JP5948056B2 - 側方流動核酸検出器 - Google Patents

Description

この出願は１以上の発明を請求しており、当該発明は２００８年７月１５日に出願され、「側方流動核酸検出器」と題する米国仮特許出願第６１／０８０，８７９号と、２００８年９月２２日に出願され、「側方流動イムノアッセイにおけるインサイツでの細胞の溶解」と題する米国仮特許出願第６１／０９８，９３５号と、２００９年５月１８日に出願され、「ウィルス性および細菌性の感染の複合された検出のための方法および装置」と題する米国仮特許出願第６１／１７９，０５９号とに開示された。当該米国仮特許出願の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益が、ここに請求され、前述の出願は本明細書に参考のために取り込まれる。

また、この出願は、１以上の発明を請求しており、当該発明は２００９年７月１４日に出願され、「側方流動核酸検出器」と題する米国特許出願第１２／５０２，６２６号と、２００９年７月１４日に出願され、「側方流動イムノアッセイにおけるインサイツでの細胞の溶解」と題する米国特許出願第１２／５０２，６６２号とに開示された。前述の出願は本明細書に参考のために取り込まれる。

本発明は核酸検出の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は核酸標的の検出のための側方流動アッセイに関する。

側方流動イムノアッセイは、一つのアッセイストリップ（ａｓｓａｙ ｓｔｒｉｐ）における種々の試薬と処理工程を組み合わせた、抗体をベースにしたイムノアッセイの部分集合であり、それゆえ、標的分子の検出のための、敏感で迅速な手段を提供している。側方流動イムノアッセイは、標的検体の広い領域に対して利用でき、サンドイッチまたは競合検査のために設計され得る。一般的に、いくつかのエピトープを有する高分子量の検体は、サンドイッチ・フォーマット（ｓａｎｄｗｉｃｈ ｆｏｒｍａｔ）で分析され、これに対し、一つだけのエピトープを表している小分子は競合アッセイによって検出される。第一検査は、ヒトの絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のために行われた。今日、排卵の監視、感染疾病器官の検出、薬物濫用の分析、および、ヒトの生理学上重要な他の検体を測定するために、市場で入手できる検査がある。獣医学的検査、環境検査、および、製品監視のための製品も紹介されている。

迅速なポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）分析は、種々のウィルス性または他の病原性の微生物薬剤の診断および処置においてますます重要になっている。側方流動イムノクロマトグラフィ検査などの先行技術のポイント・オブ・ケア検査は、抗体およびその抗原を含むイムノアッセイである。そのようなフォーマットの結合アッセイは、リガンドおよびその受容体と、それらに関連する結合定数に基づいて動作する。抗体とその抗原との間の関連性の本質的な欠如は、当該技術において周知である。すなわち、リガンド−受容体結合アッセイは、貯蔵中の温度サイクルと熱応力によって劣化する傾向にあり、サンプル・マトリクス中の成分からの干渉がしばしば起こり、アッセイの間に非特異的な結合を引き起こし、誤った結果を招いてしまう。これらの固有の限界は、信頼できるアッセイの結果のためのリガンド−受容体の相互作用における充分な特異性を提供しない。リガンド−受容体結合は、上述の特異性と制限をタンパク質抗原標的に提供するが、タンパク質をコードする核酸配列に対しては提供しない。

本発明の結合アッセイは、標識化された核酸中の少なくとも一つの配列を有する前記標的核酸中の少なくとも一つの配列の間の相補塩基対によって、標識に結合される別の核酸中の少なくとも一つの配列と多重構造で結合する標的核酸を含む。本発明のアッセイは、抗体タンパク質抗原アッセイの固有的な欠陥を克服する。好ましい実施形態において、着色タグが付けられた核酸配列が、相補標的核酸を結合するために用いられる。当該タグが付けられた核酸配列は、好ましくは、デオキシリボ核酸、リボヌクレオチド、または、ペプチドヌクレオチドから作られる。

本発明の実施形態の側方流動結合アッセイのための検査ストリップの概略上面図を示す。 本発明の第一実施形態の一本鎖標的核酸の陽性検出可能な複合体を概略的に示す。 本発明の第二実施形態の二本鎖標的核酸を概略的に示す。 本発明の第二実施形態の図３で示された標的核酸のＸ結合部位と相補的な核酸配列を含む、第一標識複合体を概略的に示す。 本発明の第二実施形態の図３で示された標的核酸のＹ結合部位と相補的な核酸配列を含む、第二標識複合体を概略的に示す。 本発明の第二実施形態の第三複合体を概略的に示す。 本発明の第二実施形態の標的核酸の前記Ｘ結合部位に結合される第一複合体を概略的に示す。 本発明の第二実施形態において、標的核酸のＸ結合部位に結合される第一複合体と、標的核酸のＹ結合部位に結合される第二複合体とを概略的に示す。 本発明の第二実施形態の検査ラインで結合されて読みだされる、複合体と標的核酸を示す。

本発明の側方流動核酸検出器は、好ましくは、増幅工程としてのポリメラーゼ連鎖反応を利用することなくサンプル中の核酸を検出する。当該増幅工程は、標的核酸の感度を高めるように設計されている。いくつかの実施形態において、検出された核酸は、さらに定量化される。核酸が定量化される方法のいくつかの例は、輝線強度の視的グラデーションまたは電子的光学読み取り器を介しての定量化を含むが、これらに限定されない。

本明細書に記載されたアッセイは、好ましくは、ポイント・オブ・ケア・アッセイであり、本明細書において定義されているとおり、側方流動アッセイとフロー・スルー・アッセイの両方を含んでいる。これらのポイント・オブ・ケア・アッセイは、サンプルが得られた後、約数分から数時間内に処理され、読み取られるが、代替的に、サンプルが得られた後、２４乃至２６時間などの遅い時間で処理され得る。

検出器は、任意の標的ウィルス、細菌、真菌類、原虫、他の病原体、アレルゲン、任意の遺伝的欠損、または、サンプル中の任意の他の標的核酸に結合された標的核酸を検出するために使用され得る。他の標的核酸は、腫瘍マーカー（化学発癌剤）、心臓マーカー（例えば、ミオグロビン、トロポニン、クレアチンキナーゼ、ＭＭＰ−９、Ｃ−クリエーティブ タンパク質）、炎症性マーカー（サイトキン、リンフォカイン、ケモカイン、細胞シグナル因子、化学誘引剤、金属タンパク質、インターフェロン、ＭｘＡおよび成長因子）、ホルモン、および、組織適合試験のためにコード化する核酸を含むが、これらに限定されない。前記標的核酸は、限定されないが、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、または、他の型のＲＮＡを含む核酸であり得る。前記検出器中の輸送液体の流動は、重力に依存するか、毛細管現象または表面張力の結果としてのものである。輸送液体は、輸送液体中に検査ストリップを浸漬することによって塗布されるか、または、輸送液体は、検査ストリップのための検査ハウジング内に維持されてもよい。

標的核酸配列を検出するために使用される核酸配列は、所望の標的に特異的になるような任意の長さであり得る。好ましい実施形態において、配列は、約１０乃至２５ヌクレオチド長さであるが、配列が必須の特異性を提供するとともにそれ以外にはアッセイに干渉しない限り、長い配列や短い配列も可能である。いくつかの好ましい実施形態において、配列は、約１５乃至１７ヌクレオチド長さである。ペプチド核酸配列（ＰＮＡｓ）が用いられる場合、長さは１０または１１ヌクレオチドの短いものであり得る。ＰＣＴプライマーが使用される場合、一般的には、１６乃至２４ヌクレオチド長さである。

本発明の側方流動核酸検出器は、検出領域用の検査ストリップ上の単一シートとともに一平面上であってもよい。あるいは、検出器は、同一または異なるサンプルからの同一または異なる標的核酸のために、同時アッセイと流体連通する複数のシート上の複数の検出領域を含む複数面であってもよい。本発明における検査用サンプルは、標的核酸を潜在的に含むと予想される任意のサンプルでよく、唾液、鼻咽頭の分泌物、粘液、組織、血液、尿、膣液、皮膚潰瘍、環境水のサンプル、および、土壌サンプルを含むが、これらに限定されない。ほとんどの場合、サンプル中の第１および第２複合体を核酸にアクセス可能にするために、変性剤か溶解剤をサンプルにインサイツで加えるのが好ましい。変性剤または溶解剤は、検査ストリップにサンプルが塗布される前にサンプルに加えられることもあるが、変性剤または溶解剤は、サンプルが変性剤または溶解剤を加える工程を含むことなく検査ストリップに直接塗布されるように、乾燥した変性剤または溶解剤として、検査ストリップの領域に事前に載せられるのが好ましい。あるいは、溶解剤は、フリーズドライまたは凍結乾燥によって事前に乾燥されてもよく、その後、検査ストリップ上に事前に載せられてもよい。溶解剤は、検査ストリップ上で吸収されたり、吸着されたり、埋め込まれたり、または、捕捉されてもよい。乾燥したまたは埋め込まれた変性剤または溶解剤は、サンプルが検査ストリップ上の第１複合体に到達する前に、変性剤または溶解剤が核酸を解放するような位置で、検査ストリップ上に事前に載せられる。乾燥したまたは埋め込まれた変性剤または溶解剤は、好ましくは、輸送液体中に可溶性であり、サンプル塗布領域内に配されるか、または、サンプル塗布領域と、第１複合体が事前に載せられる領域との間に配される。他の実施形態において、弱溶解剤は、使用中の緩衝液の一部であってもよい。このシナリオにおいて、下流にある複合体領域上には有害作用はなく、サンプルは、複合体領域の上流または下流のいずれかあってもよい。

採取されたサンプルが、採取およびサンプル分析装置への移動の前に溶解されない場合、分析用にサンプルを採取して準備するために必要な工程の数は減少する。このような実施形態において、サンプルを載せた後に、輸送液体（緩衝液）とともに移動するサンプルは、溶解剤と遭遇するであろう。溶解剤は、検査ストリップ上に事前に載せられ、乾燥させており、輸送液体によって溶出される。最初に乾燥させた溶解剤は、好ましくは、サンプル塗布領域と複合体領域（第１複合体の塗布領域）との間で局在化しているか、または、いずれかの領域または両方の領域に重なっている。溶解剤は、好ましくは、サンプル輸送液体中に可溶性であり、溶解剤は、サンプル輸送液体に接触すると、可溶化するとともに活性化する。サンプル輸送液体はその後、溶液または懸濁液中の溶解剤と、懸濁液中のサンプル成分とを両方とも含有する。サンプル中の任意の溶解−感受性成分は、その後、懸濁液中で溶解剤に晒され、インサイツでそれ自体が溶解する。使用している緩衝液は、その後、任意の溶解から解放された成分を含む検体を、検出領域へと運ぶ。

溶解剤が事前に載せられ、乾燥される位置は、必要に応じて変えることができる。サンプルが溶解剤と相互作用するための時間を最大化するために、同様に、溶解剤が検出領域に到達する量を最小化するために、溶解剤は、サンプル塗布領域内またはサンプル塗布領域のちょうど下流に配されてもよい。あるいは、溶解した生成物が複合体領域に到達する前に移動しなければならない距離を最小化するために、溶解剤は複合体領域（第１複合体の塗布領域）のさらに近傍に配されてもよい。

ひとつの実施形態において、視覚的に読み出される核酸アッセイ検査の感度は、少量の蛍光染料または蛍光ラテックスビーズ複合体を、最初の複合体材料に加えることによって高められる。可視スペクトル検査ラインが目に見えると、検査結果は観察され、記録される。しかしながら、明白に目に見える検査ラインを生じさせるものではない弱陽性の場合、ＵＶスペクトルなどの適切なスペクトル光線が、検査ラインに投げかけられることによって、検査ラインで視認できる色を鮮やかにするために検査ラインで結合される蛍光ラテックスビーズを励起するとともに蛍光を出す。

側方流動装置は知られており、例えば、米国公開特許出願第２００５／０１７５９９２号、および、第２００７／００５９６８２号に記載されている。両出願内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。当該技術分野で知られている他の側方流動装置は、本発明のシステムおよび方法によって代替的に用いられることができる。

米国公開特許出願第２００７／００５９６８２号は、１以上の干渉物質を含有することもできるサンプルと検体とを検出することについて開示している。この公開公報は、クロマトグラフィー担体上の干渉物質を獲得することによって検体と干渉物質とを分離することと、および、干渉物質から分離したその担体上で検体を検出することとを教示している。

米国公開特許出願第２００５／０１７５９９２号は、体液サンプルがスワブ部材などの採取装置によって採取されるヒトの体液中で、病原体および／またはアレルギー関連成分などの標的を検出する方法を開示している。サンプルはスワブ部材からサンプル分析装置へと移され、サンプル分析装置において、免疫化学的手段または酵素的手段によって標的の分析が行われる。検査結果は非常に短時間で表示することができ、ユーザが直接読み出すことができる。これによって、ポイント・オブ・ケア検査は、患者の診察中に、結果を入手することができるようになる。この同時係属出願において開示される発明は、結膜炎の診断に特に有効である。

図１は、本発明の実施形態において、核酸検出のための側方流動結合アッセイのための検査ストリップの概略的な上面図を示す。図１に示す検査ストリップが、特定の構造と、サンプル塗布、第１および第２複合体のための異なる配置を有する他の構造とを有する一方で、変性剤または溶解剤の配置は、本発明の精神の範囲内である。この例の検査ストリップ（１０）は、第１部分（１２）、第２部分（１４）、第３部分（１６）、および、任意で、第４部分（１８）を含む。このような部分は、好ましくは、裏当て材料（２０）上に取り付けられる。流れは、図１の上方方向（２２）に生じる。第４部分（１８）は、本明細書で検出領域とも呼ばれている第３部分（１６）を通って流れる輸送液体と材料を採取するための廃棄物パッドとして機能し、好ましくは、ニトロセルロース膜を含む。以下に記載の第１複合体は、複合体領域に載せられ、この領域は、この図の第２部分（１４）の下方部分（２４）である。１つの実施形態において、以下に記載の第２複合体は、検出領域（１６）の検査領域（２６）上に載せられる。別の実施形態において、第２複合体は、第２部分（１４）の上方部分（３０）上に載せられる。この実施形態において、第２複合体は、ビオチンなどの固定化剤を含み、および、検査領域（２６）は、第２複合体を検査領域（２６）に結合させるためのアビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンの機能性などの固定部位を有する。以下に記載の第３複合体は、好ましくは、検査領域（２６）上の検出領域（１６）の制御領域（２８）上に載せられる。検査領域（２６）および制御領域（２８）は、好ましくは、検出領域（１６）の幅よりも長い長さを有する領域である。

本発明の１つの実施形態において、検査されるサンプル中の標的核酸は、輸送液体中の第１複合体よりも速く移動する。この実施形態において、サンプルは、第１複合体より下の第１部分（１２）上に載せられ、使用中の緩衝液などの輸送液体は、サンプルがアッセイを行うために載せられる場所よりも下の第１部分（１２）に塗布される。あるいは、サンプル溶液それ自体は、この実施形態において、輸送液体として用いられてもよい。別の実施形態において、検査されるサンプル中の標的核酸は、輸送液体中の第１複合体よりも遅く移動する。この実施形態において、サンプルは、第２部分（１４）の上方部分（３０）上に載せられ、輸送液体は、検査ストリップの第１部分（１２）に塗布される。両方の実施形態において、アッセイは、好ましくは、検査ライン（２６）と結合していない第１複合体のほぼすべてが制御線（２８）に到達する前に、行われる。サンプルを載せる位置と第１複合体を載せる位置は、アッセイの状況に依存しており、標的核酸配列が標識した第１複合体上の相補的な核酸配列と結合可能となるように、サンプルが検査ストリップ上で第１複合体と遭遇する限り、該位置は変化することもある。例えば、サンプルは第１複合体（複合体）および他の埋め込まれた材料の上に、直接加えられるか、または、第１複合体および他の埋め込まれた材料のわずかに下流またはわずかに上流に加えられてもよい。

本発明の実施形態において、少なくとも１つの第１核酸配列は、第１複合体を形成するために、標識に対して共役される。本明細書で用いられる「標識」という用語とは、蛍光タグなどの、原子、複数の原子、または、分子のことを言い、これらは、核酸に付着するかまたは結合され、および、検出可能でかつ好ましくは定量化された信号を提供するために使用される。核酸配列は、ビオチン−アビジンなどの非共有結合を介して標識と適切に結合されることもある。同様に、標識は、蛍光発光ビーズまたは蛍光ビーズもしくは、染色ラテックスビーズと混合させたコロイド金粒子などのミクロビーズであってもよく、この場合、染料は、赤色染料、蛍光染料、リン光染料、または、化学発光染料などの目に見える染料であってもよい。このような第１複合体は、側方流動クロマトグラフィーの移動相で用いられる。標識の検出方法は、蛍光発光、化学発光、放射線、比色分析、重量測定、Ｘ線回折、Ｘ線吸収、磁性、および、酵素活性を含むが、これらに限定されない。可視スペクトル検査ラインは、定量化した検査結果を生成するために、分光計によって解釈されてもよい。第１複合体は、使用中の緩衝液などの輸送液体か、または、側方流動ストリップに塗布されたサンプルによって、固定されるような形状で、側方流動ストリップに上に配される。

定性的解釈は、検査ラインの強度と色合いを観察することによって視覚的に行われる目で見える赤色線量が標識として用いられる例において、検体の濃度が検出の下限値と等しいかまたは該下限値をわずかに上回る場合、検査ラインはかすかに見ることができ、色合いはピンクである。検体の濃度が上昇するにつれて、検査ラインの強度は呼応して増加し、色合いはピンクから鮮血色へと移り変わる。定量的解釈は、可視スペクトルで動作する分光計を用いて展開される。吸収測定または反射率測定のいずれかは、検査ラインの定量化を発達させるために、可視スペクトル中で用いられてもよい。検体の特徴的な濃度の第１セットを展開する。各濃度がサンプル塗布領域に適用され、検査が展開される。分光計は、検査ラインの吸収または反射率のいずれかを測定するために用いられる。標準的な曲線は、分光計の測定された値から計算される。標準的な曲線は、通常は直線的である。他の実施形態において、蛍光タグが用いられる場合、検体の既知の濃度の類似するセットが展開されてもよい。分光計によって検査されるとともに定量化される検体の未知の濃度は、標準的な曲線上に示される際に、検体の濃度と相関可能な値を産出する。

１つの実施形態において、第２の核酸配列は、検査領域中の側方流動検査ストリップ上において、第２複合体中で固定される。第２核酸配列は、本発明の精神の範囲内で、第２複合体を形成する様々な方法によって固定化されてもよい。固定化が、核酸配列を少なくとも１つの化学物質と結合させることによって達成される場合、固定化は直接的であってもよく、固定化が核酸配列を少なくとも１つの化学物質または他の成分で物理的に捕捉することによって達成される場合、固定化は間接的なものであってもよい。固定化は、ポリリシンとの結合、ミクロビーズとの結合、および、ヒドロゲルへの取り込みを含むが、これらに限定されない。ラテックスビーズなどのミクロビーズは、ニトロセルロース膜、ナイロン、または、ポリエステルなどの培地の管腔中で、直接固定されても、または、捕捉されてもよい。ヒドロゲルは、適切な培地で直接固定化されてもよく、または、捕捉機構によって固定化されてもよい。

１つの実施形態において、標的核酸の単一の連続的な配列の異なる部分は、第１核酸配列と第２核酸配列との両方と相補的であることが可能である。一例として、２５のヌクレオチドのペプチド核酸配列（ＰＮＡｓ）は、標的核酸の一部と相補的である。このようなヌクレオチドの約半分（例えば、１１または１２ヌクレオチド）は、第１複合体中の第１核酸配列として用いられ、ヌクレオチドの他の半分（例えば、１２または１３ヌクレオチド）は、第２複合体中の第２核酸配列として用いられる。この例において、第１核酸配列は、標的核酸の単一配列の１つの部分と結合し、第２核酸配列は、標的核酸の単一配列の第２部分と結合する。

別の実施形態において、第２核酸配列は、第２複合体を形成するために、固定化剤と結合される。この実施形態において、第２複合体は、検査ストリップの第２部分（１４）の上方部分（３０）上に載せられる。固定化剤のための受容体は、検査領域（２６）上の固定化部位で固定化される。固定化剤がアッセイ中に検査領域に到達すると、固定化剤は、検査領域（２６）上の第２複合体を固定化させるために受容体と結合する。固定化剤と受容体は、アッセイの所望の核酸相互作用に干渉しない強力な特定の相互作用による、任意の対であってもよい。固定化剤はビオチンであってもよく、受容体はアジビン、ニュートラアビジン、または、ストレプトアビジンであってもよい。あるいは、固定化剤は、レクチンであってもよく、固定化部位は、グリコシル部分であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、レクチンはエンドウレクチンであり、グリコシル部分は、赤血球のグリコシル単位である。固定化剤と固定化部位は、本発明の精神の範囲内で逆にさせてもよい。例えば、アビジンは、検査領域（２６）における固定化部位で受容体として作用するビオチンを有する第２複合体を形成するために、第２核酸配列と共役されてもよい。

アッセイの好適な実施形態において、第１核酸配列に相補的な第３核酸配列は、制御領域上の第３複合体で固定化される。第３核酸は、本発明の精神の範囲内で、第２核酸配列に関して、先に議論された様々な方法のうちの任意の方法によって固定化されてもよい。アッセイの実行中に、サンプル中の標的核酸と結合しない第１複合体のいずれかが、制御領域に到達すると、検査領域を通って第３複合体と結合するように、第３複合体は設計される。このような方法で、標的核酸と結合しない第１複合体のいずれかが検出され、および、いくつかの実施形態において、定量化される。本発明のアッセイは、制御領域を含むことなく実行されることもあるが、制御領域は、陰性の検査結果を確認するため、および、陽性の検査結果に関して検査領域と比較するために、好ましい。

標的核酸は、任意の核酸配列であってもよく、該核酸配列は、ウィルス、細菌、真菌、植物、動物、人工的に作り出した配列、遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）、または、化石標本からの核酸配列を含むが、これらに限定されない。サンプルはサンプル塗布領域中のストリップに塗布される。サンプル塗布領域は、第１複合体の前に来て、第１複合体に重なり、または、検査ストリップ上の第１複合体の次に来てもよい。サンプルが第１複合体の後に塗布される場合、輸送液体を用いることによって、第１複合体を動員するとともに、標的核酸サンプルのいずれかに第１複合体をさらすために第１複合体を輸送する。１つの実施形態において、検査領域は、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイで用いられる配列である、少なくとも１つの固定化された核酸配列からなる。配列は、好ましくは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または、ペプチドヌクレオチドから作られる。この実施形態において、第１複合体は、標識に対して複合化した標的核酸の、そのようなＰＣＲタイプのプライマーを含む。このようなプライマーは、好ましくは、アンチセンス配列であり、該配列は、ウィルス、細菌、および、真菌などの生物からの核酸の対応する「センス」配列を補完する。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、本発明の精神の範囲内において側方流動アッセイで入れ替えてもよい。

ただ１つの検査ラインが図面では示されているが、複数の検査ラインは本発明の精神の範囲内である。複数の標的があるいくつかの実施形態において、各標的の存在は、好ましくは、別の検査ラインに対応する。複数の標的がある他の実施形態において、１以上の標的の存在が単一の標的の存在とは異なる特徴を有するように、複数の標的の存在は、同じ検査ライン上で表示されてもよい。例えば、同じ検査ライン上の複数の標的の存在は、各々の標的のみの存在とは異なる色によって、目に見えるように表示されてもよい。

図２は、本発明の第１実施形態における、陽性検出可能な標的核酸の複合体を示す。この実施形態において、サンプル中の標的核酸（４０）は、一本鎖核酸配列である。第１複合体（４２）は、標的核酸（４０）の配列の内部部分に相補的な少なくとも１つの第１核酸配列（４４）を含む。第１核酸配列（４４）は、標識（４６）に結合される。第２複合体は、標的核酸（４０）の配列の外側部分と相補的な少なくとも１つの第２核酸配列（４８）を含む。側方流動アッセイにおける標的核酸の異なる部分に相補的な２つの配列を用いることで、アッセイの特異性を改善する。いくつかの実施形態において、第１核酸配列（４４）は、好ましくは、内部ＰＣＲプライマーであり、第２核酸配列（４８）は、好ましくは、外部ＰＣＲプライマーである。あるいは、第１核酸配列（４４）は、外部ＰＣＴプライマーであり、第２核酸配列（４８）は内部ＰＣＲプライマーである。１つの第１核酸配列と１つの標識で、各々の第１複合体には十分であるが、第１複合体は、好ましくは、図２に示す第１核酸配列の複数のコピーと、図２のアスタリスクで示す複数の標識ユニットとを有する。８つの核酸配列が図２で示されるが、第１複合体の標的核酸との結合を促進する任意の数は、本発明の精神の範囲内で用いられてもよい。

図３乃至図９は、本発明の第２の実施形態において、陽性検出可能な標的核酸の複合体を示す。図３に示すように、この実施形態において、サンプル中の標的核酸（５０）は、二本鎖核酸である。サンプル中の標的核酸（５０）は、好ましくは、二本鎖の少なくとも一部を切り開いて、第１鎖（５２）および第２鎖（５４）とするために、ＤＮＡｚｏｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ、ホルムアミド、または、尿素などの変性剤または溶解剤によって、インサイツで変性させる。これは、サンプルを検査ストリップに塗布する前に、変性剤または溶解剤をサンプル溶液に加えることによって、なされることでもあり、または、変性剤または溶解剤は、先に議論したように、検査ストリップの領域に事前に載せられてもよい。あるいは、核酸の変性は、本発明の精神の範囲内で、アッセイの張度、温度、または、ｐＨを調節または制御することによってなされてもよい。本発明のアッセイは、サンプル中の核酸を部分的に変性させるか完全に変性させるかのいずれかによって、実行されてもよいが、部分的な開口が側方流動アッセイにおける検出には好ましい。

好適な実施形態において、核酸が検査ストリップに加えられた直後に変性および／または溶解されるように、変性剤または溶解剤はサンプル塗布領域に配される。他の実施形態において、標的核酸が第１標識複合体（５６）と遭遇する前またはその間に、少なくとも部分的に変性および／または溶解されるように、変性剤または溶解剤は、検査ストリップ上の任意の位置に配される。

図４に示されるように、第１複合体（５６）は、少なくとも１つの第１核酸配列（５８）を含み、該配列は、好ましくは、標的核酸配列の一本鎖（５２）に対するプライマーまたはオリゴヌクレオチドのアンチセンス配列（５８）である。第１核酸配列（５８）は、標識（６０）に結合される。標識は、目に見えるタグまたは蛍光タグなどの、任意の原子、複数の原子、または、分子であってもよく、これらは、核酸に付着するかまたは結合され、および、検出可能でかつ好ましくは定量化された信号を提供するために使用される。核酸配列は、ビオチン−アビジンなどの非共有結合を介して、標識に適切に結合されてもよい。同様に、標識は、蛍光発光ビーズまたは蛍光ビーズ、もしくは、染色ラテックスビーズと混合させたコロイド金粒子などのミクロビーズであってもよく、この場合、染料は、赤色染料、蛍光染料、リン光染料、または、化学発光染料などの目に見える染料であってもよい。

図５は、第２複合体（６２）を示し、該複合体は、好ましくは、アンチセンスプライマーまたはオリゴヌクレオチドである少なくとも１つの第２核酸配列（６４）と、ビオチンなどの固定化剤（６６）とを含む。第２核酸配列（６４）は、標的核酸（５０）の第２鎖（５４）のＹ結合部位に相補的である。この実施形態において、第２複合体（６２）は、好ましくは、図１で示される検査ストリップ（１０）の第２部分（１４）の上方部分（３０）上に配され、図６で示されるアビジン結合のプローブ（７０）などの受容体は、アッセイの開始時、検査ストリップ（１０）の検査領域（２６）（好ましくは、ニトロセルロース膜）上で固定される。第２複合体は、代替的に、サンプルが載せられる検査ストリップの一部上で浸透することもあれば、または、サンプルが検出領域に到達する前にそれがサンプルに遭遇する検査ストリップ中の任意の場所で浸透することもある。加えて、第２複合体は、必ずしも第１複合体の下流に配される必要があるわけではない。例えば、サンプルパッドは、サンプルの一本鎖ＹＤＮＡに対するビオチン化（Ｂ）ウィルス性プライマーまたはオリゴヌクレオチドのアンチセンスで浸透させてもよい。アジビン（７２）とビオチン（６６）は、これらの図において固定化剤として示されているが、本明細書に記載の他の固定化剤またはそれ以外に当該技術分野で知られている他の固定化剤を代替的に使用することもできる。

図３乃至図９の実施形態において、側方流動が、吸収剤の先端を輸送液体に浸漬させることによって開始されると、第１複合体（５６）が動員され、第１複合体（５６）上のプライマーまたはオリゴヌクレオチド配列（５８）は、図７で示すＸ結合部位で開かれた核酸の一本鎖（５２）と共役する。第１複合体（５６）とサンプル核酸（５０）は、それらが検査ストリップを介して溶出する間、互いに遭遇するように、検査ストリップ上の任意の場所に配されてもよい。

第１複合体の標的核酸は、その後、第２複合体（６２）にさらされる。第２配列（６４）は、図８で示されるＹ結合部位で第二鎖と共役する。図８で示す全体的な複合体は、その後、検査領域に移動し、この検査領域で、ビオチン（６６）は、ビオチン（６６）のアビジン（７２）との結合を介して、検査領域で固定化されたアビジン（７２）によって捕捉される。これは目に見える読み出しラインをもたらす。検査領域は、標的核酸配列がサンプル中に存在するときのみ目に見え、このことは、サンプルが標的核酸に関して陽性であることを示している。標的核酸配列が存在しない陰性サンプルにおいて、検査領域は無色のままである。検査領域の強度は、目に見えるようタグ付けされた複合粒子で結合された蛍光か、または、蛍光複合粒子で混合された蛍光のいずれかによって、増大されてもよい。
第１および第２核酸配列は、好ましくは、双方とも、相補的な標的核酸のアンチセンス配列であるため、Ｘ結合部位およびＹ結合部位は、好ましくは、重なっていない配列である。第１および第２核酸配列がアンチセンスプライマーである場合、操作されたプライマーの質は、標的核酸の不在下において、誤った陽性の検査結果をもたらすことになる第１配列と第２配列の潜在的な任意の直接結合を防ぐために、重要である。

本発明の別の実施形態において、側方流動アッセイは、サンプル中の１以上の標的核酸について検査する。この実施形態において、別の組み合わせの第１複合体と第２複合体は、検出される各々の標的核酸のために用いられる。この実施形態において、各々の第１複合体は、各々の標的核酸が、他の標的核酸からの干渉を受けることなく、別々に検出および定量化されるように、異なる方法によって検出可能な異なる標識を有する。

本明細書で議論される分析検査は、好ましくは、患者が施術者によってまだ検査されている間に結果を許可する。好適な実施形態において、検査結果は、装置にサンプルを塗布した後１０分足らずで得られ、検査結果は、好ましくは、約１０分読み出される。高陽性サンプルにおいて、検査領域（好ましくは、検査ライン）の読み出しは、１乃至５分以内に目に見える。

したがって、本明細書に記載の実施形態は、本発明の原理の適用の例示にすぎないことを理解されたい。例示された実施形態の詳細に対する本明細書における参照は、本発明に必要不可欠とみなされる特徴を列挙している特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。

Claims (25)

1. サンプル中の少なくとも１つの二本鎖標的核酸を検出するための検査ストリップであって、
   前記検査ストリップは、
   少なくとも１つの検査領域を含む少なくとも１つの検出領域と、
   前記サンプルを前記検査ストリップに塗布するためのサンプル塗布領域と、
   二本鎖標的核酸の一部を切り開いて第１鎖及び第２鎖とする少なくとも１つの溶解剤又は変性剤を含む溶解領域と、
   少なくとも１つの標識と結合される少なくとも１つの第１核酸配列を含む少なくとも１つの第１複合体とを備え、
   前記第１複合体は、第１複合体塗布領域に載せられ、および、
   前記第１核酸配列は、前記二本鎖標的核酸の前記第１鎖の配列の一部と相補的な配列を含み、
   前記検査ストリップは、
   少なくとも１つの固定化剤と結合される少なくとも１つの第２核酸配列を含む少なくとも１つの第２複合体を含み、
   前記固定化剤は、検査ストリップの検査領域で固定化可能であり、および、
   前記第２核酸配列は、前記二本鎖標的核酸の前記第２鎖の配列の一部と相補的な配列を含み、
   前記サンプル、前記第１複合体、および、前記第２複合体はすべて、前記サンプル中の前記二本鎖標的核酸を検出するためのアッセイを実行中に、前記サンプルが溶解領域及び第１複合体と第２複合体の両方と遭遇するような位置の検査ストリップ上に配される
   ことを特徴とする検査ストリップ。
2. 前記検出領域は、前記検査領域を超えて配され、前記二本鎖標的核酸と結合しない前記第１複合体の任意の部分を固定化するための制御領域をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の検査ストリップ。
3. 前記固定化剤を認識及び固定化する受容体をさらに含み、
   前記第２複合体は、前記検査領域の上流位置に載せられ、固定化部位は前記検査領域に配されることを特徴とする、請求項１に記載の検査ストリップ。
4. 前記固定化剤を認識及び固定化する受容体をさらに含み、
   前記第２複合体は、前記検査領域に載せられ、前記受容体は前記検査領域の上流位置に載せられることを特徴とする、請求項１に記載の検査ストリップ。
5. 前記標識は、
   （ａ）少なくとも１つの蛍光ミクロビーズで混合された少なくとも１つのコロイド金粒子と、
   （ｂ）少なくとも１つの染料ラテックスミクロビーズと、
   からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の検査ストリップ。
6. 前記サンプルは、前記二本鎖標的核酸のアッセイの感度を上げるための増幅工程を含まずにアッセイ上で処理されることを特徴とする、請求項１に記載の検査ストリップ。
7. サンプル中の少なくとも１つの二本鎖標的核酸を検出するための検査ストリップであって、
   前記検査ストリップは、
   少なくとも１つの検査領域を含む少なくとも１つの検出領域と、
   前記サンプルを前記検査ストリップに塗布するためのサンプル塗布領域と、
   二本鎖標的核酸の一部を切り開いて第１鎖及び第２鎖とする少なくとも１つの溶解剤又は変性剤を含む溶解領域と、
   少なくとも１つの標識と結合される少なくとも１つの第１核酸配列を含む少なくとも１つの第１複合体とを備え、
   前記第１複合体は、第１複合体塗布領域に載せられ、
   前記第１核酸配列が前記二本鎖標的核酸の第１鎖の配列の一部に対して相補的な配列を含み、
   前記検査ストリップは、さらに、
   少なくとも１つの固定化剤と結合される少なくとも１つの第２核酸配列を含む、少なくとも１つの第２複合体を備え、
   前記第２複合体はアッセイ開始時に検査領域で固定化されず、
   前記固定化剤はアッセイの検査領域において固定化可能であり、
   前記第２核酸配列が前記二本鎖標的核酸の第２鎖の配列の一部に対して相補的な配列を含み、
   前記サンプルと前記第１複合体及び第２複合体は、すべて、前記サンプル中の前記二本鎖標的核酸を検出するために前記アッセイを実行中に前記サンプルが溶解領域、及び前記第１複合体と前記第２複合体の両方に遭遇するような位置で検査ストリップ上に載せられる
   ことを特徴とする検査ストリップ。
8. 前記サンプルは、増幅工程を含まずにアッセイ上で処理されることを特徴とする請求項７記載の検査ストリップ。
9. 前記固定化剤を認識し、固定化部位で固定化する受容体をさらに含み、
   前記第２複合体は、前記検査領域の上流位置に載せられ、前記固定化部位は前記検査領域に配されることを特徴とする、請求項７に記載の検査ストリップ。
10. 前記標識は、
    （ａ）少なくとも１つの蛍光ミクロビーズで混合された少なくとも１つのコロイド金粒子と、
    （ｂ）少なくとも１つの染料ラテックスミクロビーズと、
    からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の検査ストリップ。
11. 前記溶解領域は前記サンプル塗布領域に配されることを特徴とする、請求項７記載の検査ストリップ。
12. ポイント・オブ・ケア・アッセイを用いて、サンプル中の少なくとも１つの二本鎖標的核酸を検出する方法であって、
    前記方法は、
    （ａ）前記二本鎖標的核酸の一部を切り開いて第１鎖及び第２鎖とする工程と、
    （ｂ）クロマトグラフィ検査ストリップ上に配される少なくとも１つの第１複合体に、前記サンプルをさらす工程であって、前記第１複合体は少なくとも１つの標識と結合される少なくとも１つの第１核酸配列を含み、前記第１核酸配列は前記二本鎖標的核酸の第１鎖の配列の一部に対して相補的な配列を含む工程と、
    （ｃ）少なくとも１つの第２複合体に、前記サンプルをさらす工程であって、前記第２複合体は少なくとも１つの第２核酸配列を含み、前記第２核酸配列は前記二本鎖標的核酸の第２鎖の配列の一部に対して相補的な配列を含む工程とを含み、
    前記二本鎖標的核酸が前記サンプルに存在する際、前記第１核酸配列と前記第２核酸配列は、前記第１複合体、前記二本鎖標的核酸、および、前記第２複合体が前記アッセイの完了時に前記検査領域で固定化されるように、前記二本鎖標的核酸と結合される
    こと特徴とする方法。
13. 前記第２複合体は少なくとも１つの固定化剤と結合し、
    前記固定化剤は前記検査ストリップの検査領域において固定化可能であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第２複合体が前記検査ストリップの検査領域に配されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
15. 工程（ａ）は前記サンプルを溶解剤又は変性剤にさらすサブステップを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
16. 前記第１核酸配列と前記第２核酸配列は、それぞれ、
    （ａ）内部プライマーと、
    （ｂ）外部プライマーと、
    （ｃ）センスプライマーと、および、
    （ｄ）アンチセンスプライマーと
    からなる群から選択される前記二本鎖標的核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）タイプのプライマーであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
17. 前記標識は、
    （ａ）少なくとも１つの蛍光ミクロビーズで混合された少なくとも１つのコロイド金粒子と、
    （ｂ）少なくとも１つの染料ラテックスミクロビーズと、
    からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
18. 前記二本鎖標的核酸の一部を切り開く工程はアッセイ条件を含み、
    前記アッセイ条件は、
    （ａ）前記二本鎖標的核酸の一部を切り開く張度、
    （ｂ）前記二本鎖標的核酸の一部を切り開く温度、
    （ｃ）前記二本鎖標的核酸の一部を切り開くｐＨ、
    （ｄ）（ａ）乃至（ｃ）の任意の組み合わせ、
    からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
19. 前記サンプルは、前記二本鎖標的核酸のアッセイの感度を上げるための増幅工程を含まずにアッセイ上で処理されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
20. ポイント・オブ・ケア・アッセイを用いて、サンプル中の少なくとも１つの二本鎖標的核酸を検出する方法であって、
    前記方法は、
    （ａ）前記二本鎖標的核酸の一部を切り開いて第１鎖及び第２鎖とする少なくとも１つのアッセイ条件に前記サンプルにさらす工程と、
    （ｂ）クロマトグラフィ検査ストリップ上に配される少なくとも１つの第１複合体に、前記サンプルをさらす工程であって、
    前記少なくとも１つの第１複合体は少なくとも１つの標識と結合される少なくとも１つの第１核酸配列を含み、前記第１複合体は第１複合体の塗布領域に載せられ、前記第１核酸配列は前記二本鎖標的核酸の第１鎖の配列の一部に対して相補的な配列を含む工程と、
    （ｃ）クロマトグラフィ検査ストリップ上に配される少なくとも１つの第２複合体に、前記サンプルをさらす工程であって、
    前記少なくとも１つの第２複合体は少なくとも１つの固定化剤と結合する少なくとも１つの第２核酸配列を含み、前記第２複合体はアッセイ開始時に検査領域で固定化されず、前記固定化剤は前記アッセイの検査領域において固定化可能であり、前記第２核酸配列は前記二本鎖標的核酸の第２鎖の配列の一部に対して相補的な配列を含む工程とを含み、
    前記二本鎖標的核酸が前記サンプルに存在する際、前記第１核酸配列と前記第２核酸配列は、前記第１複合体、前記二本鎖標的核酸、および、前記第２複合体が前記アッセイの完了時に前記クロマトグラフィ検査ストリップの検査領域で固定化されるように、前記二本鎖標的核酸と結合される
    こと特徴とする方法。
21. 前記工程（ａ）のアッセイ条件が、前記二本鎖標的核酸の一部を切り開いて前記第１鎖及び前記第２鎖とする溶解剤又は変性剤を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
22. 前記溶解剤は、前記検査ストリップに前記サンプルを塗布する前に前記サンプルに加えられることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
23. 前記クロマトグラフィ検査ストリップは溶解領域を含み、
    該溶解領域は、
    工程（ａ）において前記二本鎖標的核酸の一部を切り開いて前記第１鎖及び前記第２鎖とする溶解剤又は変性剤を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
24. 前記アッセイ条件は、
    （ａ）前記二本鎖標的核酸の一部を切り開く張度、
    （ｂ）前記二本鎖標的核酸の一部を切り開く温度、
    （ｃ）前記二本鎖標的核酸の一部を切り開くｐＨ、及び
    （ｄ）（ａ）乃至（ｃ）の任意の組み合わせ、
    からなる群から選択され、
    前記二本鎖標的核酸の一部を切り開く前記工程は前記アッセイ条件を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
25. 前記サンプルは、前記二本鎖標的核酸のアッセイの感度を上げるための増幅工程を含まずにアッセイ上で処理されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。