JP4659734B2 - 一ステップオリゴクロマトグラフィー装置及びその使用方法 - Google Patents
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Description
− 特異的試薬をコートされた感作領域に液体が移動することを可能とする多孔質の活性材料を含む第一領域。この第一領域はサンプルパッドと称され、その上で乾燥された又はその中に含浸された検出試薬を含む。それは付与領域及び/又は吸着(サブ)領域をさらに含むことができる。サンプルパッド領域は付与領域と一般的に称される;
− 特異的試薬が吸着される多孔質の活性材料からなる、検出領域とも称される第二領域。装置の第二領域の線上に噴霧されたこれらの試薬のいくつかは、検出されるべき分析対象物に対して直接的に又は間接的に特異的であり、サンプル分析対象物−ラベル試薬複合体と反応すべきであり、一方、第二領域のさらなる線上に結果として噴霧される他の非特異的試薬は過剰の検出試薬と反応する役割を有する。この第二領域は好ましくはニトロセルロースから作られ、コントロール線、好ましくは検出領域の後ろのコントロール線を含むことができる;及び
− 所望により、第一及び第二領域を通して来る過剰の液体を吸収する役割を有する多孔質材料からなる第三領域。この領域は一般的に吸着又は吸収領域と称される。
本発明は所望により分子増幅工程後に得られるポリヌクレオチド分子を検出するための新規で進歩性のある技術を提供することを目的とする。
プライマー:分析対象物特異的なオリゴブクレオチド(増幅のために使用され、ラベルされて捕獲試薬と反応させられる)。
本発明はシート状クロマトグラフィー装置、特にディップスティック、フロースルー及び横方向流動装置に関し、前記装置は
− 付与領域(所望によりコンジュゲートパッドを有する)、
− 検出領域(所望によりコントロール部分(例えばコントロール線)を有する)、及び
− 所望により吸収領域
を有する。検出領域は分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた又はこのオリゴヌクレオチドに結合されたハプテン又はペプチドを特異的に認識する少なくとも一つの捕獲試薬を含み;付与領域は少なくとも一つの特異的なラベルされたコンジュゲート(直接的ラベル又は間接的ラベルと)を含み、このコンジュゲートは好ましくは分析対象物と特異的にハイブリダイズし、一般的にプローブと称されるオリゴヌクレオチド(DNA,RNA,PNA,LNA)である。陽性反応の場合には、即ち複合体が前記特異的(捕獲)試薬と前記ハプテン又はペプチドに結合された特異的分析対象物であって前記特異的コンジュゲートとハイブリダイズされた分析対象物との間に形成される場合には、シグナルが生成される。このシグナルは特異的シグナルとも称される。分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドは分析対象物の分子増幅のために用いられるプライマーの一つである。
図1は本発明の検出装置を用いて得られる陽性テストを表す。
コロイド金粒子の調製
約20nmのコロイド金粒子はクエン酸ナトリウムを用いたテトラクロロ金酸の還元によって調製された。約60mgのHAuCl4・3H2Oを含む200mlの超純水は沸騰するまで加熱され、約5mlの4%二水和クエン酸ナトリウム溶液が添加された。沸騰は暗赤色の溶液が得られるまで数分間続けられた。溶液は使用前に室温で平衡化された。溶液中の粒子濃度を評価するためにOD520nmが測定された。
コロイド金粒子にオリゴヌクレオチドを結合させることは当該技術分野では周知である。チオールでラベルされたオリゴヌクレオチドはコロイド金粒子と反応させられる。今回の場合、5’アミノ変性されたオリゴヌクレオチドはN−スクシンイミジルS−アセチルプロピオネート(SATP)によって変性され、保護されたメルカプト(チオール)基を有するオリゴヌクレオチドが得られた。この保護されたメルカプト基はさらに脱保護された。これらの反応は本質的にSATPの製造業者(Pierce,Rockford,IL)によって記述されるようにして行われた。二つのオリゴヌクレオチドがトキソプラスマ症オリゴクロマトグラフィー装置でプローブとして用いられた:一つはトキソプラスマ標的遺伝子に対して特異的であり(5’ CCCTCTGCTGGCGAAAAGTG 3’)もう一つは内部コントロールに対して特異的である(5’ AGGGTCTACTACTGGGTTACCTG 3’)。
本実施例で用いられたオリゴクロマトグラフィー装置(1)はプラスチック要素の如き固体支持体(17)からなり、その上に付与領域(2)(好ましくはMDIからのポリエステルコンジュゲートパッドから作られている)、検出領域(3)(好ましくはニトロセルロースから作られている)、及び吸着領域(4)(好ましくはセルロースから作られている)が配置されている。これらの材料は支持プラスチック(17)の両面(11,12)に存在することが有利である。テスト面(11)と称される一方の面は(トキソプラスマ)標的ポリヌクレオチドを検出する役割を有する。コントロール面(12)と称される他方の面は内部コントロールの増幅を検出する役割を有し、移動コントロール(16)要素も有する。
テスト面(11)では、ニトロセルロース膜は中性(neutralite)アビジンで感作されることが好ましい。(トキソプラスマ)特異的オリゴヌクレオチドプローブコンジュゲートはこのテスト面(11)の付与領域(2)のポリエステル膜(MDI)に含浸されている。
コントロール面(12)では、ニトロセルロース膜は2本の線(19,18)を有する。下部の内部コントロール増幅テスト線(18)は中性アビジンで感作されることが好ましい。好ましくは上部の移動テスト線(19)は移動コントロールオリゴヌクレオチドで感作されており、その配列(5’ CAGGTAACCCAGTAG 3’)は内部コントロールプローブの配列に対して逆平行である。このコーティングのため、5’−ビオチニル化移動コントロールオリゴヌクレオチドはキャリアタンパク質として用いられる中性アビジンと混合される。内部コントロールに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブコンジュゲート(14,15)はこのコントロール面(12)の付与領域(2)のポリエステル膜(MDI)に含浸される(図2b)。
内部コントロールは陰性のトキソプラスマテスト結果が真の陰性であることを示すように、即ち陰性の結果がテストされたサンプル中にひょっとして存在するかもしれない増幅阻害物質によるものではないように設計される。この内部コントロールは増幅前に反応混合物に添加されるテンプレートであり、阻害物質がサンプル中に存在しない限り、少なくともトキソプラスマ標的遺伝子の不在下で増幅されるべきである。内部コントロールテンプレートは以下の基準で設計されるオリゴヌクレオチドである:
− 標的増幅物と(ほぼ)同一の長さ
− 標的増幅物と(ほぼ)同一のG/C含有量
− 標的増幅物と同一のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅される
− この内部コントロールテンプレートの内部部分でトキソプラスマ標的遺伝子プローブの配列が内部プローブの配列によって置換される。
このようにして、トキソプラスマ特異的なプローブは内部コントロール増幅物にハイブリダイズせず、内部コントロールプローブはトキソプラスマ標的遺伝子増幅物にハイブリダイズしない。これらの規準に従って、Toxo内部コントロールテンプレートの配列は以下のようである:5’ GGTTGCAGTCACTGACGAGCTCAGGGTCTACTGGGTTACCTGAAAGTCATGAGTATCTGTGCAACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTCG 3’(下線を引いた部分が内部コントロールプローブの配列である)。
増幅混合物に添加されるべきToxo内部コントロールテンプレートの量はサンプルの不在下で全ての場合(24/24)でこの内部コントロールの増幅を可能にするように決定された。発明者は穏やかな阻害剤として用いられる0.01%のSDSの存在下で内部コントロールはPCR後もはや検出されなかったことも示した。
トキソプラスマを含むサンプルからのDNAの抽出は「EXTRAcell DNA extraction」キット(Bioline,Torino,Italy)を製造業者の指示に従って用いて実現した。DNAは商業的に利用可能な又は科学文献に記載されたいかなる他の方法によって抽出されることもできる。抽出されたDNAは抽出後直ちに使用されるか又は使用するまで−20℃で保存される。
トキソプラスマのB1遺伝子増幅はビオチンでラベルされたリバースプライマーを用いてPCRによって行われた。
増幅混合物(反応あたり45μl)は以下の材料を含む(最終濃度は5μlのサンプルを含む混合物について示されている):
− それぞれ0.1mMの最終濃度での四つのdNTP(dATP,dCTP,dGTP及びdTTP)
− MgCl2を含むPCR緩衝液(1×の最終濃度(Sigma))
− Taqポリメラーゼ(2 Unit,Sigma)
− 内部コントロールオリゴヌクレオチドテンプレート(1,67 10−22モル)。
− 94℃で5分間
− 45サイクル(94℃で20秒間、55℃で20秒間、72℃で30秒間)
− 72℃で1分間
− 94℃で30秒間。
増幅された生成物はさらなる使用まで4℃で保存される。
40〜50μlの増幅された生成物がこの容量の3倍のオリゴクロマトグラフィー緩衝液(55℃で予め平衡化されたもの)を含有するチューブにピペットされる。オリゴクロマトグラフィースティックがチューブに直ちに入れられ、アッセイチューブは閉じられる。クロマトグラフィーは10分まで進行する(チューブは加熱ブロック又は他の装置中で55℃に維持される)。増幅された生成物はスティックに移動し、乾燥した金コンジュゲート化オリゴヌクレオチドプローブは再水和される。スティックのテスト面ではプローブはトキソプラスマ標的遺伝子増幅生成物と特異的にハイブリダイズする。複合体は次にニトロセルロースに移動し、複合体は増幅された生成物中に存在するビオチンによるラベルを通して固定された中性アビジンによって捕獲される(増幅のリバースオリゴヌクレオチドはビオチンでラベルされている)。複合体の捕獲は陽性シグナル、即ちコロイド金粒子が蓄積してピンクから紫色を呈する線を生じる。スティックのコントロール面では内部プローブコンジュゲートは内部コントロール増幅生成物と特異的にハイブリダイズする。複合体は次にニトロセルロースに移動し、複合体は固定された中性アビジンによって捕獲される(内部コントロールは同一のビオチンでラベルされたリバースオリゴヌクレオチドで増幅される)。複合体の捕獲は陽性シグナルを生じる。残りの非反応性内部コントロールプローブコンジュゲートはさらに移動して移動コントロール線に到達し、そこでそれは固定された移動コントロールオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして陽性シグナルを生じる。
DNA抽出
stx1及びstx2遺伝子を有するか又は有さない大腸菌の培養物のサンプルからのDNAの抽出は「EXTRAcell DNA extraction」キット(Bioline,Torino,Italy)を製造業者の指示に従って用いて実現した。DNAは商業的に利用可能な又は科学文献に記載されたいかなる他の方法によって抽出されることもできる。抽出されたDNAは抽出後直ちに使用されるか又は使用するまで−20℃で保存される。テストされた大腸菌株はそれぞれ陽性及び陰性コントロールとしてATCC株No.35150,43890及び25922(ここに参考文献として組入れる)を含んでいた。
増幅されたstx1及びstx2遺伝子の特異的な検出のためのオリゴクロマトグラフィー(ディップ)スティックは、stx1及びstx2増幅生成物に対して特異的な二つのコロイド金ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが混合されてコンジュゲートパッドで乾燥されたことを除いては、増幅されたトキソプラスマB1遺伝子の特異的な検出のためのオリゴクロマトグラフィースティックのテスト面と同様に構成された。オリゴヌクレオチドプローブの配列は以下の通りである:
N−STX1−F2:5’−CTTCTTATCTGGATTTAATG−3’(配列番号1)(増幅されたstx1遺伝子の検出用)
N−STX2−F3:5’−TCTGTGTATACGATGACGCC−3’(配列番号2)(増幅されたstx2遺伝子の検出用)
シガトキシン様の毒素I及びIIをそれぞれコードするstx1及びstx2大腸菌遺伝子の両方を検出するため、これらの遺伝子の内部配列はPaton及びPaton(J.Clin.Microbiol.,Feb.1998,vol.36(2):598−602)によって記載されているオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅された。stx1の増幅のためのフォワード及びリバースパライマーはそれぞれstx1−F(5’−ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC−3’,配列番号3)及びstx1−R−biot(5’−AGAACGCCCACTGAGATCATC−3’,配列番号4)である。
− それぞれ0.3mMの最終濃度での四つのdNTP(dATP,dCTP,dGTP及びdTTP)
− PCR緩衝液(1×の最終濃度(Sigma))
− Taqポリメラーゼ(1 Unit,Sigma)。
− 94℃で5分間
− 35サイクル(94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で45秒間)
− 72℃で2分間
− 94℃で30秒間。
増幅された生成物はさらなる使用まで4℃で保存される。
stx1及び/又はstx2の増幅された遺伝子の検出のためのオリゴクロマトグラフィーテストは特異的なstx1−stx2スティックが用いられたことを除いては増幅されたトキソプラスマB1遺伝子の検出と同様にして行われる。このスティックでは二つの「受容体」がニトロセルロース上にコートされる:一つの抗体はジゴキシゲニンに特異的に結合し、stx2コロイド金ラベルされたプローブを有する複合体中にstx2の増幅された遺伝子を含むすべてのジゴキシゲニンでラベルされた分子を捕獲するであろう。第二の受容体は中性アビジンであり、ビオチンに特異的に結合し、stx1コロイド金ラベルされたプローブを有する複合体中にstx1の増幅された遺伝子を含むすべてのビオチンラベルされた分子を捕獲するであろう。
実施例3:SARS−CoVウイルスの検出
コロイド金粒子の調製
約20nmのコロイド金粒子は上述のようにして調製された。
SARS−CoVオリゴクロマトグラフィー装置でプローブとして用いられたオリゴヌクレオチドは上述のようにしてコロイド金粒子に結合された。これらのオリゴヌクレオチドは以下のものであった:一つはSARS−CoV標的遺伝子に対して特異的なものであり(5’ CCCTCTGCTGGCGAAAAGTG 3’)、もう一つは内部コントロールに対して特異的なものであり、トキソプラスマの内部コントロールに対するものと同一であった(5’ AGGGTCTACTACTGGGTTACCTG 3’)。
本実施例で用いられたオリゴクロマトグラフィー装置はトキソプラスマ増幅物の検出のために用いられた装置と極めて良く似ている。コントロール面はトキソプラスマオリゴクロマトグラフィースティックのコントロール面と同一である。テスト面にはニトロセルロース膜が中性アビジンで感作されている。SARS−CoV特異的なオリゴヌクレオチドプローブコンジュゲートはこのテスト面の付与領域のポリエステル膜(MDI)に含浸される。
内部コントロールは陰性のSARS−CoVテスト結果が真の陰性であることを示すように、即ち陰性の結果がテストされたサンプル中にひょっとして存在するかもしれない増幅阻害物質によるものではないように設計される。この内部コントロールはRT−PCR前に反応混合物に添加されるRNAテンプレートであり、阻害物質がサンプル中に存在しない限り、少なくともSARS−CoV標的遺伝子の不在下で逆転写されて増幅されるべきである。内部コントロールテンプレートはRNAテンプレートである。このRNAは内部コントロール増幅物が以下の基準に合うように設計された:
− 標的増幅物と同一の長さ
− 標的増幅物と同一のG/C含有量
− 標的増幅物と同一のオリゴヌクレオチドプライマーで逆転写されかつ増幅される
− この内部コントロールテンプレートの内部部分でSARS−CoV標的遺伝子プローブの配列が内部プローブの配列によって置換される。
このようにして、SARS−CoV特異的なプローブは内部コントロール増幅物にハイブリダイズせず、内部コントロールプローブはSARS−CoV標的遺伝子増幅物にハイブリダイズしない。内部コントロールテンプレートRNAはT7 RNAポリメラーゼを製造業者(Epicentre)によって記述されるようにして用いるインビトロ転写によって作成された。
このインビトロ転写のために用いられたテンプレートはT7 RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列及びそれに続く作成されるべき内部コントロールRNAテンプレートの配列を含む二本鎖DNAである。この二本鎖DNAの配列は以下の通りであった(RNA転写物に相当する配列は下線を引かれている):5’ TAATACGACTCACTATAGGGAGGCACCCGCGAAGAAGCTATTCTTTAGGGTCTACTGGGTTACCTGCCGGATGTAGAGGGCTGTCATGCAA 3’
RT−PCR混合物に添加されるべきSARS−CoV内部コントロールテンプレートRNAの量はサンプルの不在下で全ての場合においてこの内部コントロールの逆転写及び増幅を可能にするものでなければならない。
SARS−CoVを含むと疑われるサンプルからのRNAの抽出は商業的に利用可能な又は科学文献に記載されたいかなる方法によって実現されることもできる。抽出されたRNAは抽出後直ちに使用されるか又は使用するまで−80℃で保存される。
SARS−CoV標的遺伝子増幅はビオチンでラベルされたリバースプライマー(配列:5’ TTGCATGACAGCCCTCTACATC 3’)及びラベルされていないフォワードプライマー(配列5’ CACCCGCGAAGAAGCTATTC 3’)を用いるRT−PCRによって行われた。リバースプライマーは標的特異的な逆転写のためのプライマーとして及び増幅のためのプライマーとして作用し、一方フォーワードプライマーは増幅反応のためのみに作用する。RT−PCRはQiagenからの“One−Step RT−PCRキット”を製造業者の指示に本質的に従って用いて行われた。
簡単に述べると、50μlのRT−PCR反応液は以下の成分を含む:
− Qiagen One−Step RT−PCR緩衝液、5×の最終濃度:10μl
− QiagenキットからのdNTPmix 10mM:2μl
− オリゴフォワード:0.15μMの最終濃度
− オリゴリバース:0.6μMの最終濃度
− Qiagenキットからの酵素混合物:2μl
− 内部コントロールRNAテンプレート:RNAの各バッチについて決定されるべきインビトロで転写されたRNAからの希釈物
− サンプル(抽出されたRNA):1μl〜5μl
− 分子生物学的グレードの水(RNAse及びDNase非含有):50μlの最終容量にする。
反応混合物はRT−PCRの開始まで氷上で維持される。熱サイクラーはRT−PCRチューブを配置する前に50℃に予備加熱される。
− 50℃で30分間
− 94℃で15分間
− 45サイクル(94℃で20秒間、55℃で20秒間、72℃で30秒間)
− 72℃で1分間
− 94℃で30秒間。
増幅された生成物はさらなる使用まで4℃で保存される。
検出はトキソプラスマ増幅生成物の検出と同様に行われた。
両面ニトロセルロースラミネートは免疫クロマトグラフィー目的のために、いわゆるマルチプレックス検出モードで多数の異なる分析対象物を検出するためにも有用である。
配列番号2はトキソプラスマN−STX2−F3オリゴヌクレオチドプローブである。
配列番号3はトキソプラスマstx1−Fフォワードプライマーである。
配列番号4はトキソプラスマstx1−R−biotリバースプライマーであり、5’位でビオチン化されている。
配列番号5はトキソプラスマstx2−Fフォワードプライマーである。
配列番号6はトキソプラスマstx2−R−DIGリバースプライマーであり、5’位でジゴキシゲニン化されている。
配列番号7はトキソプラスマ標的遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブである。
配列番号8は内部コントロールのためのオリゴヌクレオチドである。
配列番号9は移動コントロールオリゴヌクレオチドである。
配列番号10はToxoの内部コントロールテンプレートである。
配列番号11はトキソプラスマB1遺伝子のフォワードプライマーである。
配列番号12はトキソプラスマB1遺伝子のリバースプライマーであり、ビオチンラベルされている。
配列番号13は内部コントロールテンプレートである。
配列番号14はSARS−CoV標的遺伝子のリバースプライマーであり、ビオチンラベルされている。
配列番号15はSARS−CoV標的遺伝子のフォワードプライマーである。
Claims (15)
- 付与領域(2)、及び検出領域(3)を含むシート状クロマトグラフィー装置(1)であって、前記検出領域(3)が分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされたハプテン又はペプチド(8)を特異的に認識する少なくとも一つの捕獲試薬(5)を含み、前記付与領域(2)が少なくとも一つのラベルされたプローブ(6)コンジュゲートを含み、前記コンジュゲートが、分析対象物の分子増幅から得られる増幅生成物又はポリヌクレオチド(7)に対して特異的であり、かつ特異的シグナルを生成することによって前記増幅生成物又はポリヌクレオチド(7)の検出を可能にすることを特徴とするシート状クロマトグラフィー装置。
- 付与領域(2)がコンジュゲートパッドを有すること、検出領域(3)が制御領域を有すること、及びシート状クロマトグラフィー装置が吸着領域(4)をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 前記分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドが分析対象物の分子増幅のために用いられるプライマーの一つと同一であることを特徴とする請求項1又は2に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 前記装置がテスト面(11)及びコントロール面(12)をさらに含む両面ニトロセルロースラミネートから作られており、前記テスト面(11)が関心のある標的ポリヌクレオチド配列(7)の特異的な検出のための試薬を含み、前記コントロール面(12)が真性の内部増幅コントロールの特異的な検出のための試薬を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 前記コントロール面(12)が(内部)コントロールプローブコンジュゲート(14)に対して相補的なコントロールオリゴヌクレオチド配列(13)から作られるクロマトグラフィーコントロール手段を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 前記試薬(5)がポリクローナル又はモノクローナル抗体又は超可変性抗体フラグメント又は前記ハプテン又はペプチド(8)に結合することができるいかなる他の分子であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 前記特異的なラベルされたプローブコンジュゲート(6,14)が直接的ラベル(15)にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド配列であり、関心のある標的ヌクレオチド配列(7)に対して特異的であるか又はコントロールのオリゴヌクレオチド配列(13)に対して特異的であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 前記ラベル(15)がコンジュゲートされた金属コロイド、コンジュゲートされたラテックス粒子及び特異的な特定の色を有する微粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項7に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- ディップスティック及び横方向流動装置からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 堅固な固体支持体(17)上に積層されたポリマー物質からなることを特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 固体支持体(17)がポリマー支持体であることを特徴とする請求項10に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 前記付与領域(2)がポリエステル製のコンジュゲートパッドを有するガラス繊維から作られた膜を含み、前記検出領域(3)がニトロセルロース、ナイロン又はポリエーテルスルホン膜(捕食者(predator))から作られた膜を限定なしに含み、前記吸着領域(4)がセルロースから作られた膜を含むことを特徴とする請求項2〜11のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 前記付与領域(2)とコンジュゲートパッドが同一材料から作られていることを特徴とする請求項2〜12のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
- 標的ポリヌクレオチド配列(7)の存在又は不在を検出することによって生物学的サンプル中の少なくとも一つの分析対象物を検出及び/又は定量する方法であって、前記ポリヌクレオチド配列(7)が請求項1〜13のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置(1)と接触させられることを特徴とする方法。
- 標的ポリヌクレオチド配列(7)が分析対象物の分子増幅から得られたものであることを特徴とする請求項14に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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