を抗原固
定化競合法に適用した態様（以下、単に抗原固定化競合
法と称する）では、特に限定されるものではないが、例
えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施するこ
とができる。まず、分析対象物（抗原）に対して特異性
を有する抗体を、先に述べた方法により予め調製してお
く。また、前記抗体を、金属コロイド標識又は金属硫化
物標識を用いて、予め標識化しておく。更に、既知量の
標準化合物（抗原）を、適当な不溶性薄膜状支持体（例
えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロース膜
等）上に固定しておく。

【００３０】抗原固定化間接的競合法では、既知量の前
記標識化抗体と、分析対象物（抗原）を含む可能性のあ
る被検試料（又はその抽出液）との接触工程が終了して
から、更に、既知量の固定化標準化合物（抗原）と接触
させる。従って、被検試料に由来する分析対象物と結合
していない標識化抗体が、不溶性薄膜状支持体の既知量
の固定化標準化合物と結合する。一方、抗原固定化直接
的競合法では、既知量の前記標識化抗体と、分析対象物
（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出
液）との接触工程と同時に、既知量の固定化標準化合物
（抗原）と接触させる。従って、被検試料に由来する未
知量の分析対象物と、不溶性薄膜状支持体の既知量の固
定化標準化合物とが、拮抗的に既知量の標識化抗体と結
合する。

【００３１】抗原固定化競合法（抗原固定化直接的競合
法及び抗原固定化間接的競合法を含む）では、前記不溶
性薄膜状支持体上の固定化標準化合物（すなわち、固定
化抗原）と、標識化抗体との反応が終了した後、固定化
標準化合物と結合した標識化抗体と、固定化標準化合物
と結合しなかった標識化抗体とを分離し、続いて、例え
ば、不溶性薄膜状支持体における固定化標準化合物を固
定した領域に、金属イオン及び還元剤を滴下することに
より、固定化標準化合物と結合した標識化抗体の標識か
らの信号を増幅する。あるいは、標識化抗体に金属イオ
ン及び還元剤を添加し、同時に薄膜状支持体に添加する
ことにより、固定化標準化合物と結合した標識化抗体の
標識からの信号を増幅する。前記分離は、例えば、緩衝
液による洗浄によって行なうことができる。

【００３２】本発明のイムノクロマトグラフ法をサンド
ウィッチ法に適用した態様（以下、単に、サンドウィッ
チ法と称する）では、特に限定されるものではないが、
例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施する
ことができる。まず、分析対象物（抗原）に対して特異
性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法に
より予め調製しておく。また、第２抗体を、金属コロイ
ド標識又は金属硫化物標識を用いて、予め標識化してお
く。第１抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体（例えば、
ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロース膜等）上に
固定し、分析対象物（抗原）を含む可能性のある被検試
料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中
に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起き
る。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に
行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応
後に、過剰量の標識化第２抗体を更に接触させると、被
検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化第１
抗体と分析対象物（抗原）と標識化第２抗体とからなる
免疫複合体が形成される。

【００３３】サンドウィッチ法では、固定化第１抗体と
分析対象物（抗原）と第２抗体との反応が終了した後、
前記免疫複合体を形成しなかった標識化第２抗体を除去
し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定
化第１抗体を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を
滴下することにより、前記免疫複合体を形成した標識化
第２抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識
化第２抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時に薄
膜状支持体に添加することにより、前記免疫複合体を形
成した標識化第２抗体の標識からの信号を増幅する。

【００３４】本発明のイムノクロマトグラフ法を固定抗
原法に適用した態様（以下、単に、固定抗原法と称す
る）では、特に限定されるものではないが、例えば、以
下の手順により分析対象物の分析を実施することができ
る。まず、分析対象物（抗体）に対して特異性を有する
第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。
また、前記第２抗体を、金属コロイド標識又は金属硫化
物標識を用いて、予め標識化しておく。分析対象物（抗
体）が特異的に結合する抗原を、適当な不溶性薄膜状支
持体（例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ
ース膜等）上に固定し、分析対象物（抗体）を含む可能
性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、
その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原
抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗
体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応
と同時又は反応後に、過剰量の標識化第２抗体を更に接
触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合に
は、固定化抗原と分析対象物（抗体）と標識化第２抗体
とからなる免疫複合体が形成される。

【００３５】固定抗原法では、固定化抗原と分析対象物
（抗体）と第２抗体との反応が終了した後、前記免疫複
合体を形成しなかった標識化第２抗体を除去し、続い
て、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化抗原を
固定した領域に、金属イオン及び還元剤を滴下すること
により、前記免疫複合体を形成した標識化第２抗体の標
識からの信号を増幅する。あるいは、標識化第２抗体に
金属イオン及び還元剤を添加し、同時に薄膜状支持体に
添加することにより、前記免疫複合体を形成した標識化
第２抗体の標識からの信号を増幅する。

【００３６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】《金コロイド標識抗体の銀増感》 （１）抗体固定化メンブレンの作製 ナイロン６６製メンブレン（Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ Ａ
ＢＣ；孔径＝３．０μｍ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに切断した。メ
ンブレンの一端から１５ｍｍの位置に、ウサギ抗マウス
イムノグロブリン（Ｉｇ）抗体（ＤＡＫＯ製）［濃度１
ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で希釈後、透析した溶液］を幅１ｍｍの直線状に塗
布した後、室温下で１時間、続いて、３７℃で３０分間
静置し、抗体を固定化した。メンブレンを、０．５％モ
ノエタノールアミンを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸塩
緩衝生理食塩液（ｐＨ８．５）に浸し、室温下で３０分
間静置し、ブロッキングした。更に、メンブレンを、
０．５％カゼインを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌマレイン酸
緩衝生理食塩液（ｐＨ７．５）に浸し、室温下で３０分
間静置し、更にブロッキングした。メンブレンを生理食
塩液で１回、蒸留水で３回洗浄し、過剰のブロッキング
液を除いた後、シリカゲルデシケータ内に保存し、室温
下で一夜乾燥させ、イムノクロマトグラフ用抗体固定化
メンブレン（以下、単に抗体固定化メンブレンと称す
る）とした。

【００３７】（２）金コロイド標識マウスＩｇＧ懸濁液
の調製 マウスＩｇＧ水溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを、２
ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇緩衝液［以下、ボラックス
（Ｂｏｒａｘ）緩衝液と称する］（ｐＨ９．２）３，０
００ｍＬ中で４℃にて一夜透析した。マウスＩｇＧ水溶
液を、４℃にて１００，０００×ｇで１時間遠心分離し
た後、その上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分
離したボラックス緩衝液（ｐＨ９．２）で、マウスＩｇ
Ｇ濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。

【００３８】一方、金コロイド液（ＧＯＬＤ ＣＯＬＬ
ＯＩＤ ２０；Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）１００ｍＬを、０．２ｍｏ
ｌ／Ｌ−Ｋ₂ＣＯ₃溶液でｐＨ９．０に調整した。ｐＨ調
整後の金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、マウスＩ
ｇＧ希釈液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹
拌した。更に、撹拌しながら１０％牛血清アルブミン
（Ａ−７８８８；Ｓｉｇｍａ製；以下、ＢＳＡと称す
る）溶液（ｐＨ９．２；４℃にて１００，０００×ｇで
１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを徐々に滴下した
後、室温下で３０分間撹拌した。この溶液に５％ショ糖
と０．２％Ｔｗｅｅｎ２０とを含む水溶液（０．４５μ
ｍフィルター濾液）２．５ｍＬを加え、混和した後、１
０℃にて１６，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を
除去した。

【００３９】沈殿した金コロイド標識マウスＩｇＧを、
０．５％ショ糖及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むボ
ラックス緩衝液（ｐＨ８．０；０．４５μｍフィルター
濾液）２０ｍＬに再懸濁し、１０℃にて１６，０００×
ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿し
た金コロイド標識マウスＩｇＧを、０．５％ショ糖及び
０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むボラックス緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）２０ｍＬに再懸濁し、１０℃にて１６，００
０×ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。最後に、
沈殿した金コロイド標識マウスＩｇＧを、０．５％ショ
糖及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むボラックス緩衝
液（ｐＨ８．０）に再懸濁した後、粒子密度が約１０¹³
／ｍＬ（波長５２０ｎｍにおける吸光度＝約１４）にな
るように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試
験管に移し、密栓して４℃に保存し、イムノクロマトグ
ラフ用金コロイド標識マウスＩｇＧ（以下、金コロイド
抗体と称する）懸濁液とした。

【００４０】（３）金コロイド抗体保持パッドの作製 前記実施例１（２）で調製した金コロイド抗体懸濁液
を、金コロイド粒子密度が約３×１０¹²／ｍＬ、約１０
¹²／ｍＬ、約３×１０¹¹／ｍＬ、約１０¹¹／ｍＬ、約３
×１０¹⁰／ｍＬ、約１０¹⁰／ｍＬ、約３×１０⁹／ｍ
Ｌ、約１０⁹／ｍＬ、約３×１０⁸／ｍＬ、約１０⁸／ｍ
Ｌ、約３×１０⁷／ｍＬ、約１０⁷／ｍＬ、約３×１０⁶
／ｍＬ、又は約１０⁶／ｍＬになるように、５．０％シ
ョ糖を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．
２）で希釈した後、各希釈液１０μＬを吸収パッドＰＲ
ＥＭ１４２０（５ｍｍ×５ｍｍ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ製）に塗布し、シリカゲルデシケーター内
で室温下、一夜減圧（≦１００ｍｍＨｇ）乾燥して、イ
ムノクロマトグラフ用金コロイド抗体保持パッド（以
下、金コロイド抗体保持パッドと称する）を調製した。

【００４１】（４）試料添加パッドの作製 グラスファイバーパッド（５ｍｍ×１８ｍｍ）を０．５
％ショ糖、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．１％ポリ
ビニールアルコール（重合度＝約５００）を含む水溶液
に浸した後、過剰の水溶液を除去し、風乾して、イムノ
クロマトグラフ用試料添加パッド（以下、試料添加パッ
ドと称する）を調製した。

【００４２】（５）吸収パッドの作製 セルロースパッド（ＡＰ１５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃ
ｏａｐｏｒａｔｉｏｎ製）を、５ｍｍ×２０ｍｍのサイ
ズに切断し、イムノクロマトグラフ用吸収パッド（以
下、吸収パッドと称する）とした。

【００４３】（６）金コロイド抗体イムノクロマトグラ
フ小片の作製 ５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティック粘
着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して上流
側から下流側に向かって、前記実施例１（４）で調製し
た試料添加パッド、前記実施例１（３）で調製した金コ
ロイド抗体保持パッド、前記実施例１（１）で調製した
抗体固定化メンブレン、及び前記実施例１（５）で調製
した吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と
１ｍｍ重ね合わせて貼付し、金コロイド抗体イムノクロ
マトグラフ小片とした。

【００４４】（７）金コロイド抗体イムノクロマトグラ
フ小片の検出感度の評価 異なった粒子密度の金コロイド抗体を一定量保持した、
前記実施例１（６）で調製した金コロイド抗体イムノク
ロマトグラフ小片（金コロイドの各粒子密度につき、２
本ずつ）を水平に静置し、各々の試料添加パッドに、
０．５％ショ糖、０．５％ＢＳＡ、及び０．２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝生理食
塩液（以下、移動相緩衝液と称する）５０μＬを滴下
し、室温下で１０分間展開した。２本の内、一方の金コ
ロイド抗体イムノクロマトグラフ小片におけるメンブレ
ン上のウサギ抗マウスＩｇ抗体を固定化した部分（以
下、検出ゾーンと称する）の金コロイド標識抗体の捕捉
に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視判定した。ま
た、残るもう一方の金コロイド抗体イムノクロマトグラ
フ小片における検出ゾーン上に、銀増感液［Ｓｉｌｖｅ
ｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．ＳＥＫＢ２
５０）；Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ製］２０μＬを滴下し、室温下で１０
分間静置した後、金コロイド抗体の捕捉及び銀増感に基
づく褐色の着色の有無を判定した。更に、そのままの状
態で３０分間静置した後、金コロイド抗体の捕捉及び銀
増感に基づく褐色の着色の有無を判定した。

【００４５】結果を表１に示す。表１において、「銀増
感法」は、銀増感液滴下後、１０分間放置した後の結
果を示し、「銀増感法」は、銀増感液滴下後、４０分
間放置した後の結果を示す。表１において、「＋＋＋」
は、検出ゾーンの着色が充分に確認することができるこ
とを意味し、「＋＋」は、検出ゾーンの着色が、前記
「＋＋＋」よりもわずかに薄いが、充分に着色を確認す
ることができることを意味し、「＋」は、検出ゾーンの
着色が、前記「＋＋＋」よりもかなり薄いが、充分に着
色を確認することができることを意味し、「±」は、検
出ゾーンの着色が、前記「＋＋＋」よりも相当に薄く、
ごくわずかに着色を確認することができることを意味
し、「−」は、検出ゾーンの着色が確認されないことを
意味する。

【００４６】金コロイド抗体の捕捉に基づく赤紫〜紫色
の着色の場合、金コロイド粒子密度が約１０¹⁰／ｍＬ
（粒子数＝１０⁸）まで検出ゾーンの着色を確認するこ
とができたに留まった。それに対して、金コロイド抗体
の捕捉及び銀増感に基づく褐色の着色の場合、１０分間
静置した後でも、金コロイド粒子密度が約１０⁸／ｍＬ
（粒子数＝１０⁶）まで検出ゾーンの着色を確認するこ
とができ、金コロイド抗体の捕捉に基づく赤紫〜紫色の
着色のみの場合と比較して１／１００の粒子密度まで検
出することができた。また、更に３０分間静置した後で
は、金コロイド粒子密度が約１０⁷／ｍＬ（粒子数＝１
０⁵）まで検出ゾーンの着色を確認することができ、金
コロイド抗体の捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色のみの場
合と比較して１／１０００の粒子密度まで検出すること
ができた。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【実施例２】《サンドウィッチイムノクロマトグラフ法
によるラクトフェリンの測定》 （１）ラクトフェリンのサンドウィッチイムノクロマト
グラフ法用メンブレンの作製 メンブレンの一端から１５ｍｍの位置に塗布したウサギ
抗マウスイムノグロブリン抗体に加え、更に、メンブレ
ンの一端から１０ｍｍの位置に、マウスモノクローナル
抗ラクトフェリン抗体１７Ｂ０４−０８［濃度１ｍｇ／
ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希
釈後、透析した溶液］を幅１ｍｍの直線状に塗布したこ
と以外は、前記実施例１（１）の操作を繰り返すことに
より、ラクトフェリンのサンドウィッチイムノクロマト
グラフ法用メンブレン（以下、１７Ｂ０４−０８メンブ
レンと称する）を調製した。なお、前記マウスモノクロ
ーナル抗ラクトフェリン抗体１７Ｂ０４−０８は、ヒト
ラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ ＬＯ５２０）を免疫原と
して、常法によりマウスを免疫して調製した。

【００４９】（２）金コロイド標識マウスモノクローナ
ル抗ラクトフェリン抗体懸濁液の調製 マウスＩｇＧの代わりに、前記実施例２（１）で使用し
た１７Ｂ０４−０８抗体とラクトフェリン分子に対する
結合部位の異なるマウスモノクローナル抗ラクトフェリ
ン抗体３２Ｄ０１−１０を用いたこと以外は、前記実施
例１（２）の操作を繰り返すことにより、ラクトフェリ
ンのイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識抗体（以
下、３２Ｄ０１−１０金コロイドと称する）懸濁液を調
製した。なお、前記マウスモノクローナル抗ラクトフェ
リン抗体３２Ｄ０１−１０は、ヒトラクトフェリン（Ｓ
ｉｇｍａ ＬＯ５２０）を免疫原として、常法によりマ
ウスを免疫して調製した。

【００５０】（３）イムノクロマトグラフ用金コロイド
抗体保持パッドの作製 前記実施例２（２）で調製した３２Ｄ０１−１０金コロ
イド懸濁液を、金コロイド粒子密度が約２．１×１０¹²
／ｍＬ（波長５２０ｎｍにおける吸光度＝約３．０）に
なるように、５．０％ショ糖を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン
酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した後、得られた希釈
液１０μＬを吸収パッドＰＲＥＭ１４２０（５ｍｍ×５
ｍｍ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）に塗布
し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦
１００ｍｍＨｇ）乾燥して、イムノクロマトグラフ用金
コロイド抗体保持パッド（以下、３２Ｄ０１−１０金コ
ロイド保持パッドと称する）を調製した。

【００５１】（４）ラクトフェリンのサンドウィッチイ
ムノクロマトグラフ小片の作製 ５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティック粘
着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して上流
側から下流側に向かって、前記実施例１（４）で調製し
た試料添加パッド、前記実施例２（３）で調製した３２
Ｄ０１−１０金コロイド保持パッド、前記実施例２
（１）で調製した１７Ｂ０４−０８メンブレン、及び前
記実施例１（５）で調製した吸収パッドの順に、各々そ
の両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、ラ
クトフェリンのサンドウィッチイムノクロマトグラフ小
片を調製した。

【００５２】（５）ラクトフェリンのサンドウィッチイ
ムノクロマトグラフ小片の検出感度の評価 前記実施例２（４）で調製したラクトフェリンのサンド
ウィッチイムノクロマトグラフ小片を水平に静置し、各
々の試料添加パッドに、前記移動相緩衝液に溶解したラ
クトフェリン標準溶液（濃度＝０．１ｎｇ／ｍＬ、０．
２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、
１．０ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、３．０ｎｇ／ｍ
Ｌ、５．０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍ
Ｌ、３０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ
／ｍＬ）５０μＬを滴下し、室温下で１０分間展開し
た。ラクトフェリンのサンドウィッチイムノクロマトグ
ラフ小片における１７Ｂ０４−０８メンブレン上の１７
Ｂ０４−０８抗体を固定化した部分（すなわち、検出ゾ
ーン）の３２Ｄ０１−１０金コロイドの捕捉に基づく赤
紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ラクトフェリン標
準溶液の最少検出濃度を判定した（検出ゾーンにわずか
でも赤紫〜紫色の着色が認められたラクトフェリン標準
溶液の濃度を最少検出濃度とした）。

【００５３】続いて、直ちに各々のラクトフェリンのサ
ンドウィッチイムノクロマトグラフ小片における前記検
出ゾーン上に、銀増感液５０μＬを滴下し、室温下で１
０分間静置した後、３２Ｄ０１−１０金コロイドの捕捉
及び金コロイドの銀増感に基づく褐色の着色の有無を目
視観察し、ラクトフェリン標準溶液の最少検出濃度を判
定した（検出ゾーンにわずかでも褐色の着色が認められ
たラクトフェリン標準溶液の濃度を最少検出濃度とし
た）。

【００５４】結果を表２に示す。表２において、「＋」
は、検出ゾーンの着色が、コントロールゾーン（ラクト
フェリンのサンドウィッチイムノクロマトグラフ小片に
おける１７Ｂ０４−０８メンブレン上のウサギ抗マウス
イムノグロブリン抗体を固定化した部分）の着色と同程
度に濃いか、あるいは、薄くても、着色が充分に目視判
定ができる程度であることを意味し、「±」は、検出ゾ
ーンの着色が、コントロールゾーンと比較してかなり薄
く、ごくわずかな着色が目視判定することができる程度
であることを意味し、「−」は、コントロールゾーンの
着色は認められるが、検出ゾーンの着色が目視判定する
ことができないことを意味する。

【００５５】３２Ｄ０１−１０金コロイドの捕捉に基づ
く赤紫〜紫色の着色の場合、ラクトフェリン標準溶液の
濃度が２０ｎｇ／ｍＬまで検出ゾーンの着色を確認する
ことができた。それに対して、３２Ｄ０１−１０金コロ
イドの捕捉及び金コロイドの銀増感に基づく褐色の着色
の場合、ラクトフェリン標準溶液の濃度が１．０ｎｇ／
ｍＬまで検出ゾーンの着色を確認することができ、３２
Ｄ０１−１０金コロイドの補足に基づく赤紫〜紫色の着
色のみの場合と比較して１／２０の濃度のラクトフェリ
ン標準溶液まで検出することができた。

【００５６】

【表２】

【００５７】

【実施例３】《抗原固定化直接競合イムノクロマトグラ
フ法によるラクトフェリンの測定》 （１）ラクトフェリンの直接競合イムノクロマトグラフ
法用メンブレンの作製 マウスモノクローナル抗ラクトフェリン抗体（１７Ｂ０
４−０８抗体）の代わりに、ヒトラクトフェリン（Ｓｉ
ｇｍａ製：以下、Ｌｆと称することがある）を用いたこ
と以外は、前記実施例２（１）の操作を繰り返すことに
より、ラクトフェリンの直接競合イムノクロマトグラフ
法用メンブレン（以下、Ｌｆメンブレンと称する）を調
製した。

【００５８】（２）金コロイド抗体保持パッドの作製 前記実施例２（２）で調製した３２Ｄ０１−１０金コロ
イド懸濁液を、金コロイド粒子密度が約１．４×１０¹²
／ｍＬ（波長５２０ｎｍにおける吸光度＝約２．０）又
は約７×１０¹⁰／ｍＬ（波長５２０ｎｍにおける吸光度
＝約０．１）になるように、５．０％ショ糖を含む５ｍ
ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した
後、得られた希釈液５μＬを吸収パッドＰＲＥＭ１４２
０（５ｍｍ×５ｍｍ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ製）に塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、
一夜減圧（≦１００ｍｍＨｇ）乾燥して、ラクトフェリ
ンのイムノクロマトグラフ用金コロイド抗体保持パッド
を調製した。以下、金コロイド粒子密度が約１．４×１
０¹²／ｍＬである希釈液を塗布した前記保持パッドを金
コロイド目視判定用保持パッドと称する。また、金コロ
イド粒子密度が約７×１０¹⁰／ｍＬである希釈液を塗布
した前記保持パッドを金コロイド銀増感用保持パッドと
称する。

【００５９】（３）ラクトフェリンの直接競合イムノク
ロマトグラフ小片の作製 ５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティック粘
着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して上流
側から下流側に向かって、前記実施例１（４）で調製し
た試料添加パッド、前記実施例３（２）で調製した金コ
ロイド目視判定用保持パッド、前記実施例３（１）で調
製したＬｆメンブレン、及び前記実施例１（５）で調製
した吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と
１ｍｍ重ね合わせて貼付し、ラクトフェリンの金コロイ
ド目視判定用イムノクロマトグラフ小片を調製した。ま
た、５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティッ
ク粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して
上流側から下流側に向かって、前記実施例１（４）で調
製した試料添加パッド、前記実施例３（２）で調製した
金コロイド銀増感用保持パッド、前記実施例３（１）で
調製したＬｆメンブレン、及び前記実施例１（５）で調
製した吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材
と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、ラクトフェリンの金コロ
イド銀増感用イムノクロマトグラフ小片を調製した。

【００６０】（４）ラクトフェリンの直接競合イムノク
ロマトグラフ小片の検出感度の評価 前記実施例３（３）で調製したラクトフェリンの金コロ
イド目視判定用イムノクロマトグラフ小片及びラクトフ
ェリンの金コロイド銀増感用イムノクロマトグラフ小片
を水平に静置し、各々の試料添加パッドに、前記移動相
緩衝液に溶解したラクトフェリン標準溶液（濃度＝０．
１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、
１．０ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、５．０ｎｇ／ｍ
Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍ
Ｌ、及び１００ｎｇ／ｍＬ）５０μＬを滴下し、室温下
で１０分間展開した。ラクトフェリンの金コロイド目視
判定用イムノクロマトグラフ小片におけるメンブレン上
のラクトフェリンを固定化した部分（すなわち、検出ゾ
ーン）の３２Ｄ０１−１０金コロイドの捕捉に基づく赤
紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ラクトフェリン標
準溶液の最少検出濃度を判定した（検出ゾーンの赤紫〜
紫色の着色が完全に消失したラクトフェリン標準溶液の
濃度を最少検出濃度とした）。

【００６１】一方、金コロイド銀増感用イムノクロマト
グラフ小片におけるメンブレン上の検出ゾーン上には、
金コロイドの前記展開後、直ちに銀増感液５０μＬを滴
下し、室温下で１０分間静置した後、３２Ｄ０１−１０
金コロイドの捕捉及び金コロイドの銀増感に基づく褐色
の着色の有無を目視観察し、ラクトフェリン標準溶液の
最少検出濃度を判定した（検出ゾーンの褐色の着色が完
全に消失したラクトフェリン標準溶液の濃度を最少検出
濃度とした）。

【００６２】結果を表３に示す。表３において、「＋」
は、コントロールゾーンの着色は認められるが、検出ゾ
ーンの着色が目視判定することができないことを意味
し、「±」は、コントロールゾーンの着色は認められる
が、検出ゾーンの着色の度合がごくわずかであることを
意味し、「−」は、検出ゾーン及びコントロールゾーン
の両方で、着色が目視で判定することができることを意
味する。

【００６３】３２Ｄ０１−１０金コロイドの捕捉に基づ
く赤紫〜紫色の着色の場合、ラクトフェリン標準溶液の
濃度が５０ｎｇ／ｍＬまで検出ゾーンの着色の消失を確
認することができた。それに対して、３２Ｄ０１−１０
金コロイドの捕捉及び金コロイドの銀増感に基づく褐色
の着色の場合、ラクトフェリン標準溶液の濃度が５ｎｇ
／ｍＬまで検出ゾーンの着色の消失を確認することがで
き、３２Ｄ０１−１０金コロイドの補足に基づく赤紫〜
紫色の着色のみの場合と比較して１／１０の濃度のラク
トフェリン標準溶液まで検出することができた。

【００６４】

【表３】

【００６５】

【実施例４】《抗原固定化直接競合イムノクロマトグラ
フ法によるオカダ酸の測定》 （１）オカダ酸の直接競合イムノクロマトグラフ法用メ
ンブレンの作製 ナイロン６６製メンブレンを５ｍｍ×２５ｍｍのサイズ
に切断した。メンブレンの一端から１０ｍｍの位置に、
エチレンジアミン溶液［濃度１０ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏ
ｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈した希釈溶
液］を幅１ｍｍの直線状に塗布し、更に、メンブレンの
一端から１５ｍｍの位置に、ウサギ抗マウスイムノグロ
ブリン（Ｉｇ）抗体（ＤＡＫＯ製）［濃度１ｍｇ／ｍ
Ｌ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈
後、透析した溶液］を幅１ｍｍの直線状に塗布した後、
室温下で１時間、３７℃で３０分間静置した。メンブレ
ンを、０．５％モノエタノールアミンを含む１００ｍｍ
ｏｌ／Ｌホウ酸塩緩衝生理食塩液（ｐＨ８．５）に浸
し、室温下で３０分間振とうさせた後、蒸留水（０．４
５μｍフィルターで濾過した蒸留水）で４回洗浄し、３
７℃で乾燥させた。

【００６６】オカダ酸（和光純薬製；以下、ＯＡと称す
る）５０μｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミド塩酸塩２３８μｇ、及びＮ
−ヒドロキシスクシニミド７１．５μｇをＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド１００μＬに溶かし、室温下で１時間
反応させた後、その約１μＬを、前記メンブレン上のエ
チレンジアミン溶液を塗布した位置に、重ねて塗布し
た。室温下で１時間反応させ、更に３７℃で１０分間反
応させた後、メンブレンを、０．５％モノエタノールア
ミンを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸塩緩衝生理食塩液
（ｐＨ８．５）に浸し、室温下で３０分間振とうした。
更に、メンブレンを、０．５％カゼインを含む１００ｍ
ｍｏｌ／Ｌマレイン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．５）に
浸し、室温下で３０分間静置し、ブロッキングした。メ
ンブレンを、生理食塩液で１回、蒸留水で３回洗浄し、
過剰のブロッキング液を除いた後、シリカゲルデシケー
タ内に保存し、室温下で一夜乾燥させ、オカダ酸の直接
競合イムノクロマトグラフ法用メンブレン（以下、ＯＡ
メンブレンと称する）を調製した。

【００６７】（２）金コロイド標識マウスモノクローナ
ル抗オカダ酸抗体懸濁液の調製 マウスＩｇＧの代わりに、マウスモノクローナル抗オカ
ダ酸抗体９５８−２抗体を用いたこと以外は、前記実施
例２（２）の操作を繰り返すことにより、オカダ酸のイ
ムノクロマトグラフ法用金コロイド標識抗体（以下、９
５８−２金コロイドと称する）懸濁液を調製した。な
お、前記マウスモノクローナル抗オカダ酸抗体９５８−
２抗体は、オカダ酸−ヒトイムノグロブリンＧ複合体を
免疫原として、常法によりマウスを免疫して調製した。

【００６８】（３）イムノクロマトグラフ用金コロイド
抗体保持パッドの作製 前記実施例４（２）で調製した９５８−２金コロイド懸
濁液を、金コロイド粒子密度が約７．１×１０¹¹／ｍＬ
（波長５２０ｎｍにおける吸光度＝約１．０）又は約
１．４×１０⁹／ｍＬ（波長５２０ｎｍにおける吸光度
＝約０．００２）になるように、５．０％ショ糖を含む
５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し
た後、得られた希釈液５μＬを吸収パッドＰＲＥＭ１４
２０に塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一
夜減圧（≦１００ｍｍＨｇ）乾燥して、オカダ酸のイム
ノクロマトグラフ用金コロイド抗体保持パッドを調製し
た。以下、金コロイド粒子密度が約７．１×１０¹¹／ｍ
Ｌである希釈液を塗布した前記保持パッドを金コロイド
目視判定用保持パッドと称する。また、金コロイド粒子
密度が約１．４×１０⁹／ｍＬである希釈液を塗布した
前記保持パッドを金コロイド銀増感用保持パッドと称す
る。

【００６９】（４）オカダ酸の直接競合イムノクロマト
グラフ小片の作製 ５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティック粘
着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して上流
側から下流側に向かって、前記実施例１（４）で調製し
た試料添加パッド、前記実施例４（３）で調製した金コ
ロイド目視判定用保持パッド、前記実施例４（１）で調
製したＯＡメンブレン、前記実施例１（５）で調製した
吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍ
ｍ重ね合わせて貼付し、オカダ酸の金コロイド目視判定
用イムノクロマトグラフ小片を調製した。また、５ｍｍ
×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティック粘着シー
ト（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して上流側から
下流側に向かって、前記実施例１（４）で調製した試料
添加パッド、前記実施例４（３）で調製した金コロイド
銀増感用保持パッド、前記実施例４（１）で調製したＯ
Ａメンブレン、前記実施例１（５）で調製した吸収パッ
ドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合
わせて貼付し、オカダ酸の金コロイド銀増感用イムノク
ロマトグラフ小片を調製した。

【００７０】（５）オカダ酸の直接競合イムノクロマト
グラフ小片の検出感度の評価 前記実施例４（４）で調製したオカダ酸の金コロイド目
視判定用イムノクロマトグラフ小片及びオカダ酸の金コ
ロイド銀増感用イムノクロマトグラフ小片を水平に静置
し、各々の試料添加パッドに、前記移動相緩衝液に溶解
したオカダ酸標準溶液（濃度＝１．０ｎｇ／ｍＬ、２．
０ｎｇ／ｍＬ、５．０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２
０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２
００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、及び１．０μｇ／
ｍＬ）５０μＬを滴下し、室温下で１０分間展開した。
オカダ酸の金コロイド目視判定用イムノクロマトグラフ
小片上におけるメンブレン上のＯＡを固定化した部分
（すなわち、検出ゾーン）の９５８−２金コロイドの捕
捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、オカ
ダ酸標準溶液の最少検出濃度を判定した（検出ゾーンの
赤紫〜紫色の着色が完全に消失したオカダ酸標準溶液の
濃度を最少検出濃度とした）。

【００７１】一方、金コロイド銀増感用イムノクロマト
グラフ小片におけるメンブレン上の検出ゾーン上には、
金コロイドの前記展開後、直ちに銀増感液５０μＬを滴
下し、室温下で３０分間静置した後、９５８−２金コロ
イドの捕捉及び金コロイドの銀増感に基づく褐色の着色
の有無を目視観察し、オカダ酸標準溶液の最少検出濃度
を判定した（検出ゾーンの褐色の着色が完全に消失した
オカダ酸標準溶液の濃度を最少検出濃度とした）。

【００７２】結果を表４に示す。表４における「＋」、
「±」、及び「−」は、表３と同じ意味である。９５８
−２金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の場
合、オカダ酸標準溶液の濃度が２００ｎｇ／ｍＬまで検
出ゾーンの着色の消失を確認することができたに留まっ
た。それに対して、９５８−２金コロイドの捕捉及び金
コロイドの銀増感に基づく褐色の着色の場合、オカダ酸
標準溶液の濃度が１０ｎｇ／ｍＬまで検出ゾーンの着色
の消失を確認することができ、９５８−２金コロイドの
補足に基づく赤紫〜紫色の着色のみの場合と比較して１
／２０の濃度のオカダ酸標準溶液まで検出することがで
きた。

【００７３】

【表４】

【００７４】

【発明の効果】本発明のイムノクロマトグラフ法によれ
ば、迅速且つ簡便に、しかも、従来公知のイムノクロマ
トグラフ法よりも更に高感度に、被検試料中の分析対象
物を分析することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のイムノクロマトグラフ法に使用するこ
とのできるイムノクロマトグラフ用小片の一態様を模式
的に示す平面図である。

【符号の説明】

１・・・試料添加パッド；２・・・標識化物質保持パッ
ド；３・・・固定化メンブレン；４・・・吸収パッド；
５・・・粘着シート；１０・・・イムノクロマトグラフ
用小片。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分析対象物及びそれと特異的に結合する
   抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免
   疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマ
   トグラフ法において、金属コロイド標識及び金属硫化物
   標識からなる群から選んだ標識に金属イオン及び還元剤
   を接触させ、前記還元剤による前記金属イオンの還元に
   より生じた金属粒子を前記標識に沈着させ、前記固定化
   免疫複合体上の前記沈着物を分析することを特徴とす
   る、前記イムノクロマトグラフ法。