ES2620384T3 - Ensayo de flujo lateral de múltiples planos con zona de desvío - Google Patents

Ensayo de flujo lateral de múltiples planos con zona de desvío Download PDF

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Robert P. Sambursky
Peter Condon
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Abstract

Un dispositivo de flujo lateral para detectar un analito en una muestra, que comprende: un compresor de muestras; una tira reactiva que comprende una zona de prueba y una zona de desvío aguas arriba de la zona de prueba, en donde la zona de desvío interrumpe el flujo lateral sobre la tira reactiva; un conjugado que comprende un primer socio de unión para el analito y un marcador; y un segundo socio de unión para el analito; y una zona de aplicación de muestra donde se aplica una muestra al dispositivo de flujo lateral, en donde la zona de aplicación de muestra está ubicada en una ubicación que está seleccionada de entre el grupo que consiste en: i) sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de detección; ii) sobre el compresor de muestras; y iii) sobre un colector de muestras que comprende una porción de recogida de muestras para la recogida de la muestra; en donde un componente que está seleccionado de entre el grupo que consiste en el conjugado, el segundo socio de unión y tanto el conjugado como el segundo socio de unión no está ubicado sobre la tira reactiva antes del uso del dispositivo de flujo lateral; y en donde el compresor de muestras crea un puente por encima de la zona de desvío para desviar el flujo sobre el compresor de muestras y devolver el flujo a la tira reactiva en el extremo de la zona de desvío.

Description

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DESCRIPCION
Ensayo de flujo lateral de multiples pianos con zona de desvio Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La invencion se refiere al campo de pruebas de diagnostico analttico inmediato. Mas particularmente, la invencion se refiere a ensayos de flujo lateral.
Descripcion de la tecnica relacionada
Los ensayos de flujo lateral son un subconjunto de ensayos que combinan diversos reactivos y etapas del proceso en una tira reactiva, proporcionando de este modo un medio sensible y rapido para la deteccion de moleculas diana. Hay disponibles inmunoensayos de flujo lateral a base de anticuerpos para una amplia gama de analitos diana y se pueden disenar para principios de prueba en sandwich o competitiva. En general, los analitos con elevado peso molecular con varios epitopos se analizan en formato sandwich mientras que las moleculas pequenas que representan solo un epitopo se detectan por medio de un ensayo competitivo. Las primeras pruebas se realzaron para gonadotropina corionica humana (hCG). Hoy existen pruebas disponibles en el mercado para monitorizar la ovulacion, detectar organismos de enfermedades infecciosas, analizar drogas, y medir otros analitos importantes para la fisiologia humana. Tambien se han presentado productos para pruebas veterinarias, pruebas medioambientales y monitorizacion de productos.
En la tecnica anterior, el receptor marcado movil (tambien conocido como el rastreador o el conjugado de prueba en el presente documento) en estos ensayos esta seco sobre la tira, contenido en una solucion de elucion externa (de tal modo que se pueda mezclar previamente con la muestra antes de la aplicacion sobre la tira reactiva), o es parte de los medios de elucion.
La publicacion de patente europea EP0582231, publicada el 9 de febrero de 1994, titulada “SOLID PHASE ASSAY’, divulga un ensayo con un soporte solido poroso con una primera parte que contacta con una muestra que puede incluir un analito de interes. La muestra fluye a traves del soporte solido y el analito, si se encuentra presente, se combina con un rastreador, que esta unido de forma reversible sobre el soporte solido. La muestra y el rastreador inicialmente se desplazan en una direccion perpendicular a la primera parte (por ejemplo, en sentido vertical) mediante flujo por capilaridad. El rastreador y el analito siguen desplazandose a continuacion mediante flujo por capilaridad a traves del material hasta una segunda parte que incluye un aglutinante inmovilizado, que se une al analito en un inmunoensayo de formato en sandwich. El desplazamiento hasta la segunda parte se produce en una direccion perpendicular a la direccion en la que el rastreador y la muestra se desplazan inicialmente (por ejemplo, en sentido lateral). Todo el desplazamiento de la muestra y el rastreador se produce debido al flujo por capilaridad a traves del dispositivo. A pesar de que el desplazamiento se produce en sentido vertical y lateral, existe una unica trayectoria de flujo. La muestra, el rastreador y el aglutinante inmovilizado estan, todos, en la misma trayectoria de flujo.
La publicacion de patente de EE. UU. con n.° 2007/0224701, publicada el 27 de septiembre de 2007, titulada “COMBINATION VERTICAL AND LATERAL FLOW IMMUNOASSAY DEVICE’, divulga dispositivos de inmunoensayo, kits y metodos para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra de liquido usando una combinacion de flujo vertical y flujo lateral. El dispositivo incluye una almohadilla rastreadora con un receptor marcado que esta verticalmente yuxtapuesto con un medio de soporte del aglutinante. El dispositivo que se divulga en esta publicacion tiene multiples secciones pero, de forma similar al documento EP0582231, solo tiene una unica trayectoria de flujo. La muestra, el receptor marcado, y el medio de soporte del aglutinante estan todos en la misma trayectoria de flujo.
Sumario de la invencion
En una realization preferida, un dispositivo de flujo lateral para detectar un analito en una muestra incluye un compresor de muestras y una tira reactiva. La tira reactiva incluye una zona de prueba y una zona de desvio aguas arriba de la zona de prueba, en la que la zona de desvio interrumpe el flujo lateral sobre la tira reactiva. El dispositivo de flujo lateral tambien incluye un conjugado que incluye un primer socio de union para el analito y un marcador y un segundo socio de union para el analito. Una zona de aplicacion de muestra, en la que se aplica una muestra al dispositivo de flujo lateral, esta ubicada en una ubicacion que esta seleccionada de entre el grupo que consiste en: i) sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion; ii) sobre el compresor de muestras; y iii) sobre un colector de muestras que comprende una portion de recogida de muestras para la recogida de la muestra. Un componente que esta seleccionado de entre el grupo que consiste en el conjugado, el segundo socio de union y tanto el conjugado como el segundo socio de union no esta ubicado sobre la tira reactiva antes del uso del dispositivo de flujo lateral. El compresor de muestras crea un puente por encima de la zona de desvio para desviar el flujo sobre el compresor de muestras y devolver el flujo a la tira reactiva en el extremo de la zona de desvio. En algunas
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realizaciones preferidas, la zona de desvio incluye una separacion. En otras realizaciones preferidas, la zona de desvio incluye una barrera.
En otra realizacion preferida, un metodo realiza un ensayo de una muestra sobre un dispositivo de flujo lateral que incluye una tira reactiva y un compresor de muestras. La muestra se coloca sobre el dispositivo de flujo lateral y el flujo lateral se interrumpe sobre la tira reactiva mediante la inclusion de una zona de desvio sobre la tira reactiva. El flujo interrumpido se desvia al compresor de muestras mediante la aplicacion de una presion al dispositivo usando el compresor de muestras y el flujo se devuelve a la tira reactiva en el extremo de la zona de desvio. En algunas realizaciones preferidas, la muestra se coloca sobre una zona de aplicacion de muestra que esta ubicada en una ubicacion que esta seleccionada de entre el grupo que consiste en: i) sobre la tira reactiva aguas arriba de una zona de deteccion; ii) sobre el compresor de muestras; y iii) sobre un colector de muestras que comprende una porcion de recogida de muestras para la recogida de la muestra.
En otra realizacion preferida, un compresor de muestras aplica presion a un colector de muestras en la zona de aplicacion de muestra de una tira reactiva para transferir una muestra sobre el colector de muestras y un socio de union de analito a la zona de aplicacion de muestra en un dispositivo de flujo lateral. Al menos uno de los socios de union del analito no esta ubicado sobre la tira reactiva o en la solucion de elucion antes del uso del dispositivo de flujo lateral. En una realizacion preferida, la tira reactiva incluye una zona de desvio impasable, tal como una barrera, separacion o surco que fuerza el flujo a traves del dispositivo para que se desvie hacia el compresor de muestras. La tira reactiva puede ser una tira reactiva universal sin ninguna molecula que se une especificamente al analito sobre la tira reactiva. El compresor de muestras puede ser un compresor de muestras universal sin ninguna molecula que se une especificamente al analito sobre el compresor de muestras. El dispositivo de flujo lateral tambien puede incluir un elemento de intensificacion, en donde el elemento de intensificacion se une al sandwich del analito para incrementar una senal de deteccion en la zona de prueba.
En una realizacion de la presente invencion, el dispositivo de flujo lateral para detectar un analito incluye un compresor de muestras, un colector de muestras con una parte de recogida de muestras, una tira reactiva con una zona de aplicacion de muestra, una zona de desvio y una zona de prueba, un conjugado que incluye un primer socio de union para el analito y un marcador, y un segundo socio de union para el analito. El conjugado o el segundo socio de union o tanto el conjugado como el segundo socio de union no estan ubicados sobre la tira reactiva antes del uso del dispositivo de flujo lateral. El compresor de muestras, el colector de muestras y la tira reactiva forman una pila vertical para aplicar la muestra a la tira reactiva por compresion. El compresor de muestras, preferiblemente, tiene una almohadilla / superficie afelpada con el conjugado y/o el segundo socio de union estando ubicados sobre la almohadilla antes del uso del dispositivo de flujo lateral. En algunas realizaciones, el dispositivo de flujo lateral incluye un primer socio de union de control ubicado sobre la almohadilla de compresor de muestras y un segundo socio de union de control inmovilizado en una zona de control de la tira reactiva, en donde el primer socio de union de control es un socio de union para el segundo socio de union de control. El dispositivo de flujo lateral esta formado, preferiblemente, de tal modo que un resultado positivo se consigue solo mediante aislamiento del analito en la zona de prueba mediante union del analito al primer socio de union y al segundo socio de union. La zona de prueba, preferiblemente, no incluye ninguna molecula que se une especificamente al analito. Preferiblemente, el segundo socio de union incluye una marca y la zona de prueba incluye un socio de union inmovilizado para la marca.
Breve descripcion de los dibujos
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figura 1
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figura 2A
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figura 2B
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figura 2C
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figura 3A
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figura 3B
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figura 4A
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figura 4C
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figura 5A
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figura 5B
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figura 6A
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figura 6B
La
figura 7A
muestra una tira reactiva y un colector de muestras en un dispositivo de flujo lateral.
muestra un compresor de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra otro compresor de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra un colector de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra una tira reactiva de flujo lateral en una realizacion de la presente invencion.
muestra un sandwich completo que incluye el analito, el conjugado y un socio de union
inmovilizado en una realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo de flujo lateral que incluye la tira reactiva de la figura 3A, un colector de
muestras y un compresor de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra otra tira reactiva de flujo lateral en una realizacion de la presente invencion.
muestra un sandwich completo que incluye el analito, el conjugado y un segundo socio de union
marcado en una realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo de flujo lateral que incluye la tira reactiva de la figura 4A, un colector de
muestras y un compresor de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra otra tira reactiva de flujo lateral mas, en una realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo de flujo lateral que incluye la tira reactiva de la figura 5A, un colector de
muestras y un compresor de muestras en otra realizacion de la presente invencion.
muestra otra tira reactiva de flujo lateral en una realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo de flujo lateral que incluye la tira reactiva de la figura 6A, un colector de
muestras y un compresor de muestras, en otra realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo similar al dispositivo de la figura 3C, excepto que la zona de prueba se
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figura 11
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figura 15B
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figura 15C
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figura 17A
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figura 17B
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figura 19A
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figura 19B
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figura 20A
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figura 20B
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figura 21A
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figura 21B
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figura 21C
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figura 22A
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figura 22B
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figura 22C
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figura 23A
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figura 23B
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figura 24A
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figura 24B
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figura 25A
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figura 25B
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figura 26A
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figura 26B
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figura 27A
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figura 27B
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figura 27C
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La
figura 29B
La
figura 30A
La
figura 30B
La
figura 31A
encuentra en la zona de aplicacion de muestra en una realizacion de la presente invencion. muestra un dispositivo similar al dispositivo de la figura 4C, excepto que la zona de prueba se encuentra en la zona de aplicacion de muestra en una realizacion de la presente invencion. muestra un dispositivo similar al dispositivo de la figura 5B, excepto que la zona de prueba se encuentra en la zona de aplicacion de muestra en una realizacion de la presente invencion. muestra un dispositivo similar al dispositivo de la figura 6B, excepto que la zona de prueba se encuentra en la zona de aplicacion de muestra en una realizacion de la presente invencion. muestra un dispositivo de flujo lateral en una realizacion de la presente invencion. muestra otro dispositivo de flujo lateral en una realizacion de la presente invencion. muestra una pila vertical en una realizacion de la presente invencion. muestra un sandwich con conjugado de oro de la tecnica anterior en la zona de prueba. muestra un sandwich con intensificacion de senales en la zona de prueba en una realizacion de la presente invencion.
muestra un sandwich con apilamiento en la zona de prueba en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista en despiece ordenado esquematica de un dispositivo de flujo lateral con
elementos de intensificacion de senales en algunas realizaciones de la presente invencion.
muestra un dispositivo de flujo lateral en otra realizacion de la presente invencion.
muestra una pila que se forma en una realizacion de la presente invencion.
muestra la pila de la figura 15A inmovilizada en la zona de prueba.
muestra un complejo que se forma en la zona de control.
muestra un dispositivo de flujo lateral en otra realizacion de la presente invencion.
muestra una pila que se forma en una realizacion de la presente invencion.
muestra la pila de la figura 17A inmovilizada en la zona de prueba.
muestra un dispositivo de flujo lateral en otra realizacion de la presente invencion.
muestra una pila que se forma en una realizacion de la presente invencion.
muestra la pila de la figura 19A inmovilizada en la zona de prueba.
muestra una tira reactiva de flujo lateral en una realizacion de la presente invencion.
muestra un sandwich “completo”, que se forma, preferiblemente, antes de alcanzar la linea de
prueba, entre el analito, el conjugado marcado y un segundo socio de union movil marcado.
muestra otra realizacion de una tira reactiva de flujo lateral con elementos intensificadores.
muestra el complejo apilado en la linea de prueba en presencia de analito.
muestra un complejo apilado con la linea de prueba con elementos intensificadores adicionales.
muestra la encapsulacion de una fuente de amplificacion en una realizacion de la presente
invencion.
muestra la encapsulacion de agente de revelado de plata en una realizacion de la presente invencion.
muestra la encapsulacion de sales de plata y agente de revelado de plata de forma conjunta en una realizacion de la presente invencion.
muestra la encapsulacion de un primer conjugado en una realizacion de la presente invencion. muestra la encapsulacion de un segundo conjugado (un conjugado de apilamiento) en una realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una barrera en otra realizacion de la presente invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 24A despues de la compresion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una separacion en otra realizacion de la presente
invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 25A despues de la compresion.
muestra una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio y un compresor
de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista en perspectiva del dispositivo de flujo lateral de la figura 26A.
muestra una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio, un compresor de
muestras, un dispositivo de recogida de muestras que comprende un papel de separacion, y una
tira reactiva cromatografica en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista desde arriba de una seccion de la tira reactiva en la realizacion de la figura 27A. muestra una vista desde arriba de una seccion de la tira reactiva despues de que el papel de separacion se haya colocado encima de la zona de aplicacion de muestra en la realizacion de la figura 27B.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio, un compresor de muestras, un dispositivo de recogida de muestras que comprende un papel de separacion, y una tira reactiva cromatografica en una realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una barrera en otra realizacion de la presente invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 29A despues de la compresion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una separacion en otra realizacion de la presente
invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 30A despues de la compresion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una barrera en otra realizacion de la presente invencion.
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figura 34A
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figura 35A
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figura 36A
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figura 37A
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figura 40A
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figura 42A
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figura 43A
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figura 44A
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figura 48C
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 31A despues de la compresion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una separacion en otra realizacion de la presente
invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 32A despues de la compresion.
muestra una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio y un compresor
de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista en perspectiva del dispositivo de flujo lateral de la figura 33A.
muestra una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio y un compresor
de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista en perspectiva del dispositivo de flujo lateral de la figura 34A.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una barrera en otra realizacion de la presente invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 35A despues de la compresion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una separacion en otra realizacion de la presente
invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 36A despues de la compresion.
muestra una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio y un compresor
de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista en perspectiva del dispositivo de flujo lateral de la figura 37A.
muestra una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio, un compresor de
muestras, un dispositivo de recogida de muestras que incluye un papel de separacion, y una tira
reactiva cromatografica en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista desde arriba de una seccion de la tira reactiva en la realizacion de la figura 38A. muestra una vista desde arriba de una seccion de la tira reactiva despues de que el papel de separacion se haya colocado encima de la zona de aplicacion de muestra en la realizacion de la figura 38B.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio, un compresor de muestras, un dispositivo de recogida de muestras que incluye un papel de separacion, y una tira reactiva cromatografica en una realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una barrera en otra realizacion de la presente invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 40A despues de la compresion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una separacion en otra realizacion de la presente
invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 41A despues de la compresion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una barrera en otra realizacion de la presente invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 42A despues de la compresion.
muestra un dispositivo de flujo lateral con una separacion en otra realizacion de la presente
invencion.
muestra el dispositivo de flujo lateral de la figura 43A despues de la compresion.
muestra una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio y un compresor
de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista en perspectiva del dispositivo de flujo lateral de la figura 44A.
muestra una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio y un compresor
de muestras en una realizacion de la presente invencion.
muestra una vista en perspectiva del dispositivo de flujo lateral de la figura 45A.
muestra un dispositivo de analisis de muestras completamente abierto con tiras reactivas duales,
asi como una zona de conjugado y una zona de aplicacion de muestra sobre un compresor de
muestras en un plano separado de las tiras reactivas en una realizacion de la presente invencion.
muestra el dispositivo de analisis de muestras de la figura 46A con parte de la carcasa cerrada,
pero la zona de conjugado aun visible en el lado izquierdo del dispositivo.
muestra el dispositivo de analisis de muestras de la figura 46A despues de que se haya iniciado la prueba.
muestra un resultado de prueba negativo tanto para MxA como para CRP en una realizacion de la presente invencion.
muestra un resultado de prueba positivo para MxA en una realizacion de la presente invencion. muestra un resultado de prueba positivo para MxA en una realizacion de la presente invencion. muestra un resultado de prueba positivo para CRP en una realizacion de la presente invencion. muestra un resultado de prueba positivo para CRP en una realizacion de la presente invencion. muestra un resultado de prueba positivo tanto para CRP como para MxA, indicando una infeccion conjunta, en una realizacion de la presente invencion.
muestra un dispositivo de analisis de muestras completamente abierto con tiras reactivas duales y una zona de conjugado sobre un compresor de muestras en un plano separado de las tiras reactivas en una realizacion de la presente invencion.
muestra el dispositivo de analisis de muestras de la figura 48 con parte de la carcasa cerrada, pero la zona de conjugado aun visible en el lado izquierdo del dispositivo.
muestra el dispositivo de analisis de muestras de la figura 48A despues de que se haya iniciado la prueba.
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La figura 49 muestra un kit para analisis de muestras que usa un dispositivo de analisis de muestras en una realizacion de la presente invencion.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos y dispositivos para detectar un analito (tambien conocido como la diana) en una muestra, en donde la muestra a analizar se aplica a un portador cromatografico. En configuraciones de multiples planos para pruebas de diagnostico analitico inmediato, el conjugado que contiene uno de los socios de union del analito en cuestion es, preferiblemente, suministrado desde un plano diferente. La muestra que contiene el analito es recogida directamente de la fuente y, preferiblemente, no experimenta ningun tratamiento, elucion, dilucion o concentracion anterior. Se hace que el conjugado entre en contacto con la muestra por medio de un compresor de muestras, tambien denominado en el presente documento como dispositivo compresor. La compresion ayuda a combinar el conjugado movilizado y la muestra. El compresor de muestras, que incluye el conjugado en algunas realizaciones preferidas es, preferiblemente, completamente independiente del dispositivo de analisis de muestras. El compresor de muestras no forma parte de la trayectoria de flujo sobre la tira reactiva. Como resultado, la transferencia del conjugado y la muestra al dispositivo de analisis de muestras, que es preferiblemente una tira reactiva, se inicia usando presion, no flujo o accion por capilaridad. Despues de que el compresor de muestras se aplique, si fuera necesario puede haber un lapso de tiempo antes de aplicar el tampon de migration. Este lapso de tiempo entre la aplicacion de muestra y el inicio de las pruebas mediante el flujo puede ser de hasta 24 horas o muchos dias, dependiendo de la estabilidad del analito. Los componentes no de la tira reactiva, incluyendo, dependiendo de la realizacion, cualquier combination del compresor de muestras, el colector de muestras y uno o mas socios de union externos, preferiblemente permanecen asociados con la tira reactiva hasta que se inicia el flujo.
En algunas realizaciones preferidas, el dispositivo de analisis de muestras incluye una zona de desvio, tal como una barrera, separation o surco que desvia el flujo a traves del dispositivo de analisis de muestras hacia un plano separado. Esto aumenta la interaction entre los reactivos sobre el compresor de muestras y tanto los reactivos como la muestra sobre el dispositivo de analisis de muestras. Ademas, la barrera bloquea por completo el flujo hasta que el compresor de muestras se hace descender para crear un “puente” que redirige el flujo hacia el plano en el que se encuentra el compresor y entonces devuelve el flujo al dispositivo de analisis de muestras en donde finaliza la barrera. Debido a que el liquido ha de fluir a traves del compresor, este recoge cualquier reactivo (incluyendo el conjugado) que este ubicado sobre la almohadilla de compresor a medida que se desplaza.
Un dispositivo de flujo lateral de la presente invencion puede ser un inmunoensayo que usa anticuerpos o un ensayo no inmunologico que no usa anticuerpos sino que, en su lugar, usa otros socios de union, incluyendo, pero sin limitarse a, acidos nucleicos, nanoparticulas, ligandos y receptores.
Antes de una descripcion adicional de la presente invencion, y para que la invencion se pueda entender mas facilmente, ciertos terminos han sido definidos en el presente documento, tal como se relacionan con la presente invencion:
El termino “compresion”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la aplicacion de muestra y cualesquiera componentes sobre una almohadilla de compresor de muestras a la tira reactiva. En algunas realizaciones en las que la zona de aplicacion de muestra se encuentra sobre un colector de muestras o la almohadilla de un compresor de muestras, la almohadilla, la parte de recogida del colector de muestras y la zona de aplicacion de muestra son, todas, preferiblemente compresibles, de tal modo que la compresion de las tres se produce durante la aplicacion de muestra a la tira reactiva.
El termino “presion”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a presion fisica y, mas especificamente, presion fisica aplicada por un compresor de muestras a una muestra sobre un colector de muestras y, a su vez, a una zona de aplicacion de muestra de una tira reactiva. En algunas realizaciones sin un colector de muestras, la presion se aplica entre el compresor de muestras y los componentes de la tira. Tal como se usa en el presente documento, presion, que puede ser suministrada mediante un medio mecanico o un usuario del dispositivo de flujo lateral, pone a la almohadilla de compresor de muestras, la parte de recogida del colector de muestras y la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva en contacto fisico para transferir la muestra y cualesquiera componentes sobre la almohadilla de compresor de muestras a la tira reactiva. Esta transferencia, preferiblemente, no se produce mediante un flujo vertical. En otras realizaciones, la presion pone la almohadilla del compresor de muestras (que puede incluir cualquiera o la totalidad de los reactivos conjugados, los reactivos de control y/o la zona de aplicacion de muestra) y la tira reactiva en contacto fisico para transferir la muestra y cualquier componente sobre la almohadilla del compresor de muestras a la tira reactiva. Esta transferencia preferiblemente no tiene lugar por medio de un flujo vertical.
Los terminos “vertical” y “en sentido vertical”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a la direction paralela al grosor o profundidad, en oposicion a las dimensiones de longitud y anchura de los elementos utilizados en el dispositivo, tales como las almohadillas o medios.
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Los terminos “lateral" y “en sentido lateral", tal como se usan en el presente documento, se refieren a la direccion paralela a la longitud, en oposicion a las dimensiones de anchura y profundidad de los elementos utilizados en el dispositivo, tales como las almohadillas y los medios.
En algunas realizaciones, muchos de los elementos de la tira reactiva son sustancialmente planos y tienen una dimension lateral que es mayor que la dimension vertical. Las magnitudes de estas dimensiones unas con respecto a otras, no obstante, se pueden cambiar dentro del espiritu de la invencion. En general, los terminos “vertical", “en sentido vertical", “lateral" y “en sentido lateral" tambien se refieren a la yuxtaposicion u orientacion de los elementos del dispositivo. Para elementos yuxtapuestos en sentido vertical, una linea normal a y que interseca la superficie plana de dicho elemento es tambien sustancialmente normal a e interseca la superficie plana de los otros elementos yuxtapuestos en sentido vertical.
La expresion “trayectoria de flujo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la trayectoria del flujo por capilaridad en un dispositivo de flujo durante el uso del dispositivo. La trayectoria de flujo en un dispositivo de flujo lateral convencional es en sentido lateral a lo largo de la longitud del dispositivo. En algunas realizaciones preferidas de la presente invencion, la trayectoria de flujo lateral se desvia hacia el compresor de muestras por medio de la zona de desvio, y entonces se desvia de vuelta sobre la tira reactiva en el extremo de la zona de desvio.
El termino “marcador”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier atomo, atomos, molecula o moleculas, tales como una marca fluorescente, usada para proporcionar una senal detectable y, preferiblemente, cuantificable. Los metodos de deteccion del marcador incluyen, pero sin limitarse a, deteccion visible, fluorescencia, quimioluminiscencia, radiactividad, colorimetria, gravimetria, difraccion de rayos X, absorcion de rayos X, magnetismo y actividad enzimatica. Las zonas de prueba del espectro visible pueden ser interpretadas por un espectrometro para dar resultados de prueba cuantificados.
La expresion “lisis in situ", tal como se usa en el presente documento, se refiere a tecnicas para incorporar agentes de lisis en un dispositivo de pruebas analiticas de diagnostico inmediato, tales como una tira reactiva de cromatografia u otro dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, de tal modo que la operacion de lisis no se realice como una etapa independiente.
El termino “zona", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier parte de la tira reactiva. Los limites de una zona son, preferiblemente, planos perpendiculares a la direccion lateral. El termino “zona" tambien abarca el termino “linea", que se refiere a una zona que tiene una longitud en la direccion lateral significativamente menor que su anchura.
Los terminos “encapsulation" y “microencapsulacion" tal como se definen en el presente documento quieren decir envolver o encapsular de forma temporal / no permanente un reactivo o componente de un ensayo en una envolvente como si se encontrara en el interior de una capsula. La envolvente protege el reactivo o componente frente a su entorno circundante hasta un instante apropiado. A continuation, el material escapa a traves de la pared de la envolvente por diversos medios, incluyendo la rotura, disolucion, fusion o difusion. En la microencapsulacion, las dimensiones de la envolvente varian de una micra a varios milimetros. El termino “encapsulado" tal como se usa en el presente documento se refiere a un componente de ensayo o un reactivo que se haya sometido a encapsulacion o microencapsulacion.
El termino “barrera" tal como se usa en el presente documento se refiere a una estructura fisica o barrera quimica que obstruye, bloquea o impide el flujo. Como alternativa, la barrera puede ser semipermeable para permitir una liberation mas lenta (retardada) de otros reactivos, por ejemplo plata o reactivos de apilamiento. En algunas realizaciones, la barrera es un material inerte como Sephadex o Sepharose o acetato de celulosa. Como alternativa, la barrera puede ser de naturaleza quimica, por ejemplo un material higroscopico incluyendo, pero sin limitarse a, sales de calcio (por ejemplo, CaCl2 o CaSO4) o gel de silice usado en desecantes. La capacidad de absorcion de desecantes es limitada (y se puede controlar mediante la incorporation de diferentes cantidades) y, una vez que se ha superado el limite, el liquido se puede mover por encima (o a traves) de los mismos. El hidrogel es otro ejemplo. Como alternativa, la barrera puede ser de naturaleza hidrofoba, que “repele" el tampon de migration acuoso. En los dispositivos de flujo lateral que se describen en el presente documento, la barrera bloquea el flujo en el plano lateral, forzando que el flujo se desvie a otro plano. En algunas realizaciones preferidas, las barreras son unas membranas impermeables que interrumpen el flujo en el mismo plano. En otras realizaciones preferidas, la barrera que impide el flujo es “semipermeable", dando lugar a dos flujos que difieren en los caudales. La trayectoria de flujo mas lento puede proporcionar nuevos reactivos de una forma retardada en el tiempo.
Los terminos “separation" o surco" tal como se usan en el presente documento se refieren a una abertura, fisura u orificio que obstruye, bloquea o impide el flujo. En los dispositivos de flujo lateral que se describen en el presente documento, la separacion o surco detiene el flujo en el plano lateral, forzando que el flujo se desvie a otro plano. La profundidad de la separacion o surco es cualquier profundidad suficiente para detener o bloquear por completo el flujo.
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Algunas realizaciones de la presente invencion incluyen ensayos en los que el analito (diana) a detectar no se une directamente a un socio de union inmovilizado en la zona de prueba de una tira reactiva. En su lugar, el analito preferiblemente interactua con uno o mas socios de union al analito en otras zonas (o en el tampon, en algunas realizaciones) sobre la tira. Al menos uno de los socios de union al analito incluye una primera marca que forma un complejo con una segunda marca inmovilizada en la zona de prueba. En otras realizaciones, el analito se une directamente a un socio de union inmovilizado en la zona de prueba de la tira reactiva.
En algunas realizaciones preferidas, un socio de union a la zona de control esta incluido sobre el compresor de muestras. Con este diseno, si la zona del conjugado sobre el compresor de muestras no esta adecuadamente comprimida y se le ha hecho contactar con la tira reactiva, no se desarrollara ninguna zona de control incluso con un flujo apropiado del tampon de migracion. Por lo tanto, el aspecto de la zona de control con las muestras de prueba tanto negativa como positiva indica un autentico control procedimental en la prueba.
En algunas realizaciones de la presente invencion, cuando comienza el flujo lateral, la tira reactiva ya no se encuentra en contacto compresivo con el compresor de muestras y el colector de muestras. En otras realizaciones de la presente invencion, no obstante, la pila vertical se mantiene durante el flujo lateral para aumentar al maximo la transferencia desde el compresor de muestras y el colector de muestras a la tira reactiva. En otras realizaciones mas, el colector de muestras se retira de la pila vertical despues de la aplicacion de muestra a la tira reactiva, pero el compresor de muestras se mantiene a continuacion en contacto con la tira reactiva durante el flujo lateral para aumentar al maximo la transferencia desde el compresor de muestras a la tira reactiva. En algunas realizaciones con una zona de desvio, la tira reactiva se encuentra en contacto de compresion con el compresor de muestras cuando comienza el flujo lateral, y el compresor de muestras crea un puente por encima de la zona de desvio.
La invencion proporciona un metodo sensible y rapido para la deteccion de analitos, por ejemplo patogenos, enzimas, mediadores inmunologicos, acidos nucleicos, proteinas, glucoproteinas, lipopolisacaridos, productos de adicion de proteinas, marcadores tumorales y cardiacos y/o compuestos de bajo peso molecular, incluyendo, pero sin limitarse a, haptenos. Los metodos y dispositivos son adecuados para el diagnostico en seres humanos y animales, por ejemplo mascotas o animales de granja. La deteccion puede incluir deteccion directa del analito y/o la deteccion de anticuerpos contra el analito, que se encuentran presentes en la muestra de fluido a poner a prueba. Preferiblemente, el metodo incluye una determinacion paralela de una pluralidad de analitos. Los patogenos se seleccionan, preferiblemente, entre virus o microorganismos, tales como bacterias, hongos (por ejemplo, levaduras o mohos) o parasitos (por ejemplo, amebas o nematodos). Los mediadores inmunitarios son parte de la cascada inflamatoria e incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos, factores de crecimiento, complementos, citoquinas, linfoquinas, quimioquinas, interferones y derivados de interferon, proteina C-reactiva, calcitonina, amiloide, moleculas de adhesion, anticuerpos, y componentes quimio-atrayentes. Los compuestos de bajo peso molecular pueden incluir moleculas de farmacos o quimicas o complejos y metabolitos formados por moleculas de farmacos o quimicas.
La deteccion puede incluir una deteccion directa de la diana, por ejemplo el patogeno, y/o la deteccion de anticuerpos contra la diana, por ejemplo el patogeno, que se encuentran presentes en la muestra de fluido a poner a prueba. Preferiblemente, el metodo incluye una determinacion paralela de una pluralidad de dianas.
Como alternativa, el analito de interes puede ser un compuesto de bajo peso molecular. En una realizacion preferida, el analito a detectar es una molecula de farmaco tal como heroina o metanfetamina. En otras realizaciones preferidas, el compuesto de bajo peso molecular es una molecula pequena, tal como un hapteno.
La invencion tambien incluye la deteccion de una pluralidad de patogenos, alergenos, mediadores inmunitarios, acidos nucleicos o compuestos de bajo peso molecular sobre un unico portador cromatografico. El dispositivo de analisis de muestras puede permitir la deteccion simultanea de una pluralidad de compuestos de bajo peso molecular, mediadores inmunitarios, acidos nucleicos, proteinas o patogenos. A pesar de que la muestra es, preferiblemente, un fluido, materia o masa seca parcial o sustancialmente solida se puede poner a prueba como una muestra en dispositivos y metodos de la presente invencion. Por ejemplo, el fluido se puede coagular o endurecer, tal como en una herida cicatrizante, ser recogido con el colector de muestras, y a continuacion transferido a la zona de aplicacion de muestra. La muestra puede ser, como alternativa, una parte endurecida de una ampolla eliminada de la ampolla que puede estar humedecida por un fluido corporal cerca del sitio de la ampolla, tal como cuando se recoge una muestra a poner a prueba para una enfermedad de transmision sexual, o humedecerse mediante el tampon de flujo sobre la tira reactiva. La muestra puede ser uno o mas exudados de heridas o ampollas.
La muestra corporal es, preferiblemente, sangre completa, suero, plasma, un fluido de membrana mucosa (de las cavidades bucal, nasal, vaginal, anal, del oido interno y ocular), liquido cefalorraquideo (LCR), fluido lacrimal, fluido del pene, una secrecion o exudado de una glandula, o una secrecion o exudado de una lesion o ampolla, por ejemplo lesiones o ampollas sobre la piel. Mas preferiblemente, la muestra se selecciona entre fluidos bucal, nasal, ocular, genital y rectal y secreciones o exudados de lesiones o ampollas de la piel.
En algunas realizaciones, la cantidad de liquido asociado con la muestra es insuficiente para transferir la muestra y/o cualquier conjugado o segundo socio de union sobre la almohadilla de compresor de muestras a la zona de
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aplicacion de muestra bajo compresion; en su lugar, el tampon de migracion proporciona el fluido adicional requerido para la transferencia de la muestra y/o conjugado y/o segundo socio de union a la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva. En otras realizaciones, la muestra y/o cualquier conjugado o segundo socio de union sobre la almohadilla de compresor de muestras es transferido a la zona de aplicacion de muestra bajo compresion. En algunas realizaciones alternativas, el tampon de migracion se puede aplicar a traves del compresor. En algunas realizaciones con una zona de desvio, el tampon de migracion recoge los componentes sobre el compresor de muestras (incluyendo reactivos conjugados, reactivos de control y la muestra) y un colector de muestras, si se encuentra presente, cuando este se desvia hacia el compresor de muestras.
En algunas realizaciones preferidas, la muestra es un fluido que no gotea o fluye despues de que es recogido. En su lugar, el fluido es una masa coagulada, de tal modo que, despues de que la muestra esta recogida sobre el colector de muestras, la muestra se pueda mantener en sentido vertical o incluso boca abajo, y la muestra permanece sobre el colector de muestras. Por ejemplo, cuando una muestra ocular es recogida y no esta sometida a pretratamiento, la muestra permanece sobre el colector de muestras incluso si se mantiene en sentido vertical o boca abajo, principalmente debido a la tension superficial. Esto se debe a que la muestra esta atrapada y contenida eficazmente sobre el colector de muestras material, por ejemplo una superficie afelpada del colector de muestras. En algunas realizaciones preferidas, se usan fibras de poli(tereftalato de etileno) (PET), tales como fibras Dacron®, o fibras de nailon, debido a que la union no es especifica o permanente, asi que estas fibras “liberan” el analito cuando se humedecen. El fenomeno es similar a limpiar suavemente una salpicadura con una toalla de papel, de tal modo que la humedad se mantiene en los poros y mediante la tension superficial. Otros materiales que se podrian usar para la superficie afelpada del colector de muestras incluyen, pero sin limitarse a, poliesteres, celulosa, rayon, alginato calcico, estructuras mecanicas sometidas a microingenieria que contienen microcapilares y/o microcanales, u otras telas o mallas. En algunas realizaciones en las que se necesita un material colector esteril para recoger un fluido del cuerpo humano, se usan preferiblemente materiales que pueden ser esterilizados y estan aprobados para biocompatibilidad.
Una ventaja significativa del metodo es que los resultados de la prueba se proporcionan dentro del periodo de consulta medica, por ejemplo en unos pocos minutos. Preferiblemente, los resultados se proporcionan en un periodo de tiempo de hasta 20 minutos, mas preferiblemente hasta 15 minutos. La prueba tambien se puede realizar hasta de 24 a 48 horas despues de que la muestra ha sido tomada del paciente. Ademas, debido a que la prueba es no invasiva, plantea muy poco riesgo para el paciente. Por lo tanto, el mejor tratamiento disponible se puede aplicar de forma oportuna para un patogeno especifico. Una ventaja adicional respecto a metodos de la tecnica anterior es que solo se requieren unos pocos microlitros de muestra para realizar un analisis. La muestra es, preferiblemente, de aproximadamente 0,1 microlitros a aproximadamente 100 microlitros, mas preferiblemente de aproximadamente 0,2 microlitros a aproximadamente 20 microlitros y, de la forma mas preferible, de aproximadamente 0,5 microlitros a aproximadamente 15 microlitros.
La invencion se puede realizar por medio de un sencillo kit de prueba. La manipulation del kit de prueba no necesita equipo de laboratorio adicional, manipulacion adicional de reactivos o instrumentation. Otra importante ventaja de la invencion que se describe en el presente documento es que el limite de detection es, normalmente, de 10 a 100 veces inferior que las pruebas de diagnostico disponibles actualmente, debido a que las muestras no requieren dilution antes de ser transferidas al dispositivo de analisis. Por lo tanto, los metodos de la presente invencion son mas sensibles y precisos que los metodos de la tecnica anterior.
Si tanto el conjugado, que incluye un primer socio de union para el analito y un marcador detectable, como un segundo socio de union para el analito estan ubicados sobre el compresor de muestras, el dispositivo de analisis de muestras se puede fabricar y usar para pruebas para cualquier analito. El usuario necesitaria simplemente elegir el compresor especifico que contenia los socios de union dirigidos al analito de interes.
En algunas de las realizaciones de la invencion, una muestra de fluido corporal se recoge de forma no invasiva con un dispositivo de recogida o elemento de hisopo. La etapa de recogida preferiblemente incluye pasar o restregar el elemento de hisopo sobre una superficie del cuerpo que contiene fluido corporal a poner a prueba. Preferiblemente, el elemento de hisopo es esteril. El elemento de hisopo puede estar seco o pretratado con un fluido antes de la etapa de recogida.
En otras realizaciones, la muestra de fluido corporal, tal como sangre, se recoge en una pipeta u otro dispositivo de recogida. La etapa de recogida preferiblemente incluye la obtencion de sangre, por ejemplo usando una lanceta, y recogiendo la misma con una pipeta.
En algunas realizaciones preferidas, no hay pretratamiento del elemento de hisopo o la sangre en la pipeta, y la muestra se recoge y se transfiere al dispositivo de analisis de muestras sin ningun tratamiento de la muestra recogida. Recogiendo la muestra con un dispositivo de recogida y no sometiendo a la muestra a etapas de pretratamiento tales como extraer y/o diluir la muestra, se evita la degradation de la muestra. El analito a poner a prueba, preferiblemente, permanece intacto o en su forma nativa rodeado por o mezclado con las otras sustancias de origen natural en la muestra.
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En la tecnica anterior, cuando la muestra se extrae y se diluye en tampon, la muestra a menudo ya no esta intacta. Esto puede cambiar la “conformacion” del analito debido a su estabilidad o labilidad. Recogiendo una muestra directamente usando un dispositivo de recogida y no pretratando la muestra, la naturaleza nativa de la muestra se preserva en forma concentrada. Debido a que esto da como resultado una mayor concentracion de muestra en menos volumen, esto incrementa la sensibilidad de la prueba. Ademas, sin dilucion de la muestra, el tiempo de aparicion y la intensidad de la zona de prueba son directamente proporcionales a la concentracion de analito. Usando un espectrometro, es posible obtener cuantificacion numerica absoluta. Ademas, el no tener que pretratar la muestra hace a la prueba mas sencilla, mas rapida y menos costosa. Tambien permite que la prueba sea realizada en un entorno clinico por medicos, enfermeros, o tecnicos de laboratorio. En tiras reactivas usadas para detectar conjuntivitis, la sensibilidad de las pruebas es comparable a la sensibilidad de pruebas de reaccion en cadena de polimerasa ultrasensibles.
Los metodos y dispositivos de la tecnica anterior requerian pretratamiento. Algunas de las razones por las que se creia que el pretratamiento era necesario incluian la creencia erronea de que el pretratamiento daria como resultado una muestra mas homogenea. Otra razon era que se creia que era necesario tamponar las muestras concentradas antes de llevar a cabo un ensayo de union. Otros describieron la necesidad de lavar la muestra, eliminar particulas y sustancias contaminantes que podrian dan lugar potencialmente a una reaccion de union inespecifica y, por lo tanto, un resultado de la prueba falso positivo. Tambien habia una creencia generalizada en la tecnica anterior de que una muestra homogenea mas grande producia los resultados de la prueba de ensayo mas sensibles y especificos.
Por el contrario, al no pretratar la muestra, el usuario conserva muestras no homogeneas, altamente concentradas. Tal como se describe mediante el principio material de la polarizacion interfacial, en materiales dielectricos no homogeneos hay distribuciones de carga que se producen en las interfaces de las fases que componen el dielectrico no homogeneo. En una muestra de fluido corporal infeccioso “intacta” (sin diluir o sin alterar) in vivo, las cargas o los portadores de carga estan impedidos mediante captura en centros de impureza o en las interfaces de fase. Las caracteristicas de esta muestra “intacta” dan como resultado un efecto condensador de dos capas que da como resultado una polarizacion de espacio - carga. Las caracteristicas de una naturaleza homogenea “intacta” dan como resultado una mayor eficiencia de union y, por lo tanto, un ensayo mas sensible.
Anteriormente se desconocia que efectos tendrian los fluidos corporales, incluyendo sangre, lagrimas y exudados purulentos, sobre diferentes materiales de superficie afelpada del colector. Especificamente, se desconocia si los analitos serian liberados eficazmente del otro material celular y transferidos desde un colector de muestras a un dispositivo de analisis de muestras.
En algunas realizaciones, el tamano de muestra es, preferiblemente, unos pocos microlitros. Despues de la transferencia de la muestra a la zona de aplicacion de muestra (preferiblemente sin tratar la muestra), se anade el medio de elucion (tambien conocido como tampon de migracion). Los metodos de la tecnica anterior de ejecucion de inmunoensayos de flujo lateral eran incapaces de realizar esta etapa de lavado. Por ejemplo, cuando se recoge una muestra ocular para realizar pruebas de infecciones oculares, tales como conjuntivitis, el tamano de muestra es, preferiblemente, de 3 a 15 microlitros. En este ejemplo, de 150 a 200 microlitros de medio de elucion se anaden a continuacion a la tira reactiva. Como comparacion con diferentes sistemas de ensayo, este lavado de 40 a 50 veces supera el lavado realizado en pruebas de ELISA dependientes de maquinas.
En un ejemplo de recogida de una muestra, usando un suave movimiento en remolino, un elemento de hisopo esteril se puede aplicar a la superficie corporal o membrana mucosa de importancia y se le permite capturar cualesquiera patogenos, compuestos de bajo peso molecular y/o mediadores inmunitarios, peptidos, glucoproteinas, acidos nucleicos y componentes relacionados con alergias contenidos en el fluido corporal.
El elemento de hisopo puede ser una parte que es dependiente del dispositivo de analisis de muestras. La muestra es, a continuacion, transferida poniendo el contacto el elemento de hisopo con el dispositivo de analisis de muestras y el compresor de muestras en condiciones, en donde al menos parte de la muestra se encuentra sobre el elemento de hisopo. Al menos parte del conjugado en algunas realizaciones en las que el conjugado esta ubicado sobre el compresor de muestras y/o al menos parte del segundo socio de union en algunas realizaciones en las que el segundo socio de union esta ubicado sobre el compresor de muestras son tambien transferidas al dispositivo de analisis de muestras debido a la presion. Esto es un fenomeno similar a exprimir el fluido fuera de una esponja. En la presente realizacion, el elemento de hisopo, preferiblemente, se encuentra en contacto tanto con una zona de aplicacion de muestra sobre el dispositivo de analisis como sobre la parte de almohadilla de compresor de muestras (que preferiblemente incluye el conjugado y/o un segundo socio de union para el analito). La muestra y el conjugado son, a continuacion, transferidos a la zona de aplicacion de muestra y, a continuacion, se desplazan a la zona de deteccion. En algunas realizaciones, el elemento de hisopo puede estar fijado en una posicion de contacto con el dispositivo de analisis de muestras en el que la zona de recogida de muestras del elemento de hisopo se encuentra en contacto directo con la zona de aplicacion de muestra del dispositivo de analisis. Por lo tanto, el elemento de hisopo y/o el dispositivo de analisis, preferiblemente, incluyen medios de fijacion para proporcionar un contacto fijado entre ambas partes en una posicion predeterminada. Como alternativa, el elemento de hisopo puede ser una parte integrante del dispositivo de analisis de muestras y la transferencia incluye hacer pasar al menos una parte de la muestra sobre el elemento de hisopo, asi como el conjugado, a la zona de aplicacion de muestra ejerciendo presion
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usando el compresor de muestras. En algunas realizaciones, el compresor de muestras es tambien una parte integrante de un dispositivo de analisis de muestras integrado y esta, preferiblemente, conectado al dispositivo mediante una bisagra. En otras realizaciones, el compresor de muestras es independiente del resto del dispositivo.
La transferencia de la muestra desde el elemento de hisopo a la zona de aplicacion de muestra sobre el dispositivo de analisis de muestras es, preferiblemente, una transferencia directa, es decir la transferencia tiene lugar sin pretratamiento de la muestra sobre el elemento de hisopo. En algunas realizaciones sin pretratamiento de la muestra o el elemento de hisopo, la microfiltracion se produce en la region en la que la superficie afelpada del elemento de hisopo contacta directamente con la superficie afelpada sobre la tira. Las fibras de la superficie afelpada se entrelazan para formar una red o interferencia fisica. Por lo tanto, elementos mas grandes contenidos en la muestra son retenidos y no se eluyen sobre el dispositivo de analisis de muestras. A medida que el conjugado y la muestra se mueven a traves de la zona de aplicacion de muestra, los analitos mas pequenos se eluyen. Ademas, cuando se usan muestras de fluidos de membrana mucosa, la alteracion mecanica de la mucosa en fluidos corporales de la membrana mucosa purifica la muestra y el analito de interes.
En otras realizaciones, la transferencia incluye una elucion de la muestra a partir del elemento de hisopo con un medio de elucion, por ejemplo un tampon o agua. El medio de elucion se puede anadir desde una fuente externa o se puede proporcionar, por ejemplo como un deposito, dentro del dispositivo de analisis. Ademas, la transferencia es, preferiblemente, una transferencia cromatografica y/o por capilaridad de fluido a la zona de deteccion sobre el dispositivo de analisis de muestras.
En otras realizaciones, una muestra de fluido corporal, tal como sangre, se recoge en una pipeta u otro dispositivo de recogida. La etapa de recogida preferiblemente incluye la obtencion de sangre, por ejemplo usando una lanceta, y recogiendo la misma con una pipeta. La sangre se transfiere entonces directamente sobre el dispositivo de analisis de muestras. En la presente realizacion, la sangre se transfiere preferiblemente a la almohadilla de compresor de muestras, o aguas arriba o aguas abajo de la zona de desvio sobre la tira reactiva.
En algunas realizaciones preferidas con un elemento de hisopo, el elemento de hisopo esta colocado entre una tira reactiva de flujo lateral y una parte de almohadilla de compresor de muestras (que puede incluir el conjugado que incluye un primer socio de union para el analito y un marcador detectable, un segundo socio de union para el analito que incluye una marca, un socio de union a la zona de control, o cualquier combinacion de cualquiera de estos). Con esta etapa, la muestra recogida es transferida directamente sobre una tira reactiva. La tira reactiva, preferiblemente, incluye una o varias superficies afelpadas o membranas activas por capilaridad.
En algunas realizaciones preferidas, la muestra se anade a una tira reactiva cromatografica, y el conjugado se anade como una etapa independiente despues de que la muestra es anadida. En las presentes realizaciones, el conjugado y la muestra no se anaden simultaneamente. Por ejemplo, un colector de muestras que incluye la muestra se coloca sobre una zona de aplicacion de muestra de una tira reactiva. Al menos parte de la muestra es transferida a la tira reactiva en este momento. A continuation, se anade el compresor de muestras que contiene el conjugado y el compresor de muestras comprime al colector de muestras. Esto facilita la transferencia adicional de la muestra, asi como la transferencia del conjugado, sobre la tira reactiva. Si se encuentra presente el analito, un complejo entre el analito en la muestra y el conjugado se puede formar en cuanto el conjugado comienza a comprimir la muestra. Con muestras de fluido, el complejo comienza a formarse debido a la naturaleza fluida de la propia muestra. En algunas realizaciones preferidas, el segundo socio de union para el analito esta tambien sobre el compresor de muestras o en la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva. En las presentes realizaciones, el sandwich completo entre el primer socio de union, el analito y el segundo socio de union se puede formar antes de que se anada si quiera el tampon. La adicion del tampon intensifica adicionalmente la formation del complejo y, a continuacion, el transporte de los componentes a la zona de deteccion. Debido a que el complejo se puede formar durante la compresion, puede haber un desfase entre el muestreo y las pruebas. La reaction entre el analito y el conjugado comienza, preferiblemente, antes de que se anada el tampon a la tira reactiva. El desfase entre cuando se anaden la muestra y el conjugado y cuando se anade el tampon puede ser de hasta 24 horas o incluso mayor.
El proceso de deteccion se iniciara directamente con la transferencia de la muestra o puede requerir un medio de elucion a aplicar para analisis de la muestra. En algunas realizaciones, el medio de elucion es simple agua corriente. En otras realizaciones, el medio de elucion es una solution tampon alcalina. En el caso de una tira reactiva inmunoqmmica en la que la zona de deteccion se encuentra en sentido lateral aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra, el medio de elucion seleccionado se mueve hacia una zona de deteccion y, de este modo, pasa el sitio de contacto dentro del dispositivo de recogida. El analito y el conjugado son eluidos por el medio de elucion y son llevados con el a la zona de deteccion. En la zona de deteccion, el analito se determina mediante metodos cualitativos y/o cuantitativos, por ejemplo en una reaccion de union inmunologica.
La tira reactiva puede estar hecha de un unico material cromatografico o, preferiblemente, varios materiales activos por capilaridad hechos de los mismos o diferentes materiales y fijados sobre un sustrato de soporte. Estos materiales se encuentran en contacto estrecho entre si para formar una trayectoria de transporte a lo largo de la cual un liquido impulsado por fuerzas de capilaridad fluye desde la zona de partida, pasando el sitio de contacto del hisopo y la zona de deteccion, hacia una zona de desechos en el otro extremo de la tira.
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Algunos materiales y membranas preferidas para la tira reactiva incluyen, pero sin limitarse a, fibras de poli(tereftalato de etileno) (PET), tales como fibras Dacron®, nitrocelulosa, poliester, nailon, acetato de celulosa, hidrogel, polipropileno, fibras de vidrio y combinaciones de estos materiales y sus sustratos. Las caracteristicas de las superficies afelpadas y membranas dependen de los tipos de materiales usados para una region o zona particular de la tira reactiva o el dispositivo de recogida. Tal como se describe en el presente documento, los materiales que permiten que los reactivos (incluyendo aquellos en la zona de reactivo, la zona de captura o cualquiera de las otras zonas que se describen en el presente documento) sean moviles y se desplacen con el medio de elucion incluyen materiales o fibras de superficie afelpada, en los que la union no es especifica o permanente, de tal modo que el analito y los reactivos pueden ser liberados cuando se encuentran con el medio de elucion o con un gran volumen de muestra. Algunos de estos materiales incluyen, pero sin limitarse a, fibras de poli(tereftalato de etileno) (PET), tales como fibras Dacron®, fibras de nailon, fibras de poliester, fibras de acetato de celulosa, fibras de polipropileno, fibras de vidrio, espuma, esponjas, y otras telas y mallas. En contraste, los materiales que inmovilizan reactivos en una zona particular (incluyendo, por ejemplo, los reactivos inmovilizados sobre la zona de prueba y la zona de control de la zona de deteccion y los reactivos de captura en las realizaciones, que incluyen reactivos de captura inmovilizados en una zona de captura aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra) incluyen, pero sin limitarse a, fibras de nitrocelulosa y nailon tratadas quimicamente, de tal modo que fibras individuales en la malla de nailon se unen permanentemente a reactivos tales como proteinas. Algunos metodos para fabricar diferentes partes de la tira incluyen, pero sin limitarse a, rallar, pulverizar, empapar, y secar materiales sobre la tira.
A pesar de que se usa nitrocelulosa para la zona de deteccion en muchas de las realizaciones de la presente invention, en otras realizaciones, se pueden usar membranas neutras, tales como de nailon o poliester. En las presentes realizaciones, proteinas, tales como neutravidina, anticuerpos y antigenos, nanoparticulas o acidos nucleicos no se inmovilizan directamente. En su lugar se conjugan a microesferas que se “depositan” en el interior de la membrana y se mantienen en las grietas.
Algunos materiales preferidos para la parte de almohadilla de compresor de muestras incluyen, pero sin limitarse a, fibras de poli(tereftalato de etileno) (PET), tales como fibras Dacron®, fibras de nailon, fibras de poliester, fibras de acetato de celulosa, fibras de polipropileno, fibras de vidrio, una superficie afelpada, espuma, esponjas, y otras telas y mallas.
Los materiales de la tira reactiva preferiblemente filtran y/o retienen materia particulada, asi como restos celulares, los precipitados, etc., en las membranas. Ademas, debido a que el volumen de la muestra es, preferiblemente, tan pequeno, la muestra permanece situada en los materiales y el tampon de elucion, que fluye directamente por debajo de la muestra, contacta con y transporta la muestra de tal modo que la muestra se pueda extraer, lisar y/o filtrar antes de que alcance la zona de prueba de la zona de deteccion.
Ademas, los dispositivos y kits de prueba de la presente invencion preferiblemente realizan los metodos que se describen en el presente documento.
En algunas realizaciones preferidas, el conjugado esta ubicado sobre un compresor de muestras, independiente del dispositivo de analisis de muestras. El conjugado, preferiblemente, incluye un primer socio de union para el analito, asi como estar marcado con un marcador detectable. El marcador es, preferiblemente, detectable de forma visible y/o por fluorescencia, pero se puede usar cualquier forma de deteccion conocida en la tecnica, dependiendo del marcador seleccionado. En algunas realizaciones preferidas con una zona de desvio, la muestra se aplica al compresor de muestras en una ubicacion que preferiblemente se solapa con el conjugado.
En algunas realizaciones, el marcador detectable para el conjugado puede ser oro coloidal, perlas de latex coloreadas, nanoparticulas fluorescentes, nanoparticulas quimioluminiscentes, nanoparticulas paramagneticas o nanoparticulas fosforescentes.
Se realiza interpretation cualitativa visualmente observando la intensidad y tonalidad de la zona de prueba. En un ejemplo en el que se usa un colorante rojo visual como marcador, cuando la concentration del analito es igual o esta ligeramente por encima del limite inferior de deteccion, la zona de prueba se puede ver debilmente y la tonalidad es rosa. A medida que la concentracion del analito se incrementa, la intensidad de la zona de prueba se incrementa de forma correspondiente y la tonalidad cambia de rosa a rojo brillante. Se desarrolla una interpretacion cuantitativa usando un espectrometro que funciona en el espectro visible. Se puede usar una medicion de la absorcion o una medicion de reflectancia en el espectro visible para desarrollar la cuantificacion de la zona de prueba. En primer lugar, se desarrollan un conjunto de concentraciones caracterizadas del analito. Cada una de las concentraciones se aplica a la zona de aplicacion de muestra y se realiza la prueba. El espectrometro se usa para medir la absorcion o la reflectancia de la zona de prueba. Se calcula una curva patron a partir de los valores medidos del espectrometro. La curva patron es normalmente lineal. En otras realizaciones, si se usan marcas fluorescentes, se puede desarrollar un conjunto similar de concentraciones del analito conocidas. Una concentracion desconocida del analito puesto a prueba y cuantificado por el espectrometro proporciona un valor que, cuando se representa graficamente en la curva patron, se puede correlacionar con una concentracion de analito.
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El marcador visual puede ser cualquier marcador visible a simple vista, incluyendo, pero sin limitarse a, particulas coloreadas tales como oro coloidal, perlas de latex tenidas, selenio o carbono. En algunas realizaciones, las marcas visuales tambien estan revestidas con elementos que exhiben fluorescencia. En algunas realizaciones, el elemento que exhibe fluorescencia es un colorante que exhibe fluorescencia. Como alternativa, una mezcla de, preferiblemente, conjugados de perlas de latex que exhiben fluorescencia incoloras se mezcla con conjugados de oro coloidal (un espectro visible), o conjugados que producen una zona de prueba de lectura visible, en inmunoensayos de flujo lateral para potenciar la sensibilidad del ensayo y para ayudar a leer visualmente autenticos positivos y autenticos negativos. En algunas realizaciones en las que se usan nanoparticulas, las nanoparticulas que se pueden usar incluyen, pero sin limitarse a, selenio, carbono y oro coloidal.
En algunas realizaciones, un segundo socio de union para el analito tambien esta ubicado sobre el compresor de muestras. El segundo socio de union incluye una marca pero no un marcador detectable. El segundo socio de union puede estar, como alternativa, ubicado en la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, o en cualquier ubicacion sobre la tira reactiva entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de detection. En algunas realizaciones en las que hay un segundo socio de union para el analito aguas abajo de la zona de deteccion o sobre el compresor de muestras, la zona de deteccion incluye una marca inmovil que se une a la parte de marca del segundo socio de union.
En una realization preferida, el segundo socio de union esta marcado con biotina. En algunas realizaciones en las que la marca sobre el segundo socio de union es biotina, la marca inmovilizada en la zona de deteccion es, preferiblemente, avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union esta marcado con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada en la zona de deteccion es, preferiblemente, biotina. Como alternativa, la marca sobre el segundo socio de union puede ser una lectina y la marca inmovilizada puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invention. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos.
En una realizacion preferida, lo socios de union especificos para los analitos en la zona del conjugado sobre el compresor de muestras y/o en la zona de aplicacion de muestra son anticuerpos monoclonales, policlonales, o recombinantes o fragmentos de anticuerpos capaces de unirse a un patogeno. En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos contra un patogeno, un mediador inmunitario, peptidos, glucoproteinas o un alergeno. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. Los metodos y dispositivos de la presente invencion se pueden usar para cualesquiera ensayos de union, y pueden evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union ligando-receptor y ensayos de union enzima-sustrato.
En la totalidad de las presentes realizaciones, un “sandwich" completo se crea, preferiblemente, entre el primer socio de union del conjugado, el analito y el segundo socio de union, en la zona de aplicacion de muestra cuando el analito se encuentra presente. Como alternativa, el “sandwich" completo se puede formar entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion, si cualquiera del primer socio de union o el segundo socio de union esta ubicado aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra. El sandwich completo se desplaza a continuation a la zona de deteccion, en la que la marca sobre el segundo socio de union se une a la marca inmovilizada en la zona de deteccion. Notese que el complejo entre la marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada en la zona de deteccion se produce independientemente de si el analito esta o no presente. No obstante, el complejo solo es detectable cuando el analito se encuentra presente y el conjugado (que incluye un marcador detectable) se ha unido al analito.
En otras realizaciones, en lugar de tener un segundo socio de union para el analito sobre el compresor de muestras o sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion, un segundo socio de union para el analito inmovilizado esta ubicado en la zona de deteccion. En las presentes realizaciones, la mitad del “sandwich" se forma entre el primer socio de union del conjugado y el analito, que a continuacion se desplaza hasta la zona de prueba, en la que el medio sandwich se une al segundo socio de union inmovilizado, completando el “sandwich" completo.
El dispositivo preferiblemente tambien incluye una zona de control, que indica si la prueba se ejecuto correctamente. En algunas realizaciones preferidas, un socio de union a la zona de control, por ejemplo un socio de union a la zona de control movil con un marcador visual, tambien esta ubicado sobre el compresor de muestras. La colocation del socio de union a la zona de control movil, que se une a un socio de union inmovilizado en la zona de control, sobre el compresor de muestras indicara si se produjo o no la transferencia del conjugado desde el compresor de muestras a la zona de aplicacion de muestra del dispositivo de analisis de muestras. Este es un control muy util, debido a que es esencial que el conjugado sea transferido para detectar la presencia del analito.
La muestra se puede tomar mediante un elemento de hisopo convencional, tal como se usa actualmente en la consulta del medico o salas de urgencias. Este elemento de hisopo es presionado posteriormente en el interior de la
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zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva cromatografica usando el compresor de muestras.
En algunas realizaciones preferidas, en lugar de lisar celulas “fuera" de un dispositivo de pruebas analfticas de diagnostico inmediato, la presente invencion utiliza “lisis in situ". En las presentes realizaciones, los metodos y dispositivos de la presente invencion incorporan una zona de lisis que incluye al menos un agente de lisis como parte de una tira reactiva de ensayo de flujo lateral, tal como las que se describen en el presente documento, u otros dispositivos de ensayo de flujo lateral conocidos en la tecnica, para lisar el material de la muestra in situ. Ademas, una zona de captura captura sustancias interferentes para incrementar la precision del ensayo.
Despues de la carga de la muestra, la muestra que se desplaza con el liquido de transporte se encuentra con el agente de lisis. El agente de lisis habra sido cargado previamente sobre la tira reactiva y es eluido por el liquido de transporte. En algunas realizaciones preferidas, el agente de lisis ha sido secado en la tira reactiva. Como alternativa, el agente de lisis puede ser secado previamente mediante secado por congelacion o liofilizacion y a continuacion cargado previamente en la tira reactiva. En otras realizaciones, el agente de lisis puede estar absorbido, adsorbido, embebido o atrapado en la tira reactiva. En una realizacion preferida, el agente de lisis esta situado sobre la zona de aplicacion de muestra o aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, de tal modo que la muestra se lisa cuando es transferida al dispositivo de analisis de muestras. El agente de lisis es, preferiblemente, soluble o miscible en el liquido de transporte de la muestra, y el agente de lisis se disuelve y se activa en el momento del contacto con el liquido de transporte de la muestra. El liquido de transporte de la muestra contiene entonces tanto agente de lisis en solucion o suspension como componentes de la muestra en suspension. Cualesquiera componentes susceptibles a lisis en la muestra, en el momento de ser expuestos en suspension al agente de lisis, son a su vez lisados in situ. El analito es, preferiblemente, expuesto a continuacion tanto al conjugado marcado como al segundo socio de union, para formar el sandwich antes de alcanzar la zona de deteccion. Como alternativa, el agente de lisis puede estar incluido en el tampon de migration.
Como alternativa, el agente de lisis se puede introducir en la tira reactiva durante una etapa de compresion de la muestra. En una realizacion, el agente de lisis esta ubicado sobre la almohadilla de compresor de muestras. Como alternativa, el agente de lisis se puede secar sobre el elemento de hisopo del colector de muestras si no es necesario que el elemento de hisopo sea esteril. En caso contrario, el elemento de hisopo se puede esterilizar despues de la adicion del agente de lisis usando tecnicas de esterilizacion que no danen la capacidad de lisado del agente de lisis.
La concentration de agente de lisis cargado previamente sobre una tira reactiva esta, preferiblemente, entre el 0,001 % y el 5 % en peso / volumen. El volumen a cargar previamente depende de donde se cargue previamente el agente de lisis. Son intervalos apropiados de 1 a 10 microlitros cuando se carga previamente en la superficie afelpada del colector de muestras (la zona de aplicacion de muestra) o de 5 a 50 microlitros cuando se carga previamente en la almohadilla absorbente o en otras ubicaciones dentro de la tira reactiva. Idealmente, la cantidad cargada previamente ha de ser de aproximadamente 3 microlitros cargados previamente en la superficie afelpada del colector de muestras o aproximadamente 10 microlitros cargados previamente en la almohadilla absorbente o en otras ubicaciones dentro de la tira reactiva.
La selection de un entorno y agente de lisado especificos dependera del analito y el ensayo. El pH y la fuerza ionica son claves para el entorno de lisado. En lo que respecta al pH establecido por el agente de lisis, un pH por debajo de
4.0 tiende a precipitar materiales, especialmente proteinas. Un pH mas elevado, por encima de aproximadamente 10,0, tiende a lisar materiales tales como proteinas y paredes celulares. Por lo tanto, un pH de aproximadamente
10.0 o superior es preferible para muchas aplicaciones. Como alternativa, se puede preferir un pH inferior para dianas de acido nucleico.
En lo que respecta a la fuerza ionica establecido por el agente de lisis, se puede usar una fuerza ionica tanto elevada como baja para lisar. Por ejemplo, una fuerza ionica baja (hipotonica) tiende a romper eritrocitos. El agua por si misma puede lisar eritrocitos. Entornos de fuerza ionica mas elevada se pueden usar para romper ciertas paredes y membranas celulares.
En lo que respecta a agentes de lisis especificos, se pueden agrupar y seleccionar basandose en sus propiedades: sales, agentes anfoteros y cationicos, y detergentes ionicos y no ionicos. El cloruro de amonio (NH4Cl) lisa eritrocitos. Otras sales, incluyendo, pero sin limitarse a, elevadas concentraciones de cloruro sodico (NaCl) y cloruro potasico (KCl), pueden romper ciertas paredes y membranas celulares. Otros agentes de lisis son agentes anfoteros incluyendo, pero sin limitarse a, Lyso PC, CHAPS y Zwittergent. Como alternativa, se pueden usar agentes cationicos incluyendo, pero sin limitarse a, C16 TAB y cloruro de benzalconio como agente de lisis. Detergentes tanto ionicos como no ionicos se usan a menudo para romper o lisar los componentes de la pared celular o la membrana celular, tales como lipoproteinas y glucoproteinas. Los detergentes ionicos comunes incluyen, pero sin limitarse a, SDS, EDTA, colato y desoxicolato. Los detergentes ionicos son buenos agentes solubilizantes. Los anticuerpos conservan su actividad en SDS al 0,1 % o menos. Los detergentes no ionicos comunes incluyen, pero sin limitarse a, octilglucosido, digitonina, C12E8, Lubrol, Triton X-100, Noniodet P-40, Tween 20 y Tween 80. Los detergentes no ionicos y levente ionicos son desnaturalizantes mas debiles y, a menudo, se usan para disolver proteinas de la membrana tales como proteinas de la superficie viral. Agentes de lisis adicionales incluyen, pero sin
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limitarse a, urea y enzimas. Se pueden usar combinaciones de diferentes agentes de lisis para optimizar el entorno de lisado.
Los tensioactivos actuan, en general, como agentes humectantes y rebajan la tension superficial de un liquido. Esto permite a continuacion una extension mas sencilla rebajando la tension interfacial entre liquidos. De este modo, los tensioactivos pueden interferir en la union natural de antigeno y anticuerpo o ligando y receptores. Las concentraciones se seleccionan, por lo tanto, experimentalmente para cada clase de agente de lisis. Una vez que se produce la lisis, es importante que las reacciones de union deseadas no sean obstaculizadas. En general, una concentracion de agente de lisis del 0,001 % se considera el limite inferior, y el limite superior es aproximadamente del 1 %. Existe un efecto aditivo o sinergico cuando se usan combinaciones de agentes de lisis. Esto expande el intervalo de trabajo de concentracion a realizar de aproximadamente el 0,001 % al 1 %. Finalmente, cierta union inespecifica no deseada se puede evitar a una concentracion de Tween 20 del 5 %. En todos los casos, la cantidad total de agente de lisis cargado previamente sobre todas las ubicaciones de una tira reactiva individual ha de ser suficiente para lisar barreras para la inmunodeteccion, permitiendo el funcionamiento practico de la tira reactiva.
El propio agente de lisis no ha de interferir con ningun otro agente detector o indicador del ensayo y, por lo tanto, no interfiere en ninguna otra interaccion y reaccion en una medida tal para impedir el funcionamiento practico del ensayo. Un agente de lisis ha de tener la suficiente vida util para permitir la fabrication, distribution y almacenamiento antes del uso de una tira reactiva en pruebas de diagnostico analitico inmediato.
En una realization preferida de la presente invention, el dispositivo de flujo lateral de la presente invention incluye un liquido de transporte de muestras, que puede ser un tampon, un compresor de muestras y una tira reactiva de cromatografia que contiene uno o varios materiales o membranas de superficie afelpada con propiedades de capilaridad a traves de los cuales fluye la muestra. En un dispositivo y metodo de la invencion, es innecesario lisar las celulas en la muestra antes de aplicar la muestra a la tira reactiva.
En algunas realizaciones preferidas, el dispositivo de flujo lateral incluye un compresor de muestras y una tira reactiva cromatografica que incluye al menos una zona de desvio. La zona de desvio preferiblemente incluye al menos una caracteristica que interrumpe el flujo en el plano en el que esta teniendo lugar el flujo. La zona de desvio puede incluir una barrera, una separation, un surco, o cualquier combination de estas caracteristicas. La barrera es preferiblemente una membrana impermeable (o una membrana sustancialmente impermeable) que se puede fabricar de cualquier material que evite que el flujo de liquido continue fluyendo en el mismo plano. Algunos materiales para la barrera incluyen, pero sin limitarse a, materiales inertes, materiales semipermeables, plasticos, hidrocarburos, metal, materiales hidrofobos, Sephadex, Sepharose, acetato de celulosa, un material higroscopico (por ejemplo, CaCl2, CaSO4 o gel de silice), o hidrogeles. La separacion o surco es cualquier fisura en el plano de la tira reactiva de flujo lateral que se extiende hasta una profundidad suficiente para detener el flujo. En una realizacion preferida, la profundidad de la separacion es preferiblemente de al menos aproximadamente 0,1 mm.
La zona de desvio retarda o detiene por completo el flujo hasta que el compresor de muestras se pone en contacto con el resto del dispositivo, y crea un puente a lo largo del cual puede fluir el fluido. El compresor de muestras actua como un puente y redirige el flujo a un plano diferente. El flujo se desvia hacia el compresor de muestras. Esto aumenta la recogida de los reactivos sobre el compresor de muestras. Por ejemplo, en algunas realizaciones en las que el conjugado se encuentra sobre el compresor de muestras, la recogida del conjugado aumenta en los dispositivos con una zona de desvio. En algunas realizaciones con un colector de muestras que esta intercalado entre la tira reactiva y el compresor de muestras, tambien se fuerza que el fluido vaya a traves del colector de muestras (por ejemplo, un hisopo), por lo tanto la muestra y el conjugado interactuan antes que en algunas realizaciones sin una zona de desvio. El fluido cambia de vuelta al plano lateral original en el extremo de la zona de desvio. En algunas realizaciones en las que tanto la zona de aplicacion de muestra como el conjugado se encuentran sobre el compresor de muestras, tanto la muestra como el conjugado encuentran el tampon de migration cuando este se desvia hacia el compresor de muestras, y ^ sandwich o un sandwich completo (dependiendo de en donde este ubicado el segundo socio de union para el analito sobre el dispositivo de analisis de muestras) se forma antes de que el tampon de migracion se este desviando de vuelta a la tira reactiva si el analito se encuentra presente en la muestra. Algunas realizaciones con una zona de desvio y un compresor de muestras aumentan la velocidad, permiten unas mejores interacciones entre el conjugado y la muestra, y permiten mas sensibilidad debido a que se coloca mas conjugado en el fluido. En las presentes realizaciones, la totalidad del fluido preferiblemente interactua con el conjugado. Esta es una mejora significativa frente a las realizaciones de compresor sin redireccionamiento, en las que aproximadamente un 20 - 30% del fluido interactua con el conjugado.
En algunas realizaciones preferidas, el dispositivo de recogida de muestras es un papel de separacion (por ejemplo, un papel de filtro) que es parte de la pila que incluye el compresor de muestras y la tira reactiva. El papel de separacion preferiblemente sustituye a un elemento de hisopo como el colector de muestras. El papel de separacion se fabrica preferiblemente de un material diferente de la nitrocelulosa de la tira reactiva o, en algunas realizaciones con una barrera, el material de la barrera. En algunas realizaciones preferidas, el papel de separacion se fabrica de un material que incluye, pero sin limitarse a, glassine, un material revestido repelente del agua, o un material revestido con politetrafluoroetileno (por ejemplo, revestimiento de Teflon ®) En algunas realizaciones, el papel de separacion es una parte integrante de la tira, por ejemplo una solapa sobre la tira. En las presentes realizaciones,
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una muestra de liquido se puede anadir por medio de un cuentagotas u otro mecanismo de adicion. En otras realizaciones, el papel de separacion esta separado de la tira antes del uso, y es uno de los componentes de la pila mientras que se esta realizando el ensayo. Un ejemplo de una muestra que preferiblemente podria usar este tipo de dispositivo de recogida de muestras es una muestra de liquido, incluyendo, pero sin limitarse a, una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de plasma, o una muestra de orina. En algunas realizaciones que usan un papel de separacion, el papel de separacion podria contener otros reactivos utiles para el ensayo, por ejemplo, materiales de lisis in situ, o ser de una porosidad diferente para capturar los materiales interferentes.
En algunas realizaciones, la presion de compresion es suficiente para inhibir el flujo en sentido lateral sin la necesidad de una zona de desvio. No obstante, en algunas matrices, por ejemplo en matrices con fluidos mas espesos, tal como moco, el flujo migra lentamente bajo el colector de muestras y no interactua bien con el compresor. Algunas realizaciones con una zona de desvio son especialmente utiles con estos tipos de muestras y matrices. No obstante, la zona de desvio se podria usar en algunas realizaciones con cualquier tipo de muestra de liquido o fluido.
En otras realizaciones alternativas con o sin una zona de desvio, la muestra se podria colocar directamente sobre una zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva cromatografica antes de la compresion o adicion del tampon de migracion. Por ejemplo, para muestras de liquido, la muestra se podria pipetear sobre una zona de aplicacion de muestra. En otros ejemplos, la muestra se podria pipetear sobre el compresor de muestras.
El colector de muestras (por ejemplo, un hisopo o un papel de separacion) se puede ubicar aguas arriba de la zona de desvio, sobre la zona de desvio, aguas abajo de la zona de desvio, o solapandose con porciones de la zona de desvio. En algunas realizaciones preferidas, el colector de muestras esta ubicado aguas arriba de o aguas abajo con respecto a la zona de desvio. La longitud de la porcion de recogida del elemento de hisopo deberia ser lo bastante grande de tal modo que la totalidad de la muestra recogida se deberia encontrar en contacto con la anchura de la tira reactiva. En algunas realizaciones preferidas, la longitud de la porcion de recogida del colector de muestras es de aproximadamente 2 mm a 5 mm. En una realization mas preferida, la porcion de recogida del colector de muestras es de aproximadamente 3 a 4 mm. La longitud del colector de muestras (el asa) no es particularmente critica. Pero, en algunas realizaciones preferidas, la longitud del colector de muestras es aproximadamente de 10 a 18 centimetros (de 4 a 7 pulgadas) dependiendo de en que parte en el cuerpo se esta tomando la muestra (por ejemplo, muestras de la garganta, nasofaringeas o vaginales).
En algunas realizaciones en las que el colector de muestras es un elemento de hisopo, la porcion de recogida del elemento de hisopo es compacta, para concentrar la muestra en una ubicacion que puede interactuar con el tampon u otro medio de elucion. La porcion de recogida compacta es preferiblemente de una longitud mas corta que las porciones de recogida de elemento de hisopo tipicas de la tecnica anterior. En algunas de las presentes realizaciones, en las que la porcion de recogida se encuentra aguas arriba de la zona de desvio, la muestra concentrada puede interactuar con el tampon y desplazarse al compresor de muestras cuando se desvia el flujo. De forma similar, cuando la porcion de recogida se encuentra aguas abajo, el tampon y los reactivos recogidos a partir del compresor de muestras (por ejemplo, el conjugado), interactuan con la muestra concentrada a medida que el flujo se desvia de vuelta sobre la tira reactiva cromatografica.
En algunas realizaciones preferidas con una zona de desvio, el compresor esta unido en una sola pieza a la tira reactiva cromatografica por medio de una bisagra o solapa (veanse, por ejemplo, las figuras 8B y 24). Si el compresor de muestras no se baja correctamente usando la bisagra, el compresor de muestras nunca forma un puente sobre la zona de desvio, y el dispositivo no sera funcional. La falta de compresion dara como resultado que el flujo no alcance nunca el extremo de la tira, y un resultado negativo en la linea de control. No hay flujo alguno si la bisagra no esta cerrada. Por lo tanto, este dispositivo tiene un control integrado. Esto tambien es cierto en algunas realizaciones sin una bisagra. Cuando el compresor de muestras se anade a la pila vertical o el dispositivo de analisis de muestras, si hay una compresion insuficiente, no habra puente y, en consecuencia, no habra flujo.
En algunas realizaciones preferidas con una zona de desvio que incluye una barrera, la barrera es una barrera con componentes encapsulados. La barrera se disuelve con el tiempo, liberando los componentes encapsulados. La barrera puede incluir cualquiera o la totalidad de los mismos reactivos que se analizan en el presente documento como que se pueden encapsular. Una barrera que se esta disolviendo realiza unas funciones duales. De forma similar a las otras barreras, esta actua como una pared para forzar el flujo al interior del compresor de muestras. Ademas, la misma retarda en el tiempo determinados componentes mediante la encapsulation de los mismos. El tampon disuelve la barrera, y estos componentes retardados en el tiempo incidiran sobre el complejo de linea de prueba despues de que los otros componentes del ensayo hayan alcanzado la linea de prueba.
La figura 1 muestra un dispositivo de analisis de muestras (tira reactiva) 1 y un colector de muestras 2. El colector de muestras 2 puede ser cualquier tipo de colector de muestras 2 conocido en la tecnica, por ejemplo el colector de muestras 2 podria ser un elemento de hisopo. La muestra 20 puede incluir el analito 3, asi como particulas interferentes 5 (que pueden incluir proteinas interferentes o genes interferentes) y otras particulas o restos celulares interferentes 4. El dispositivo de analisis de muestras 1 incluye una zona de conjugado 8 aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 18 en esta figura. A pesar de que la zona del conjugado 8 se muestra aguas arriba de la zona
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de aplicacion de muestra 18 en esta figura, la zona del conjugado 8 se puede solapar, como alternativa, con la zona de aplicacion de muestra 18 o estar aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 18 dentro del espiritu de la presente invention. La zona de aplicacion de muestra 18 es tambien una zona de microfiltracion que, preferiblemente, elimina por filtration restos celulares y particulas interferentes 4 que se encuentran en la muestra 20.
La zona del conjugado 8, preferiblemente, incluye tanto un conjugado movil 15, que incluye una parte que se une al analito 3 y un marcador detectable, como un socio de union a la zona de control 16 con un marcador detectable, que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de la zona de control con un marcador visual. En algunas realizaciones, el conjugado movil es un conjugado al anticuerpo de prueba con un marcador visual. El socio de union a la zona de control 16 se une con un socio de union inmovilizado para el en la zona de control 11 e indica si la prueba se ha realizado correctamente. Si el analito 3 se encuentra presente en la muestra 20, el analito se une al conjugado 15, y el complejo conjugado 15 - analito 3 se desplaza hasta la zona de prueba 10 en la zona de detection 12. El analito 3 se une a continuation a un socio de union inmovilizado 17 para el analito 3, para formar el “sandwich" completo en un ensayo de tipo sandwich.
La transferencia de la muestra desde el colector de muestras 2 a la zona de aplicacion de muestra 18 sobre el dispositivo de analisis de muestras es, preferiblemente, una transferencia directa, es decir la transferencia tiene lugar sin pretratamiento de la muestra sobre el colector de muestras 2. En algunas realizaciones sin pretratamiento de la muestra o el colector de muestras 2, se aplica presion 14 y la microfiltracion se produce en la region en la que la superficie afelpada del colector de muestras contacta directamente con la superficie afelpada sobre el dispositivo de analisis de muestras 1. Las fibras de la superficie afelpada se entrelazan para formar una red o interferencia fisica. Por lo tanto, elementos mas grandes contenidos en la muestra, por ejemplo restos celulares y particulas interferentes 4 son retenidos y no se eluyen.
El dispositivo de aplicacion de muestras 1 preferiblemente tambien incluye una zona de bloqueo 9 que incluye uno o mas reactivos de captura. Esta zona de bloqueo captura proteinas y/o genes interferentes 5 que pueden estar en la muestra 20. La captura de una sustancia interferente 4, 5 por uno o mas reactivos de captura se produce cuando el reactivo de captura interactua de alguna manera con la sustancia interferente para evitar que la sustancia interferente interfiera en la deteccion del analito. A pesar de que una zona de bloqueo 9 se muestra en la figura 1, los reactivos de captura pueden estar ubicados en una zona de captura 9 hecha de materiales que permitan a los reactivos de captura ser moviles, en el medio de elucion, mezclarse y secarse con los reactivos, incorporarse en la zona de aplicacion de muestra, incorporarse en el material de la superficie afelpada del colector de muestras, y/o inmovilizarse sobre un material inmovilizante (por ejemplo, nitrocelulosa) como una linea o una zona. Cualquiera de estos o una combination de estos se puede usar en las realizaciones de la presente invencion, dependiendo de la prueba y la matriz de la muestra.
El dispositivo de analisis de muestras 1 tambien incluye de forma opcional una almohadilla absorbente 7 aguas arriba de la zona del conjugado 8 y la zona de aplicacion de muestra 18. El tampon se anade y se desplaza en la direction de la flecha 6 para eluir los componentes de prueba, incluyendo la muestra 20, el conjugado 15 y el socio de union a la zona de control 16, a la zona de deteccion 12. El dispositivo de analisis de muestras 1 tambien incluye, preferiblemente, una almohadilla de desechos 13 en el extremo aguas abajo del dispositivo 1. El dispositivo de analisis de muestras 1 tambien puede incluir de forma opcional un sustrato 23.
Los dispositivos y metodos de la presente invencion incluyen un compresor de muestras 30. Algunos ejemplos esquematicos de compresores de muestras 30 que se podrian usar se muestran en las figuras 2A y 2b. Los compresores de muestras 30 preferiblemente incluyen un mango 31, una parte extendida 32 y una parte de almohadilla 33. En algunos disenos, el compresor de muestras incluye secciones adicionales, tal como una parte de repisa 34 sobre la cual esta colocada la parte de almohadilla 33. A pesar de que se muestran ejemplos especificos en las figuras 2A y 2B, cualquier compresor de muestras 30 que es capaz de ejercer presion para transferir uno o mas componentes del ensayo y la muestra al dispositivo de analisis de muestras, se podria usar en las realizaciones de la presente invencion. En algunas realizaciones preferidas, el conjugado 36 se carga previamente y se seca sobre una almohadilla 33 que forma la zona del conjugado. En algunas realizaciones preferidas, un control marcado 61 que es capaz de complejarse con un socio de union en la zona de control tambien se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30. En otras realizaciones preferidas, el segundo socio de union 38 para el analito esta ubicado sobre la almohadilla 33. Cualquier combinacion del conjugado 36, el segundo socio de union 38, o el socio de union a la zona de control 61 puede estar sobre la parte de almohadilla 33 del compresor de muestras 30.
La figura 2C muestra un ejemplo de un colector de muestras 35. En este ejemplo, el colector de muestras 35 es un elemento de hisopo. El colector de muestras 35 preferiblemente incluye una parte de recogida de muestras 60 que, preferiblemente, esta hecha de materiales de tipo superficie afelpada. En algunas realizaciones, el colector de muestras 35 es esteril.
Las figuras 3A a 3C muestran una realization de un sistema con un compresor de muestras 30, un colector de muestras 35 y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). La tira reactiva preferiblemente
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incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. La tira reactiva tambien incluye preferiblemente un sustrato de soporte 48. La zona de deteccion 52 preferiblemente incluye una zona de prueba 45, que incluye un socio de union inmovilizado 38 para el analito 40, asi como una zona de control 46. En la presente realizacion, el conjugado 36 se encuentra sobre el compresor de muestras 30. El primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36, desde el compresor de muestras 30 se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich, que es transportado a continuacion al segundo socio de union 38 que esta inmovilizado en una zona de prueba 45. El sandwich completo 420 que se forma entre la parte 37 del conjugado 36 que se une al analito 40, el analito 40 y el segundo socio de union 38, se muestra en la figura 3B. En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union a la zona de control 61 con un marcador detectable. El socio de union a la zona de control 6l se compleja con su socio de union en la zona de control 46. Incluir el socio de union a la zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, en lugar de sobre la tira reactiva o en el tampon, tal como se conoce en la tecnica anterior, permite al usuario estar seguro de que los componentes sobre el compresor de muestras 30 que, en la presente realizacion, incluyen tanto el conjugado 36 como el socio de union a la zona de control 61, han sido transferidos eficazmente al dispositivo de analisis de muestras y, por lo tanto, garantiza el funcionamiento apropiado del sistema.
En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union a la zona de control 61 es tambien preferiblemente un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de union a anticuerpos contra el analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo mostrado en las figuras 3A - 3C de la presente invencion se puede usar para cualesquiera ensayo de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union ligando-receptor y ensayos de union enzima-sustrato.
Durante el funcionamiento, el colector de muestras 35 se coloca de tal modo que la muestra este directamente encima de la zona de aplicacion de muestra 44. En algunas realizaciones, la colocacion del colector de muestras 35 por encima de la zona de aplicacion de muestra 44 no es simultanea con la colocacion del compresor de muestras 30. En otras palabras, en las presentes realizaciones, parte de la muestra es transferida a la zona de aplicacion de muestra 44 antes de que el compresor de muestras 30 se anada a la pila vertical.
El compresor de muestras 30 ejerce presion 51 sobre el colector de muestras 35, usando la presion para transferir la muestra, que incluye el analito 40 (si se encuentra presente) y el conjugado 36 sobre la zona de aplicacion de muestra 44. Si tambien hay un socio de union a la zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, el socio de union a la zona de control 61 tambien es transferido. Notese que la transferencia es debida a la presion, no debida al flujo o a la accion de capilaridad. A continuacion, se anade el tampon 43 para permitir el flujo del complejo conjugado 36 - analito 40 (si se encuentra presente) a la zona de deteccion 52. Un socio de union inmovilizado 38 en la zona de prueba 45 se une a continuacion al analito, formando el sandwich completo. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. El funcionamiento apropiado de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46 debido a la interaccion entre el socio de union a la zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
A pesar de que no se muestra, tambien puede haber de forma opcional una zona de lisis que, preferiblemente, se solapa con o se encuentra aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. En otras realizaciones, puede haber una zona de bloqueo que incluye reactivos de captura, de forma similar a la zona que se describe con respecto a la figura 1.
En otras realizaciones, la zona del conjugado puede contener ambos socios de union para el analito en la muestra para formar un “sandwich completo". Uno de los socios de union preferiblemente tiene un marcador adecuado tal como biotina, avidina, lectina, un resto glicosilo, un ligando especifico o un receptor especifico. El otro puede estar conjugado a las nanoparticulas apropiadas, tal como se ha mencionado en lo que antecede. El sandwich completo es capturado a continuacion en la zona de prueba en la que el socio de union del marcador adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, avidina para biotina, biotina para avidina, resto glicosilo para lectina, lectina para el resto glicosilo, un receptor para el ligando o un ligando para el receptor, esta inmovilizado.
La figura 20A muestra un ejemplo de una tira reactiva en una realizacion de la presente invencion. La tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. La tira reactiva tambien incluye preferiblemente un sustrato de soporte 48. En la presente realizacion, todo el sandwich (primer socio de union 513 - analito 40 - segundo socio de union-518) se forma en la zona de aplicacion de muestra 44. El “sandwich completo" 514 se muestra en la figura 20B. La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una marca inmovilizada 511 que se une a la marca 519 del segundo socio de union 518. La marca inmovilizada 511 no se une directamente al analito 40; en su lugar, se une a traves de un intermediario, la marca 519 sobre el segundo socio de union 518 para el analito 40.
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En la presente realizacion, un primer socio de union 513, que es parte del conjugado marcado 505, se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich. El segundo socio de union 518 tambien incluye una marca 519. El segundo socio de union 518, en la presente realizacion, preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva, mientras que el conjugado marcado 505, preferiblemente, se carga previamente y se seca sobre una zona del conjugado marcada 515 aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. Como alternativa, el segundo socio de union 518 y/o la zona del conjugado marcada 515 pueden estar ubicadas en cualquier lugar sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de detection 52 incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra 44, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44 o entre la zona de aplicacion de muestra 44 y la zona de deteccion 52. En una realizacion preferida, aproximadamente el 75 - 80 % del conjugado 505 marcado 509 se encuentra aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra (con aproximadamente el 20 - 25 % del conjugado marcado 505 solapandose con la zona de aplicacion de muestra 44) y aproximadamente el 75 - 80 % del segundo socio de union 518 esta ubicado aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44 (con aproximadamente el 20 - 25 % del segundo socio de union solapandose con la zona de aplicacion de muestra 44). A pesar de que no se prefiere, en otras realizaciones, el conjugado marcado 505, el segundo socio de union 518 o ambos pueden estar ubicados en el tampon o mezclarse previamente con la muestra antes de que la muestra se anada a la tira reactiva. En otras realizaciones mas, cualquiera de o todos los componentes se podrian solapar con la zona de deteccion 52.
En algunas realizaciones, tanto el primer socio de union 513 como el segundo socio de union 518 son diferentes anticuerpos para el analito 40. En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos contra el analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo mostrado en la figura 20A se puede usar para cualesquiera ensayos de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union ligando-receptor y ensayos de union enzima-sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 518 esta marcado 519 con biotina. En algunas realizaciones en las que la marca 519 sobre el segundo socio de union 518 es biotina, la marca inmovilizada 511 en la zona de deteccion 52 es, preferiblemente, avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 518 esta marcado 519 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 511 en la zona de deteccion 52 es, preferiblemente, biotina. Como alternativa, la marca 519 sobre el segundo socio de union 518 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 511 puede ser un resto glicosilo dentro del espiritu de la presente invention. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, un colector de muestras que contiene la muestra se coloca de tal modo que la muestra este directamente por encima de la zona de aplicacion de muestra 44. En algunas realizaciones preferidas, la muestra no ha sido sometida a pretratamiento antes de la aplicacion a la tira reactiva. En su lugar, la muestra sigue estando en su forma nativa.
La muestra es transferida a la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva. Se forma un sandwich con el conjugado marcado 505 como un trozo de pan y el segundo socio de union 518 como el segundo trozo de pan, con el analito 40 entre ellos, cuando los tres componentes entran en contacto entre si durante el flujo 43. El complejo conjugado marcado 505 - analito 40 (si se encuentra presente) - segundo socio de union 518 (un sandwich completo) fluye hasta la zona de deteccion 52. Una marca inmovilizada 511 en la zona de prueba 45 se une a continuation a la marca 519. Debido a que el conjugado marcado 505 incluye un marcador 509, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. El funcionamiento apropiado de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46, preferiblemente debido a la interaction entre un socio de union a la linea de control y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
A pesar de que no se muestra, tambien puede haber de forma opcional una zona de lisis que, preferiblemente, se solapa con la zona de aplicacion de muestra 44 o esta, como alternativa, ubicada en otras partes de la tira reactiva dentro del espiritu de la presente invencion.
En algunas realizaciones preferidas que usan marcas, la zona de deteccion incluye un anticuerpo contra la marca. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, policlonal o de dominio unico. Por ejemplo, cuando la marca es biotina, un anticuerpo anti-biotina se inmoviliza en la zona de prueba en lugar de avidina, neutravidina o estreptavidina.
Las figuras 4A a 4C muestran un ejemplo de una realizacion del sistema con un compresor de muestras 30, un colector de muestras 35, y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). Similar a la figura 3A - 3C, la tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. La tira reactiva tambien incluye preferiblemente un sustrato de soporte 48. En la presente realizacion, todo el sandwich (primer socio de union 37 -
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analito 40 - segundo socio de union-38) se forma en la zona de aplicacion de muestra 44 (preferiblemente antes de la adicion de tampon). En algunas realizaciones, la colocacion del colector de muestras 35 por encima de la zona de aplicacion de muestra 44 no es simultanea con la colocacion del compresor de muestras 30. En otras palabras, en las presentes realizaciones, parte de la muestra es transferida a la zona de aplicacion de muestra 44 antes de que el compresor de muestras 30 se anada a la pila vertical.
La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una marca inmovilizada 50 que se une a la marca 39 del segundo socio de union 38. En la presente realizacion, un primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36 y, preferiblemente, se carga previamente y se seca sobre almohadilla 33 del compresor de muestras 30, se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich. El segundo socio de union 38 en la presente realizacion tambien preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras. El segundo socio de union 38 tambien incluye una marca 39.
El sandwich completo 520 que se forma entre el socio de union 37 del conjugado 36, el analito 40 y el segundo socio de union 38 en la presente realizacion (asi como las realizaciones en las figuras 5A - 5B, 6A - 6B, 7B, 7C y 7D) se muestra en la figura 4B. En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union a la zona de control 61 (mostrado en la figura 3C) con un marcador detectable. El socio de union a la zona de control 61 se compleja con su socio de union en la zona de control 46. Incluir el socio de union a la zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, en lugar de sobre la tira reactiva o en el tampon, tal como se conoce en la tecnica anterior, permite al usuario estar seguro de que los componentes sobre el compresor de muestras 30, que incluyen tanto el conjugado 61 como el socio de union a la zona de control 61, han sido transferidos eficazmente al dispositivo de analisis de muestras y por lo tanto garantiza el funcionamiento apropiado del sistema.
En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union a la zona de control 61 tambien es, preferiblemente, un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos contra el analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo mostrado en las figuras 4A - 4C de la presente invention se puede usar para cualesquiera ensayos de union, y puede evitar el uso de anticuerpos / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union ligando- receptor y ensayos de union enzima-sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 38 esta marcado con biotina 39. En algunas realizaciones en las que la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 es biotina, la marca inmovilizada 50 en la zona de detection es preferiblemente avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 38 esta marcado 39 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion 52 es, preferiblemente, biotina. Como alternativa, la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 50 puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invencion. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, el colector de muestras 35 se coloca de tal modo que la muestra este directamente por encima de la zona de aplicacion de muestra 44. El compresor de muestras 30 ejerce presion 51 sobre el colector de muestras 35. La presion transfiere la muestra (incluyendo el analito 40, si se encuentra presente), el conjugado 36 y el segundo socio de union marcado 38 sobre la zona de aplicacion de muestra 44. Si hay tambien un socio de union a la zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, el socio de union a la zona de control 61 tambien es transferido. Notese que la transferencia es debida a la presion, no debida al flujo o la action de capilaridad. A continuation, se anade tampon 43 para permitir el flujo del complejo conjugado 36 - analito 40 (si se encuentra presente) - segundo socio de union 38 (un sandwich completo) hasta la zona de deteccion 52. Una marca inmovilizada 50 en la zona de prueba 45 se une a continuacion a la marca 39. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. El funcionamiento apropiado de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46 debido a la interaction entre el socio de union a la zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
A pesar de que no se muestra, tambien puede haber de forma opcional una zona de lisis, que preferiblemente se solapa con la zona de aplicacion de muestra 44. En otras realizaciones, puede haber una zona de bloqueo que incluye reactivos de captura, de forma similar a la zona que se describe con respecto a la figura 1.
En otra realizacion, los dos socios de union para el analito estan ubicados de tal manera para conseguir un “sandwich vertical" en el que la muestra se une con el conjugado que esta siendo comprimido desde el segundo plano y se puede unir simultanea o concurrentemente con el otro socio de union ubicado sobre la tira en el plano de la tira. Por lo tanto una intercalation del analito en la muestra se consigue mediante union al socio desde el
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conjugado suministrado desde encima del plano de la tira y union al segundo socio de union ubicado sobre el plano de la tira por debajo del material de suministro de la muestra.
Las figuras 5A y 5B muestran otro ejemplo de una realizacion del sistema con un compresor de muestras 30, un colector de muestras 35 y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). Similar a la figura 3A - 3C, la tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. La tira reactiva tambien incluye preferiblemente un sustrato de soporte 48. Similar a la realizacion mostrada en las figuras 4A y 4C, en la presente realizacion, todo el sandwich (primer socio de union 37 - analito 40 - segundo socio de union 38) se forma en la zona de aplicacion de muestra 44. La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una marca inmovilizada 50 que se une a la marca 39 del segundo socio de union 38. En la presente realizacion, un primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36 y, preferiblemente, se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich. El segundo socio de union 38 en la presente realizacion preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva. El segundo socio de union 38 tambien incluye una marca 39. Como alternativa, el segundo socio de union 38 en la presente realizacion puede estar ubicado en cualquier lugar sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra y entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion.
En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union a la zona de control 61 (mostrado en la figura 3C) con un marcador detectable. El socio de union a la zona de control 61 se compleja con su socio de union en la zona de control 46. Incluir el socio de union a la zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, en lugar de sobre la tira reactiva o en el tampon, tal como se conoce en la tecnica anterior, permite al usuario estar seguro de que los componentes sobre el compresor de muestras 30, que incluyen tanto el conjugado 61 como el socio de union a la zona de control 61, han sido transferidos eficazmente al dispositivo de analisis de muestras y, por lo tanto, garantiza el funcionamiento apropiado del sistema.
En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union a la zona de control 61 tambien es, preferiblemente, un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos contra el analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo mostrado en las figuras 5A - 5B de la presente invencion se puede usar para cualesquiera ensayos de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union ligando-receptor y ensayos de union enzima-sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 38 esta marcado con biotina 39. En algunas realizaciones en las que la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 es biotina, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion es preferiblemente avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 38 esta marcado 39 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion 52 es preferiblemente biotina. Como alternativa, la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 50 puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invencion. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, el colector de muestras 35 se coloca de tal modo que la muestra este directamente por encima de la zona de aplicacion de muestra 44. El compresor de muestras 30 ejerce presion 51 sobre el colector de muestras 35, usando la presion para transferir la muestra (incluyendo el analito 40, si se encuentra presente) y el conjugado 36 sobre la zona de aplicacion de muestra 44. Un sandwich “vertical" se forma con el conjugado 36 como pieza superior y el segundo socio de union 38 como pieza inferior, con el analito 40 entre ellos. Si hay tambien un socio de union a la zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, el socio de union a la zona de control 61 tambien es transferido. Notese que la transferencia es debida a la presion, no debida al flujo o la accion de capilaridad. A continuacion, se anade el tampon 43 para permitir el flujo del complejo conjugado 36 - analito 40 (si se encuentra presente) - segundo socio de union 38 (un sandwich completo) hasta la zona de deteccion 52. Una marca inmovilizada 50 en la zona de prueba 45 se une a continuacion a la marca 39. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. El funcionamiento apropiado de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46, debido a la interaction entre el socio de union a la zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
A pesar de que no se muestra, tambien puede haber de forma opcional una zona de lisis, que preferiblemente se solapa con o esta ubicada aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. En otras realizaciones, puede haber una zona de bloqueo que incluye reactivos de captura, de forma similar a la zona que se describe con respecto a la
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figura 1.
Las figuras 6A y 6B muestran otra realizacion de la presente invencion, en la que el compresor de muestras 30 incluye el segundo socio de union 38 para el analito 40, acoplado con una marca 39, y la tira reactiva incluye el conjugado 36, que incluye tanto un primer socio de union 37 para el analito 40 como un marcador detectable 41, y la marca inmovilizada 50 que se une a la marca sobre el segundo socio de union en la zona de prueba 45. La presente realizacion funciona analogamente a la realizacion que se describe con respecto a las figuras 5A y 5B, excepto que el sandwich “vertical" se forma con el segundo socio de union 38 como pieza superior y el conjugado 36 como pieza inferior, con el analito 40 entre ellos. Como alternativa, el conjugado 36, en la presente realizacion, puede estar ubicado en cualquier lugar sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de detection incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra o entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion.
Las figuras 7A a 7D son similares a las figuras 3C, 4C, 5B y 6B, respectivamente, excepto que la zona de deteccion 52 se solapa con la zona de aplicacion de muestra 44, en estas figuras. La zona de deteccion, en las presentes realizaciones, esta hecha preferiblemente de nitrocelulosa. A pesar de que no se requiere estrictamente ningun flujo lateral para ejecutar el ensayo en las presentes realizaciones, se prefiere al menos una cantidad nominal de flujo, de tal modo que el sandwich sea capaz de unirse en la zona de prueba y cualquier conjugado no unido sea eliminado por lavado de la zona de prueba. En una realizacion, en lugar de un tampon de migration que es aplicado en un extremo de la tira reactiva, un fluido de lavado se puede aplicar directamente a la zona de prueba, desde arriba o desde el lado, por ejemplo usando un frasco de agua. En una realizacion, el compresor de muestras y el colector de muestras son sustancialmente transparentes, de tal modo que la zona de prueba se pueda leer sin la retirada de la pila vertical de la tira reactiva. Notese que, a pesar de que tanto la zona de prueba 45 como el control 46 se muestran dentro de la zona de aplicacion de muestra en estas figuras, en otras realizaciones la zona de prueba 45 se podria solapar con la zona de aplicacion de muestra 44 mientras la zona de control 46 se encuentra aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. Si la zona de control estuviera en sentido lateral aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44, seria necesario anadir tampon para permitir el flujo. Ademas, puede ser preferible anadir un tampon, por ejemplo un tampon que incluye plata, para intensificar la senal de un resultado positivo.
Una tira reactiva universal 80, tal como se muestra en la figura 8A, se puede usar cuando el compresor de muestras 30 incluye ambos de los socios de union 37, 38 para el analito 40. El compresor de muestras 30 y el colector de muestras 35 serian transferidos a la tira reactiva universal 80 en la ventana de la muestra 81. Debido a que los elementos especificos para el analito 40, que esta siendo puesto a prueba, se encuentran sobre el compresor de muestras 30, la zona de prueba 83 en la ventana de visualization 82 de la tira reactiva universal 80 solo necesita tener una marca 50 que se compleja con la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 para el analito 40. Por ejemplo, cuando el segundo socio de union 38 para el analito 40 esta marcado 39 con biotina, la zona de prueba 83 de la tira reactiva universal 80 incluiria avidina 39, un socio de union para biotina. La tira reactiva universal 80 tambien incluye preferiblemente una zona de control 84 y una carcasa 85. Para las realizaciones de las figuras 7A a 7D, la zona de prueba esta ubicada en la ventana de la muestra 81. En otras realizaciones, el marcador adecuado puede ser una secuencia de nucleotidos que puede hibridar con la secuencia de acido nucleico adecuada inmovilizada en la zona de prueba.
A pesar de que el compresor de muestras y el colector de muestras se muestran como entidades independientes en las figuras 1 - 8A, la almohadilla 33 del compresor de muestras y la parte colectora de muestras 60 del colector de muestras pueden ser componentes de un unico elemento dentro del espiritu de la presente invencion. Por ejemplo, el colector de muestras puede estar conectado de forma que pueda girar o de forma flexible o como parte de un cartucho al compresor de muestras, de tal modo que una muestra pueda ser recogida de un paciente con la parte de recogida de muestras sin exponer al paciente a la almohadilla de compresor de muestras y, a continuation, la parte de recogida de muestras y la almohadilla de compresor de muestras se pueden poner en contacto para aplicacion a la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva por compresion. El colector de muestras tambien puede estar conectado de forma que pueda girar o de forma flexible a la casete de prueba o se puede insertar como un cartucho. En otra realizacion, la muestra se puede inyectar de forma forzada directamente sobre la tira reactiva antes de colocar el compresor y/o los conjugados en position. En otra realizacion mas, el colector de muestras puede contactar con los conjugados en un cartucho externo que, a continuacion, encaja o se inserta en una casete de prueba para poner al material en contacto con la tira reactiva. En otra realizacion, la muestra se puede aplicar al compresor de muestras.
En algunas realizaciones, el compresor de muestras 30 esta conectado, de forma que pueda girar, a la carcasa 85 tal como se muestra en la figura 8b. Mientras que la bisagra del compresor de muestras 30 se muestra de tal modo que el compresor de muestras 30 este girado hacia el extremo aguas abajo de la tira cuando esta abierto, la carcasa podria estar disenada de tal modo que el compresor de muestras 30 esta articulado a cualquier lado o en otras direcciones dentro del espiritu de la presente invencion. La parte de recogida de muestras 60 del colector de muestras 35 esta, preferiblemente, insertada desde el lado de tal modo que se alinea con un agujero de insertion 88 en el lado de la carcasa 85. No obstante, el colector de muestras 35 se podria insertar en cualquier direction dependiendo del diseno de la carcasa. El compresor de muestras 30 preferiblemente incluye una almohadilla (no visible en la figura 8B), con uno o mas componentes de ensayo, ubicada sobre la superficie del compresor de
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muestras orientada hacia la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva 80. El compresor de muestras 30 se cierra a continuacion de tal modo que una presion de compresion se aplica a la pila vertical de la almohadilla de compresor de muestras, la parte de recogida de muestras y la zona de aplicacion de muestra para transferir la muestra y los uno o mas componentes de ensayo a la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva. A pesar de que hay una almohadilla absorbente que se proyecta desde la carcasa en el extremo aguas arriba alejado del dispositivo en la figura 8B, la longitud de la almohadilla absorbente puede variar. De hecho, mientras se pueda anadir tampon en el extremo aguas arriba (por ejemplo, a traves de una ventana de aplicacion en la carcasa), no es necesario hacer que la almohadilla absorbente se extienda significativamente fuera de la carcasa. En la presente realizacion, no existe ninguna posibilidad de perder el compresor de muestras, y no existe ninguna necesidad de alinear el compresor de muestras con la zona de aplicacion de muestra cuando se forma la pila vertical. Una ventaja de las presentes realizaciones es que permiten un lapso de tiempo entre la aplicacion de muestra y el inicio real de flujo a la zona de prueba. En otras palabras, el sandwich se puede preparar previamente, y el flujo iniciarse mucho mas tarde.
Como alternativa, la almohadilla 33 puede ser independiente del compresor de muestras. La almohadilla puede estar sobre un aplicador del socio de union similar al colector de muestras. En las presentes realizaciones, el aplicador del socio de union puede estar ubicado entre la parte de recogida de muestras y la zona de aplicacion de muestra cuando la presion es aplicada por el compresor de muestras para transferir la muestra a la zona de aplicacion de muestra.
La figura 9 muestra una pila vertical que incluye un compresor de muestras 30, un colector de muestras 35 con una parte de recogida de muestras 60, un aplicador del socio de union 62 con una almohadilla del aplicador 64 y una zona de aplicacion de muestra 44 de una tira reactiva. A pesar de que el aplicador del socio de union 62 incluye un mango en la figura 9, el aplicador del socio de union 62 podria, como alternativa, simplemente ser una almohadilla. La parte de repisa 34 del compresor de muestras 30 aplica presion a la parte de recogida de muestras 60 cargada con una muestra y la almohadilla del aplicador 64 cargada con al menos un socio de union para un analito para el que se realizaran pruebas en la muestra. La presion preferiblemente empuja a al menos una parte de la muestra desde la parte de recogida de muestras 60 para humedecer la almohadilla del aplicador 64, movilizando de este modo parte del socio de union, de tal modo que al menos parte de la muestra y parte del socio de union son transferidas a la zona de aplicacion de muestra 44. En algunas realizaciones, esta transferencia se produce sin dilucion. En algunas realizaciones con pequenos volumenes de muestra o muestras viscosas o solidas, no obstante, se puede usar un liquido adicional para facilitar la transferencia de la muestra y el socio de union a la tira reactiva. En algunas realizaciones, tal como se muestra en la figura 9, el compresor de muestras no tiene ninguna almohadilla, a pesar de que se puede usar una almohadilla para ayudar en la transferencia, tal como suministrando liquido o tampon adicional, dentro del espiritu de la presente invencion. En algunas realizaciones, tal como se muestra en la figura 9, la parte de recogida de muestras 60 esta ubicada entre el compresor de muestras 30 y la almohadilla del aplicador 64 en la pila vertical para ayudar en la transferencia del socio de union a la tira reactiva durante la compresion. Como alternativa, la almohadilla del aplicador 64 puede estar colocada entre el compresor de muestras 30 y la parte de recogida de muestras 60 dentro del espiritu de la presente invencion. En algunas realizaciones en las que el sandwich completo se forma antes de alcanzar la zona de prueba, se pueden usar dos aplicadores del socio de union (un aplicador independiente para cada socio de union de analito), con la parte de recogida de muestras, estando la primera almohadilla del aplicador y la segunda almohadilla del aplicador colocadas en cualquier orden sobre la pila vertical. Como alternativa, un unico aplicador del socio de union podria incluir ambos de los socios de union para el analito. En otras realizaciones, la muestra, el primer socio de union y el segundo socio de union se pueden aplicar de forma secuencial a la tira reactiva en cualquier orden usando el compresor de muestras dentro del espiritu de la presente invencion.
En un metodo de aplicacion de una muestra a una tira reactiva de un dispositivo de flujo lateral, al menos un socio de union externo se coloca en primer lugar sobre la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva. El socio de union externo puede estar ubicado sobre una almohadilla externa. En algunas realizaciones en las que hay dos socios de union al analito, que se unen al analito antes de alcanzar la zona de prueba, se pueden anadir uno o ambos de los socios de union al analito. Un colector de muestras que incluye la muestra se coloca en una pila vertical entre el socio de union externo y un compresor de muestras. El compresor de muestras aplica presion al colector de muestras para transferir el socio de union externo y al menos una parte de la muestra a la zona de aplicacion de muestra. Como alternativa, el socio de union externo se podria anadir y ser comprimido por el compresor de muestras, a continuacion retirado, antes de que el colector de muestras se aplique por encima de la zona de aplicacion de muestra, en la que la muestra es comprimida sobre la tira reactiva. En otra realizacion alternativa, al menos un socio de union externo se coloca en la pila vertical entre el compresor de muestras y el colector de muestras. Como alternativa, el colector de muestras se anade y se comprime, a continuacion se retira y, a continuacion, el socio de union externo se anade y se comprime sobre la tira reactiva. En otras realizaciones, el colector de muestras se encuentra en una pila vertical entre un primer socio de union externo y un segundo socio de union externo, y el compresor de muestras aplica presion a la pila vertical. En las presentes realizaciones, ni la tira ni el compresor de muestras tienen un socio de union de analito especifico. La muestra, el socio de union al analito y el socio de union de control tambien se puede aplicar a la zona de aplicacion de muestra en multiples etapas en cualquier combinacion Identro del espiritu de la presente invencion.
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Como alternativa, en un dispositivo de flujo lateral de la presente invencion, el compresor de muestras puede ser un compresor de muestras universal sin componentes espedficos para el analito de interes. En una realizacion, el compresor de muestras no contiene componentes del ensayo. En algunas realizaciones con a control, la almohadilla de compresor de muestras contiene solo el socio de union a la zona de control movil. En algunas de las presentes realizaciones, uno o mas aplicadores del socio de union incluyen al menos un socio de union para el analito y se convierten en parte de la pila vertical con el compresor de muestras y el colector de muestras cuando la muestra es transferida a la zona de aplicacion de muestra. La muestra, el socio de union al analito y el socio de union de control movil tambien se pueden aplicar a la zona de aplicacion de muestra en multiples etapas en cualquier combinacion dentro del espiritu de la presente invencion.
En otra realizacion de la presente invencion, el compresor de muestras 30 tambien sirve como colector de muestras, y la almohadilla 33 del compresor de muestras tambien sirve como parte de recogida de muestras. En la presente realizacion, el conjugado, el segundo socio de union, el socio de union a la linea de control y/o cualquier combinacion de los tres, estan preferiblemente ubicados sobre una superficie posterior de la almohadilla 33, en la que la almohadilla esta fijada al brazo del compresor de muestras. En algunas realizaciones en las que es necesario realizar la recogida de muestras de forma esteril, el compresor de muestras 30 es esterilizado preferiblemente a continuacion por radiacion antes del uso como colector de muestras. La muestra es recogida a continuacion usando la parte frontal de la almohadilla de tal modo que el paciente no es expuesto al conjugado o el segundo socio de union durante la adquisicion de la muestra. Cuando la muestra se aplica a la zona de aplicacion de muestra de la tira reactiva, la almohadilla es, preferiblemente, comprimida de tal modo que la muestra se mezcla con el conjugado o el segundo socio de union y al menos una parte de ambos es exprimida sobre la tira reactiva. En otras realizaciones, la muestra que se ha recogido se transfiere de un colector de muestras (por ejemplo, una pipeta) a la almohadilla del compresor de muestras antes de la realizacion del ensayo.
En algunas realizaciones, un dispositivo de flujo lateral de la presente invencion tambien puede incluir un sistema de amplificacion de senales incorporado, en linea o in situ. El sistema de amplification de muestras se puede usar en combinacion con un compresor de muestras o en un metodo o dispositivo sin un compresor de muestras dentro del espiritu de la presente invencion. En algunas realizaciones en las que se usa oro coloidal como marcador detectable para el conjugado, la senal del oro coloidal en el conjugado unido a la zona de prueba se puede amplificar adicionalmente mediante intensification con plata. Formulaciones adecuadas de sales de plata y los agentes de revelado de plata se pueden secar en el sitio de aplicacion de muestra o aguas arriba de este o aguas abajo de este. Las sales de plata y los agentes de revelado se pueden secar de forma conjunta, aguas arriba o aguas abajo entre si, o pueden estar separados por el area de aplicacion de muestra. En otras realizaciones, las sales de plata y/o los agentes de revelado de plata se encapsulan para crear un retardo de tiempo para la intensificacion, permitiendo de ese modo que se forme un sandwich completo en la linea de prueba antes de que tenga lugar la intensificacion de plata.
En otras realizaciones, el apilamiento, en el que el sistema incluye un conjugado con un antigeno adicional y un segundo conjugado, que es preferiblemente una nanoparticula, con el socio de union especifico del antigeno, se usa para amplificar la senal. El segundo conjugado tambien incluye preferiblemente un marcador. En el segundo conjugado, el socio de union puede estar conjugado a una particula que es del mismo tamano, mas pequena o de mayor tamano de la particula en el primer conjugado. En algunas realizaciones, el antigeno y el segundo conjugado estan encapsulados. En otras realizaciones mas, tanto la intensificacion con plata como la intensificacion por apilamiento se pueden usar sobre la misma tira reactiva. El conjugado y los elementos de intensificacion con plata de apilamiento pueden estar juntos o aguas arriba o aguas abajo entre si. Una caracteristica preferida de las presentes realizaciones es que las nanoparticulas y/o intensificadores de plata “de apilamiento" no entran en contacto con el conjugado inicialmente sino que entran en contacto solo mientras el conjugado esta inmovilizado en la zona de prueba. Por lo tanto, se consigue una mejor especificidad. En algunas realizaciones, uno o ambos de los elementos de intensificacion de plata y/o los elementos de intensificacion de apilamiento se encapsulan para crear un retardo de tiempo para la amplificacion de la senal.
En algunas realizaciones en las que un “sandwich completo" esta formado entre el analito 40, el primer socio de union al analito 37 y el segundo socio de union al analito 38 antes de que el complejo alcance la zona de detection 52 (vease, por ejemplo, las figuras 4A - 4C, 5A - 5B, y 6A - 6B), la intensificacion con plata u otras senales de amplificacion se pueden colocar aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44 de tal modo que la sal de plata y/o agente de revelado de plata interactua con el sandwich completo antes de que el complejo alcance la zona de deteccion 52. En otras realizaciones con un sandwich completo, la sal de plata y/o agente de revelado de plata estan ubicados aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44 de tal modo que el sandwich completo se forma y se desplaza hasta la sal / agente de revelado de plata antes de alcanzar la zona de deteccion 52.
En la tecnica anterior, tal como se muestra en la figura 10, hay una correspondencia uno a uno entre el analito 40 y el marcador 41 en la zona de prueba 45, debido a que cada analito se une a un socio de union inmovilizado 38 y un socio de union movil 37 sin ningun marcador 41 sobre el conjugado 36.
En un sistema de amplificacion de senales de la presente invencion, la fuente de amplificacion puede estar ubicada en cualquier lugar sobre la tira reactiva, incluyendo en la zona de aplicacion de muestra, o aguas arriba o aguas
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abajo de esta. Como alternativa, la fuente de amplificacion puede estar ubicada en el tampon o sobre el compresor de muestras. Cualquiera o la totalidad de los elementos de amplificacion se pueden encapsular.
En algunas realizaciones, tal como se muestra en la figura 11, la fuente de amplificacion 70 se deposita no espedficamente sobre el conjugado, de tal modo que multiples conjugados estan asociados con un analito unido en la zona de prueba. En la presente realizacion, la fuente de amplificacion es, preferiblemente, una o mas sales de plata, y un agente de revelado de plata se puede usar para intensificar la senal en ensayos usando oro coloidal como la parte de marcador 41 del conjugado. Las sales de plata y el agente de revelado de plata se pueden ubicar o introducir de cualquier manera para intensificar la deteccion del analito. En algunas realizaciones en las que se usa oro coloidal como marcador detectable para el conjugado, la senal del oro coloidal en el conjugado unido en la zona de prueba se puede amplificar mediante intensificacion con plata. Formulaciones adecuadas de sales de plata y los agentes de revelado de plata se pueden secar en el sitio de aplicacion de muestra aguas arriba de este o aguas abajo de este. Las sales de plata y los agentes de revelado se pueden secar de forma conjunta, aguas arriba o aguas abajo entre si, o separados por el area de aplicacion de muestra. Como alternativa, sales y/o agentes de revelado de plata pueden estar incluidos como parte del tampon. En algunas realizaciones preferidas, las sales de plata y/o el agente de revelado de plata se pueden encapsular.
En una realizacion preferida, la mezcla de las sales de plata y agentes de revelado se seca en un area entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de prueba. En la presente realizacion, un sandwich completo del analito entre dos socios de union (estando uno un conjugado sobre oro y el otro marcado adecuadamente con marcadores tales como biotina) se mueve al interior del area de intensificacion con plata y juntos se desplazan a la zona de prueba en la que son capturados. A pesar de que la intensificacion con plata se puede aplicar al medio sandwich antes de la captura, la intensificacion con plata se aplica preferiblemente despues de la captura, dado que, en caso contrario, puede interferir en la union en la zona de prueba. Las sales de plata y los agentes de revelado se pueden usar en cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a las mostradas en las figuras 3A - 3C, 4A - 4C, 5A - 5B, 6A - 6B, y 7A - 7D.
En otra realizacion mas, el area de intensificacion con plata esta ubicada directamente debajo del material de aplicacion de muestra. El compresor con ambos socios de union, tal como se han descrito en lo que antecede, formarian el sandwich completo y se volverian potenciados por sales de plata y agentes de revelado todos en su lugar. Este megacomplejo se puede mover a continuacion al interior de la zona de prueba en la que puede ser capturado.
En otra realizacion mas, la intensificacion con plata se consigue incorporando las sales de plata y los agentes de revelado en el tampon de migracion. En otras realizaciones, las sales de plata y/o el agente de revelado de plata pueden estar ubicados sobre el compresor de muestras o el colector de muestras en situaciones en las que no es necesario que el colector de muestras sea esteril. En caso contrario, el colector de muestras se puede esterilizar despues de la adicion de las sales de plata y/o el agente de revelado de plata usando tecnicas de esterilizacion, tales como, por ejemplo, radiacion, que no danan las sales de plata y/o el agente de revelado de plata.
En otra realizacion mas, las sales de plata se secan en el sitio, aguas arriba, o aguas abajo del area de aplicacion de muestra y el agente de revelado de plata se puede anadir a la ventana de visualizacion como una etapa independiente.
En una realizacion preferida que implica la intensificacion con plata, debido a que la plata es sensible a la luz, la prueba se realiza boca abajo (con la casete dada la vuelta en algunas realizaciones en las que se usa una casete) o protegida de otro modo de la luz ambiente antes de que se complete la prueba.
En otra realizacion, la intensificacion con plata se consigue como una etapa independiente en la que la sal de plata y el agente de revelado se anaden juntos o por separado al area de la ventana de visualizacion 82 en la que esta ubicada la zona de prueba 83. Si no hay ningun area de la ventana de visualizacion 82, la sal de plata y el agente de revelado se anaden, preferiblemente, a la zona de prueba 83 de la tira. En algunas de las presentes realizaciones, la intensificacion con plata se anade a la tira reactiva mientras sigue estando humeda o seca despues del uso. En algunas de las presentes realizaciones, la tira se retira de cualquier carcasa y una parte de la tira que contiene la zona de prueba 83 se corta y se trata con intensificacion con plata de forma conjunta o por separado.
En una realizacion preferida, despues de que se ha realizado la prueba, se deja secar a la tira al aire. El secado moderado de la tira se consigue en aproximadamente de 20 a 30 minutos, pero depende de las condiciones medioambientales. Despues de que la tira se ha secado, una gota o dos de la sal de plata y los agentes de revelado se anaden al area de la ventana de visualizacion 82 en la que esta ubicada la zona de prueba 83. Si no hay ningun area de la ventana de visualizacion 82, la sal de plata y el agente de revelado se anaden, preferiblemente, a la zona de prueba 83 de la tira. Esto intensifica la sensibilidad al menos 5 veces. La sal de plata y los agentes de revelado se pueden anadir de forma conjunta o por separado. La intensificacion con plata se produce casi instantaneamente y los resultados se leen preferiblemente en el plazo de dos a tres minutos despues del anadido de la intensificacion con plata. Si los resultados no se leen rapidamente, la tira se puede volver negra y el fondo interferira en la lectura de la linea de prueba gris / negra resultante. Este fondo se puede reducir al minimo en gran medida si se anade una
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solucion de lavado a la ventana de visualizacion 82 / zona de prueba 83. La sensibilidad se puede intensificar adicionalmente con el uso de un lector optico portatil, por ejemplo un espectrometro en miniatura fabricado por Ocean Optics, Inc. (Dunedin, Florida). Un lector portatil es un espectrometro en miniatura de mano, que cuantifica la intensidad del color de la linea de prueba que mide la absorbancia o la reflectancia del complejo marcado que se une a la linea de prueba. La cuantificacion de la linea de prueba se puede determinar mediante el uso de una curva patron. En el desarrollo de una curva patron, se crean varias valoraciones de la concentracion del analito y se registra la salida del lector en cada valoracion. El lector incrementa la sensibilidad de una prueba en 5 a 10 veces. Durante el funcionamiento, la ventana de deteccion para ver la linea de prueba visible se coloca directamente sobre o en las proximidades de la abertura del espectrometro, de tal modo que se pueda realizar una medicion directa de absorbancia o reflectancia.
En otra realizacion preferida, la solucion de sal de plata y/o agente de revelado incluye un liquido volatil. La sal de plata y el agente de revelado se podrian preparar juntas en una unica solucion o como soluciones independientes. Cualquier liquido que se evapora a temperatura ambiente o se vaporiza facilmente y no interfiere en la prueba se podria usar. El disolvente volatil se selecciona de tal manera que no disuelve el material de la membrana (por ejemplo, nitrocelulosa) que compone la zona de prueba 83 en la que el segundo socio de union 17 (vease la figura 1), 38 (vease las figuras 3A - 3C y 7A) o la marca inmovilizada 50 (vease las figuras 4A - 4C, 5A - 5B, 6A - 6B y 7B - 7D) estan ubicados. Algunos ejemplos de un liquido volatil que se podrian usar incluyen, pero sin limitarse a, metanol, alcohol isopropilico, bajas concentraciones de benceno y bajas concentraciones de acetona. La intensificacion con plata tiene la sal de plata y un agente de revelado que es, preferiblemente, de naturaleza relativamente organica. La solucion de sal de plata y agente de revelado se anade al area de la ventana de visualizacion 82 en la que la zona de prueba 83 esta ubicada al final de la prueba (por ejemplo, aproximadamente 10 minutos despues de que la muestra se anadio a la tira), cuando la tira siegue estando bastante humeda. Si no hay ningun area de la ventana de visualizacion 82, la sal de plata y el agente de revelado se anaden preferiblemente a la zona de prueba 83 de la tira. El liquido volatil “seca” el area en la que se anade el liquido (la zona de prueba 83). En la presente realizacion, no es necesario esperar a que toda la tira este moderadamente seca. La presente realizacion crea secado “in-situ” de solo el area de interes (la zona de prueba 83).
En algunas realizaciones, tal como se muestra en la figura 12, la amplificacion se debe a un fenomeno de “apilamiento” en el que un segundo conjugado 74 “se apila” sobre al menos una parte del complejo formado durante el ensayo. En las presentes realizaciones, el primer conjugado 72 incluye una parte adicional 73 a la que un socio de union 76 de la parte 73 se une especificamente, y el segundo conjugado 74 preferiblemente tambien incluye un marcador 78. Por ejemplo, cuando el segundo socio de union 38 incluye una marca de avidina 39, el sandwich completo es capturado en la zona de prueba por biotina inmovilizada 50, y posterior o concurrentemente, el conjugado “de apilamiento” se acumula o se apila sobre el sandwich completo inmovilizado en la zona de prueba, dando origen a mas acumulacion apilada y mejor percepcion de senales. En una realizacion, el primer conjugado es oro conjugado a un anticuerpo del analito e IgY de pollo, y el segundo conjugado es una perla de latex rojo conjugada a un antigeno de conejo anti-IgY de pollo.
Preferiblemente, el “apilamiento” se usa solo en algunas realizaciones en las que el “sandwich completo” se forma antes de alcanzar la zona de prueba. Por ejemplo, en las figuras 4C, 5B, 6B, 7B, 7C y 7D, un sandwich completo se forma en la zona de aplicacion de muestra. En una realizacion preferida, anticuerpo de raton sobre conjugado marcado se une a un antigeno para formar un primer complejo. El primer complejo se une inmediatamente al anticuerpo policlonal marcado con biotina movilizado para formar un sandwich completo como un segundo complejo. El segundo complejo es capturado a continuacion en la zona de prueba por avidina mediante el marcador de biotina. El conjugado con marcador anti-raton liberado lentamente se une a continuacion y se aplica sobre el anticuerpo de raton en el segundo complejo en la zona de prueba. El conjugado con marcador anti-raton esta ubicado preferiblemente de tal modo que alcance la zona de prueba despues de que se han formado los complejos de analito. Algunas ubicaciones preferidas para el conjugado con marcador anti-raton incluyen en la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, anadido al tampon despues de una cantidad de tiempo predeterminada, aplicado a la zona de prueba despues de que el sandwich se ha formado o en la trayectoria de flujo pero encapsulado para retardar su liberacion, por ejemplo, durante 20 a 30 segundos. En la presente realizacion, el apilamiento incrementa la sensibilidad del ensayo de 3 - 5 veces.
En algunas realizaciones de la presente invention con conjugados de oro, que se pueden usar en todos los ensayos de flujo lateral, un anticuerpo anti-IgY de pollo marcado y secado u otro resto inmunogeno inespecifico, se incorpora en la tira reactiva aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra o, como alternativa, en el tampon. Cuando la muestra es de mamifero (por ejemplo, ser humano), el resto inmunogeno inespecifico es, preferiblemente, de un organismo no mamifero tal como, por ejemplo, un ave, un pez o una planta, de tal modo que no interfiera en la union al analito. El segundo conjugado, por ejemplo anti-IgY de pollo, es movilizado a continuacion por el tampon. Retardar la movilizacion del segundo conjugado permite que el sandwich completo fluya y comience la union mediante una marca inmovilizada con una marca, por ejemplo biotina-avidina, captura en la zona de prueba en el caso de un segundo socio de union movil. El sandwich completo se acumula en la zona de prueba, seguido por union y apilamiento del segundo conjugado, por ejemplo perlas de latex de color rojo, encima del primer conjugado, por ejemplo oro. La presente realizacion tambien incrementa la sensibilidad del ensayo de 3 - 5 veces. En algunas realizaciones en las que el segundo socio de union para el analito se inmoviliza en la zona de prueba, el medio
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sandwich preferiblemente se desplaza hasta la zona de prueba, seguido por union y apilamiento.
La figura 11 muestra amplificacion inespedfica y la figura 12 muestra amplification espetifica. En otras realizaciones, se podrian usar combinaciones de tanto amplificacion espedfica como amplificacion inespedfica, para amplificar adicionalmente la senal. Como un ejemplo, la primera amplificacion se debe a un fenomeno de “apilamiento" tal como se ha mostrado y descrito en lo que antecede con respecto a la figura 12 en la que un segundo conjugado 74 “se apila” sobre al menos una parte del complejo formado durante el ensayo. Se proporciona una amplificacion adicional cuando una fuente de amplificacion 70 se deposita a si misma de forma inespedfica sobre el conjugado, de tal modo que multiples conjugados se asocien con un analito unido en la zona de prueba, tal como se ha mostrado y descrito en lo que antecede con respecto a la figura 11. Como alternativa, se podrian usar otras combinaciones de amplificacion espedficas e inespedfica.
En otra realization de apilamiento e intensification de senales, la intensification se realiza usando una enzima conjugada al resto de apilamiento. En un ejemplo, la enzima es peroxidasa de rabano picante, y esta conjugada a un anticuerpo de conejo anti-raton. A pesar de que la peroxidasa de rabano picante se usa a menudo para amplificar una senal debil, se podrian usar, como alternativa, otras enzimas que intensifican senales debiles incluyendo, pero sin limitarse a, fosfatasa alcalina, catalasa, ureasa y glucosa oxidasa. Analogamente, se podrian usar como alternativa otros anticuerpos que se unen al conjugado o un intermediario. No hay nanoparticulas o microesferas en la presente realizacion. En su lugar, la presente realizacion incluye una forma “soluble” del conjugado. La ubicacion en la que se seca este conjugado enzimatico puede variar; se puede encontrar aguas arriba, aguas abajo o solapandose con la zona de aplicacion de muestra. En algunas realizaciones con un compresor de muestras, el conjugado enzimatico podria estar, como alternativa, sobre el compresor de muestras. El conjugado enzimatico se seca, preferiblemente, sobre la tira reactiva, pero no se inmoviliza. Puede estar ubicado en solitario o en combination con otros componentes que forman el “sandwich” con el anticuerpo (que esta, preferiblemente, biotinilado) y/o el anticuerpo conjugado a oro.
La figura 14 muestra una realizacion de un detector con una enzima conjugada al resto de apilamiento. La zona de control 46 incluye un primer socio de union de control inmovilizado 110. La zona de prueba 45 incluye un primer socio de union a la zona de prueba inmovilizado 109 sobre la membrana. Un primer socio de union al analito 102 conjugado a un segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 101 se seca o se incorpora de otro modo (por ejemplo, se liofiliza) en la zona de aplicacion de muestra 44. A pesar de que no se muestra en esta figura, el primer socio de union al analito 102 podria estar, como alternativa, ubicado aguas arriba o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. Un socio de union 107 para un segundo socio de union al analito 103 esta conjugado a una enzima 108, y esta ubicado aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. Como alternativa, el socio de union 107 para el segundo socio de union al analito 103 se podria solapar con la zona de aplicacion de muestra 44 o estar ubicado aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. La almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 esta, preferiblemente, embebida con el segundo socio de union al analito 103 conjugado a un primer marcador detectable 104 y se mezcla preferiblemente con un segundo socio de union de control 105 conjugado a un segundo marcador detectable 106, que sirve como control.
A pesar de que la figura 14 muestra los diferentes reactivos en ciertas ubicaciones sobre la tira reactiva o el compresor de muestras 30, tambien son posibles otras ubicaciones para cada uno del primer socio de union al analito 102 conjugado a un segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 101, el socio de union 107 para el segundo socio de union al analito 103, el segundo socio de union al analito conjugado al primer marcador detectable 104, y el segundo socio de union de control 105 conjugado al segundo marcador detectable 106 sobre la tira reactiva y/o sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30. Otras realizaciones no requieren un compresor de muestras 30. En las presentes realizaciones, los reactivos 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 y 108 estaran ubicados en diversas ubicaciones, preferiblemente aguas arriba de la zona de prueba 45, sobre la tira reactiva.
La muestra se toma sobre un hisopo de la muestra 35, que se coloca a continuation sobre la zona de aplicacion de muestra 44 a traves de la ventana de la muestra 81 (en realizaciones con una carcasa y una ventana de la muestra) o justamente sobre la zona de aplicacion de muestra 44. El compresor de muestras 30 es comprimido a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44. La punta absorbente del compresor de muestras 30 se sumerge, preferiblemente, en tampon de migration durante aproximadamente 15 - 30 segundos antes de retirar el compresor de muestras 30. Las figuras 15A y 15B muestran los diferentes complejos que se forman entre los reactivos de prueba y el analito. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, se compleja con el primer socio de union al analito 102 y el segundo socio de union al analito 103, que se compleja con el socio de union 107 conjugado con la enzima 108.
Si el analito 40 no se encuentra presente en la muestra, el segundo socio de union al analito 103 aun se compleja con el socio de union 107 conjugado con la enzima 108, pero estos no se complejan con la muestra o el primer socio de union al analito 102. El segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 101 se unira al primer socio de union a la zona de prueba 109 en la zona de prueba 45, independientemente de si el analito 40 esta o no presente en la muestra. No obstante, si no hay analito presente, nada sera visible en la linea de prueba. El resultado se lee visualmente en aproximadamente diez minutos. Si se forma una linea de prueba visible junto con una linea de
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control visible, el resultado indica niveles elevados de analito en la muestra. Si, al cabo de 10 minutos, no hay ninguna linea visible en la linea de prueba, entonces una gota de un sustrato para la enzima se anade en la linea de prueba. Si la adicion del sustrato enzimatico da como resultado una senal visible, el resultado indica una muestra positiva debil. Una linea visible en la linea de control indica que el segundo socio de union de control 105 conjugado a la segundo marcador detectable 106 se ha unido al primer socio de union de control 110 en la zona de control 46 y que la prueba se ha realizado correctamente. La figura 15C muestra el complejo que se forma en la zona de control.
Como un ejemplo, un detector del virus del herpes simple (VHS) incluye las siguientes secciones, tal como se muestra en la figura 14. La zona de control 46 incluye anticuerpo de conejo anti-IgY de pollo inmovilizado 110. La zona de prueba 45 incluye NeutrAvidina inmovilizada 109 sobre la membrana de nitrocelulosa. El anticuerpo biotinilado 101 policlonal anti-VHS-1 y/o VHS-2 102 se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44. A pesar de que no se muestra en esta figura, el anticuerpo anti-VHS-1/VHS-2 102 podria secarse, como alternativa, aguas arriba o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. Anticuerpo de conejo anti-IgG de raton (H&L) 107 conjugado a peroxidasa de rabano picante (HRP) 108 se seca aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. Como alternativa, el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 107 conjugado a peroxidasa de rabano picante 108 se podria solapar con la zona de aplicacion de muestra 44 o estar ubicado aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. La almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 esta, preferiblemente, embebida con anticuerpo monoclonal de raton anti-gD 1&2 103 (anticuerpos monoclonales dirigidos contra la glucoproteina D del virus del herpes simple) conjugado a oro coloidal 104 y mezclada con IgY de pollo 105 conjugada a perlas de latex tenidas de color azul 106, que sirve como control.
La muestra se toma sobre un hisopo de la muestra 35, que se coloca a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44 a traves de la ventana de la muestra 81 (en realizaciones con una carcasa y una ventana de la muestra) o justo sobre la zona de aplicacion de muestra 44. El compresor de muestras 30 es comprimido a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44. La punta absorbente del compresor de muestras 30 se sumerge, preferiblemente, en tampon de migracion durante aproximadamente 15 - 30 segundos antes de retirar el compresor de muestras 30. Las figuras 15A y 15B muestran los diferentes complejos que se forman entre los reactivos de prueba y el analito. Si el VHS (el analito 40) se encuentra presente en la muestra, se compleja con el anticuerpo biotinilado 101 policlonal anti-VHS1/2 102 y el anticuerpo monoclonal de raton anti-gD1&2 103 conjugado a oro coloidal 104, que se compleja con el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 107 conjugado con HRP 108.
Si el VHS no se encuentra presente en la muestra, el anticuerpo monoclonal de raton anti-gD1&2 103 conjugado a oro coloidal 104 aun se compleja con el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 107 conjugado con HRP 108, pero estos no se complejan con la muestra o el anticuerpo biotinilado 101 policlonal anti-VHS1/2 102. El anticuerpo biotinilado 101 policlonal anti-VHS1/2 102 se unira a neutravidina 109 en la zona de prueba 45, independientemente de si el VHS esta o no presente en la muestra. No obstante, si no hay VHS presente, el anticuerpo biotinilado 101 policlonal anti-VHS 1/2 102 no sera visible en la linea de prueba. El resultado se lee visualmente en aproximadamente diez minutos. Si una linea de prueba de color rojo visible se forma junto con la linea de control de color azul, el resultado indica niveles elevados de VHS en la muestra. Si, al cabo de 10 minutos, no hay ninguna linea de color rojo visible en la linea de prueba, entonces una gota del sustrato enzimatico TMBM (u otro sustrato para peroxidasa de rabano picante) se anade en la linea de prueba. Si la adicion del TMBM da como resultado una iinea de prueba de color azul / purpura, el resultado indica una muestra positiva debil. Una linea de color azul en la linea de control indica que la IgY de pollo 105 conjugada a las perlas de latex tenidas de color azul 106 se ha unido al anticuerpo de conejo anti-IgY de pollo 110 en la zona de control 46 y que la prueba se ha realizado correctamente. La figura 15C muestra el complejo que se forma en la zona de control.
En la presente realizacion, la prueba de diagnostico analitico inmediato se convierte en ligada a enzimas y la amplificacion depende de la cantidad de enzima y sustrato, y se incrementa con el tiempo. Esto no ocurre en conjugados marcados visualmente a nanoparticulas como oro coloidal o microesferas como perlas de latex. Ademas, el resultado de la linea de prueba no se debe a inmunoensayo antigeno-anticuerpo alguno, sino a un ensayo de union entre un ligando y un receptor tal como neutravidina y biotina. La union en la linea de prueba no es debida a union inmunologica sino a union quimica. Por lo tanto, esto no es un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA o EIA). En su lugar, es una cromofiltografia ligada a enzimas, o cromofiltografia enzimatica de multiples planos directa cuando se usa con un compresor de muestras. Incluso con una etapa adicional de anadir el sustrato enzimatico a la linea de prueba, la prueba sigue siendo sencilla de realizar.
En una realizacion de apilamiento alternativa, mostrada en las figuras 16, 17A, y 17B, una enzima esta unida fisicamente al marcador detectable sobre tanto el conjugado como el resto de apilamiento. En un ejemplo, la enzima reviste perlas detectables visiblemente (por ejemplo, perlas de latex de color rojo) y esta conjugada a un anticuerpo de conejo anti-raton. A pesar de que la peroxidasa de rabano picante se usa a menudo para amplificar una senal debil, se podrian usar, como alternativa, otras enzimas que intensifican senales debiles incluyendo, pero sin limitarse a, fosfatasa alcalina, catalasa, ureasa y glucosa oxidasa. Analogamente, se podrian usar como alternativa otros anticuerpos que se unen al conjugado o un intermediario. No hay nanoparticulas o microesferas en la presente realizacion. En su lugar, la presente realizacion incluye una forma “soluble" del conjugado. La ubicacion en la que se seca este conjugado enzimatico puede variar; se puede encontrar aguas arriba, aguas abajo o solapandose con la zona de aplicacion de muestra. En algunas realizaciones con un compresor de muestras, el conjugado enzimatico
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podria estar, como alternativa, sobre el compresor de muestras. El conjugado enzimatico se seca, preferiblemente, sobre la tira reactiva, pero no se inmoviliza. Puede estar ubicado en solitario o en combination con otros componentes que forman el “sandwich" con el anticuerpo que esta, preferiblemente, biotinilado.
La figura 16 muestra una realization de un detector con una enzima unida fisicamente al marcador detectable sobre tanto el conjugado como el resto de apilamiento. La zona de control 46 incluye un primer socio de union de control inmovilizado 110, de forma similar al detector mostrado en la figura 14. La zona de prueba 45 incluye un primer socio de union a la zona de prueba inmovilizado 209 sobre una membrana. Un primer socio de union al analito 202 conjugado a un segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 201 se seca o se incorpora de otro modo (por ejemplo, se liofiliza) en la zona de aplicacion de muestra 44. A pesar de que no se muestra en esta figura, el primer socio de union al analito 202 podria estar ubicado, como alternativa, aguas arriba o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44.
Un socio de union 207 para un segundo socio de union al analito 203, que esta conjugado a una enzima 208 y conjugado a un marcador detectable 215 (que tambien esta conjugado a la enzima 208), esta preferiblemente embebido en la almohadilla 33 del compresor de muestras 30. En otras realizaciones, hay solo un socio de union 207 para el segundo socio de union al analito 203 conjugado a un marcador detectable 215, y el marcador detectable tambien esta conjugado a la enzima 208. En algunas realizaciones, la enzima 208 esta conjugada al marcador detectable 215 revistiendo el marcador detectable 215. En algunas realizaciones, el socio de union 207 conjugado a la enzima 208 mas el socio de union 207 conjugado al marcador detectable 215 (que tambien esta conjugado a la enzima 208) podria estar ubicado sobre la tira reactiva, solapandose con la zona de aplicacion de muestra 44 o estando ubicado aguas abajo o aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. La almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien esta preferiblemente embebida con el segundo socio de union al analito 203 conjugado a un marcador detectable 204 revestido con la enzima 208 que, preferiblemente, se mezcla con un segundo socio de union de control 105 conjugado a un marcador detectable 106 (mostrado en la figura 14), que sirve como control.
A pesar de que la figura 16 muestra los diferentes reactivos en ciertas ubicaciones sobre la tira reactiva o el compresor de muestras 30, otras ubicaciones para cada uno del primer socio de union al analito 202 conjugado al segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 201, el socio de union 207 conjugado a la enzima 208 mas el socio de union 207 conjugado al marcador detectable 215 revestido con la enzima, y el segundo socio de union de control 105 conjugado al marcador detectable 106, sobre la tira reactiva y/o sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30 tambien son posibles. Otras realizaciones no requieren un compresor de muestras 30. En las presentes realizaciones, los reactivos 201, 202, 203, 204, 105, 106, 207, 208 y 215 estaran ubicados en diversas ubicaciones, preferiblemente aguas arriba de la zona de prueba 45, sobre la tira reactiva.
La muestra se toma sobre un hisopo de la muestra 35, que se coloca a continuation sobre la zona de aplicacion de muestra 44 a traves de la ventana de la muestra 81 (en realizaciones con una carcasa y una ventana de la muestra) o justo sobre la zona de aplicacion de muestra 44. El compresor de muestras 30 es comprimido a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44. La punta absorbente del compresor de muestras 30 se sumerge, preferiblemente, en tampon de migration durante aproximadamente 15 - 30 segundos antes de retirar el compresor de muestras 30. Las figuras 17A a 17B muestran los diferentes complejos que se forman entre los reactivos de prueba y el analito. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, se compleja con el primer socio de union al analito 202 y el segundo socio de union al analito 203. El segundo socio de union al analito tambien se compleja con el socio de union 207.
Si el analito 40 no se encuentra presente en la muestra, el segundo socio de union al analito 203 aun se compleja con el socio de union 207, pero estos no se complejan con la muestra o el primer socio de union al analito 202. El segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 201 se unira al primer socio de union a la zona de prueba 209 en la zona de prueba 45, independientemente de si el analito 40 esta o no presente en la muestra. No obstante, si no hay analito 40 presente, el segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 201 conjugado al primer socio de union al analito 202 y complejado con el primer socio de union a la zona de prueba 209 no sera visible en la linea de prueba. El resultado se lee visualmente en aproximadamente diez minutos. Si se forma una linea de prueba visible junto con una linea de control visible, el resultado indica niveles elevados de analito en la muestra. Si, al cabo de 10 minutos, no hay ninguna linea visible en la linea de prueba, entonces una gota del sustrato enzimatico se anade en la linea de prueba. Si la adicion del sustrato enzimatico da como resultado una linea de prueba visible, el resultado indica una muestra positiva debil. Una linea visible en la linea de control indica que el segundo socio de union de control 105 se ha unido al primer socio de union de control 110 en la zona de control 46 y que la prueba se ha realizado correctamente. El complejo de la linea de control se muestra en la figura 15C.
En la presente realizacion, la enzima esta unida fisicamente al marcador detectable (por ejemplo, perlas de latex) y se mueve con el marcador detectable. Por lo tanto, la especificidad y los problemas con el fondo mejoran. A niveles elevados de antigeno, un resultado positivo es facilmente detectable de forma visible mediante una linea visible. A niveles muy bajos, el sustrato enzimatico se anade a la ventana de resultados para conseguir una reaction de color amplificada por enzimas. Depositando muchos de los reactivos, incluyendo el socio de union 207, que incluye la enzima 208 y el marcador detectable 215, sobre el compresor de muestras, estos reactivos no se encuentran sobre
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la tira. En algunas realizaciones preferidas, el segundo socio de union al analito 203 se puede mezclar previamente con el socio de union 207 (con o sin el socio de union marcado con enzimas) y estar embebido en la almohadilla de compresor de muestras. En las presentes realizaciones, la tira reactiva incluye el segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 202, que se une al primer socio de union a la zona de prueba 209. Esto convierte a la tira reactiva en un ensayo de union y no un inmunoensayo.
Como un ejemplo, un detector del virus del herpes simple (VHS) incluye las siguientes secciones, tal como se muestra en la figura 16. La zona de control 46 incluye un anticuerpo de conejo anti-IgY de pollo inmovilizado 110, de forma similar al detector mostrado en la figura 14. La zona de prueba 45 incluye NeutrAvidina inmovilizada 209 sobre la membrana de nitrocelulosa. Un anticuerpo biotinilado 201 policlonal anti-VHS-1 y/o VHS-2 202 se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44. A pesar de que no se muestra en esta figura, el anticuerpo anti-VHS-1/VHS-2 202 podria secarse, como alternativa, aguas arriba o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. Anticuerpo de conejo anti-IgG de raton (H&L) 207 conjugado a peroxidasa de rabano picante (HRP) 208 mas anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 207 conjugado a perlas de latex de color rojo 215 revestidas con peroxidasa de rabano picante y esta preferiblemente embebido en la almohadilla 33 del compresor de muestras 30. En otras realizaciones, solo existe anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 207 conjugado a perlas de latex de color rojo 215 revestidas con peroxidasa de rabano picante. Como alternativa, el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 207 conjugado a peroxidasa de rabano picante 208 mas anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 207 conjugado a perlas de latex de color rojo 215 revestidas con peroxidasa de rabano picante podria estar ubicado sobre la tira reactiva, que se solapa con la zona de aplicacion de muestra 44 o que esta ubicado aguas abajo o aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. La almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 esta, preferiblemente, tambien embebida con anticuerpo monoclonal de raton anti-gD 1&2 203 (anticuerpos monoclonales dirigidos contra la glucoproteina D del virus del herpes simple) conjugado a perlas de latex de color rojo 204 revestidas con peroxidasa de rabano picante y mezclado con IgY de pollo 105 conjugada a perlas de latex tenidas de color azul 106 (mostradas en la figura 14), que sirve como control.
La muestra se toma sobre un hisopo de la muestra 35, que se coloca a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44 a traves de la ventana de la muestra 81 (en realizaciones con una carcasa y una ventana de la muestra) o justo sobre la zona de aplicacion de muestra 44. El compresor de muestras 30 es comprimido a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44. La punta absorbente del compresor de muestras 30 se sumerge preferiblemente en tampon de migracion durante aproximadamente 15 - 30 segundos antes de retirar el compresor de muestras 30. Las figuras 17A y 17B muestran los diferentes complejos que se forman entre los reactivos de prueba y el analito. Si el VHS (el analito 40) se encuentra presente en la muestra, se compleja con el anticuerpo biotinilado 201 policlonal anti-VHS1/2 202 y el anticuerpo monoclonal de raton anti-gD1&2 203 conjugado a perlas de latex de color rojo 204, que se compleja con el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 207 conjugado con HRP 208 y el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 207 conjugado a perlas de latex de color rojo 215 revestidas con peroxidasa de rabano picante.
Si el VHS no se encuentra presente en la muestra, el anticuerpo monoclonal de raton anti-gD1&2 203 conjugado a las perlas de latex de color rojo 204 aun se compleja con el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 207, pero estos no se complejan con la muestra o el anticuerpo biotinilado 201 policlonal anti-VHS1/2 202. El anticuerpo biotinilado 201 policlonal anti-VHS1/2 202 se unira a NeutrAvidina 209 en la zona de prueba 45, independientemente de si el VHS esta o no presente en la muestra. No obstante, si no hay VHS presente, el anticuerpo biotinilado 201 policlonal anti-VHS 1/2 202 no sera visible en la linea de prueba. El resultado se lee visualmente en aproximadamente diez minutos. Si una linea de prueba de color rojo visible se forma junto con la linea de control de color azul, el resultado indica niveles elevados de VHS en la muestra. Si, al cabo de 10 minutos, no hay ninguna linea de color rojo visible en la linea de prueba, entonces una gota del sustrato enzimatico TMBM (u otro sustrato para peroxidasa de rabano picante) se anade en la linea de prueba. Si la adicion del TMBM da como resultado una linea de prueba de color azul / purpura, el resultado indica una muestra positiva debil. Una linea de color azul en la linea de control indica que la IgY de pollo 105 conjugada a las perlas de latex tenidas de color azul 106 se ha unido al anticuerpo de conejo anti-IgY de pollo 110 en la zona de control 46 y que la prueba se ha realizado correctamente. El complejo de la linea de control se muestra en la figura 15C.
En este ejemplo, anticuerpo de conejo anti-raton se conjuga a la enzima, que tambien se conjuga a las perlas de latex de color rojo, un anticuerpo de conejo anti-raton adicional se conjuga directamente a las mismas perlas. La enzima esta unida fisicamente a las perlas y se mueve con las perlas. Por lo tanto, la especificidad y los problemas con el fondo mejoran. A niveles elevados de antigeno, un resultado positivo es facilmente detectable de forma visible mediante una linea de color rojo. A niveles muy bajos, el sustrato enzimatico se anade a la ventana de resultados para conseguir una reaccion de color amplificada por enzimas.
Al depositar el anticuerpo de conejo anti-raton conjugado a las perlas de color rojo (junto con el conjugado enzimatico sobre la misma perla) sobre el compresor de muestras, estos reactivos no se encuentran sobre la tira. En algunas realizaciones preferidas, el anticuerpo monoclonal de raton anti-gD 1&2 libre se puede mezclar previamente con el anticuerpo de conejo anti-raton (con o sin el anticuerpo de conejo anti-raton marcado con enzimas) y embeberse en la almohadilla de compresor de muestras. En las presentes realizaciones, la tira reactiva incluye biotina que se une a neutravidina. Esto convierte a la tira reactiva en un ensayo de union y no un inmunoensayo.
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Las figuras 18, 19A, y 19B muestran otra realizacion de apilamiento de la presente invencion. En la presente realizacion, una enzima se conjuga / se une fisicamente a un marcador detectable sobre el resto de apilamiento y el conjugado que se une al analito no incluye un marcador detectable. La presente realizacion incrementa adicionalmente la especificidad. En un ejemplo, la enzima reviste perlas detectables visiblemente (por ejemplo, perlas de latex de color rojo) y se conjuga a un anticuerpo de conejo anti-raton. A pesar de que a menudo se usa peroxidasa de rabano picante para amplificar una senal debil, se podrian usar, como alternativa, otras enzimas que intensifican senales debiles incluyendo, pero sin limitarse a, fosfatasa alcalina, catalasa, ureasa y glucosa oxidasa. Analogamente, se podrian usar como alternativa otros anticuerpos que se unen al conjugado o un intermediario. No hay nanoparticulas o microesferas en la presente realizacion. En su lugar, la presente realizacion incluye una forma “soluble" del conjugado. La ubicacion en la que se seca este conjugado enzimatico puede variar; se puede encontrar aguas arriba, aguas abajo o solapandose con la zona de aplicacion de muestra. En algunas realizaciones con un compresor de muestras, el conjugado enzimatico podria estar, como alternativa, sobre el compresor de muestras. El conjugado enzimatico se seca, preferiblemente, sobre la tira reactiva, pero no se inmoviliza. Puede estar ubicado en solitario o en combinacion con otros componentes que forman el “sandwich" con el anticuerpo (que esta, preferiblemente, biotinilado).
Una realizacion de un detector con enzima conjugada / unida fisicamente a un marcador detectable sobre el resto de apilamiento y un conjugado que se une al analito que no incluye un marcador detectable se muestra en la figura 18. La zona de control 46 incluye un primer socio de union de control inmovilizado 110, de forma similar al detector mostrado en la figura 14. La zona de prueba 45 incluye un primer socio de union a la zona de prueba inmovilizado 309 sobre una membrana. Un primer socio de union al analito 302 conjugado a un segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 301 se seca o se incorpora de otra manera (por ejemplo, se liofiliza) en la zona de aplicacion de muestra 44. A pesar de que no se muestra en esta figura, el primer socio de union al analito 302 podria estar, como alternativa, ubicado aguas arriba o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. Una mezcla de un socio de union 307 para el segundo socio de union al analito 303 conjugado a una enzima 308 y el socio de union 307 conjugado a un marcador detectable 315 (por ejemplo, perlas de latex) revestidas o conjugadas de otro modo a la enzima 308 esta, preferiblemente, embebido en la almohadilla 33 del compresor de muestras 30. En otras realizaciones, solo existe el socio de union 307 conjugado al marcador detectable 315, que tambien se conjuga a la enzima 308 (por ejemplo, mediante la enzima que reviste las perlas de latex). A pesar de que el socio de union 307 conjugado a la enzima y el socio de union 307 conjugado al marcador detectable 315 revestido con la enzima se muestra sobre el compresor de muestras 30 en esta figura, estos componentes podrian estar, como alternativa, ubicados sobre la tira reactiva, solapandose con la zona de aplicacion de muestra 44 o estando ubicados aguas abajo o aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. La almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien esta, preferiblemente, embebida con un segundo socio de union al analito 303. A diferencia de en las realizaciones anteriores, el segundo socio de union al analito 303 no esta conjugado a un marcador detectable o una enzima. En algunas realizaciones, el segundo socio de union al analito 303 se mezcla, preferiblemente, con el segundo socio de union de control 105 conjugado al marcador detectable 106 (mostrada en la figura 14), que sirve como control.
A pesar de que la figura 18 muestra los diferentes reactivos en ciertas ubicaciones sobre la tira reactiva o el compresor de muestras 30, tambien son posibles otras ubicaciones para cada uno del primer socio de union al analito 302 conjugado al segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 301, la mezcla del socio de union 307 para el segundo socio de union al analito 303 conjugado a una enzima 308 y el socio de union 307 conjugado a un marcador detectable 315 revestido o conjugado de otro modo a la enzima 308, el segundo socio de union al analito 303 y el segundo socio de union de control 105 conjugado a un marcador detectable 106, sobre la tira reactiva y/o sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30. Otras realizaciones no requieren un compresor de muestras 30. En las presentes realizaciones, los reactivos 301, 302, 303, 304, 105, 106, 307, 308 y 315 estaran ubicados en diversas ubicaciones, preferiblemente aguas arriba de la zona de prueba 45, sobre la tira reactiva.
La muestra se toma sobre un hisopo de la muestra 35, que se coloca a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44 a traves de la ventana de la muestra 81 (en realizaciones con una carcasa y una ventana de la muestra) o justo sobre la zona de aplicacion de muestra 44. El compresor de muestras 30 es comprimido a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44. La punta absorbente del compresor de muestras 30 se sumerge preferiblemente en tampon de migracion durante aproximadamente 15 - 30 segundos antes de retirar el compresor de muestras 30. Las figuras 19A y 19B muestran los diferentes complejos que se forman entre los reactivos de prueba y el analito. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, se compleja con el primer socio de union al analito 302 y el segundo socio de union al analito 303. El segundo socio de union al analito 303 tambien se compleja con el socio de union 307.
Si el analito 40 no se encuentra presente en la muestra, el segundo socio de union al analito 303 aun se compleja con el socio de union 307, pero estos no se complejan con la muestra o el primer socio de union al analito 302. El segundo socio de union a la zona de prueba inmovilizado 301 se une al primer socio de union a la zona de prueba 309 en la zona de prueba 45, independientemente de si el analito esta o no presente en la muestra. No obstante, si no hay analito 40 presente, el complejo resultante no sera visible en la linea de prueba. El resultado se lee visualmente en aproximadamente diez minutos. Si se forma una linea de prueba visible junto con la linea de control visible, el resultado indica niveles elevados de analito 40 en la muestra. Si, al cabo de 10 minutos, no hay ninguna
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lmea visible en la lmea de prueba, entonces una gota de un sustrato enzimatico se anade en la lmea de prueba. Si la adicion del sustrato enzimatico da como resultado una linea de prueba visible, el resultado indica una muestra positiva debil. Una lmea visible en la linea de control indica que el segundo socio de union de control 105 conjugado al marcador detectable 106 se ha unido al primer socio de union de control 110 en la zona de control 46 y que la prueba se ha realizado correctamente. El complejo de la linea de control se muestra en la figura 15C.
En la presente realizacion, el socio de union 307 se conjuga a la enzima 308, que tambien se conjuga al marcador detectable 315 (por ejemplo, perlas de latex), y un socio de union adicional 307 se conjuga directamente al mismo marcador detectable 315. La enzima esta unida fisicamente al marcador detectable y se mueve con el marcador detectable. Por lo tanto, la especificidad y los problemas con el fondo mejoran. A niveles elevados de antigeno, un resultado positivo es facilmente detectable de forma visible mediante una linea visible. A niveles muy bajos, el sustrato enzimatico se anade a la ventana de resultados para conseguir una reaccion de color amplificada por enzimas.
Al depositar el socio de union 307 y sus otros componentes (308 y 315) sobre el compresor de muestras, estos reactivos no se encuentran sobre la tira. En algunas realizaciones preferidas, el segundo socio de union al analito 303 se puede mezclar previamente con el socio de union 307 (con o sin el socio de union marcado con enzimas 307) y embeberse en la almohadilla de compresor de muestras. En las presentes realizaciones, el dispositivo incluye socios de union tales como biotina y avidina. Esto convierte a la tira reactiva en un ensayo de union y no un inmunoensayo.
Como un ejemplo, un detector del virus del herpes simple (VHS) incluye las siguientes secciones, tal como se muestra en la figura 18. La zona de control 46 incluye anticuerpo de conejo anti-IgY de pollo inmovilizado 110, de forma similar al detector mostrado en la figura 14. La zona de prueba 45 incluye NeutrAvidina inmovilizada 309 sobre una membrana de nitrocelulosa. El anticuerpo biotinilado 301 policlonal anti-VHS-1 y/o VHS-2 302 se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44. A pesar de que no se muestra en esta figura, el anticuerpo anti-VHS-1/VHS-2 302 podria estar ubicado, como alternativa, aguas arriba o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra. Anticuerpo de conejo anti-IgG de raton (H&L) 307 conjugado a peroxidasa de rabano picante (HRP) 308 mas anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 307 conjugado a perlas de latex de color rojo 315 revestidas con peroxidasa de rabano picante esta preferiblemente embebido en la almohadilla 33 del compresor de muestras. En otras realizaciones, solo hay anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 307 conjugado a perlas de latex de color rojo 315 revestidas con peroxidasa de rabano picante. Como alternativa, el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 307 conjugado a peroxidasa de rabano picante 308 mas anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 307 conjugado a perlas de latex de color rojo revestidas con peroxidasa de rabano picante 308 podrian estar ubicados sobre la tira reactiva, solapandose con la zona de aplicacion de muestra 44 o estando ubicados aguas abajo o aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44. La almohadilla sobre el compresor de muestras 30 tambien esta, preferiblemente, embebida con anticuerpo monoclonal de raton anti-gD 1&2 libre 303. A diferencia de en la realizaciones anteriores, los anticuerpos monoclonales de raton libres 303 no estan conjugados a un marcador detectable o una enzima. Los anticuerpos monoclonales de raton libres 303 se mezclan preferiblemente con IgY de pollo 105 conjugada a perlas de latex tenidas de color azul (mostradas en la figura 14), que sirve como control.
La muestra se toma sobre un hisopo de la muestra 35, que se coloca a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44 a traves de la ventana de la muestra 81 (en realizaciones con una carcasa y una ventana de la muestra) o justo sobre la zona de aplicacion de muestra 44. El compresor de muestras 30 es comprimido a continuacion sobre la zona de aplicacion de muestra 44. La punta absorbente del compresor de muestras 30 se sumerge, preferiblemente, en tampon de migracion durante aproximadamente 15 - 30 segundos antes de retirar el compresor de muestras 30. Las figuras 19A y 19B muestran los diferentes complejos que se forman entre los reactivos de prueba y el analito. Si el VHS (el analito 40) se encuentra presente en la muestra, se compleja con el anticuerpo biotinilado 301 policlonal anti-VHS1/2 302 y el anticuerpo monoclonal de raton anti-gD 1 &2 303, que se compleja con el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 307 conjugado con HRP 308 y el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 307 conjugado a perlas de latex de color rojo 315 revestidas con peroxidasa de rabano picante.
Si el VHS no se encuentra presente en la muestra, el anticuerpo monoclonal de raton anti-gD1&2 303 aun se compleja con el anticuerpo de conejo anti-IgG de raton 307, pero estos no se complejan con la muestra o el anticuerpo biotinilado 301 policlonal anti-VHS1/2 302. El anticuerpo biotinilado 301 policlonal anti-VHS1/2 202 se unira a neutravidina 309 en la zona de prueba 45, independientemente de si el VHS esta o no presente en la muestra. No obstante, si no hay VHS presente, el anticuerpo biotinilado 301 policlonal anti-VHS 1/2 302 no sera visible en la linea de prueba. El resultado se lee visualmente en aproximadamente diez minutos. Si una linea de prueba de color rojo visible se forma junto con la linea de control de color azul, el resultado indica niveles elevados de VHS en la muestra. Si, al cabo de 10 minutos, no hay ninguna linea de color rojo visible en la linea de prueba, entonces una gota del sustrato enzimatico TMBM (u otro sustrato para peroxidasa de rabano picante) se anade en la linea de prueba. Si la adicion del TMBM da como resultado una linea de prueba de color azul / purpura, el resultado indica una muestra positiva debil. Una linea de color azul en la linea de control indica que la IgY de pollo 105 conjugada a las perlas de latex tenidas de color azul 106 se ha unido al anticuerpo de conejo anti-IgY de pollo 110 en la zona de control 46 y que la prueba se ha realizado correctamente. El complejo de la linea de control se muestra en la figura 15C.
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Al depositar el anticuerpo de conejo anti-raton conjugado a las perlas de color rojo (junto con el conjugado enzimatico sobre la misma perla) sobre el compresor de muestras, estos reactivos no se encuentran sobre la tira. En algunas realizaciones preferidas, el anticuerpo monoclonal de raton anti-gD 1&2 libre se puede mezclar previamente con el anticuerpo de conejo anti-raton (con o sin el anticuerpo de conejo anti-raton marcado con enzimas) y embeberse en la almohadilla de compresor de muestras. En las presentes realizaciones, el dispositivo incluye socios de union tales como biotina y avidina. Esto convierte a la tira reactiva en un ensayo de union y no un inmunoensayo.
En algunas realizaciones preferidas, la nitrocelulosa esta “bloqueada” con bloqueantes, lo que incrementa la especificidad de la reaccion. Algunos ejemplos para bloqueantes incluyen, pero sin limitarse a, caseina y albumina de suero bovino (BSA). En cuanto se bloquea la membrana de nitrocelulosa, la carga inherente de la nitrocelulosa se neutraliza y, por lo tanto, ninguna proteina adicional se puede unir a la membrana bloqueada. Ademas, la estructura cromatografica se cambia y el flujo es mas como un flujo deslizante o resbaladizo en lugar de cromatografia tradicional. El resultado es un proceso de cromofiltografia unico.
La figura 21A muestra otra realizacion de una tira reactiva de flujo lateral con elementos intensificadores. La presente realizacion preferiblemente incluye un socio de union marcado 407 que es especifico para una especie en lugar de un analito 40. Como un ejemplo, cuando el socio de union 402 para el analito es un anticuerpo de raton, el socio de union especifico de especie marcado 407 es un anticuerpo anti-raton. Como otro ejemplo, cuando el socio de union 402 para el analito es un anticuerpo de conejo, el socio de union especifico de especie marcado 407 es un anticuerpo anti-conejo. Los expertos en la materia entenderian que cualquier socio de union especifico de especie 407, u otro socio de union no especifico para el analito 40 pero especifico para un socio de union 402 para el analito, se podria usar en la presente realizacion. Los expertos en la materia tambien sabrian como seleccionar especies para reducir al minirno reacciones cruzadas.
La zona de aplicacion de muestra 44 incluye un primer socio de union 402 para el analito 40. Notese que el primer socio de union 402 no incluye un marcador detectable. En la presente realizacion, parte del primer socio de union 402 esta preferiblemente marcada 401 y un socio de union 409 para la marca 401 esta preferiblemente marcado con un marcador detectable. En algunas realizaciones preferidas, la cantidad del primer socio de union 402 que esta marcado 401 es del 1 - 10 % de la cantidad total del primer socio de union 402 en la prueba.
La zona de aplicacion de muestra 44 tambien incluye un socio de union especifico de especie marcado 407 (conjugado a un marcador detectable 417) que se une al primer socio de union 402 debido a la especie del primer socio de union 402. La zona de aplicacion de muestra 44 tambien incluye, preferiblemente, un socio de union de control 405 marcado 415. A pesar de que el primer socio de union 402 para el analito 40, el conjugado que incluye un marcador visible 417 y un socio de union especifico de especie 407, y el conjugado de control 405 conjugado a un marcador visible 415 se muestran en la zona de aplicacion de muestra 44 en esta figura, cualquier combinacion de estos elementos puede estar ubicada en otras ubicaciones sobre la tira reactiva (aguas arriba, aguas abajo o solapandose con la zona de aplicacion de muestra) o sobre un compresor de muestras 30, tal como se ha descrito en algunas realizaciones anteriores.
La zona de prueba 45 incluye un segundo socio de union inmovilizado 427 para el analito 40. La zona de control 46 incluye un socio de union inmovilizado 420 para el socio de union de control 405. La zona de prueba 45 y la zona de control 46 estan, preferiblemente, ubicadas sobre una membrana de nitrocelulosa.
Cuando una muestra que incluye analito 40 se anade a la tira reactiva, el primer socio de union 402 se une al analito 40 y forma “medio sandwich”. Esto se produce preferiblemente sin flujo sobre la tira reactiva. Cuando se aplica tampon de migracion, este moviliza el “medio sandwich”. El tampon de migracion tambien moviliza al socio de union especifico de especie 407. Durante el flujo, el socio de union especifico de especie 407 interactua con y se une al primer socio de union 402 en el medio sandwich. Debido a multiples sitios de union sobre el primer socio de union 402, existe un efecto de agregacion o apilamiento que intensifica la deteccion del analito 40. En la zona de prueba 45, el analito 40, que es ahora parte de un complejo agregado o apilado, se une al segundo socio de union inmovilizado 427 para formar el sandwich completo. El resultado es una senal visible intensificada formada en la zona de prueba 45. La union entre el socio de union de control 405 y el socio de union de control inmovilizado 420 da como resultado una senal detectable 415.
En presencia del analito 40, la senal detectable 417 conjugada al socio de union especifico de especie 407 es parte del complejo y ha de ser visible. Si una linea de prueba visible es “leida” por el usuario, la prueba es registrada como un resultado positivo para la presencia del analito 40. Si la linea de prueba no es visible o es equivoca, entonces una o mas gotas de un fluido que incluye un socio de union a una marca 409 para la marca 401 conjugado a un
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marcador detectable (por ejemplo, oro coloidal o perlas de latex) se anaden en la zona de prueba 45. El socio de union a una marca 409 se une instantaneamente a la marca 401 sobre el primer socio de union 402. Esto intensifica en gran medida la visibilidad de la linea de prueba en presencia del analito 40. En ausencia del analito, el socio de union a una marca 409 se disipa y no hay ninguna linea de prueba visible.
La figura 21B muestra un complejo apilado en la linea de prueba cuando el analito 40 se encuentra presente en la muestra. La figura 21C muestra el complejo apilado con la adicion de las marcas 401 y 409.
En un ejemplo de la realizacion mostrada en las figuras 21A a 21C para detectar el virus del herpes simple (VHS), la zona de aplicacion de muestra 44 incluye anticuerpo para gD 1&2 de VHS de raton libre 402 (que se une a VHS), asi como algo de anticuerpo para gD1&2 de VHS de raton 402 biotinilado 401. En una realizacion preferida, aproximadamente 1 - 10 % del anticuerpo para gD1&2 de VHS libre 402 esta biotinilado 401.
La zona de aplicacion de muestra 44 tambien incluye anticuerpo de conejo anti-raton 407 conjugado a perlas de latex de color rojo 417 y un anticuerpo para IgY de pollo de control 405 conjugado a perlas de latex de color azul 415. Notese que el anticuerpo de conejo anti-raton 407 no es especifico para un analito 40. En su lugar, se une especificamente al anticuerpo para gD1&2 de VHS de raton 402. Tal como se ha descrito en lo que antecede, cualquiera del anticuerpo para gD1&2 de VHS 402, el anticuerpo para gD1&2 de VHS 402 biotinilado 401, el anticuerpo de conejo anti-raton conjugado a las perlas de latex de color rojo, el anticuerpo para IgY de pollo conjugado a perlas de latex de color azul, o cualquier combinacion de estos elementos, puede estar, como alternativa, aguas arriba, aguas abajo o solapandose con la zona de aplicacion de muestra 44, o estar incluido sobre un compresor de muestras 30 en algunas realizaciones en las que se usa un compresor de muestras 30. La zona de prueba 45 incluye anticuerpo de conejo anti-VHS inmovilizado 427, que se une al analito VHS 40 cuando se encuentra presente en la muestra. La zona de control 46 incluye anticuerpo de conejo anti-IgG de pollo / conejo inmovilizado 420. La zona de prueba 45 y la zona de control 46 estan ubicadas, preferiblemente, sobre una membrana de nitrocelulosa.
Cuando una muestra que incluye el analito 40 se anade a la tira reactiva, el anticuerpo para gD1&2 de VHS 402 se une al analito VHS 40 y forma “medio sandwich". Esto se produce sin flujo sobre la tira reactiva. Cuando se aplica tampon de migracion, moviliza el “medio sandwich". El tampon de migracion tambien moviliza el anticuerpo de conejo anti-raton 407. Durante el flujo, el anticuerpo de conejo anti-raton 407 interactua con y se une al anticuerpo para gD1&2 de VHS 402 en el medio sandwich. Debido a multiples sitios de union sobre el anticuerpo de raton 402, existe un efecto de agregacion o apilamiento que intensifica la deteccion del analito 40. En la zona de prueba 45, el analito complejo agregado o apilado 40, que es ahora parte de un complejo agregado o apilado, se une al anticuerpo de conejo anti-VHS inmovilizado 427 para formar el sandwich completo. El resultado es una senal visible intensificada que se forma en la zona de prueba 45. La union se produce entre el conjugado a IgY de pollo de control 405 y el anticuerpo de conejo anti-IgG de pollo / conejo inmovilizado 420, dando como resultado un marcador detectable de color azul 415.
En presencia del analito 40, las perlas de latex de color rojo 417 conjugadas al anticuerpo de conejo anti-raton 407 son parte del complejo y han de ser visibles. Si una linea de prueba visible es “leida" por el usuario, la prueba se registra como un resultado positivo para la presencia del analito 40. Si la linea de prueba no es visible o es equivoca, entonces una gota de avidina, neutravidina o estreptavidina conjugada 409 a oro coloidal o perlas de latex se anade en la zona de prueba 45. El conjugado de avidina, neutravidina o estreptavidina 409 se une instantaneamente a la biotina 401 sobre el anticuerpo para gD1&2 de VHS 402. Esto intensifica en gran medida la visibilidad de la linea de prueba en presencia del analito 40. En ausencia del analito, el conjugado a avidina, estreptavidina o neutravidina 409 se disipa y no hay ninguna linea de prueba visible.
En algunas realizaciones, en lugar de una membrana de nitrocelulosa, se pueden usar membranas tales como de nailon o poliester que son neutras. En las presentes realizaciones, las proteinas tales como neutravidina, anticuerpos y antigenos no estan inmovilizadas directamente. En su lugar, estan conjugadas a microesferas que se “depositan" en la membrana y se mantienen en sus grietas. A pesar de que se muestra el uso de una membrana neutra con respecto a la presente realizacion particular, se podrian usar, como alternativa, membranas neutras y microesferas depositadas sobre esas membranas, en otras realizaciones de la presente invencion.
La figura 13 muestra algunas ubicaciones preferidas de materiales de intensification de senales tanto para intensification con plata como apilamiento en algunas realizaciones de dispositivos de flujo lateral de la presente invencion. La figura 13 muestra de forma esquematica dos opciones para la ubicacion de la zona de deteccion, y en la figura se muestran solo los elementos especificos para la intensificacion de senales.
En algunas realizaciones con intensificacion con plata, la sal de plata 70 esta ubicada preferiblemente en una zona 90 entre la zona de aplicacion de muestra 44 y la zona de prueba 45 para permitir que al menos parte del sandwich se forme antes de la union a la sal de plata. Como alternativa, la sal de plata 70 se puede colocar sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, en la zona de aplicacion de muestra 44, en una zona 92 aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44, en el tampon de migracion 43 o directamente sobre la zona de prueba 45 despues de que el ensayo se ha realizado. En algunas realizaciones, el agente de revelado de plata 71 tambien esta
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ubicado en la zona 90 entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de prueba. En otras realizaciones, el agente de revelado de plata 71 esta ubicado en la zona 92 aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44, en el tampon de migracion 43, sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, o directamente sobre la zona de prueba 45 despues de que el ensayo se ha realizado.
En algunas realizaciones con apilamiento, el primer conjugado 72 puede estar ubicado sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, en la zona de aplicacion de muestra 44, en una zona 92 aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44, o en una zona 90 aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra. Como alternativa, el primer conjugado 72 se puede mezclar previamente con la muestra antes de la aplicacion a la zona de aplicacion de muestra; en la presente realizacion, el medio sandwich se forma fuera del dispositivo de ensayo. El segundo conjugado 74 esta ubicado, preferiblemente, en una zona 92 aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra. Como alternativa, el segundo conjugado 74 puede estar ubicado sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30. Como alternativa, el segundo conjugado 74 puede estar en una ubicacion en la que se puede retardar su alcance del primer conjugado 72, incluyendo, pero sin limitarse a, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba del conjugado o anadirse en un momento despues de que el ensayo ha comenzado, tal como en el tampon de migracion o directamente en la zona de prueba. A pesar de que no se prefiere, cualquiera o ambos del primer conjugado 72 o el segundo conjugado 74 podrian estar, como alternativa, ubicados en el tampon de migracion 43 (que no se muestra).
En algunas realizaciones, la amplification de senal puede incluir uno o mas componentes retardados en el tiempo encapsulados. Por ejemplo, uno cualquiera o ambos de los componentes de intensification de plata 70, 71 se pueden encapsular, tal como se muestra en las figuras 22A a 22C. En otra realizacion, el conjugado de apilamiento 74 se puede encapsular, tal como se muestra en la figura 23B. En aun otra realizacion, tanto el conjugado de apilamiento 74 como uno cualquiera o ambos de los componentes de intensificacion de plata 70, 71 se pueden encapsular. Cualquiera de los elementos de intensificacion de senal que se describen en las figuras 11 - 21 se puede encapsular. En otras realizaciones, cualquiera de los componentes del ensayo de flujo lateral se podria encapsular, para proporcionar un retardo de tiempo. Por ejemplo, el primer conjugado 72 se muestra como encapsulado en la figura 23A. A pesar de que no se prefiere la encapsulation del primer conjugado 72, esta figura representa la posibilidad de encapsular cualquiera de los componentes del ensayo, para crear un retardo de tiempo.
Los componentes encapsulados preferiblemente se pulverizan o se secan sobre la tira reactiva, a pesar de que tambien son posibles otros metodos de colocation sobre la tira reactiva. En algunas realizaciones preferidas, se colocan elementos de intensificacion encapsulados en la linea de prueba, o justo aguas arriba de la linea de prueba, a pesar de que tambien son posibles otras ubicaciones sobre la tira reactiva.
La plata 70 y/o el agente de revelado 71 se encapsulan y se colocan sobre el dispositivo de flujo lateral, preferiblemente o bien en forma seca o bien en solution. La plata encapsulada 70 y/o el agente de revelado encapsulado 71 estan preferiblemente incorporados en, pero no inmovilizados sobre, el dispositivo de flujo lateral. El material de encapsulacion 600 se disuelve mediante el tampon de migracion, preferiblemente despues de aproximadamente 5 minutos, liberando de ese modo la plata despues de que se haya formado el sandwich completo en la linea de prueba. En otra realizacion, la matriz de encapsulacion 600 puede contener unos “sustratos” estrategicamente ubicados tales como peptidos sobre los cuales las proteasas pueden actuar y escindir, haciendo de este modo orificios en la matriz. Estas proteasas o agentes “liticos” se pueden encontrar en el tampon de migracion. En lugar de proteasas, hay agentes liticos tales como sales que se acumulan lentamente y rompen de forma selectiva la matriz de encapsulacion 600. La liberation de los componentes encapsulados (liberation temporalizada o liberacion retardada) es o bien por la disolucion lenta del material de encapsulacion 600 o bien por “orificios de perforation” en la matriz de encapsulacion 600 a traves de los cuales las particulas o reactivos encapsulados escapan lentamente y fluyen hacia la linea de prueba en la que ya se ha formado o se esta formando el sandwich. Asimismo, en algunas realizaciones, algunos o la totalidad de los componentes retardados en el tiempo “se apilan” sobre el complejo de sandwich antes de que el complejo de sandwich se una a la linea de prueba y quede inmovilizado.
En algunas realizaciones, tanto la plata 70 como el agente de revelado 71 se pueden encapsular de forma conjunta, tal como se muestra en la figura 22C. En las presentes realizaciones, la plata 70 y el agente de revelado 71 estan preferiblemente separados como globulos independientes dentro de la encapsulacion 600. Los globulos se pueden romper a diferentes tasas. Por lo tanto cuando se rompe la encapsulacion 600, un globulo incluye la sal de plata 70 y un globulo separado incluye el agente de revelado 71. El globulo que incluye el agente de revelado 71 se puede romper a una velocidad menor que la sal de plata 70, o viceversa. A modo de analogia, imaginese un globo que contiene diferentes canicas de colores. El globo se puede romper, permitiendo que escapen las diferentes canicas de colores. Un tipo de canica encapsula la sal de plata y otro tipo de canica, que se rompe mas lento que la canica de sal de plata, encapsula el agente de revelado. En otras realizaciones, la plata y el agente de revelado se encapsulan por separado (veanse las figuras 22A y 22B), pero en la misma ubicacion sobre la tira reactiva. En aun otras realizaciones, la plata 70 y el agente de revelado 71 se encapsulan por separado (veanse las figuras 22A y 22B) en diferentes ubicaciones sobre la tira reactiva. En otras realizaciones, se encapsula solo uno de la plata 70 (vease la figura 22A) o el agente de revelado 71 (vease la figura 22B).
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De forma similar, el conjugado de apilamiento 74 se puede encapsular, tal como se muestra en la figura 23B, y colocarse sobre el dispositivo de flujo lateral o bien en forma seca o bien en solucion. En algunas realizaciones con anticuerpos, antigenos, u otros conjugados para amplificar la senal (aumentar el apilamiento), se podria usar la encapsulacion de estos componentes para la estructura de apilamiento secundaria. En algunas realizaciones preferidas, estos componentes, que en algunos ejemplos son anticuerpos o antigenos, preferiblemente se encapsulan en la linea de prueba, pero como alternativa pueden estar ubicados sobre otros lugares sobre la tira reactiva.
Cualquier componente de la tira reactiva, en particular aquellos que realizan operaciones secundarias (tales como amplificar senales) incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos, antigenos, peptidos y enzimas, se podria encapsular dentro del espiritu de la presente invencion. Ademas, se podria usar encapsulacion de elementos de intensificacion en combinacion con cualquiera de las realizaciones que se divulgan en el presente documento.
En la tecnica se conocen metodos de encapsulacion y microencapsulacion. Algunos metodos de encapsulacion incluyen, pero sin limitarse a, metodos de encapsulacion fisica tales como extrusion centrifuga, encapsulacion de nucleo de boquilla vibratoria, secado por pulverizacion o revestimiento de lecho fluido, o metodos de encapsulacion quimica tales como coacervacion, polimerizacion interfacial (policondensacion interfacial o reticulacion interfacial), polimerizacion in situ o polimerizacion matricial.
Como algunos ejemplos, la plata 70, el agente de revelado 71 y/o el conjugado de apilamiento 74 se pueden encapsular en diversas envolventes conformadas incluyendo, pero sin limitarse a, capsulas, perlas, microperlas, esferas, cristales y particulas. En algunas realizaciones preferidas, se usan productos de encapsulacion LipoTechnologies (LipoTechnologies, Inc., (Vandalia, OH)) (por ejemplo, productos de encapsulacion Lipocrystal™, productos de encapsulacion Liposphere™, productos de encapsulacion Lipopearl™, productos de encapsulacion Lipocapsule ™, productos de encapsulacion Lipobead™ y productos de encapsulacion Lipoparticle™).
En algunas realizaciones, los materiales 600 que se usan para la encapsulacion incluyen, pero sin limitarse a, celulosa o silice. La celulosa actua como una esponja, de tal modo que los componentes secados o humedos (tales como plata) se podrian secar sobre la celulosa. Las presentes realizaciones difieren de aquellas en las que la plata 70, el agente de revelado 71 o los conjugados de apilamiento 74 se encapsulan en solucion dentro de una esfera 610 u otra forma.
En otras realizaciones, los materiales que se usan para la encapsulacion incluyen, pero sin limitarse a, mezclas de esteres de colesterol, una matriz de polimero, una matriz de alginato, una matriz de agar, una matriz de gelatina, polioximetilen urea (PMU), metoximetil metilol melamina (MMM), lactosa, manitol, celulosa microcristalina, hidroxipropilmetilcelulosa, o cualquier combinacion de estos materiales. En algunas realizaciones que usan productos Lipoparticle™, el material se puede encapsular en un sustrato, incluyendo, pero sin limitarse a, ciclodextrina, nailon poroso, materiales a base de silice, o celulosa, y entonces encapsularse adicionalmente en otro recipiente de encapsulacion. En las presentes realizaciones, los ejemplos de principios activos incluyen, pero sin limitarse a, acido salicilico, tocoferol, mentol, triclosan, etilhexilo, metoxicinnamato y/o intensificadores de brillo optico. En algunas realizaciones, el recipiente de encapsulacion esta pigmentado.
A pesar de que los metodos y dispositivos se describen en el presente documento como ensayos en sandwich, los metodos y dispositivos de la presente invencion se pueden usar igualmente en ensayos competitivos. En estos ensayos competitivos, el conjugado preferiblemente incluye un analito o un analogo de analito, en lugar de un socio de union del analito, que esta unido a un marcador, o, como alternativa, el segundo socio de union se sustituye con un analito o un analogo de analito. Un resultado de prueba positivo se indica entonces por la falta de la presencia del marcador en la zona de prueba de la tira reactiva.
Las figuras 24 y 25 muestran algunas realizaciones de dispositivos de flujo lateral con una zona de desvio 500 en algunas realizaciones preferidas de la presente invencion.
Las figuras 24A y 24B muestran una realizacion con una zona de desvio 500 que incluye una barrera 510. El sistema incluye un compresor de muestras 30, un colector de muestras 535, y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). La tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de desvio 500, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. La tira reactiva preferiblemente tambien incluye un sustrato de soporte 48. Tal como se muestra en las figuras 24A y 24B, en algunas realizaciones, la porcion de recogida 560 del colector de muestras 535 es compacta, de tal modo que la misma concentra la muestra sobre el colector 560. La zona de desvio 500 incluye una barrera 510. En otras realizaciones, se podrian usar los colectores de muestras 35 que se muestran en las realizaciones previas. La barrera 510 es preferiblemente una membrana impermeable (o una membrana sustancialmente impermeable) que se puede fabricar de cualquier material que evite que el flujo de liquido continue fluyendo en el mismo plano. Algunos materiales para la barrera incluyen, pero sin limitarse a, plasticos, hidrocarburos o metal.
En la presente realizacion, la totalidad del sandwich (primer socio de union 37 - analito 40 - segundo socio de union 38) se forma en la zona de aplicacion de muestra 44. La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una
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marca inmovilizada 50 que se une a la marca 39 del segundo socio de union 38. En la presente realizacion, un primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36 y preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich. El segundo socio de union 38 en la presente realizacion preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva. El segundo socio de union 38 tambien incluye una marca 39. Como alternativa, el segundo socio de union 38 en la presente realizacion se puede encontrar en cualquier parte sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, y entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion. De forma similar, la zona de aplicacion de muestra 44 se puede encontrar aguas arriba de la zona de desvio 500, aguas abajo de la zona de desvio 500, o solapandose con o encima de la zona de desvio 500.
En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union de zona de control 61 con un marcador detectable. El socio de union de zona de control 61 se compleja con su socio de union 110 en la zona de control 46 cuando la prueba se ha realizado correctamente.
La zona de desvio 500 detiene por completo el flujo hasta que el compresor de muestras 30 se pone en contacto con el resto del dispositivo, y crea un puente a lo largo del cual puede fluir el fluido, tal como se muestra por medio de la linea de puntos 520 en la figura 24B. El compresor de muestras 30 actua como un puente y redirige el flujo a un plano diferente. El flujo se desvia hacia el compresor de muestras 30. Esto aumenta la recogida del primer socio de union 37 y el socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30. El fluido cambia de vuelta al plano lateral original en el extremo de la zona de desvio 500.
En otras realizaciones, el socio de union de zona de control 61 podria estar ubicado sobre la tira reactiva, por ejemplo aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, sobre la zona de aplicacion de muestra, o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra. En cualquiera de las realizaciones con un socio de union de zona de control 61, el socio de union de zona de control 61 no alcanzara la zona de control 46 a menos que el compresor de muestras 30 haya formado eficazmente el puente, permitiendo que el flujo continue mas alla de la barrera 510 (a medida que este se desplaza a traves del compresor de muestras 30 en un plano alternativo) y entonces de vuelta sobre la tira reactiva.
En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union de zona de control 61 es tambien preferiblemente un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos frente al analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo que se muestra en la figura 24 se puede usar para cualquier ensayo de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union de ligando - receptor y ensayos de union de enzima - sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 38 esta marcado con biotina 39. En algunas realizaciones en las que la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 es biotina, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion es preferiblemente avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 38 esta marcado 39 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion 52 es preferiblemente biotina. Como alternativa, la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 50 puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invention. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, el colector de muestras 535 se coloca de tal modo que la muestra se encuentra directamente por encima de la zona de aplicacion de muestra 44. La barrera 510 en la zona de desvio 500 detiene el flujo lateral 43 sobre la tira reactiva. Cuando se anade el compresor de muestras 30, este ejerce una presion 51 sobre el colector de muestras 535, y crea un puente por encima de la barrera 510. El fluido se desvia 520 hacia el compresor de muestras 30 en un plano separado. Cuando el medio de elucion, la muestra o el tampon fluye a traves del compresor de muestras 30, este recoge el primer socio de union de analito 37 del conjugado 36 y el socio de union de zona de control 61. El flujo se desplaza a traves de la portion de recogida 560 del colector de muestras 535 a medida que este vuelve a la tira reactiva despues del extremo de la barrera 510, en donde los componentes que se desplazan en el flujo interactuan con la muestra de interes. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, el analito 40 se une al primer socio de union de analito 36 y el segundo socio de union 38, creando un sandwich “vertical" con el conjugado 36 como la pieza de arriba y el segundo socio de union 38 como la pieza de debajo, con el analito 40 entremedias de los mismos (vease la figura 4B). Si hay tambien un socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, tambien se transfiere el socio de union de zona de control 61. Una marca inmovilizada 50 en la zona de prueba 45 se une entonces a la marca 39. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. La realizacion apropiada de la
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prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46 debido a la interaccion entre el socio de union de zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
Observese que, mientras que las figuras 24A y 24B muestran los reactivos en una configuracion determinada (similar a la de las figuras 5A a 5B), los reactivos se pueden colocar en unas configuraciones alternativas, por ejemplo las configuraciones que se muestran en las figuras 1, 3, 4, 6, 8 y 9 con la adicion de la barrera que se muestra en la figura 24. Ademas, la realizacion que se muestra en la figura 22 se podria usar en combinacion con cualquiera de los elementos de intensificacion o las realizaciones de encapsulacion que se divulgan en el presente documento.
A pesar de que la barrera se muestra como una longitud especifica en relacion con el resto de la tira reactiva en las figuras 24A y 24B, las figuras son esquematicas. La barrera 510 puede ser de cualquier longitud sobre la tira reactiva suficiente para detener el flujo y requerir que el compresor de muestras 30 vuelva a comenzar el flujo. La barrera 510 esta disenada para no ser tan larga como para obstruir el flujo de vuelta al interior del plano lateral en el extremo de aguas abajo del compresor de muestras 30.
En una realizacion preferida, la barrera 510 incluye componentes encapsulados. La barrera 510 en las presentes realizaciones se fabrica de un material que se disuelve con el tiempo (tal como se analiza en el presente documento), liberando los componentes encapsulados. La barrera 510 puede incluir cualquiera o la totalidad de los mismos reactivos que se han analizado en el presente documento como que se pueden encapsular. Una barrera que se esta disolviendo 510 realiza unas funciones duales. De forma similar a las otras barreras 510, esta actua como una pared para forzar el flujo al interior del compresor de muestras. Ademas, la misma retarda en el tiempo determinados componentes mediante la encapsulacion de los mismos. El tampon o el medio de elucion disuelve lentamente la barrera 510, y estos componentes retardados en el tiempo incidiran sobre el complejo de linea de prueba despues de que los otros componentes del ensayo hayan alcanzado la linea de prueba.
Las figuras 25A y 25B muestran una zona de desvio 500 con una separacion o surco 525. El sistema incluye un compresor de muestras 30, un colector de muestras 535, y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). La tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de desvio 500, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. La tira reactiva preferiblemente tambien incluye un sustrato de soporte 48. Tal como se muestra en las figuras 25A y 23B, en algunas realizaciones, la porcion de recogida 560 del colector de muestras 535 es compacta, de tal modo que la misma concentra la muestra sobre el colector 560. En otras realizaciones, se podrian usar los colectores de muestras 35 que se muestran en las realizaciones previas. La zona de desvio 500 incluye una separacion 525. La separacion 525 interrumpe el flujo al eliminar las membranas que permiten el flujo a lo largo de la tira reactiva.
En la presente realizacion, la totalidad del sandwich (primer socio de union 37 - analito 40 - segundo socio de union 38) se forma en la zona de aplicacion de muestra 44. La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una marca inmovilizada 50 que se une a la marca 39 del segundo socio de union 38. En la presente realizacion, un primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36 y preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich. El segundo socio de union 38 en la presente realizacion preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva. El segundo socio de union 38 tambien incluye una marca 39. Como alternativa, el segundo socio de union 38 en la presente realizacion se puede encontrar en cualquier parte sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, y entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion. De forma similar, la zona de aplicacion de muestra 44 se puede encontrar aguas arriba de la zona de desvio 500, aguas abajo de la zona de desvio 500, o solapandose con o encima de la zona de desvio 500.
En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union de zona de control 61 con un marcador detectable. El socio de union de zona de control 61 se compleja con su socio de union 110 en la zona de control 46 cuando la prueba se ha realizado correctamente.
La zona de desvio 500 detiene por completo el flujo hasta que el compresor de muestras 30 se pone en contacto con el resto del dispositivo, y crea un puente a lo largo del cual puede fluir el fluido, tal como se muestra por medio de la linea de puntos 520 en la figura 25B. El compresor de muestras 30 actua como un puente y redirige el flujo a un plano diferente. El flujo se desvia hacia el compresor de muestras 30. Esto aumenta la recogida del primer socio de union 37 y el socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30. El fluido cambia de vuelta al plano lateral original en el extremo de la zona de desvio 500.
En otras realizaciones, el socio de union de zona de control 61 podria estar ubicado sobre la tira reactiva, por ejemplo aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44, sobre la zona de aplicacion de muestra 44, o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. En cualquiera de las realizaciones con un socio de union de zona de control 61, el socio de union de zona de control 61 no alcanzara la zona de control 46 a menos que el compresor de muestras 30 haya formado eficazmente el puente, permitiendo que el flujo continue mas alla de la separacion (a
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medida que este se desplaza a traves del compresor de muestras 30 en un plano alternativo) y entonces de vuelta sobre la tira reactiva.
En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union de zona de control 61 es tambien preferiblemente un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos frente al analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo que se muestra en la figura 23 se puede usar para cualquier ensayo de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union de ligando - receptor y ensayos de union de enzima - sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 38 esta marcado con biotina 39. En algunas realizaciones en las que la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 es biotina, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion es preferiblemente avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 38 esta marcado 39 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion 52 es preferiblemente biotina. Como alternativa, la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 50 puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invention. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, el colector de muestras 535 se coloca de tal modo que la muestra se encuentra directamente por encima de la zona de aplicacion de muestra 44. La separation 525 en la zona de desvio 500 detiene el flujo lateral 43 sobre la tira reactiva. Cuando se anade el compresor de muestras 30, este ejerce una presion 51 sobre el colector de muestras 535, y crea un puente por encima de la separacion 525. El fluido se desvia 520 hacia el compresor de muestras 30 en un plano separado. Cuando el medio de elucion, la muestra o el tampon fluye a traves del compresor de muestras 30, este recoge el primer socio de union de analito 37 del conjugado 36 y el socio de union de zona de control 61. El flujo se desplaza a traves de la portion de recogida 560 del colector de muestras 535 a medida que este vuelve a la tira reactiva despues del extremo de la separacion 525, en donde los componentes que se desplazan en el flujo interactuan con la muestra de interes. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, el analito 40 se une al primer socio de union de analito 36 y el segundo socio de union 38, creando un sandwich “vertical" con el conjugado 36 como la pieza de arriba y el segundo socio de union 38 como la pieza de debajo, con el analito 40 entremedias de los mismos (vease la figura 4B). Si hay tambien un socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, tambien se transfiere el socio de union de zona de control 61. Una marca inmovilizada 50 en la zona de prueba 45 se une entonces a la marca 39. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. La realizacion apropiada de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46 debido a la interaction entre el socio de union de zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
Observese que, mientras que las figuras 25A y 25B muestran los reactivos en una configuration determinada (similar a la de las figuras 5A a 5B), los reactivos se pueden colocar en unas configuraciones alternativas, por ejemplo las configuraciones que se muestran en las figuras 1, 3, 4, 6, 8 y 9 con la adicion de la separacion que se muestra en la figura 25. Ademas, la realizacion que se muestra en la figura 25 se podria usar en combination con cualquiera de los elementos de intensification o las realizaciones de encapsulation que se divulgan en el presente documento.
A pesar de que la separacion 525 se muestra en las figuras 25A y 25B como extendiendose hacia abajo hasta el sustrato de soporte, solo es necesario que la separacion 525 sea de suficiente profundidad para detener el flujo. En otras realizaciones, la separacion 525 se llena o se llena parcialmente con un material de barrera, que puede ser impermeable o permeable.
En otras realizaciones preferidas, mas de una barrera, mas de una separacion, o una combinacion de al menos una barrera y al menos una separacion pueden constituir la zona de desvio.
Las figuras 26A y 26B muestran un dispositivo de flujo lateral con una bisagra 800, una zona de desvio 500, y un compresor de muestras 30 en otra realizacion de la presente invencion. La bisagra 800 facilita la compresion, pero por lo demas la presente realizacion funciona de forma similar a las realizaciones de zona de desvio que se describen en las figuras 24 y 25. La bisagra 800 y la almohadilla de compresor de muestras 33 en la presente realizacion se podria usar con cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento. Como alternativa, la configuracion de bisagra en la figura 8B se podria usar con una zona de desvio 500 en otras realizaciones de la invencion. Observese que, a pesar de que el colector de muestras 535 se muestra en estas figuras, se podria usar, como alternativa, el colector de muestras 35.
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Las figuras 27A - 27C muestran un dispositivo de flujo lateral con una zona de desvio, un compresor de muestras y una tira reactiva cromatografica que incluye un papel de separacion en una realizacion de la presente invencion. En la presente realizacion, al menos un papel de separacion 760 es parte de la tira reactiva cromatografica. El dispositivo que se muestra en las figuras 27A - 27C incluye al menos un papel de separacion 760 que esta ubicado adyacente a una zona de aplicacion de muestra 44 sobre la tira reactiva cromatografica. Para facilitar la aplicacion de una muestra al papel de separacion 760, el papel de separacion esta ubicado preferiblemente adyacente a la trayectoria del flujo lateral (en el mismo plano). La figura 27A muestra una vista lateral del dispositivo, por lo tanto solo es visible el papel de separacion 760. La figura 27B muestra una vista desde arriba de la zona de aplicacion de muestra 44 y el papel de separacion adyacente 760. Una muestra se anade al papel de separacion 760, por ejemplo una muestra de liquido se anade con una pipeta u otro dispositivo de adicion de muestras, antes de la realizacion del ensayo. Antes de la compresion con el compresor de muestras 30, se da la vuelta al papel de separacion 760 sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la trayectoria de flujo lateral, tal como se muestra en la figura 27C. A pesar de que el papel de separacion 760 se muestra aguas abajo de la barrera 510 en la figura 25, el papel de separacion 760 y la zona de aplicacion de muestra 44 de forma opcional se puede encontrar aguas arriba de la barrera 510, o incluso sobre o solapandose con la barrera 510 en algunas realizaciones alternativas. Si hay multiples papeles separadores 760, estos pueden estar ubicados en diferentes lugares sobre el dispositivo. La funcion y la estructura del dispositivo es por lo demas similar a la del dispositivo que se muestra y se describe en las figuras 25A y 25B.
Mientras que las figuras 1 - 18 y 24 - 25 muestran un elemento de hisopo 35, 535 con una porcion de recogida de muestras 60, 560, en otras realizaciones, el dispositivo de recogida de muestras es al menos un papel de separacion 660 que se coloca en la misma ubicacion en la pila vertical que la porcion de recogida de muestras 60, 560 del elemento de hisopo 35, 535 que se muestran en las figuras. Como un ejemplo, el dispositivo que se muestra en la figura 28 sustituye al elemento de hisopo 35, 535, con un papel de separacion 660. A pesar de que el papel de separacion 660 y la zona de aplicacion de muestra 44 se muestran aguas abajo de la barrera 510 en la figura 28, el papel de separacion 660 se puede aplicar de forma opcional aguas arriba de la barrera 510, o incluso sobre o solapandose con la barrera 510 en algunas realizaciones alternativas. En otras realizaciones, multiples papeles separadores se pueden usar y ubicar en diferentes ubicaciones sobre el dispositivo. Este dispositivo en esta figura por lo demas opera de forma similar al dispositivo que se describe y se muestra en las figuras 24A y 24B.
Uno o mas papeles separadores 660 o 760 se pueden usar como el colector de muestras en cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento.
Las figuras 29A y 29B muestran otra realizacion con una zona de desvio 500 que incluye una barrera 510. El sistema incluye un compresor de muestras 30 y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). En la presente realizacion, la muestra preferiblemente se anade directamente al compresor de muestras 30. Un analito 40 se muestra sobre el compresor de muestras 30 para mostrar que la muestra se ha anadido al compresor de muestras 30. La tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de desvio 500, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. A pesar de que la zona de aplicacion de muestra 44 en la presente realizacion es la ubicacion en la que la muestra encuentra en primer lugar la tira reactiva, la muestra en la presente realizacion se anade al compresor de muestras 30 y se desplaza en el tampon de migracion hasta la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva.
La tira reactiva preferiblemente tambien incluye un sustrato de soporte 48. La zona de desvio 500 incluye una barrera 510. La barrera 510 es preferiblemente una membrana impermeable (o una membrana sustancialmente impermeable) que se puede fabricar de cualquier material que evite que el flujo de liquido continue fluyendo en el mismo plano. Algunos materiales para la barrera incluyen, pero sin limitarse a, plasticos, hidrocarburos o metal.
En la presente realizacion, ^ del sandwich (el primer socio de union 37 - analito 40) comienza a formarse sobre el compresor de muestras 30, y la totalidad del sandwich (primer socio de union 37 - analito 40 - segundo socio de union 38) se forma antes de que la muestra alcance la zona de prueba 45. La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una marca inmovilizada 50 que se une a la marca 39 del segundo socio de union 38. En la presente realizacion, un primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36 y preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich. El segundo socio de union 38 en la presente realizacion preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva. El segundo socio de union 38 tambien incluye una marca 39. Como alternativa, el segundo socio de union 38 en la presente realizacion se puede encontrar en cualquier parte sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, y entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion.
En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union de zona de control 61 con un marcador detectable. El socio de union de zona de control 61 se compleja con su socio de union 110 en la zona de control 46 cuando la prueba se ha realizado correctamente.
La zona de desvio 500 detiene por completo el flujo hasta que el compresor de muestras 30 se pone en contacto con el resto del dispositivo, y crea un puente a lo largo del cual puede fluir el fluido, tal como se muestra por medio
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de la linea de puntos 520 en la figura 29B. El compresor de muestras 30 actua como un puente y redirige el flujo a un plano diferente. El flujo se desvia hacia el compresor de muestras 30. Esto aumenta la recogida del primer socio de union 37, la muestra y el socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30. El fluido cambia de vuelta al plano lateral original en el extremo de la zona de desvio 500.
En otras realizaciones, el socio de union de zona de control 61 podria estar ubicado sobre la tira reactiva, por ejemplo aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, sobre la zona de aplicacion de muestra, o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra. En cualquiera de las realizaciones con un socio de union de zona de control 6l, el socio de union de zona de control 61 no alcanzara la zona de control 46 a menos que el compresor de muestras 30 haya formado eficazmente el puente, permitiendo que el flujo continue mas alla de la barrera 510 (a medida que este se desplaza a traves del compresor de muestras 30 en un plano alternativo) y entonces de vuelta sobre la tira reactiva.
En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union de zona de control 61 es tambien preferiblemente un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos frente al analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo que se muestra en la figura 29 se puede usar para cualquier ensayo de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union de ligando - receptor y ensayos de union de enzima - sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 38 esta marcado con biotina 39. En algunas realizaciones en las que la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 es biotina, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion es preferiblemente avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 38 esta marcado 39 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion 52 es preferiblemente biotina. Como alternativa, la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 50 puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invention. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, la muestra se coloca sobre el compresor de muestras 30. La barrera 510 en la zona de desvio 500 detiene el flujo lateral 43 sobre la tira reactiva. Cuando se anade el compresor de muestras 30, este crea un puente por encima de la barrera 510. El fluido se desvia 520 hacia el compresor de muestras 30 en un plano separado. Cuando el medio de elucion, la muestra o el tampon fluye a traves del compresor de muestras 30, este recoge la muestra, el primer socio de union de analito 37 del conjugado 36 y el socio de union de zona de control 61. El flujo vuelve a la tira reactiva despues del extremo de la barrera 510. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, el analito 40 se une al primer socio de union de analito 36 y el segundo socio de union 38, creando un sandwich “vertical" con el conjugado 36 como la pieza de arriba y el segundo socio de union 38 como la pieza de debajo, con el analito 40 entremedias de los mismos. Si hay tambien un socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, tambien se transfiere el socio de union de zona de control 61. Una marca inmovilizada 50 en la zona de prueba 45 se une entonces a la marca 39. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. La realization apropiada de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46 debido a la interaction entre el socio de union de zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
A pesar de que la barrera se muestra como una longitud especifica en relation con el resto de la tira reactiva en las figuras 29A y 29B, las figuras son esquematicas. La barrera 510 puede ser de cualquier longitud sobre la tira reactiva suficiente para detener el flujo y requerir que el compresor de muestras 30 vuelva a comenzar el flujo. La barrera 510 esta disenada para no ser tan larga como para obstruir el flujo de vuelta al interior del plano lateral en el extremo de aguas abajo del compresor de muestras 30.
En una realizacion preferida, la barrera 510 incluye componentes encapsulados. La barrera 510 en las presentes realizaciones se fabrica de un material que se disuelve con el tiempo (tal como se analiza en el presente documento), liberando los componentes encapsulados. La barrera 510 puede incluir cualquiera o la totalidad de los mismos reactivos que se han analizado en el presente documento como que se pueden encapsular. Una barrera que se esta disolviendo 510 realiza unas funciones duales. De forma similar a las otras barreras 510, esta actua como una pared para forzar el flujo al interior del compresor de muestras. Ademas, la misma retarda en el tiempo determinados componentes mediante la encapsulation de los mismos. El tampon o el medio de elucion disuelve lentamente la barrera 510, y estos componentes retardados en el tiempo incidiran sobre el complejo de linea de prueba despues de que los otros componentes del ensayo hayan alcanzado la linea de prueba.
Las figuras 30A y 30B muestran una zona de desvio 500 con una separation o surco 525. El sistema incluye un compresor de muestras 30 y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). En la presente
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realizacion, la muestra preferiblemente se anade directamente al compresor de muestras 30. Un analito 40 se muestra sobre el compresor de muestras 30 para mostrar que la muestra se ha anadido al compresor de muestras 30. La tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de desvio 500, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. A pesar de que la zona de aplicacion de muestra 44 en la presente realizacion es la ubicacion en la que la muestra encuentra en primer lugar la tira reactiva, la muestra en la presente realizacion se anade al compresor de muestras 30 y se desplaza en el tampon de migracion hasta la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva.
La tira reactiva preferiblemente tambien incluye un sustrato de soporte 48. La zona de desvio 500 incluye una separacion 525. La separacion 525 interrumpe el flujo al eliminar las membranas que permiten el flujo a lo largo de la tira reactiva.
En la presente realizacion, ^ del sandwich (el primer socio de union 37 - analito 40) comienza a formarse sobre el compresor de muestras 30, y la totalidad del sandwich (primer socio de union 37 - analito 40 - segundo socio de union 38) se forma antes de que la muestra alcance la zona de prueba 45. La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una marca inmovilizada 50 que se une a la marca 39 del segundo socio de union 38. En la presente realizacion, un primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36 y preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich. El segundo socio de union 38 en la presente realizacion preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva. El segundo socio de union 38 tambien incluye una marca 39. Como alternativa, el segundo socio de union 38 en la presente realizacion se puede encontrar en cualquier parte sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, y entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion.
En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union de zona de control 61 con un marcador detectable. El socio de union de zona de control 61 se compleja con su socio de union 110 en la zona de control 46 cuando la prueba se ha realizado correctamente.
La zona de desvio 500 detiene por completo el flujo hasta que el compresor de muestras 30 se pone en contacto con el resto del dispositivo, y crea un puente a lo largo del cual puede fluir el fluido, tal como se muestra por medio de la linea de puntos 520 en la figura 30B. El compresor de muestras 30 actua como un puente y redirige el flujo a un plano diferente. El flujo se desvia hacia el compresor de muestras 30. Esto aumenta la recogida de la muestra, el primer socio de union 37 y el socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30. El fluido cambia de vuelta al plano lateral original en el extremo de la zona de desvio 500.
En otras realizaciones, el socio de union de zona de control 61 podria estar ubicado sobre la tira reactiva, por ejemplo aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44, sobre la zona de aplicacion de muestra 44, o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. En cualquiera de las realizaciones con un socio de union de zona de control 61, el socio de union de zona de control 61 no alcanzara la zona de control 46 a menos que el compresor de muestras 30 haya formado eficazmente el puente, permitiendo que el flujo continue mas alla de la separacion (a medida que este se desplaza a traves del compresor de muestras 30 en un plano alternativo) y entonces de vuelta sobre la tira reactiva.
En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union de zona de control 61 es tambien preferiblemente un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos frente al analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo que se muestra en la figura 30 se puede usar para cualquier ensayo de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union de ligando - receptor y ensayos de union de enzima - sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 38 esta marcado con biotina 39. En algunas realizaciones en las que la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 es biotina, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion es preferiblemente avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 38 esta marcado 39 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion 52 es preferiblemente biotina. Como alternativa, la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 50 puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invention. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, la separacion 525 en la zona de desvio 500 detiene el flujo lateral 43 sobre la tira reactiva. Cuando se anade el compresor de muestras 30, este crea un puente por encima de la separacion 525. El
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fluido se desvia 520 hacia el compresor de muestras 30 en un plano separado. Cuando el medio de elucion, la muestra o el tampon fluye a traves del compresor de muestras 30, este recoge la muestra, el primer socio de union de analito 37 del conjugado 36 y el socio de union de zona de control 61. El flujo vuelve a la tira reactiva despues del extremo de la separacion 525. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, el analito 40 se une al primer socio de union de analito 36 y el segundo socio de union 38, creando un sandwich “vertical" con el conjugado 36 como la pieza de arriba y el segundo socio de union 38 como la pieza de debajo, con el analito 40 entremedias de los mismos. Si hay tambien un socio de union de zona de control 6l sobre el compresor de muestras 30, tambien se transfiere el socio de union de zona de control 61. Una marca inmovilizada 50 en la zona de prueba 45 se une entonces a la marca 39. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. La realizacion apropiada de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46 debido a la interaccion entre el socio de union de zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
A pesar de que la separacion 525 se muestra en las figuras 30A y 30B como extendiendose hacia abajo hasta el sustrato de soporte, solo es necesario que la separacion 525 sea de suficiente profundidad para detener el flujo. En otras realizaciones, la separacion 525 se llena o se llena parcialmente con un material de barrera, que puede ser impermeable o permeable.
En otras realizaciones preferidas, mas de una barrera, mas de una separacion, o una combinacion de al menos una barrera y al menos una separacion pueden constituir la zona de desvio.
Las figuras 31A y 31B muestran otra realizacion con una zona de desvio 500 que incluye una barrera 510. El sistema incluye un compresor de muestras 30 y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). La tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de desvio 500, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. La tira reactiva preferiblemente tambien incluye un sustrato de soporte 48.
La zona de desvio 500 incluye una barrera 510. La barrera 510 es preferiblemente una membrana impermeable (o una membrana sustancialmente impermeable) que se puede fabricar de cualquier material que evite que el flujo de liquido continue fluyendo en el mismo plano. Algunos materiales para la barrera incluyen, pero sin limitarse a, plasticos, hidrocarburos o metal.
En la presente realizacion, la muestra preferiblemente se anade directamente a la zona de aplicacion de muestra 44. Un analito 40 se muestra en la zona de aplicacion de muestra 44 para mostrar que la muestra se ha anadido a la zona de aplicacion de muestra 44. La totalidad del sandwich (primer socio de union 37 - analito 40 - segundo socio de union 38) se forma en la zona de aplicacion de muestra 44. La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una marca inmovilizada 50 que se une a la marca 39 del segundo socio de union 38. En la presente realizacion, un primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36 y preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, se une al analito 40 en la muestra de prueba para formar medio sandwich. El segundo socio de union 38 en la presente realizacion preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva. El segundo socio de union 38 tambien incluye una marca 39. Como alternativa, el segundo socio de union 38 en la presente realizacion se puede encontrar en cualquier parte sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, y entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion. De forma similar, la zona de aplicacion de muestra 44 se puede encontrar aguas arriba de la zona de desvio 500, aguas abajo de la zona de desvio 500, o solapandose con o encima de la zona de desvio 500.
En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union de zona de control 61 con un marcador detectable. El socio de union de zona de control 61 se compleja con su socio de union 110 en la zona de control 46 cuando la prueba se ha realizado correctamente.
La zona de desvio 500 detiene por completo el flujo hasta que el compresor de muestras 30 se pone en contacto con el resto del dispositivo, y crea un puente a lo largo del cual puede fluir el fluido, tal como se muestra por medio de la linea de puntos 520 en la figura 31B. El compresor de muestras 30 actua como un puente y redirige el flujo a un plano diferente. El flujo se desvia hacia el compresor de muestras 30. Esto aumenta la recogida del primer socio de union 37 y el socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30. El fluido cambia de vuelta al plano lateral original en el extremo de la zona de desvio 500.
En otras realizaciones, el socio de union de zona de control 61 podria estar ubicado sobre la tira reactiva, por ejemplo aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, sobre la zona de aplicacion de muestra, o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra. En cualquiera de las realizaciones con un socio de union de zona de control 61, el socio de union de zona de control 61 no alcanzara la zona de control 46 a menos que el compresor de muestras 30 haya formado eficazmente el puente, permitiendo que el flujo continue mas alla de la barrera 510 (a medida que este se desplaza a traves del compresor de muestras 30 en un plano alternativo) y entonces de vuelta sobre la tira reactiva.
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En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union de zona de control 61 es tambien preferiblemente un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union espedficos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos frente al analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo que se muestra en la figura 31 se puede usar para cualquier ensayo de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union de ligando - receptor y ensayos de union de enzima - sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 38 esta marcado con biotina 39. En algunas realizaciones en las que la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 es biotina, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion es preferiblemente avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 38 esta marcado 39 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion 52 es preferiblemente biotina. Como alternativa, la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 50 puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invention. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, la muestra se coloca sobre la zona de aplicacion de muestra 44. La barrera 510 en la zona de desvio 500 detiene el flujo lateral 43 sobre la tira reactiva. Cuando se anade el compresor de muestras 30, este ejerce una presion 51 sobre la tira reactiva, y crea un puente por encima de la barrera 510. El fluido se desvia 520 hacia el compresor de muestras 30 en un plano separado. Cuando el medio de elucion, la muestra o el tampon fluye a traves del compresor de muestras 30, este recoge el primer socio de union de analito 37 del conjugado 36 y el socio de union de zona de control 61. El flujo vuelve a la tira reactiva despues del extremo de la barrera 510, en donde los componentes que se desplazan en el flujo interactuan con la muestra de interes. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, el analito 40 se une al primer socio de union de analito 36 y el segundo socio de union 38, creando un sandwich “vertical" con el conjugado 36 como la pieza de arriba y el segundo socio de union 38 como la pieza de debajo, con el analito 40 entremedias de los mismos. Si hay tambien un socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, tambien se transfiere el socio de union de zona de control 61. Una marca inmovilizada 50 en la zona de prueba 45 se une entonces a la marca 39. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. La realizacion apropiada de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46 debido a la interaction entre el socio de union de zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
A pesar de que la barrera se muestra como una longitud especifica en relation con el resto de la tira reactiva en las figuras 31A y 31B, las figuras son esquematicas. La barrera 510 puede ser de cualquier longitud sobre la tira reactiva suficiente para detener el flujo y requerir que el compresor de muestras 30 vuelva a comenzar el flujo. La barrera 510 esta disenada para no ser tan larga como para obstruir el flujo de vuelta al interior del plano lateral en el extremo de aguas abajo del compresor de muestras 30.
En una realizacion preferida, la barrera 510 incluye componentes encapsulados. La barrera 510 en las presentes realizaciones se fabrica de un material que se disuelve con el tiempo (tal como se analiza en el presente documento), liberando los componentes encapsulados. La barrera 510 puede incluir cualquiera o la totalidad de los mismos reactivos que se han analizado en el presente documento como que se pueden encapsular. Una barrera que se esta disolviendo 510 realiza unas funciones duales. De forma similar a las otras barreras 510, esta actua como una pared para forzar el flujo al interior del compresor de muestras. Ademas, la misma retarda en el tiempo determinados componentes mediante la encapsulation de los mismos. El tampon o el medio de elucion disuelve lentamente la barrera 510, y estos componentes retardados en el tiempo incidiran sobre el complejo de linea de prueba despues de que los otros componentes del ensayo hayan alcanzado la linea de prueba.
Las figuras 32A y 32B muestran una zona de desvio 500 con una separation o surco 525. El sistema incluye un compresor de muestras 30 y un dispositivo de analisis de muestras (una tira reactiva en la figura). La tira reactiva preferiblemente incluye una almohadilla absorbente 42, una zona de desvio 500, una zona de aplicacion de muestra 44, una zona de deteccion 52 y una almohadilla de desechos opcional 47. La tira reactiva preferiblemente tambien incluye un sustrato de soporte 48. La zona de desvio 500 incluye una separacion 525. La separacion 525 interrumpe el flujo al eliminar las membranas que permiten el flujo a lo largo de la tira reactiva.
En la presente realizacion, la muestra preferiblemente se anade directamente a la zona de aplicacion de muestra 44. Un analito 40 se muestra en la zona de aplicacion de muestra 44 para mostrar que la muestra se ha anadido a la zona de aplicacion de muestra 44. La totalidad del sandwich (primer socio de union 37 - analito 40 - segundo socio de union 38) se forma en la zona de aplicacion de muestra 44. La zona de prueba 45 en la presente realizacion incluye una marca inmovilizada 50 que se une a la marca 39 del segundo socio de union 38. En la presente realizacion, un primer socio de union 37, que es parte del conjugado 36 y preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la almohadilla 33 del compresor de muestras 30, se une al analito 40 en la muestra de prueba para
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formar medio sandwich. El segundo socio de union 38 en la presente realizacion preferiblemente se carga previamente y se seca sobre la zona de aplicacion de muestra 44 de la tira reactiva. El segundo socio de union 38 tambien incluye una marca 39. Como alternativa, el segundo socio de union 38 en la presente realizacion se puede encontrar en cualquier parte sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion incluyendo, pero sin limitarse a, solapandose con la zona de aplicacion de muestra, aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra, y entre la zona de aplicacion de muestra y la zona de deteccion. De forma similar, la zona de aplicacion de muestra 44 se puede encontrar aguas arriba de la zona de desvio 500, aguas abajo de la zona de desvio 500, o solapandose con o encima de la zona de desvio 500.
En algunas realizaciones preferidas, la almohadilla 33 sobre el compresor de muestras 30 tambien incluye un socio de union de zona de control 61 con un marcador detectable. El socio de union de zona de control 61 se compleja con su socio de union 110 en la zona de control 46 cuando la prueba se ha realizado correctamente.
La zona de desvio 500 detiene por completo el flujo hasta que el compresor de muestras 30 se pone en contacto con el resto del dispositivo, y crea un puente a lo largo del cual puede fluir el fluido, tal como se muestra por medio de la linea de puntos 520 en la figura 32B. El compresor de muestras 30 actua como un puente y redirige el flujo a un plano diferente. El flujo se desvia hacia el compresor de muestras 30. Esto aumenta la recogida del primer socio de union 37 y el socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30. El fluido cambia de vuelta al plano lateral original en el extremo de la zona de desvio 500.
En otras realizaciones, el socio de union de zona de control 61 podria estar ubicado sobre la tira reactiva, por ejemplo aguas arriba de la zona de aplicacion de muestra 44, sobre la zona de aplicacion de muestra 44, o aguas abajo de la zona de aplicacion de muestra 44. En cualquiera de las realizaciones con un socio de union de zona de control 61, el socio de union de zona de control 61 no alcanzara la zona de control 46 a menos que el compresor de muestras 30 haya formado eficazmente el puente, permitiendo que el flujo continue mas alla de la separacion (a medida que este se desplaza a traves del compresor de muestras 30 en un plano alternativo) y entonces de vuelta sobre la tira reactiva.
En un ejemplo, tanto el primer socio de union 37 como el segundo socio de union 38 son diferentes anticuerpos para el analito. El socio de union de zona de control 61 es tambien preferiblemente un anticuerpo, y su socio de union en la zona de control es un antigeno (o viceversa). En otras realizaciones, socios de union especificos tambien pueden ser antigenos capaces de unirse a anticuerpos frente al analito. Otros tipos de socios de union son macromoleculas bioorganicas como aptameros o receptores, nanoparticulas o acidos nucleicos. El dispositivo que se muestra en la figura 32 se puede usar para cualquier ensayo de union, y puede evitar el uso de anticuerpo / antigenos o acidos nucleicos, por ejemplo, en ensayos de union de ligando - receptor y ensayos de union de enzima - sustrato.
En una realizacion preferida, el segundo socio de union 38 esta marcado con biotina 39. En algunas realizaciones en las que la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 es biotina, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion es preferiblemente avidina, neutravidina o estreptavidina. En otras realizaciones, el segundo socio de union 38 esta marcado 39 con avidina, neutravidina o estreptavidina. En las presentes realizaciones, la marca inmovilizada 50 en la zona de deteccion 52 es preferiblemente biotina. Como alternativa, la marca 39 sobre el segundo socio de union 38 puede ser una lectina y la marca inmovilizada 50 puede ser un resto glicosilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la lectina es la lectina de guisante y el resto glicosilo es una unidad glicosilo de eritrocitos. La marca sobre el segundo socio de union y la marca inmovilizada se pueden invertir dentro del espiritu de la presente invention. Por ejemplo, el resto glicosilo puede ser la marca sobre el segundo socio de union, con una marca de lectina inmovilizada en la zona de deteccion. En otras realizaciones, se pueden usar otros receptores y ligandos para las marcas.
Durante el funcionamiento, la separacion 525 en la zona de desvio 500 detiene el flujo lateral 43 sobre la tira reactiva. Cuando se anade el compresor de muestras 30, este crea un puente por encima de la separacion 525. El fluido se desvia 520 hacia el compresor de muestras 30 en un plano separado. Cuando el medio de elucion o el tampon fluye a traves del compresor de muestras 30, este recoge el primer socio de union de analito 37 del conjugado 36 y el socio de union de zona de control 61. El flujo vuelve a la tira reactiva despues del extremo de la separacion 525, en donde los componentes que se desplazan en el flujo interactuan con la muestra de interes. Si el analito 40 se encuentra presente en la muestra, el analito 40 se une al primer socio de union de analito 36 y el segundo socio de union 38, creando un sandwich “vertical" con el conjugado 36 como la pieza de arriba y el segundo socio de union 38 como la pieza de debajo, con el analito 40 entremedias de los mismos (vease la figura 4B). Si hay tambien un socio de union de zona de control 61 sobre el compresor de muestras 30, tambien se transfiere el socio de union de zona de control 61. Una marca inmovilizada 50 en la zona de prueba 45 se une entonces a la marca 39. Debido a que el conjugado 36 incluye un marcador 41, el complejo que se forma es detectable e indica un resultado positivo. La realizacion apropiada de la prueba tambien da como resultado un resultado positivo detectable en la zona de control 46 debido a la interaction entre el socio de union de zona de control 61 y su socio inmovilizado en la zona de control 46.
A pesar de que la separacion 525 se muestra en las figuras 32A y 32B como extendiendose hacia abajo hasta el sustrato de soporte, solo es necesario que la separacion 525 sea de suficiente profundidad para detener el flujo. En
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otras realizaciones, la separacion 525 se llena o se llena parcialmente con un material de barrera, que puede ser impermeable o permeable.
En otras realizaciones preferidas, mas de una barrera, mas de una separacion, o una combinacion de al menos una barrera y al menos una separacion pueden constituir la zona de desvio.
Las figuras 33A y 33B muestran un dispositivo de flujo lateral con una bisagra 800, una zona de desvio 500, y un compresor de muestras 30 en otra realization de la presente invention. La bisagra 800 facilita la compresion, pero por lo demas la presente realizacion funciona de forma similar a las realizaciones de zona de desvio que se describen en las figuras 29 y 30. La bisagra 800 y la almohadilla de compresor de muestras 33 en la presente realizacion se podrian usar con cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento. Como alternativa, la configuration de bisagra en la figura 8B se podria usar con una zona de desvio 500 en otras realizaciones de la invencion.
Las figuras 34A y 34B muestran un dispositivo de flujo lateral con una bisagra 800, una zona de desvio 500, y un compresor de muestras 30 en otra realizacion de la presente invencion. La bisagra 800 facilita la compresion, pero por lo demas la presente realizacion funciona de forma similar a las realizaciones de zona de desvio que se describen en las figuras 31 y 32. La bisagra 800 y la almohadilla de compresor de muestras 33 en la presente realizacion se podrian usar con cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento. Como alternativa, la configuracion de bisagra en la figura 8B se podria usar con una zona de desvio 500 en otras realizaciones de la invencion.
A pesar de que las figuras 24 - 34 se describen usando socios de union para el analito aguas arriba de la zona de prueba, con unas marcas 50 inmovilizadas en la zona de prueba, en otras realizaciones alternativas, el segundo socio de union 38 para el analito se podria inmovilizar en la zona de prueba en la totalidad de las configuraciones de tira reactiva que se describen en las figuras 24 - 34. En las presentes realizaciones, solo ^ del sandwich (primer socio de union 37 - analito 40) se forma antes de que la muestra alcance la zona de prueba.
Algunas realizaciones con el segundo socio de union 38 en la zona de prueba 45 se muestran en las figuras 35A y 35B, la figura 36A y 36B, la figura 37A y 37B, la figura 38, la figura 39, las figuras 40A y 40B, las figuras 41A y 41B, las figuras 42A y 42B, las figuras 43A y 43B, las figuras 44A y 44B, y las figuras 45A y 45B. Las presentes realizaciones son similares a las realizaciones que se muestran en las figuras 24A y 24B, las figuras 25A y 25B, las figuras 26A y 26B, las figuras 27A a 27C, la figura 28, la figura 29, las figuras 30A y 30B, las figuras 31A y 31B, las figuras 32A y 32B, las figuras 33A y 33B, y las figuras 34A y 34B, respectivamente, excepto que por no hay marca 39 o marca inmovilizada 50 alguna y el segundo socio de union 38 esta inmovilizado en la zona de prueba 45. En consecuencia, el sandwich completo (primer socio de union 37 - analito 40 - segundo socio de union 38) no se forma hasta que la muestra alcanza la zona de prueba 45.
En otras realizaciones con un compresor de muestras 30, el compresor de muestras no incluye reactivo alguno para la prueba, y se usa solo para proporcionar una presion o para formar un puente sobre una zona de desvio sobre la tira reactiva.
Tiras reactivas bimodales que usan una zona de desvio
De forma aislada, ni MxA ni CRP es por si solo sensible o especifico en la identification de infecciones tanto bacterianas como viricas. Los valores de corte bajos de CRP muestran una alta sensibilidad y una baja especificidad para detectar infecciones bacterianas. Los valores de corte altos de CRP muestran una baja sensibilidad y una alta especificidad para detectar infecciones bacterianas. MxA es especifico para identificar una infection virica, pero el mismo no es sensible para infecciones bacterianas. Un patron multiplexado de resultados que incluyen puntos de decision medica que reflejan valores de corte de CRP bajo, CRP alto y MxA proporciona de forma conjunta una forma sensible y especifica para identificar una respuesta inmune a una infeccion virica y/o bacteriana.
En una realizacion preferida de un inmunoensayo de flujo lateral multiplexado, el patron de sangre extraida de la yema del dedo de resultados de prueba muestra un resultado positivo con una equivalencia de suero con un corte de nivel de CRP bajo de aproximadamente 10 mg/l, una equivalencia de suero con un corte de nivel de CRP alto de aproximadamente 80 mg/l y un corte de MxA de aproximadamente 40 ng/ml.
Las tiras reactivas duales bimodales se pueden usar para diferenciar infecciones bacterianas y viricas en seres humanos, pero tambien se pueden usar en aplicaciones veterinarias para animales. Debido a que el CRP difiere dependiendo de la especie, no hay anticuerpos comunes para CRP entre especies. Por lo tanto, es necesario que las pruebas veterinarias incluyan CRP especifico de la especie particular que se este sometiendo a prueba. El MxA se conserva bien entre especies, por lo tanto es posible usar MxA humano en pruebas veterinarias. No obstante, el MxA para una especie particular se podria usar como alternativa para intentar aumentar adicionalmente la especificidad. Se pueden desarrollar pruebas veterinarias que usan las tiras reactivas duales bimodales que se describen en el presente documento para una especie especifica, incluyendo, pero sin limitarse a, gatos, perros, conejos, cerdos, ovejas, caballos, vacas, monos, chimpances, babuinos u orangutanes.
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Una configuracion preferida para un dispositivo de analisis de muestra de tira reactiva dual bimodal con una zona de desvto sobre ambas tiras reactivas se muestra en las figuras 46A a 46C. El dispositivo de analisis de muestras o tarjeta reactiva 899 incluye una carcasa cerrable 835 con dos lados 836, 837 y una espina o porcion articulada 831. En una realizacion preferida, la tarjeta reactiva 899 es de aproximadamente 11,5 cm de longitud (L) x 7 cm de anchura (W) cuando los dos lados 836, 837 estan cerrados. No obstante, se puede usar una tarjeta reactiva de cualquier tamano 899 que de cabida a la totalidad de los componentes. Dentro del primer lado 836 de la carcasa 835, hay dos tiras reactivas 815, 825, incluyendo cada una una almohadilla de recepcion 845, una zona de desvio 850, una almohadilla de transferencia 855 y una zona de deteccion 805. El primer lado 836 tambien incluye una almohadilla absorbente 840 y preferiblemente una almohadilla de desechos 860. La primera tira reactiva 815 preferiblemente incluye una zona de deteccion 805 con una linea de prueba de MxA 802, una linea de prueba de CRP bajo 803 y una linea de control 804. La segunda tira reactiva 825 preferiblemente incluye una zona de deteccion 805 con una linea de prueba de CRP alto 823 y una linea de control 804. La totalidad de las lineas de prueba son visibles a traves de las ventanas 865 sobre el segundo lado 837 de la carcasa 835 cuando la carcasa
835 esta cerrada. La almohadilla absorbente 840 es preferiblemente una almohadilla individual a la que se anade el tampon de migracion para iniciar el flujo lateral. De forma similar, la almohadilla de desechos 860 es preferiblemente una almohadilla individual que recoge el tampon de migracion en exceso al final de la prueba. No obstante, en otras realizaciones, cada tira podria tener una almohadilla absorbente separada 840 y/o una almohadilla de desechos 860.
El segundo lado 837 de la carcasa 835 incluye tres secciones separadas 838, 839 y 870. La porcion intermedia, un compresor de muestras o solapa 870, preferiblemente incluye dos zonas de conjugado 872, 874, incluyendo cada una un socio de union marcado para al menos un analito, y un control marcado. Una ventana 843 esta ubicada en la porcion inferior 838 del segundo lado 837 de la carcasa de tal modo que el tampon se puede anadir a la almohadilla absorbente 840 cuando la carcasa 835 esta cerrada. Las ventanas de visualizacion 865 para las zonas de deteccion 805 se encuentran sobre la porcion superior 839 del segundo lado 837 de la carcasa 835.
Asimismo, preferiblemente cada una de la porcion superior 839 y la porcion inferior 838 del segundo lado 837 de la carcasa 835 incluye al menos un boton, chaveta o saliente 875 que coincide con uno o mas orificios 895 de tal modo que las porciones superior e inferior 838, 839 se puedan sujetar facilmente sobre el primer lado 836 de la carcasa 835. En una realizacion preferida, hay dos chavetas 875 sobre la porcion inferior 838 que coinciden con dos orificios 895 que flanquean la almohadilla absorbente 840 sobre el primer lado 836 de la carcasa 835 y dos chavetas 875 sobre la porcion superior 839 que coinciden con dos orificios 895 que flanquean la almohadilla de desechos 860 sobre el primer lado 836 de la carcasa 835. En otras realizaciones, los orificios 895 se encuentran sobre el segundo lado 837 de la carcasa 835 y las chavetas 875 se encuentran sobre el primer lado 836 de la carcasa 835. En aun otras realizaciones, se podrian usar otros mecanismos de sujecion reversible para afianzar la porcion superior 838 y/o la porcion inferior 839 del segundo lado 837 de la carcasa 835 al primer lado 836 de la carcasa 835. En otras realizaciones, las secciones superior e inferior 838, 839 se cierran de forma permanente, por ejemplo usando un adhesivo, antes del uso.
La solapa 870, que tambien se conoce como un compresor de muestras, sobre el segundo lado 837 de la carcasa incluye dos zonas de conjugado 872, 874 y dos zonas de aplicacion de muestra 873, 876, y se puede abrir y cerrar con facilidad. La solapa 870 preferiblemente tambien incluye al menos un boton, chaveta o saliente 875 que coincide con uno o mas orificios 895 de tal modo que la solapa 870 se cierra correctamente con facilidad sobre el primer lado
836 de la carcasa 835 despues de que se haya anadido una muestra a las zonas de aplicacion de muestra 873, 876. En otras realizaciones, los orificios 895 se encuentran sobre el segundo lado 837 de la carcasa 835 y las chavetas 875 se encuentran sobre el primer lado 836 de la carcasa 835. En aun otras realizaciones, se podrian usar otros mecanismos de sujecion reversible para afianzar la solapa 870 al primer lado 836 de la carcasa 835.
Las zonas de conjugado 872, 874 y las zonas de aplicacion de muestra 873, 876 preferiblemente se solapan. En algunas realizaciones preferidas, las zonas de conjugado 872, 874 se colorean debido a los colorantes en los conjugados de muestra y los conjugados de control, y la muestra se coloca directamente sobre la porcion coloreada de la solapa 870. En una realizacion preferida, la zona de conjugado 872 que se usa para la primera tira reactiva 815 contiene un socio de union de MxA que esta marcado con un colorante de color rojo, un socio de union de CRP bajo que esta marcado con un colorante de color negro, y un socio de union de control que esta marcado con un colorante de color azul. En la presente realizacion, la zona de conjugado 872 aparece de color purpureo. La otra zona de conjugado 874 contiene un socio de union de CRP alto que esta marcado con un colorante de color negro y un socio de union de control que esta marcado con un colorante de color azul. En la presente realizacion, la zona de conjugado 874 aparece de color azulado.
La zona de desvio 850 preferiblemente incluye una separacion o barrera que interrumpe el flujo lateral, desviando el tampon de migracion hacia arriba hacia la solapa 870 que incluye las zonas de conjugado 872, 874 y las zonas de aplicacion de muestra 873, 876.
Durante el funcionamiento, las porciones superior e inferior 838, 839 del segundo lado 837 de la carcasa 835 preferiblemente se cierran a presion antes del uso al afianzar las chavetas 875 a los orificios 895. El dispositivo de analisis de muestras o tarjeta reactiva 899 preferiblemente se coloca sobre una superficie plana. Si la solapa 870 no esta ya abierta, el usuario la abre para acceder a las zonas de aplicacion de muestra 873, 876. Se toma del paciente
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una muestra de sangre que se va a someter a prueba. La muestra se puede recoger por medio de cualquier procedimiento conocido en la tecnica. En una realizacion preferida, una muestra de 5 pl de sangre se anade a cada una de las zonas de aplicacion de muestra 873, 876 y entonces se cierra la solapa 870. Cada una de las muestras de 5 pl se recoge preferiblemente con independencia de la otra. Las muestras de sangre preferiblemente se anaden directamente al dispositivo 899, sin pretratamiento alguno.
Para asegurar que el compresor de muestras o solapa 870 se ha cerrado correctamente, se aplica preferiblemente una presion a la carcasa 835 por encima de las chavetas 875 para cerrar a presion las chavetas 875. Es necesario que la parte de arriba de la solapa 870 se encuentre a nivel con la parte de arriba del resto del segundo lado 837 de la carcasa 835 para que la prueba se realice de forma apropiada. Se anade tampon de migracion a la almohadilla absorbente 840, lo que inicia el flujo lateral 885. En algunas realizaciones preferidas, el tampon de migracion incluye uno o mas agentes de lisis, por ejemplo detergentes, para lisar la muestra de sangre y exponer el MxA intracelular en la muestra. Cuando el tampon de migracion alcanza la zona de desvio 850, este se desvia hacia arriba hacia la solapa 870. Este se desplaza a traves de las zonas de conjugado 872, 874, recogiendo cualquier complejo que se haya formado entre el socio de union de MxA y MxA en la muestra, el socio de union de CRP bajo y niveles bajos de CRP en la muestra, el socio de union de CRP alto y niveles altos de CRP en la muestra, asi como el conjugado de control.
Debido a que las zonas de conjugado 872, 874 forman un puente sobre la zona de desvio 850 sobre las tiras reactivas de flujo lateral 815, 825, el tampon de migracion, que ahora contiene muestra, conjugado y los complejos que se han descrito en lo que antecede, se desplaza entonces a la almohadilla de transferencia 855, y a las zonas de detection 805 sobre cada una de las tiras reactivas 815, 825. Si MxA se encuentra presente en la muestra, la linea de prueba de MxA 802 sobre la primera tira reactiva 815 sera de color rojo. Si un nivel bajo umbral de CRP se encuentra presente en la muestra, la linea de prueba de CRP bajo 803 sobre la primera tira reactiva 815 sera de color negro. Si un nivel alto umbral de CRP se encuentra presente en la muestra, la linea de prueba de CRP alto 823 sobre la segunda tira reactiva 825 sera de color negro. Si la prueba se realiza correctamente, las lineas de control
804 tanto sobre la primera tira 815 como sobre la segunda tira reactiva 825 seran de color azul. En algunas realizaciones preferidas, los niveles de deteccion son 40 ng/ml para MxA, 10 mg/l para CRP bajo sobre la primera tira reactiva 815 y 80 mg/l para CRP alto sobre la segunda tira reactiva 825. Los resultados de la prueba deberian ser visibles despues de aproximadamente 5 - 20 minutos, preferiblemente en un plazo de aproximadamente 10 minutos.
Debido a que el socio de union de control se encuentra sobre el compresor de muestras o solapa 870 y no sobre ninguna de las tiras reactivas 815, 825, hay un autentico control procedimental en esta configuration. Si la solapa 870 no se ha cerrado de forma apropiada, nada aparecera en la zona de deteccion 805, lo que indica que la prueba se realizo de forma no apropiada.
Las figuras 47A a 47F muestran resultados de prueba usando el dispositivo 899 que se muestra en las figuras 46A a 46C, con dos tiras reactivas 815, 825 una junto a otra, en las que una primera tira reactiva 815 realiza una prueba en busca de la presencia tanto de MxA como de niveles bajos de CRP y la segunda tira reactiva 825 realiza una prueba en busca de niveles altos de CRP.
La figura 47A muestra un resultado negativo en la linea de prueba de MxA 802 y un resultado negativo en la linea de prueba de CRP bajo 803 sobre la primera tira reactiva 815, asi como un resultado negativo en la linea de prueba de CRP alto 823 sobre la segunda tira reactiva 825. Mas en concreto, las unicas lineas visibles en la zona de deteccion
805 del ensayo de flujo lateral 899 son las dos lineas de control de color azul 804. Este resultado indica que la muestra es negativa para infecciones tanto bacterianas como viricas.
Las figuras 47B y 47C son positivos para una infection virica. En la figura 47B, la presencia de dos lineas de control de color azul 804 y una linea de MxA de color rojo 802 indican una infeccion virica. En la figura 47C, la presencia de dos lineas de control de color azul 804 y una linea de MxA de color rojo 802 indican una infeccion virica. Debido a que hay tambien una linea de CRP bajo de color negro 803 en la figura 47C, hay una posibilidad de una infeccion conjunta bacteriana, a pesar de que existe la ausencia de una linea de CRP alto 823.
Las figuras 47D y 47E son positivos para una infeccion bacteriana. En la figura 47D, la presencia de dos lineas de control de color azul 804 y una linea de CRP bajo de color negro 803 indica una infeccion bacteriana. En la figura 47E, la presencia de dos lineas de control de color azul 804, una linea de CRP bajo de color negro 803, y una linea de CRP alto de color negro 823 tambien indica una infeccion bacteriana. La linea de MxA se encuentra ausente en ambas figuras 47D y 47E, indicando la ausencia de una infeccion virica.
La figura 47F indica una infeccion conjunta (infecciones tanto bacterianas como viricas). La presencia de dos lineas de control de color azul 804, una linea de MxA de color rojo 802, una linea de CRP bajo de color negro 803, y una linea de CRP alto de color negro 823 indica la presencia de infecciones tanto bacterianas como viricas.
Otra configuracion preferida para un dispositivo de analisis de muestra de tira reactiva dual bimodal 1000 se muestra en las figuras 48A a 48C. Esta configuracion 1000 es similar a la configuracion 899 que se muestra en las figuras
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46A a 46C, pero las zonas de aplicacion de muestra 1073, 1076 estan ubicadas sobre cada una de las tiras reactivas 1015, 1025, aguas abajo de la zona de desvio 850. El dispositivo de analisis de muestras o tarjeta reactiva 1000 incluye una carcasa cerrable 835 con dos lados 836, 837 y una espina o porcion articulada 831. En una realizacion preferida, la tarjeta reactiva 1000 es de aproximadamente 11,5 cm de longitud (L) x 7 cm de anchura (W) cuando los dos lados 836, 837 estan cerrados. No obstante, se puede usar una tarjeta reactiva de cualquier tamano 1000 que de cabida a la totalidad de los componentes. Dentro del primer lado 836 de la carcasa 835, hay dos tiras reactivas 1015, 1025, incluyendo cada una una almohadilla de recepcion 845, una zona de desvio 850, una almohadilla de transferencia 1055 y una zona de detection 805. El primer lado 836 tambien incluye una almohadilla absorbente 840 y preferiblemente una almohadilla de desechos 860. La primera tira reactiva 1015 preferiblemente incluye una zona de deteccion 805 con una linea de prueba de MxA 802, una linea de prueba de CRP bajo 803 y una linea de control 804. La segunda tira reactiva 1025 preferiblemente incluye una zona de deteccion 805 con una linea de prueba de CRP alto 823 y una linea de control 804. La totalidad de las lineas de prueba son visibles a traves de las ventanas 865 sobre el segundo lado 837 de la carcasa 835 cuando la carcasa 835 esta cerrada. La almohadilla absorbente 840 es preferiblemente una almohadilla individual a la que se anade el tampon de migration para iniciar el flujo lateral. De forma similar, la almohadilla de desechos 860 es preferiblemente una almohadilla individual que recoge el tampon de migracion en exceso al final de la prueba. No obstante, en otras realizaciones, cada tira podria tener una almohadilla absorbente separada 840 y/o una almohadilla de desechos 860.
El segundo lado 837 de la carcasa 835 incluye tres secciones separadas 838, 839 y 1070. La porcion intermedia, o solapa 1070, que tambien se conoce como un compresor de muestras, preferiblemente incluye dos zonas de conjugado 872, 874, incluyendo cada una un socio de union marcado para al menos un analito, y un control marcado. Una ventana 843 esta ubicada en la porcion inferior 838 del segundo lado 837 de la carcasa de tal modo que el tampon se puede anadir cuando la carcasa 835 esta cerrada. Las ventanas de visualization 865 para las zonas de deteccion 805 se encuentran sobre la porcion superior 839 del segundo lado 837 de la carcasa 835.
Asimismo, preferiblemente cada una de la porcion superior 839 y la porcion inferior 838 del segundo lado 837 de la carcasa 835 incluye al menos un boton, chaveta o saliente 875 que coincide con uno o mas orificios 895 de tal modo que las porciones superior e inferior 838, 839 se puedan sujetar facilmente sobre el primer lado 836 de la carcasa 835. En una realizacion preferida, hay dos chavetas 875 sobre la porcion inferior 838 que coinciden con dos orificios 895 que flanquean la almohadilla absorbente 840 sobre el primer lado 836 de la carcasa 835 y dos chavetas 875 sobre la porcion superior 839 que coinciden con dos orificios 895 que flanquean la almohadilla de desechos 860 sobre el primer lado 836 de la carcasa 835. En otras realizaciones, los orificios 895 se encuentran sobre el segundo lado 837 de la carcasa 835 y las chavetas 875 se encuentran sobre el primer lado 836 de la carcasa 835. En aun otras realizaciones, se podrian usar otros mecanismos de sujecion reversible para afianzar la porcion superior 838 y/o la porcion inferior 839 del segundo lado 837 de la carcasa 835 al primer lado 836 de la carcasa 835. En otras realizaciones, las secciones superior e inferior 838, 839 se cierran de forma permanente, por ejemplo por medio de un adhesivo, antes del uso.
La solapa 1070 sobre el segundo lado 837 de la carcasa incluye dos zonas de conjugado 872, 874 y se puede abrir y cerrar con facilidad. La solapa 1070 preferiblemente tambien incluye al menos un boton, chaveta o saliente 875 que coincide con uno o mas orificios 895 de tal modo que la solapa 1070 se cierra correctamente con facilidad sobre el primer lado 836 de la carcasa 835 despues de que se haya anadido una muestra a las zonas de aplicacion de muestra 1073, 1076 sobre las tiras reactivas 1015, 1025. En otras realizaciones, los orificios 895 se encuentran sobre el segundo lado 837 de la carcasa 835 y las chavetas 875 se encuentran sobre el primer lado 836 de la carcasa 835. En aun otras realizaciones, se podrian usar otros mecanismos de sujecion reversible para afianzar la solapa 1070 al primer lado 836 de la carcasa 835.
En algunas realizaciones preferidas, las zonas de conjugado 872, 874 se colorean debido a los colorantes en los conjugados de muestra y los conjugados de control. En una realizacion preferida, la zona de conjugado 872 que se usa para la primera tira reactiva 1015 contiene un socio de union de MxA que esta marcado con un colorante de color rojo, un socio de union de CRP bajo que esta marcado con un colorante de color negro, y un socio de union de control que esta marcado con un colorante de color azul. En la presente realizacion, la zona de conjugado 872 aparece de color purpureo. La otra zona de conjugado 874 contiene un socio de union de CRP alto que esta marcado con un colorante de color negro y un socio de union de control que esta marcado con un colorante de color azul. En la presente realizacion, la zona de conjugado 874 aparece de color azulado.
La zona de desvio 850, que preferiblemente incluye una separation o barrera, interrumpe el flujo lateral, desviando el tampon de migracion hacia arriba hacia la solapa 1070 que incluye las zonas de conjugado 872, 874.
Durante el funcionamiento, las porciones superior e inferior 838, 839 del segundo lado 837 de la carcasa 835 preferiblemente se cierran a presion antes del uso al afianzar las chavetas 875 a los orificios 895. El dispositivo de analisis de muestras o tarjeta reactiva 1000 preferiblemente se coloca sobre una superficie plana. Si la solapa 1070 no esta ya abierta, el usuario la abre para acceder a las zonas de aplicacion de muestra 1073, 1076. Las zonas de aplicacion de muestra 1073, 1076 pueden estar ubicadas en cualquier porcion de la almohadilla de transferencia 1055. Se toma del paciente una muestra de sangre que se va a someter a prueba. La muestra se puede recoger por medio de cualquier procedimiento conocido en la tecnica. En una realizacion preferida, una muestra de 5 pl de
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sangre se anade a cada una de las zonas de las zonas de aplicacion de muestra 1073, 1076 y entonces se cierra la solapa 1070. Cada una de las muestras de 5 pl se recoge preferiblemente con independencia de la otra. La sangre preferiblemente se anade directamente al dispositivo 1000, sin pretratamiento alguno. En algunas realizaciones preferidas, una flecha 1002 u otra indicacion (que se muestra en la figura 48A), por ejemplo las palabras “anadir muestra aqui” muestran al usuario en donde colocar la muestra sobre las tiras reactivas 1015, 1025.
Para asegurar que la solapa 1070 se ha cerrado correctamente, se aplica preferiblemente una presion a la carcasa 835 por encima de las chavetas 875 para cerrar a presion las chavetas 875. Es necesario que la parte de arriba de la solapa 1070 se encuentre a nivel con la parte de arriba del resto del segundo lado 837 de la carcasa 835 para que la prueba se realice de forma apropiada. Se anade tampon de migracion a la almohadilla absorbente 840, lo que inicia el flujo lateral 885. En algunas realizaciones preferidas, el tampon de migracion incluye uno o mas agentes de lisis, por ejemplo detergentes, para lisar la muestra de sangre y exponer el MxA intracelular en la muestra. Cuando el tampon de migracion alcanza la zona de desvio 850, este se desvia hacia arriba hacia la solapa 1070. Este se desplaza a traves de las zonas de conjugado 872, 874, recogiendo los socios de union de MxA, los socios de union de CRP bajo, y los socios de union de CRP alto, asi como el conjugado de control.
Debido a que las zonas de conjugado 872, 874 forman un puente sobre la zona de desvio 850 sobre las tiras reactivas de flujo lateral 1015, 1025, el tampon de migracion, que ahora contiene un conjugado, se desplaza entonces a la almohadilla de transferencia 1055, que incluye las zonas de aplicacion de muestra 1073, 1076, y a las zonas de deteccion 805 sobre cada una de las tiras reactivas 1015, 1025. Si MxA se encuentra presente en la muestra, la linea de prueba de MxA 802 sobre la primera tira reactiva 1015 sera de color rojo. Si un nivel bajo umbral de CRP se encuentra presente en la muestra, la linea de prueba de CRP bajo (803) sobre la primera tira reactiva (1015) sera de color negro. Si un nivel alto umbral de CRP se encuentra presente en la muestra, la linea de prueba de CRP alto 823 sobre la segunda tira reactiva 1025 sera de color negro. En algunas realizaciones preferidas, los niveles de deteccion son 40 ng/ml para MxA, 10 mg/l para CRP bajo sobre la primera tira reactiva 1015 y 80 mg/l para CRP alto sobre la segunda tira reactiva 1025. Los resultados de la prueba deberian ser visibles despues de aproximadamente 5 - 20 minutos, preferiblemente en un plazo de aproximadamente 10 minutos. Si la prueba se realizo correctamente, las lineas de control 804 tanto sobre la primera tira 1015 como sobre la segunda tira reactiva 1025 seran de color azul.
Debido a que el socio de union de control se encuentra sobre la solapa (1070) y no sobre ninguna de las tiras reactivas 1015, 1025, hay un autentico control procedimental en esta configuracion. Si la solapa 1070 no se ha cerrado de forma apropiada, nada aparecera en la zona de deteccion 805, lo que indica que la prueba se realizo de forma no apropiada.
En una realizacion alternativa, las zonas de aplicacion de muestra 1073, 1076 estan ubicadas sobre la almohadilla de recepcion 845, antes de la zona de desvio 850. En la presente realizacion, el tampon de migracion se desplaza a traves de las zonas de aplicacion de muestra 1073, 1076, y entonces se desvia hacia la solapa 1070.
En algunas realizaciones preferidas de las configuraciones que se muestran en las figuras 46A a 46C y 48A a 48C, mas de aproximadamente 1,2 ml de tampon de migracion se coloca sobre la almohadilla absorbente 840. Si se anade menos de 1,0 ml en algunas realizaciones en las que la zona de desvio (850) es una separacion, el tampon queda atascado en la separacion debido a que la separacion contiene aproximadamente 1,0 ml.
Tal como se muestra en la figura 49, en una realizacion preferida, un kit 1100 incluye el dispositivo de analisis de muestras 800, 1000, una lanceta 1102, una o mas pipetas 1101 y un tampon de migracion 1103. La lanceta 1102 se usa para realizar una puncion en la piel y una o mas pipetas 1101 se usan para recoger la sangre del sitio de puncion. En una realizacion preferida, 5 pl de sangre se transfieren a partir de una primera pipeta 1101 a la primera zona de conjugado 872 y otros 5 pl de sangre se transfieren a partir de una segunda pipeta 1101 y se anaden a la segunda zona de conjugado 874. Se cierra la solapa 870, y el tampon de migracion 1103 se anade a la almohadilla absorbente 840, tal como se describe en la descripcion de las figuras 46A a 46C y 48A a 48C.
En otras realizaciones con un compresor de muestras 30, el compresor de muestras no incluye reactivo alguno para la prueba, y se usa solo para proporcionar una presion o para formar un puente sobre una zona de desvio sobre la tira reactiva.
A pesar de que los metodos y dispositivos se describen en el presente documento como ensayos en sandwich, los metodos y dispositivos de la presente invencion se pueden usar igualmente en ensayos competitivos. En estos ensayos competitivos, el conjugado preferiblemente incluye un analito o un analogo del analito, en lugar de un socio de union de analito, unido a un marcador o, como alternativa, el segundo socio de union se sustituye por el analito o analogo del analito. Un resultado positivo es indicado entonces por la falta o la presencia del marcador en la zona de prueba de la tira reactiva.
Por consiguiente, ha de entenderse que las realizaciones de la invencion que se describe en el presente documento son meramente ilustrativas de la aplicacion de los principios de la invencion. La referencia en el presente documento a detalles de las realizaciones ilustradas no tiene por objeto limitar el alcance de las reivindicaciones, que enuncian
por si mismas las caracteristicas que se consideran esenciales para la invencion.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un dispositivo de flujo lateral para detectar un analito en una muestra, que comprende:
    un compresor de muestras;
    una tira reactiva que comprende una zona de prueba y una zona de desvio aguas arriba de la zona de prueba, en donde la zona de desvio interrumpe el flujo lateral sobre la tira reactiva; un conjugado que comprende un primer socio de union para el analito y un marcador; y un segundo socio de union para el analito; y
    una zona de aplicacion de muestra donde se aplica una muestra al dispositivo de flujo lateral, en donde la zona de aplicacion de muestra esta ubicada en una ubicacion que esta seleccionada de entre el grupo que consiste en: i) sobre la tira reactiva aguas arriba de la zona de deteccion; ii) sobre el compresor de muestras; y iii) sobre un colector de muestras que comprende una porcion de recogida de muestras para la recogida de la muestra; en donde un componente que esta seleccionado de entre el grupo que consiste en el conjugado, el segundo socio de union y tanto el conjugado como el segundo socio de union no esta ubicado sobre la tira reactiva antes del uso del dispositivo de flujo lateral; y
    en donde el compresor de muestras crea un puente por encima de la zona de desvio para desviar el flujo sobre el compresor de muestras y devolver el flujo a la tira reactiva en el extremo de la zona de desvio.
  2. 2. El dispositivo de flujo lateral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que, cuando la zona de aplicacion de muestra se encuentra sobre un colector de muestras, el colector de muestras esta ubicado entre el compresor de muestras y la tira reactiva en una pila vertical.
  3. 3. El dispositivo de flujo lateral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la zona de desvio comprende: (A) una barrera fisica que detiene o retarda el flujo en una direccion lateral sobre la tira reactiva, (B) una barrera quimica que detiene o retarda el flujo en una direccion lateral sobre la tira reactiva, o (C) una separacion que detiene el flujo en una direccion lateral sobre la tira reactiva.
  4. 4. El dispositivo de flujo lateral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la zona de desvio comprende una barrera fisica que detiene o retarda el flujo en una direccion lateral sobre la tira reactiva y en el que la barrera fisica comprende componentes encapsulados y la barrera fisica se disuelve tras la aplicacion de un medio de elucion.
  5. 5. El dispositivo de flujo lateral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el compresor de muestras comprende una almohadilla y en el que el conjugado o el segundo socio de union estan ubicados sobre la almohadilla antes del uso del dispositivo de flujo lateral.
  6. 6. El dispositivo de flujo lateral de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el compresor de muestras comprende una almohadilla que comprende un primer socio de union de control que esta ubicado sobre la almohadilla y un segundo socio de union de control que esta inmovilizado en una zona de control de la tira reactiva, en donde el primer socio de union de control es un socio de union para el segundo socio de union de control.
  7. 7. El dispositivo de flujo lateral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el dispositivo de flujo lateral esta formado de tal modo que solo se logra un resultado positivo mediante la captura del analito en la zona de prueba a traves de la formacion de un complejo entre el analito, el primer socio de union y el segundo socio de union.
  8. 8. El dispositivo de flujo lateral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la zona de prueba no comprende molecula alguna que se una especificamente al analito.
  9. 9. El dispositivo de flujo lateral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el segundo socio de union comprende una marca y la zona de prueba comprende un socio de union inmovilizado de la marca.
  10. 10. Un metodo de realizacion un ensayo de una muestra sobre un dispositivo de flujo lateral que comprende una tira reactiva y un compresor de muestras, comprendiendo el metodo las etapas de:
    a) colocar una muestra sobre el dispositivo de flujo lateral;
    b) interrumpir el flujo lateral sobre la tira reactiva mediante la inclusion de una zona de desvio sobre la tira reactiva;
    c) desviar el flujo interrumpido al compresor de muestras mediante la aplicacion de una presion al dispositivo usando el compresor de muestras; y
    d) devolver el flujo a la tira reactiva en el extremo de la zona de desvio.
  11. 11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que, en la etapa a), la muestra se coloca sobre una zona de aplicacion de muestra que esta ubicada en una ubicacion que esta seleccionada de entre el grupo que consiste en: i) sobre la tira reactiva aguas arriba de una zona de deteccion; ii) sobre el compresor de muestras; y iii) sobre un colector de muestras que comprende una porcion de recogida de muestras para la recogida de la muestra.
  12. 12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que, cuando la muestra se coloca sobre un colector de muestras, el colector de muestras esta ubicado entre el compresor de muestras y la tira reactiva en una pila vertical; y
    en el que, de forma opcional, la etapa a) comprende adicionalmente colocar una almohadilla con un socio de union 5 para un analito sobre la pila vertical y en el que en la etapa d) al menos una porcion del socio de union se transfiere a la tira reactiva.
  13. 13. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que la zona de desvio comprende una barrera fisica que detiene o retarda el flujo en una direccion lateral sobre la tira reactiva; y
    10 en el que, de forma opcional, la barrera fisica comprende al menos un componente encapsulado, que comprende adicionalmente la etapa de disolver la barrera fisica para liberar el componente encapsulado.
  14. 14. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que la zona de desvio comprende una separacion que detiene el flujo en una direccion lateral sobre la tira reactiva.
    15
  15. 15. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el compresor de muestras comprende un componente que esta seleccionado de entre el grupo que consiste en un primer socio de union, un segundo socio de union y tanto el primer socio de union como el segundo socio de union.
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