KR102489679B1 - 바이러스 및 박테리아 감염의 복합 검출을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

측방향 유동 분석은 바이러스 감염과 박테리아 감염을 검출 및 구별할 수 있다. 복합 현장 검사 진단 장치는, 바이러스 감염과 박테리아 감염의 신속한 구별을 효과적으로 돕기 위해서, 바이러스 감염에 대한 마커 및 박테리아 감염에 대한 마커를 시험한다. 일부의 바람직한 실시예에서, 바이모달 방법 및 장치는 감염이 박테리아성 및/또는 바이러스성인지를 결정한다. 이중용도의 2개 스트립의 샘플 분석 장치는 MxA 및 낮은 레벨의 C-반응성 단백질을 검출하는 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립, 및 높은 레벨의 C-반응성 단백질을 검출하는 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함한다. 일부의 바람직한 실시예에서, 샘플은 핑거스틱 혈액 샘플이다.

Description

바이러스 및 박테리아 감염의 복합 검출을 위한 방법 및 장치{METHOD AND DEVICE FOR COMBINED DETECTION OF VIRAL AND BACTERIAL INFECTIONS}

관련 출원에 대한 참조

본 출원은 하기의 계류중인 출원으로부터 우선권을 주장한다:

"전환 구역을 이용한 다면 측방향 유동 분석(MULTIPLANAR LATERAL FLOW ASSAY WITH DIVERTING ZONE)"이라는 명칭으로 2013년 3월 7일자로 출원된 미국 출원 제13/788,616호;

"바이러스 및 박테리아 감염의 복합 검출을 위한 방법 및 장치(METHOD AND DEVICE FOR COMBINED DETECTION OF VIRAL AND BACTERIAL INFECTIONS)"라는 명칭으로 2013년 3월 8일자로 출원된 미국 출원 제13/790,125호;

"바이러스 및 박테리아 감염의 복합 검출을 위한 방법 및 장치(METHOD AND DEVICE FOR COMBINED DETECTION OF VIRAL AND BACTERIAL INFECTIONS)"라는 명칭으로 2013년 3월 8일자로 출원된 미국 출원 제13/790,160호.

기술분야

본 발명은 측방향 유동 면역분석(lateral flow immunoassay)의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 바이러스 및 박테리아 감염을 신속하게 검출하는 측방향 유동 면역분석에 관한 것이다.

발열(fever)은 가정의학과 및 소아과 병원 모두의 응급 진료 센터에 대한 유아기 방문의 일반적인 원인이다. 가장 일반적으로, 이것은, 호흡기 감염 또는 위장염(gastroenteritis)과 관련된다. 소아에 있어서의 발열의 높은 발생률 및 불필요한 항생제의 신중한 투여는 바이러스 및/또는 박테리아 감염을 나타내는 바이오마커(biomarker)를 위한 신속한 스크리닝 시험(screening test)을 개발하는 이유이다.

흔히 바이러스 감염을 박테리아 감염과 구별하는 것이 어렵다. 이것은 자신의 증상을 말로 표현할 수 없는 유아, 및 실험실 진단의 이용이 고가이고 시간 소모적이며, 결과를 생성하는 데 수일이 필요한 외래환자에서 특히 그렇다. 최근에는, 많은 새로운 진단 마커가 알려져 있다. 이와 같은 마커들 중 몇몇은 바이러스 감염을 박테리아 감염과 구별하는데 큰 가능성을 보여준다. 이와 같은 2개의 단백질은 MxA와 C-반응성 단백질(CRP)을 포함한다. 대부분의 호흡기 감염은 40%가 바이러스에 의해 유발되고 25 내지 50%가 A군 베타 용혈성 연쇄구균(group A beta hemolytic streptococcus)에 의해 유발되는 인두염과 관련된다. 보다 적은 원인은 급성의 세기관지염(bronchiolitis) 및 폐렴(pneumonia)이다.

중증 지역사회 획득 폐렴은 케이스의 약 60%가 박테리아 감염에 의해 유발되어, 환자의 약 10%가 중환자실(ICU)에 입원할 필요가 있다. 나머지의 30%는 호흡기 바이러스와 관련된다.

모든 항균제(antimicrobials)의 약 80%가 1차 진료 시에 처방되고, 이들의 80%까지가 기도의 증상을 위한 것이다. 기도 감염은 1차 진료 시에 기침의 단연코 가장 일반적인 원인이다. 광범위 항생제는 급성 기관지염을 포함하는 기침에 대해 흔히 처방되고, 이와 같은 처방의 대부분은 유익하더라도 환자에게는 아주 조금 유익할 뿐이며, 부작용을 일으키고, 항생제 내성을 증가시킬 수도 있다. 의사가 항생제를 투여하게 하는 요인은, 박테리아 감염의 적절한 진단 바이오마커의 결여, 환자의 추적 조사의 결핍에 대한 걱정, 및 시간적 압박을 포함한다.

Mx 단백질은 고분자량 GTPase의 상과(superfamily)의 일부이다. 따라서, 이와 같은 GTPase는 Ⅰ형 알파/베타 또는 Ⅱ형 인터페론(interferon; IFN)에 의해 상향 조절된다. Mx GTPase는 오직 IFN 알파/베타 인터페론 처리된 세포에서만 발현되고, IFN 감마 인터페론 처리된 세포에서는 발현되지 않는다. Ｉ형 인터페론은 선천성 면역 반응에 중요한 역할을 하고, 면역조정성, 항증식성 및 항바이러스성 기능을 갖는다. 인간 MxA, 즉 78kDa 단백질은 IFN 처리된 세포의 세포질에 축적하지만, 광범위한 바이러스의 복제를 억제한다. MxA 단백질은, 보다 낮은 기초 농도, 보다 긴 반감기(2.3일) 및 빠른 유도 때문에, 2',5'-올리고아데닐산 합성효소 (oligoadenylate synthetase)와 같은 다른 유도 단백질에 비해 바이러스 감염을 위한 마커로서 특정 이점을 제공할 수 있다. MxA mRNA는, IFN 유도의 1 내지 2시간 이내에 IFN으로 자극된 격리 말초 혈액의 백혈구에서 검출 가능하고, MxA 단백질은 그 후에 바로 축적하기 시작한다.

연구들에 의해, 말초 혈액에서의 MxA 단백질의 발현이 바이러스 감염에 대한 민감성 및 특이적 마커라는 것이 드러나고 있다. 박테리아 감염 군과 비교하여 바이러스 감염 군에서의 보다 높은 MxA 레벨은, MxA 단백질이 오직 Ｉ형 IFN에 의해서만 유도되고, IFN-감마, IL-1, TNF-알파, 또는 박테리아 감염에 의한 임의의 다른 사이토카인에 의해서는 유도되지 않는다는 사실로 설명될 수 있다. 혈청 Ｉ형 IFN 레벨은 심지어 심각한 박테리아에 감염된 환자에게서도 정상 한계 내에서 유지된다.

유사하게, 대부분의 바이러스 감염은 급성기 반응(acute phase response)을 거의 일으키지 않는 것으로 보고되고 있으며, 낮은 C-반응성 단백질(CRP) 농도는 바이러스 유래의 질병과 박테리아 병인의 질병을 구별하는 데 사용되고 있다. CRP의 혈장 농도가 자극 후에 급속하게 증가하고, 짧은 반감기로 인해 급속하게 감소하기 때문에, CRP는 감염 및 염증성 질환을 진단 및 모니터링하는 데 매우 유용한 도구일 수 있다. 스칸디나비아에서는, CRP 현장 검사는 일반 진료에 있어서 호흡기 감염된 환자의 일상적인 평가의 일부이며, 그 사용은 비용 효율적인 것으로 증명되어 있다. 일반 진료에 있어서, CRP는 박테리아 질환의 진단, 및 박테리아 감염과 바이러스 감염의 구별에 매우 유용한 것으로 알려져 있다. 흔히, CRP의 진단값은 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate; ESR)의 진단값보다 우수하고, 백혈구 수치(white blood cell count; WBC)의 진단값과 동등하거나 더 우수한 것으로 알려져 있다.

임상적으로, 특정의 전신성 바이러스 감염과 박테리아 감염을 구별하는 것은 어려울 수 있다. 폐렴과 같은 중증 감염의 경우, 또는 오진의 결과가 패혈성 인두염(Strep throat) 등을 갖는 중증 합병증으로 이어질 수 있는 경우에, 박테리아 배양이 통상 수행된다. 때때로, 배양균을 얻기 곤란하다. 불행하게도, 바이러스 배양은 결과를 받는데 상당한 시간이 지체되므로 일상적으로는 수행되지 않는다. 새로운 바이러스 스크리닝 PCR 패널은 유용하지만, 고가이고, 현장 검사에서 정보를 제공하지 못한다. 따라서, 바이러스 감염과 박테리아 감염을 구별할 수 있는 진단 시험을 간단하고 용이하게 사용하기 위한 요구가 여전히 남아있다.

본 발명은, 바이러스 감염과 박테리아 감염을 검출 및 구별할 수 있는 측방향 유동 분석을 제공한다. 복합 현장 검사 진단 장치는, 바이러스 감염과 박테리아 감염의 신속한 구별을 효과적으로 돕기 위해서, 바이러스 감염에 대한 마커 및 박테리아 감염에 대한 마커를 시험한다. 한 바람직한 실시예에서, 박테리아 마커는 CRP이다. 다른 바람직한 실시예에서, 바이러스 마커는 MxA이다. 본 발명의 일부 실시예에 있어서, 샘플을 장치에 적용하기 전에, 샘플 내의 세포를 용해시키는 것은 불필요하다.

하나의 바람직한 실시예에서, 방법은 우선 샘플을 채취함으로써 감염이 박테리아성 및/또는 바이러스성인지를 결정한다. 그 후에, 샘플은 이중용도의 2개 스트립의 샘플 분석 장치로 이송된다. 샘플 분석 장치는 제1 시약 구역 및 제2 시약 구역을 갖는 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함한다. 제1 시약 구역은 낮은 레벨의 C-반응성 단백질에 특이적인 적어도 하나의 제1 시약을 포함하고, 그에 따라 샘플이 제1 시약과 접촉하는 경우, 낮은 레벨의 C-반응성 단백질이 샘플 내에 존재하면 제1 표지식 복합체가 형성된다. 제2 시약 구역은 MxA에 특이적인 적어도 하나의 제2 시약을 포함하고, 그에 따라 샘플이 제2 시약과 접촉하는 경우, MxA가 샘플 내에 존재하면 제2 표지식 복합체가 형성된다. 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 또한 제1 표지식 복합체에 결합되는 제1 결합 파트너, 및 제2 표지식 복합체에 결합되는 제2 결합 파트너를 포함하는 제1 검출 구역을 포함한다. 2개 스트립의 측방향 유동 분석 장치는 또한 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립에 대해 측방향 유동 방향으로 평행한 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함한다. 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 높은 레벨의 C-반응성 단백질에 특이적인 적어도 하나의 제3 시약을 포함하는 적어도 하나의 제3 시약 구역을 포함하고, 그에 따라 샘플이 제3 시약과 접촉하는 경우, 높은 레벨의 C-반응성 단백질이 샘플 내에 존재하면 제3 표지식 복합체가 형성된다. 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상의 제3 시약은 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상의 제2 시약에 의해 검출된 C-반응성 단백질의 레벨보다 높은 C-반응성 단백질의 레벨만을 검출한다. 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 또한 제3 표지식 복합체에 결합되는 제3 결합 파트너를 포함하는 제2 검출 구역을 포함한다. 샘플은 또한 낮은 레벨의 C-반응성 단백질, MxA 및 높은 레벨의 C-반응성 단백질의 존재에 대해 분석된다.

다른 바람직한 실시예에서, 이중용도의 2개 스트립의 측방향 유동 분석 장치는 샘플 내의 박테리아 마커 및/또는 바이러스 마커를 검출한다. 이 장치는 제1 시약 구역 및 제2 시약 구역을 갖는 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함한다. 제1 시약 구역은 낮은 레벨의 C-반응성 단백질에 특이적인 적어도 하나의 제1 시약을 포함하고, 그에 따라 샘플이 제1 시약과 접촉하는 경우, 낮은 레벨의 C-반응성 단백질이 샘플 내에 존재하면 제1 표지식 복합체가 형성된다. 제2 시약 구역은 MxA에 특이적인 적어도 하나의 제2 시약을 포함하고, 그에 따라 샘플이 제2 시약과 접촉하는 경우, MxA가 샘플 내에 존재하면 제2 표지식 복합체가 형성된다. 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 또한 제1 표지식 복합체에 결합되는 제1 결합 파트너, 및 제2 표지식 복합체에 결합되는 제2 결합 파트너를 포함하는 제1 검출 구역을 포함한다. 2개 스트립의 측방향 유동 분석 장치는 또한 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립에 대해 측방향 유동 방향으로 평행한 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함한다. 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 높은 레벨의 C-반응성 단백질에 특이적인 적어도 하나의 제3 시약을 포함하는 적어도 하나의 제3 시약 구역을 포함하고, 그에 따라 샘플이 제3 시약과 접촉하는 경우, 높은 레벨의 C-반응성 단백질이 샘플 내에 존재하면 제3 표지식 복합체가 형성된다. 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상의 제3 시약은 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상의 제2 시약에 의해 검출된 C-반응성 단백질의 레벨보다 높은 C-반응성 단백질의 레벨만을 검출한다. 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 또한 제3 표지식 복합체에 결합되는 제3 결합 파트너를 포함하는 제2 검출 구역을 포함한다.

다른 바람직한 실시예는 감염이 박테리아성 및/또는 바이러스성인지를 결정하는 방법이며, 샘플을 채취하는 단계를 포함한다. 그 후에, 샘플은 샘플 분석 장치로 이송된다. 샘플 분석 장치는 제1 시약 구역 및 제2 시약 구역을 갖는 샘플 압축기(sample compressor)를 포함하며, 제1 시약 구역은 낮은 레벨의 C-반응성 단백질에 특이적인 적어도 하나의 제1 시약, 및 MxA에 특이적인 적어도 하나의 제2 시약을 포함하고, 그에 따라 샘플이 제1 시약과 접촉하는 경우, 낮은 레벨의 C-반응성 단백질이 샘플 내에 존재하면 제1 표지식 복합체가 형성되며, 샘플이 제2 시약과 접촉하는 경우, MxA가 샘플 내에 존재하면 제2 표지식 복합체가 형성되며, 제2 시약 구역은 높은 레벨의 C-반응성 단백질에 특이적인 적어도 하나의 제3 시약을 포함하고, 제3 시약은 제1 시약에 의해 검출된 C-반응성 단백질의 레벨보다 높은 C-반응성 단백질의 레벨만을 검출하고, 그에 따라 샘플이 제3 시약과 접촉하는 경우, 높은 레벨의 C-반응성 단백질이 샘플 내에 존재하면 제3 표지식 복합체가 형성된다. 또한, 상기 장치는 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함하며, 이 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 제1 표지식 복합체에 결합되는 제1 결합 파트너 및 제2 표지식 복합체에 결합되는 제2 결합 파트너를 포함하는 제1 검출 구역, 및 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상에서 제1 검출 구역의 상류 측에 위치되는 제1 전환 구역을 포함한다. 제1 전환 구역은 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상에서의 측방향 유동을 차단한다. 상기 장치는 또한 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립에 대해 측방향 유동 방향으로 평행한 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함한다. 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 제3 표지식 복합체에 결합되는 제3 결합 파트너를 포함하는 제2 검출 구역, 및 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상에서 제2 검출 구역의 상류 측에 위치되는 제2 전환 구역을 포함한다. 제2 전환 구역은 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상에서의 측방향 유동을 차단한다. 상기 장치는 또한 샘플이 샘플 분석 장치상에 배치되는 곳인 제1 샘플 적용 구역을 포함한다. 제1 샘플 적용 구역은, i) 검출 구역의 상류 측의 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상의 위치, 및 ii) 샘플 압축기의 제1 시약 구역 상의 위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 위치에 위치된다. 상기 장치는 또한 샘플이 샘플 분석 장치상에 배치되는 곳인 제2 샘플 적용 구역을 포함한다. 제2 샘플 적용 구역은, i) 검출 구역의 상류 측의 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상의 위치, 및 ii) 샘플 압축기의 제2 시약 구역 상의 위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 위치에 위치된다. 샘플 압축기는 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 및 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립과는 상이한 평면에 있다. 샘플 압축기의 제1 시약 구역은 제1 전환 구역 위에 브리지를 생성하고 샘플 압축기의 제2 시약 구역은 제2 전환 구역 위에 브리지를 생성하여, 유동을 샘플 압축기 상으로 전환시키고 제1 전환 구역 및 제2 전환 구역의 단부에서 유동을 제1 크로마토그래피 시험 스트립 및 제2 크로마토그래피 시험 스트립으로 복귀시킨다. 샘플은 낮은 레벨의 C-반응성 단백질, MxA 및 높은 레벨의 C-반응성 단백질의 존재에 대해 분석된다.

다른 바람직한 실시예는 샘플 내의 분석물을 검출하기 위한 측방향 유동 장치이다. 상기 장치는 제1 시약 구역 및 제2 시약 구역을 갖는 샘플 압축기를 포함하며, 제1 시약 구역은 낮은 레벨의 C-반응성 단백질에 특이적인 적어도 하나의 제1 시약, 및 MxA에 특이적인 적어도 하나의 제2 시약을 포함하고, 그에 따라 샘플이 상기 제1 시약과 접촉하는 경우, 낮은 레벨의 C-반응성 단백질이 샘플 내에 존재하면 제1 표지식 복합체가 형성되며, 샘플이 제2 시약과 접촉하는 경우, MxA가 샘플 내에 존재하면 제2 표지식 복합체가 형성되며, 제2 시약 구역은 높은 레벨의 C-반응성 단백질에 특이적인 적어도 하나의 제3 시약을 포함하고, 제3 시약은 제2 시약에 의해 검출된 C-반응성 단백질의 레벨보다 높은 C-반응성 단백질의 레벨만을 검출하고, 그에 따라 샘플이 제3 시약과 접촉하는 경우, 높은 레벨의 C-반응성 단백질이 샘플 내에 존재하면 제3 표지식 복합체가 형성된다. 또한, 상기 장치는 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함하며, 이 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 제1 표지식 복합체에 결합되는 제1 결합 파트너 및 제2 표지식 복합체에 결합되는 제2 결합 파트너를 포함하는 제1 검출 구역, 및 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상에서 제1 검출 구역의 상류 측에 위치되는 제1 전환 구역을 포함한다. 제1 전환 구역은 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상에서의 측방향 유동을 차단한다. 상기 장치는 또한 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립에 대해 측방향 유동 방향으로 평행한 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립을 포함한다. 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립은 제3 표지식 복합체에 결합되는 제3 결합 파트너를 포함하는 제2 검출 구역, 및 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상에서 제1 검출 구역의 상류 측에 위치되는 제2 전환 구역을 포함한다. 제2 전환 구역은 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상에서의 측방향 유동을 차단한다. 상기 장치는 또한 샘플이 샘플 분석 장치상에 배치되는 곳인 제1 샘플 적용 구역을 포함한다. 제1 샘플 적용 구역은, i) 검출 구역의 상류 측의 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상의 위치, 및 ii) 샘플 압축기의 제1 시약 구역 상의 위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 위치에 위치된다. 상기 장치는 또한 샘플이 샘플 분석 장치상에 배치되는 곳인 제2 샘플 적용 구역을 포함한다. 제2 샘플 적용 구역은, i) 검출 구역의 상류 측의 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 상의 위치, 및 ii) 샘플 압축기의 제2 시약 구역 상의 위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 위치에 위치된다. 샘플 압축기는 제1 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립 및 제2 측방향 유동 크로마토그래피 시험 스트립과는 상이한 평면에 있다. 샘플 압축기의 제1 시약 구역은 제1 전환 구역 위에 브리지를 생성하고 샘플 압축기의 제2 시약 구역은 제2 전환 구역 위에 브리지를 생성하여, 유동을 샘플 압축기 상으로 전환시키고 제1 전환 구역 및 제2 전환 구역의 단부에서 유동을 제1 크로마토그래피 시험 스트립 및 제2 크로마토그래피 시험 스트립으로 복귀시킨다.

다른 바람직한 실시예에서, 방법은 샘플을 채취하고 이 샘플을 샘플 분석 장치로 이송함으로써, 적어도 하나의 세포외 분석물 및 적어도 하나의 세포내 분석물을 동시에 검출한다. 샘플은 또한 용해되고, 동일한 샘플 분석 장치상에서 세포외 분석물 및 세포내 분석물이 동시에 검출된다. 하나의 바람직한 실시예에서, 세포외 분석물은 C-반응성 단백질이고, 세포내 분석물은 MxA 단백질이다.

다른 바람직한 실시예에서, 샘플 내의 MxA 단백질 및 C-반응성 단백질을 검출하는 방법은, 제1 표지에 접합되는 MxA 단백질에 대한 항체와 상기 제1 표지와 상이한 제2 표지에 접합되는 C-반응성 단백질에 대한 항체의 혼합물에 샘플을 추가하는 단계, MxA 단백질에 대한 항체가 응집했는지의 여부를 결정함으로써 MxA 단백질의 존재를 검출하는 단계, 및 C-반응성 단백질에 대한 항체가 응집했는지의 여부를 결정함으로써 C-반응성 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 샘플에서의 알려지지 않은 바이러스 감염의 존재를 검출하는 방법은 우선 샘플을 채취한다. 그 후에, 샘플은 샘플 분석 장치의 샘플 적용 구역으로 이송된다. 샘플 분석 장치는, 표지를 내측에 갖는 시알산 나노마이셀을 포함하는 컨쥬게이트(conjugate) 구역, 및 샘플 적용 구역으로부터 측 방향으로 하류 측에 위치되고, 시알산 동족체 나노입자를 포함하는 검출 구역을 포함한다. 샘플은 검출 구역에서 양성 결과에 대해 분석된다.

다른 바람직한 실시예에서, 샘플에서의 알려지지 않은 바이러스 감염의 존재를 검출하는 방법은 우선 샘플을 채취한다. 그 후에, 샘플은 샘플 분석 장치의 샘플 적용 구역으로 이송된다. 샘플 분석 장치는, 바이러스 감염을 유발하는 특정 바이러스에 대한 결합 파트너 및 표지를 포함하는 나노마이셀, 및 표지를 내측에 포함하는 시알산 동족체 나노마이셀로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 분자를 갖는 컨쥬게이트 구역을 포함한다. 또한, 샘플 분석 장치는 샘플 적용 구역으로부터 측방향으로 하류 측에 위치되고, 바이러스 감염을 유발하는 바이러스에 특이적인 나노입자를 갖는 검출 구역을 포함한다. 샘플은 검출 구역에서 양성 결과에 대해 분석된다.

도 1은 바이러스 감염과 박테리아 감염을 구별하기 위한 신속한 스크리닝 시험 윈도우의 외관 시험 결과 및 그 결과의 해석을 도시한다.
도 2는 상이한 색상의 시험 라인을 갖는 3개의 카세트를 도시한다.
도 3은 라인 모두가 동일한 색상인 2개 라인 검출기, 및 라인 모두가 상이한 색상을 갖는 초민감성의 2개 라인 검출기의 비교를 도시한다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에서 바이러스 마커의 존재에 대응하는 시험 라인, 및 박테리아 마커의 존재를 검출하는 제2의 별개 시험 라인을 갖는 장치를 도시한다.
도 4b는 본 발명의 다른 실시예에서 바이러스 마커의 존재에 대응하는 시험 라인, 및 박테리아 마커의 존재를 검출하는 제2의 별개 시험 라인을 갖는 장치를 도시한다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에서 샘플 적용 구역과 시약 구역 사이에 위치된 용해 구역을 포함하는 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에서 샘플 적용 구역과 중첩하는 용해 구역을 포함하는 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에서 시약 구역과 중첩하는 용해 구역을 포함하는 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에서 샘플 적용 구역 및 시약 구역과 중첩하는 용해 구역을 포함하는 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에서 고CRP 레벨과 같은 박테리아 마커의 존재에 대응하는 시험 라인을 갖는 장치를 도시한다.
도 6b는 본 발명의 다른 실시예에서 고CRP 레벨과 같은 박테리아 마커의 존재에 대응하는 시험 라인을 갖는 장치를 도시한다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에서 샘플 적용 구역과 시약 구역 사이에 위치된 용해 구역을 포함하는 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에서 샘플 적용 구역과 중첩하는 용해 구역을 포함하는 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에서 시약 구역과 중첩하는 용해 구역을 포함하는 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 7d는 본 발명의 일 실시예에서 샘플 적용 구역 및 시약 구역과 중첩하는 용해 구역을 포함하는 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에서 이중 시험 스트립뿐만 아니라, 이 시험 스트립으로부터 분리된 평면에서의 샘플 압축기 상에 컨쥬게이트 구역 및 샘플 적용 구역을 갖는 완전 개방 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 8b는 도 8a의 샘플 분석 장치를 도시하는 것으로서, 하우징의 일부가 폐쇄되었지만 컨쥬게이트 구역이 여전히 장치의 좌측에서 보이고 있다.
도 8c는 시험이 개시된 후의 도 8a의 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에서 MxA 및 CRP 모두에 대해 음성인 시험 결과를 도시한다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에서 MxA에 대해 양성인 시험 결과를 도시한다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에서 MxA에 대해 양성인 시험 결과를 도시한다.
도 9d는 본 발명의 일 실시예에서 CRP에 대해 양성인 시험 결과를 도시한다.
도 9e는 본 발명의 일 실시예에서 CRP에 대해 양성인 시험 결과를 도시한다.
도 9f는 본 발명의 일 실시예에서 동시 감염을 나타내는 CRP 및 MxA 모두에 대해 양성인 시험 결과를 도시한다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에서 이중 시험 스트립, 및 이 시험 스트립으로부터 분리된 평면에서의 샘플 압축기 상에 컨쥬게이트 구역을 갖는 완전 개방 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 10b는 도 10a의 샘플 분석 장치를 도시하는 것으로서, 하우징의 일부가 폐쇄되었지만 컨쥬게이트 구역이 여전히 장치의 좌측에서 보이고 있다.
도 10c는 시험이 개시된 후의 도 10a의 샘플 분석 장치를 도시한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 샘플 분석 장치를 사용한 샘플 분석을 위한 키트를 도시한다.
도 12는 본 발명의 다른 실시예에서 이중 시험 스트립을 갖는 샘플 분석 장치를 도시한다.

본 발명은 바이러스 감염과 박테리아 감염을 구별할 수 있는 측방향 유동 분석을 제공한다. 특정 박테리아 또는 바이러스 감염에 특이적인 분석물(analyte)에 대해 시험하는 대신에, 본 명세서에서 설명되는 측방향 유동 분석은 일반적인 비특정 박테리아 감염 및 일반적인 비특정 바이러스 감염에 반응하여 숙주(host)에 특이적으로 생성되는 진단 마커에 대해 시험한다. 진단 마커는 바람직하게는 박테리아 또는 바이러스 유래의 비특정적이고 및/또는 알려지지 않은 질병의 마커이다. 바람직한 실시예에서, 비특정적이고 및/또는 알려지지 않은 박테리아 및/또는 바이러스 감염에 대한 분석 반응을 위한 특정 마커이다.

복합 현장 검사 진단 장치는 바이러스 감염과 박테리아 감염 모두에 대한 마커를 시험하고, 예를 들어 외래환자 진료실에서, 또는 응급 진료 방문 동안에, 바이러스 감염과 박테리아 감염의 신속한 구별을 효과적으로 도울 수 있다. 이와 같은 능력은, 오진 및 그 후의 항생제 남용을 제한함으로써, 의료 비용을 크게 절감할 수 있다. 이와 같은 실천에 의해, 항생제 알레르기, 부작용 발생, 및 항생제 내성을 제한할 수 있다. 시험으로부터 결과를 신속하게 얻는 것에 의해, 또한 환자가 의사에 의해 여전히 검사되고 있는 동안에 진단이 가능하게 된다. 바람직한 실시예에 있어서, 시험 결과는 샘플을 장치에 적용한 후 10분 이내에 얻어지고, 바람직하게는 약 10분에 판독된다. 높은 양성인 샘플에서는, 시험 라인은 약 1 내지 5분 이내에 보여진다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 측방향 유동 면역분석 장치는, 버퍼일 수 있는 샘플 이송 액체와, 샘플이 유동하게 하는 모세관 특성을 갖는 하나 또는 몇몇 플리스(fleece) 재료 또는 막을 포함하는 크로마토그래피 시험 스트립을 포함한다. 시험 스트립을 위한 일부의 바람직한 재료 또는 막은, Dacron® 섬유와 같은 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 섬유, 니트로셀룰로오스, 폴리에스테르, 나일론, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리프로필렌, 유리 섬유, 및 이들 재료 및 그 백킹부의 조합을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 일부 실시예에서, 샘플을 시험 스트립에 적용하기 전에, 샘플 내의 세포를 용해시키거나 임의의 방식으로 샘플을 처리하는 것은 불필요하다.

본 발명의 하나의 바람직한 방법은 샘플 분석 장치, 예를 들어 크로마토그래피 시험 스트립을 사용하여 감염이 박테리아성인지 바이러스성인지를 결정한다. 이와 같은 방법에서, 샘플이 채취되어, 크로마토그래피 시험 스트립으로 이송된다. 바람직한 실시예에서, 샘플은 백혈구를 포함하는 샘플이다. 시험 스트립은 시약 구역을 포함한다. 시약 구역은 바람직하게는 박테리아 마커에 특이적인 적어도 하나의 제1 시약을 포함하고, 그에 따라 샘플 내에 존재하는 박테리아 마커가 제1 시약과 접촉하는 경우, 제1 표지식 복합체가 형성된다. 시약 구역은 또한 바람직하게는 바이러스 마커에 특이적인 적어도 하나의 제2 시약을 포함하고, 그에 따라 샘플 내에 존재하는 바이러스 마커가 제2 시약과 접촉하는 경우, 제2 표지식 복합체가 형성된다. 검출 구역은 제1 표지식 복합체에 결합되는 박테리아 마커 결합 파트너, 및 제2 표지식 복합체에 결합되는 바이러스 마커 결합 파트너 모두를 포함한다. 그 후에, 샘플은 바이러스 마커 및/또는 박테리아 마커의 존재에 대해 분석된다.

본 발명의 장치의 바람직한 실시예는 샘플 적용 구역을 포함한다. 상기 장치는 또한 시약 구역을 포함하며, 이와 같은 시약 구역은, 박테리아 마커에 특이적인 적어도 하나의 제1 시약으로서, 샘플 내에 존재하는 박테리아 마커가 제1 시약과 접촉하는 경우, 제1 표지식 복합체가 형성되는, 적어도 하나의 제1 시약과, 박테리아 마커에 특이적인 적어도 하나의 제2 시약으로서, 샘플 내에 존재하는 바이러스 마커가 제2 시약과 접촉하는 경우, 제2 표지식 복합체가 형성되는, 적어도 하나의 제2 시약을 포함한다. 상기 장치상의 검출 구역은 제1 표지식 복합체에 결합되는 박테리아 마커 결합 파트너, 및 제2 표지식 복합체에 결합되는 바이러스 마커 결합 파트너를 포함한다. 사용될 수 있는 장치의 하나의 예는 크로마토그래피 시험 스트립이다. 다른 바람직한 실시예에서, 상기 장치의 구역들 중 일부는 하나 이상의 크로마토그래피 시험 스트립 상에 있는 반면, 다른 구역들(예를 들면, 시약 구역, 샘플 적용 구역, 및/또는 대조 결합 파트너)은 크로마토그래피 시험 스트립으로부터 분리되고 그와 상이한 평면에 있는 샘플 압축기 상에 있다.

바람직한 실시예에서, 바이러스 마커 또는 박테리아 마커의 존재는 육안으로 보이는 시험 라인에 의해 나타내진다. 바이러스 마커의 존재는 제1 시험 라인에 의해 나타내질 수 있는 한편, 박테리아 마커의 존재는 제2 시험 라인에 의해 나타내진다. 일부 실시예에 있어서, 제1 시험 라인은 양성일 때 제1 색상을 표시하고, 제2 시험 라인은 양성일 때 제1 색상과 상이한 제2 색상을 표시한다. 제1 시험 라인 및 제2 시험 라인 모두가 샘플 분석 장치상의 동일한 공간에 위치되는 실시예에서, 제1 시험 라인 및 제2 시험 라인 모두가 양성일 때 바람직하게는 제3 색상이 형성된다. 다른 실시예에서, 2개의 시험 라인은 장치상에서 서로 공간적으로 분리되어 있다.

바이러스 및 박테리아 감염은 대단히 전염성이 강하고, 임상적으로 징후 및 증상에서 크게 겹치므로 임상적으로 구별하기 어려워서, 흔히 전신성 항생제의 과처방을 야기하고 항생제 내성을 조장한다. 선진국에서, 급성 호흡기 감염은 의료 상담의 20%, 결근의 30% 및 모든 항생제 처방의 75%를 차지하는 질병률의 주요 원인이다. 미국에서는, 급성 호흡기 감염으로 인해 매년에 한번 약 7천6백만 명이 병원을 방문하고 있다. 감염에 대한 면역 반응을 검출하는 능력은 바이러스 및/또는 박테리아 병인으로 인해 발생하는 감염을 구별하는 임상 진단 능력에 도움을 준다.

하나의 바람직한 실시예에서, 박테리아 마커는 CRP이다. 다른 바람직한 실시예에서, 바이러스 마커는 MxA이다. 일부의 바람직한 실시예에서, 검출 구역은 또한 장치가 동작하고 있을 때에, 육안으로 볼 수 있는 대조 라인(control line)을 포함한다.

하나의 바람직한 실시예에서, 바이러스 감염에 대한 마커는 MxA이고, 박테리아 감염에 대한 마커는 C-반응성 단백질(CRP)이다. 높은 MxA 단백질 레벨은 전신성 바이러스 감염과 크게 상관되고, CRP의 증가는 박테리아 감염과 더 많이 연관된다. 본 발명은 샘플 내의 MxA 및 CRP를 식별하기 위한 신속한 감염성 스크리닝 시험을 포함한다. MxA는 백혈구(white blood cell) 내에 존재한다. 그러므로 샘플은, 백혈구를 입수 가능한 어떠한 곳에서도, 예를 들어 말초 혈액 샘플, 비인두 흡인물 (nasopharyngeal aspirate), 눈물, 척수액(spinal fluid), 및 중이 흡인물(middle ear aspirate)에서 취해질 수 있다.

CRP 및 MxA를 함유하는 단일 시험 스트립을 갖는 일부의 바람직한 실시예에서, 양성 결과를 도출하는데 요구되는 샘플 내의 CRP의 임계 농도는 약 6 내지 15 mg/L이다. 다른 바람직한 실시예에서, 양성 결과를 도출하기 위한 샘플 내의 MxA의 임계 농도는 15 ng/㎖ 정도로 낮을 수 있지만, 임계 농도는 보다 높게는 약 20 ng/㎖ 내지 약 250 ng/㎖의 범위에 있을 수도 있다. 임계 농도는 시험 스트립에 적용될 샘플의 크기뿐만 아니라, 적용 가능하다면 그 희석에 따라 달라질 수 있다.

일부 실시예에서, 본 명세서에서 설명되는 장치 및 방법은 말초 전혈로부터 직접적으로 MxA 및 CRP 모두의 신속하고 가시적이고 정량적인 체외 검출을 가능하게 한다. 하나의 바람직한 실시예에서, 시험은, 호흡기 질환과 일치하는 호흡기 증상을 갖고 급성 인두염 또는 지역사회 획득 폐렴의 의심 진단을 갖는, 발열 발병의 7일 이내에 있는 1살 초과의 환자에 있어서 의심되는 바이러스 및/또는 박테리아 감염에 대한 면역 반응을 측정한다. 음성 결과는 반드시 호흡기 감염을 배제하지 않으며, 진단, 치료 또는 다른 관리 결정의 근거로서만 사용되어야 한다. 일부 실시예에서, 추가적인 실험실 시험(예를 들면, 박테리아 및 바이러스 배양법, 면역형광법, 바이러스 중합효소 연쇄 반응법 및 방사선 촬영법) 및 임상적 프리젠테이션의 사용은 바람직하게는 특정의 보다 낮은 호흡기 또는 인두 병원균이 존재하는지의 여부를 확인하는데 추가로 사용된다.

또한, 잘못된 위양성(false positive) 또는 위음성(false negative)을 야기하는 일부 상태가 있다. 이들은, 샘플을 제공하는 환자에 의한 면역억제 약물의 현재 사용, 샘플을 제공하는 환자에 의한 경구 항감염성 약물의 현재 사용, 샘플을 제공하는 환자에 의한 (예를 들면, 다발성 경화증, HIV, HBV, HCV를 위한) 인터페론 치료의 현재 사용, 및 샘플을 제공하는 환자에 의한 최근 30일 내의 생 바이러스 예방접종을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 위음성 및 위양성 모두는 레벨이 치료로 인해 변동될 수 있으므로 가능성이 있다.

바람직한 실시예에서, 본 장치 및 방법은 외래환자 진료실 또는 응급 진료 클리닉에서의 전문적인 사용에 의도되고, 다른 임상적(실험실 또는 방사선 검사) 및 유행병 정보와 함께 사용되어야 한다.

바람직한 실시예에서, 이중용도 이중 크로마토그래피 시험 스트립 분석은 결과의 다중화된 패턴을 사용하여 환자에 있어서의 바이러스 및/또는 박테리아 감염에 대한 신체의 면역 반응을 검출한다. 하나의 특정 바람직한 실시예에서, 이와 같은 분석은, 믹소바이러스 저항성 A(myxovirus resistance A; MxA), 낮은 레벨의 C-반응성 단백질("저"CRP) 및 높은 레벨의 C-반응성 단백질("고"CRP)에 대해 시험한다. 바람직하게는 2개의 시험 스트립이 사용된다. 일부 실시예에서, 크로마토그래피 시험 스트립과 상이한 평면에 있는 샘플 압축기가 또한 사용된다. 제1 시험 스트립은 MxA 및 낮은 레벨의 C-반응성 단백질에 대해 분석하고, 제2 시험 스트립은 높은 레벨의 C-반응성 단백질에 대해 분석한다. 제1 시험 스트립 및/또는 샘플 압축기는 MxA 단백질 및 낮은 레벨의 C-반응성 단백질을 검출하는 시약을 포함한다. 제2 시험 스트립 및/또는 샘플 압축기는 높은 레벨의 C-반응성 단백질을 검출하는 시약을 포함한다. 2개의 시험 스트립은 바람직하게는 나란히 이어져 있고, 각 스트립은 또한 바람직하게는 대조 라인을 포함한다. 대조 시약은 바람직하게는 시험 스트립 상에 있거나 샘플 압축기 상에 있다. 이들 시험은 바이러스, 박테리아, 또는 바이러스 및 박테리아 동시 감염과 같은 생물학적 감염을 검출하고 분류한다. 일부의 바람직한 실시예에서, 이중용도 이중 크로마토그래피 시험 스트립 분석은 발열성 호흡기 질병을 갖는 환자로부터의 샘플을 검출하는데 사용된다.

2개의 시험 스트립을 갖는 일부의 바람직한 실시예에서, 제1 시험 스트립 상에서는, 양성 결과를 도출하기 위해 샘플 내에서의 약 6 내지 15 mg/L의 CRP("저"CRP 레벨)의 임계 농도(혈청 컷오프 값)가 요구되고, 양성 결과를 도출하기 위해 샘플 내에서의 적어도 15 ng/㎖의 MxA의 임계 농도가 요구된다. 다른 바람직한 실시예에서, 양성 결과를 도출하기 위해 MxA에 대한 임계 농도는 약 15 ng/㎖ 내지 약 250 ng/㎖의 범위 내에 있을 수 있다. 임계 농도는 시험 스트립에 적용되는 샘플의 크기뿐만 아니라, 적용 가능하다면 그 희석에 따라 달라질 수도 있다. 하나의 바람직한 실시예에서, 예를 들어 혈액 샘플로부터의 세포외 혈청에서의 저CRP의 임계 농도는 혈청 컷오프 값에 대해 10 mg/L과 등가인 핑거스틱(fingerstick) 컷오프 값에 대해 7 mg/L이다. 하나의 바람직한 실시예에서, 예를 들어 혈액 샘플로부터의 말초 혈액 단핵 세포에서의 MxA의 임계 농도는 40 ng/㎖의 정맥 혈액 컷오프 값과 등가인 핑거스틱 컷오프 값에 대해 40 ng/㎖이다. 제2 시험 스트립 상에서는, 일부의 바람직한 실시예에서, 양성 결과를 도출하기 위해 샘플 내에서의 약 60 내지 600 mg/L의 CRP("고"CRP 레벨)의 임계 농도가 요구된다. 하나의 특히 바람직한 실시예에서, 제2 시험 스트립 상의 고CRP의 임계 농도는 핑거스틱 컷오프 값에 대해 약 80 mg/L이다.

다른 실시예에서, 바이러스 감염 및/또는 박테리아 감염을 위한 다른 마커가 사용될 수도 있다. 예를 들면, 숙주 유전자의 약 12%는 림프구성 맥락수막염 바이러스(Lymphocytic Choriomeningitis Virus; LCMV) 감염 후에 그 발현을 변경시키고, 이들 유전자의 서브세트는 독성 및 비독성 LCMV 감염을 구별할 수 있다. 주요한 전사 변화는 정량적인 PCR 및 단백질 연구에 의해 예비 확인을 제공하였고, 아레나바이러스(arenavirus) 질환에 대한 바이오마커로서의 잠재적인 유용한 후보이다. 박테리아 감염에 대한 다른 마커는, 프로칼시토닌(procalcitonin), 뇨 트립신 억제제(urinary trypsin inhibitor; uTi), 리포 다당류(lipopolysaccharide), IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, ESR 및 WBC 수치의 상승(밴드(band)의 증가), 젖산 (Lactate), 트로포닌(Troponin), 혈관 내피 증식 인자(vascular endothelial growth factor), 혈소판 유래 증식 인자(platelet derived growth factor), 코르티솔(cortisol), 프로아드레노메둘린(proadrenomedullin), 대식세포 유주 억제 마커 (macrophage migratory inhibitory marker), 활성 단백질 C, CD4,8,13,14, 또는 64, 카스파제(caspase), 태반 유래 증식 인자(placenta derived growth factor), 칼시토닌 유전자관련 펩티드(calcitonin gene-related peptide), 고 유동성(high mobility) 그룹 1, 코펩틴(copeptin), 나트륨이뇨 펩티드(naturietic peptides), 리포 다당류 결합 단백질(lipopolysaccharide binding protein), 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor alpha), 순환 혈관내피 전구 세포(circulating endothelial progenitor cells), 보체(complement) 3a, 및 골수계 세포 상에 발현된 트리거 수용체(triggering receptor expressed on myeloid cells)(trem-1)를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.

하나의 실시예에서, 구별되는 감염은 호흡기 감염이다. 다른 실시예에서, 박테리아성 또는 바이러스성일 수 있는 다른 타입의 감염은 본 발명의 시스템을 이용하여 구별된다. 일부 예는, 뇌염(encephalitis), 뇌수막염(meningitis), 위장염, 발열성 호흡기 질병(기관지염(bronchitis), 인후염, 폐렴을 포함함), 부비동염 (sinusitis), 중이염(otitis media), 요로 감염증(urinary tract infections) 및 결막염(conjunctivitis)을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.

측방향 유동 장치는 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 공개 제2005/0175992호 및 제2007/0059682호에 개시되어 있다. 이들 문헌 모두의 내용은 본 명세서에 참조로 합체된다. 본 기술분야에 알려진 다른 측방향 유동 장치는 대안적으로 본 발명의 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있다.

미국 특허 공개 제2007/0059682호는 하나 이상의 방해 물질(interfering substance)을 함유할 수도 있는 샘플 및 분석물을 검출하는 것을 개시하고 있다. 이와 같은 문헌은 크로마토그래피 캐리어(chromatographic carrier) 상에서 방해 물질을 포착함으로써 분석물을 방해 물질로부터 분리하고, 방해 물질로부터 분리된 캐리어 상의 분석물을 검출하는 것을 교시하고 있다.

미국 특허 공개 제2007/0175992호는, 인간의 체액 샘플이 스왑 부재(swab member)와 같은 채취 장치에 의해 채취되는 인간의 체액에 있어서 병원균 및/또는 알레르기 관련 성분과 같은 표적(target)을 검출하는 방법을 개시하고 있다. 샘플은 스왑 부재로부터 샘플 분석 장치로 이송되고, 이와 같은 샘플 분석 장치상에서는 표적의 분석이 면역화학적 또는 효소적 수단에 의해 이루어질 수 있다. 시험 결과는 매우 단시간에 표시될 수 있고, 사용자에 의해 직접 판독될 수 있다. 이것은, 환자 방문 동안에 결과를 이용 가능한 현장 검사 시험을 가능하게 한다. 이와 같은 동시 계속중인 출원에 개시된 발명은 결막염의 진단에 특히 유리하다.

본 발명의 방법에서, 분석될 샘플은 크로마토그래피 캐리어 상에 적용된다. 캐리어는, 하나의 단일 크로마토그래피 재료로 제조될 수 있거나, 또는 바람직하게는, 동일하거나 상이한 재료로 이루어지고 캐리어 백킹부(carrier backing) 상에 고정된 몇몇 모세관 활성 재료로 제조될 수 있다. 이와 같은 재료는 이송 경로를 형성하도록 서로 밀접하게 접촉하고, 이와 같은 이송 경로를 따라서, 모세관력에 의해 구동되는 액체가 적용 구역으로부터 유동하여, 시약 구역을 통과하고 하나 이상의 검출 구역을 향해 그리고 선택적으로 캐리어의 다른 단부에서 폐기물 구역을 향해 유동한다. 다른 실시예에서, 액체는 샘플 적용 구역 내로 유동하기 전에 시약 구역을 통과한다. 특히 바람직한 실시예에서, 캐리어는 크로마토그래피 시험 스트립이다. 다른 바람직한 실시예에서, 샘플은 크로마토그래피 시험 스트립과 상이한 평면에 있는 샘플 압축기에 적용되고, 그 후에 샘플 압축기에 의해 크로마토그래피 시험 스트립으로 이송될 수도 있다.

일부 실시예에서, 샘플은 캐리어의 적용 구역을 샘플 내로 침지함으로써 캐리어에 직접 적용된다. 대안적으로, 캐리어에 샘플을 적용하는 과정은 건조 또는 습윤 상태의 와이핑 요소(wiping element)로 샘플을 채취함으로써 실행될 수 있으며, 샘플은 이와 같은 와이핑 요소로부터, 선택적으로 습윤화한 후에, 캐리어의 적용 구역으로 이송될 수 있다. 통상, 와이핑 요소는 살균되고, 건조되거나, 채취 단계 전에 유체로 사전 처리될 수 있다. 본 발명에 따른 와이핑 요소에 적합한 재료는 합성 재료, 직물 또는 섬유 웨브(fibrous web)를 포함할 수 있다. 이와 같은 와이핑 요소의 일부 예가 독일 특허 DE 44 39 429호 및 DE 196 22 503호에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참조로 합체된다. 다른 실시예에서, 샘플은 피펫 (pipette)과 같은 채취 용기(collection receptacle)에 의해 채취되고, 캐리어로 직접 이송될 수 있다.

검출 방법의 타입에 따라서, 다양한 시약이 캐리어의 시약 구역에 존재하며, 일부 실시예에서는, 이와 같은 시약 구역은 바람직하게는 적용 구역과 검출 구역 사이에 위치되거나, 다른 실시예에서는, 바람직하게는 적용 구역 이전에 위치된다. 또 다른 실시예에서, 시약은 검출 구역을 포함하는 캐리어와 분리되고 그와 상이한 평면에 있는 샘플 압축기 상에 있을 수도 있다.

샌드위치 면역측정에 있어서, 검출될 각각의 박테리아 및 바이러스 마커에 특이적인 시약 구역 내에 표지식의 비고정화된 시약을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 샘플 내에 존재하는 바이러스 또는 박테리아 마커가 시약 구역 내에 존재하는 대응하는 표지식 바이러스 또는 박테리아 시약과 접촉하는 경우, 표지식 복합체가 마커와 대응하는 표지식 시약 사이에 형성된다. 표지식 복합체는, 결국, 검출 구역내의 시험 라인에서 고정화된 바이러스 또는 박테리아 마커 결합 파트너와 새로운 복합체를 형성할 수 있다. 경합 면역분석에서, 시약 구역은 바람직하게는 검출 구역 내의 고정화된 마커 결합 파트너를 위한 마커와 경합하는 표지식의 비고정화된 마커 유사체(analogue)를 함유한다. 시약 구역 및 검출 구역 내의 마커 결합 파트너는 바람직하게는 대응하는 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론, 다중클론 또는 재조합 항체, 혹은 항체의 단편이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 검사될 샘플 내에 존재할 수 있는 방해 물질을 감소시킨다. 방해 물질, 예를 들어 인간의 항-마우스 항체(human anti-mouse antibody; HAMA)는 또한 시약 구역의 표지식의 비고정화된 시약 및 검출 구역의 고정화된 결합 파트너와 복합체를 형성하고, 그에 따라 면역분석에서 양성 시험 결과를 나타낼 수 있으며, 캐리어는 적어도 하나의 포획 구역을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 포획 구역은, 특정의 방해 물질에 특이적으로 결합되는 고정화된 포획 시약을 포함하고, 이에 의해 포획 구역 내의 방해 물질을 고정화시킨다. 포획 구역이 공간에 의해 검출 구역으로부터 분리되고, 샘플이 캐리어의 검출 구역에 도달하기 전에 시약 구역 및 포획 구역 위로 이동하기 시작함에 따라, 본 방법은 방해 물질 또는 물질들이 관심의 대상인 분석물 또는 분석물들로부터 분리될 수 있게 한다. 바람직하게는, 포획 구역은 시약 구역과 검출 구역 사이에 위치된다. 그러나 포획 구역은 또한 적용 구역과 시약 구역의 사이에 위치될 수도 있다.

마커의 검출은 검출 구역에서 달성될 수 있다. 결합 분자는 검출 구역에서의 면역 반응 또는 다른 반응에 의해 표지식 복합체 또는 표지식 마커-유사체를 고정화시키고, 그에 따라 공정 동안에 검출 구역에서 가시적인 시험 라인을 형성한다. 바람직하게는, 표지는 광학적으로 검출 가능한 표지이다. 시험 라인에서 복합체를 형성함으로써, 표지를 농축 및 고정화시켜, 시험 라인이 육안으로 보이게 되어, 양성 시험 결과를 나타낸다. 직접적인 표지, 보다 특별하게는, 육안으로 가장 잘 인식될 수 있는 금 표지가 특히 바람직하다. 추가로, 전자 판독 장치(예를 들면, 측광 변환기, 음향 변환기, 임피던스 변환기, 전위차 변환기, 및/또는, 전류 변환기에 기초함)는 보다 정밀한 결과 및 분석물의 반정량(semi-quantification)을 얻는데 사용될 수 있다. 다른 표지는 라텍스, 형광체(fluorophore), 또는 인광체 (phosphorophore)일 수도 있다.

하나의 실시예에서, 시각적으로 판독된 측방향 유동 면역분석 시험의 감도는 소량의 형광 염료 또는 형광 라텍스 비드 컨쥬게이트를 초기의 컨쥬게이트 재료에 추가함으로써 향상될 수 있다. 가시 스펙트럼 시험 라인이 가시적으로 존재할 때, 검사 결과가 관찰되어 기록된다. 그러나, 뚜렷한 시각적 시험 라인을 발생하지 않는 약한 양성의 경우에, UV 스펙트럼과 같은 적절한 스펙트럼의 광이 시험 라인 상에 비춰져서, 시험 라인에 결합되는 형광 라텍스 비드를 여기시켜 형광을 발하게 하여 시험 라인에서의 가시적인 색상을 선명하게 한다.

바람직한 실시예에서, 시약은, 바이러스 마커의 존재에 대응하는 가시적인 시험 라인이 박테리아 마커의 존재에 대응하는 시험 라인과 분리되도록 구성된다. 그러므로 단지 검출 구역 내의 시험 라인의 현색(development) 위치에 의해 샘플이 박테리아 마커 또는 바이러스 마커(또는 양쪽)를 함유하는지의 여부가 용이하게 결정될 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 시약은 상이한 색상의 시험 라인이 현색되도록 선택될 수 있다. 즉, 바이러스 마커의 존재는 박테리아 마커의 존재에 의해 현색된 라인과 상이한 색상의 라인을 현색시킨다. 예를 들면, 바이러스 마커를 인식하는 시약에 대응하는 표지는 적색일 수 있는 반면, 박테리아 마커를 인식하는 시약에 대응하는 표지는 녹색이다. 비고정화된 시약에 부착될 수 있는 상이한 색상의 표지는 잘 알려져 있다. 일부 예는 콜로이드 금, 콜로이드 셀레늄, 콜로이드 탄소, 라텍스 비드, 상자성 비드, 형광체 및 화학발광체 표지, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.

도 4a 및 도 4b는 바이러스 마커의 존재에 대응하는 시험 라인(402), 및 박테리아 마커의 존재를 검출하는 제2의 다른 시험 라인(403)을 갖는 크로마토그래피 시험 스트립(400)을 도시한다. 샘플은 크로마토그래피 시험 스트립(400)의 적용 구역(401)에 적용된다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 그 후에 샘플은 적어도 하나의 표지식 바이러스 결합 파트너 및 적어도 하나의 표지식 박테리아 결합 파트너를 포함하는 시약 구역(460)을 통과하고, 이와 같은 결합 파트너는 샘플 이송 액체(예를 들면, 버퍼 용액)에 의해 용출된 후에 이 샘플 이송 액체와 함께 이동할 수 있다. 대안적으로, 도 4b에 도시된 바와 같이, 시약 구역(460)은 시약 구역 내의 표지식 결합 파트너가 샘플 이송 액체에 의해 용출되어 샘플로 이동하도록 샘플 적용 구역 (401)의 상류 측에 위치된다. 표지식 바이러스 결합 파트너는 관심의 대상인 바이러스 마커에 특이적으로 결합되어 복합체를 형성할 수 있으며, 이와 같은 복합체는 검출 구역 내의 다른 특정 시약 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합될 수 있다. 표지식 박테리아 결합 파트너는 관심의 대상인 박테리아 마커에 특이적으로 결합되어 복합체를 형성할 수 있으며, 이와 같은 복합체는 검출 구역 내의 다른 특정 시약 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합될 수 있다. 도면에 도시되어 있지 않지만, 흡수 패드뿐만 아니라, 폐기물 구역, 캐리어 백킹부, 하우징, 및 결과 판독을 위한 하우징 내의 개구부를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 다른 알려진 측방향 유동 면역분석 구성요소는 또한 선택적으로는 이와 같은 실시예에서의 시험 스트립(400)의 구성요소일 수도 있다.

시험 스트립(400)은, 바이러스 마커 및 그것의 표지식 결합 파트너에 의해 형성된 바이러스 시약 복합체에 상보적인 고정화된 특정 결합 파트너를 포함하는, 바이러스 마커, 예를 들어 시험 라인(402)의 검출을 위한 적어도 하나의 제1 섹션을 포함하는 검출 구역(405)을 또한 포함한다. 따라서, 시험 라인(402)에서, 검출 구역 결합 파트너는 결합된 바이러스 마커와 함께 시약 구역(460)으로부터 표지식 바이러스 결합 파트너를 포착한다. 그것의 표지식 결합 파트너에 의한 바이러스 마커의 이와 같은 국소화는 시험 라인(402)에서 표시를 발생시킨다. 시험 라인(402)에서, 바이러스 마커의 존재는 표지식 결합 파트너의 축적으로 생기는 시험 라인 (402) 표시의 정성적 및/또는 정량적 판독에 의해 결정된다.

검출 구역(405)은 박테리아 마커 및 그것의 표지식 결합 파트너에 의해 형성된 박테리아 시약 복합체에 상보적인 고정화된 특정 결합 파트너를 포함하는, 박테리아 마커, 예를 들어 시험 라인(403)의 검출을 위한 적어도 하나의 제2 섹션을 또한 포함한다. 따라서, 시험 라인(403)에서, 검출 구역 결합 파트너는 결합된 박테리아 마커와 함께 시약 구역(460)으로부터 표지식 박테리아 결합 파트너를 포착한다. 그것의 표지식 결합 파트너에 의한 박테리아 마커의 이와 같은 국소화는 시험 라인(403)에서 표시를 발생시킨다. 시험 라인(403)에서, 박테리아 마커의 존재는 표지식 결합 파트너의 축적으로 생기는 시험 라인(403) 표시의 정성적 및/또는 정량적 판독에 의해 결정된다. 시험 라인(402)이 도면에서의 유동 방향(408)에 대해 시험 라인(403)의 상류 측에 있지만, 대안적인 실시예에서, 시험 라인(403)은 시험 라인(402)의 상류 측에 있다. 또 다른 실시예에서, 시험 라인(402 및 403)은 시험 스트립 상의 동일한 위치에 위치된다.

선택적으로, 검출 구역(405)은 다른 바이러스 및/또는 박테리아 마커를 검출하는 추가적인 시험 라인뿐만 아니라, 대조 라인(404)을 포함할 수 있다. 대조 라인(404)은, 표지식 특정 결합 파트너가 어떠한 바이러스 또는 박테리아 마커와도 결합하지 않을 수 있더라도 분석의 길이를 통해 이동하였다는 것을 나타내고, 그에 따라 분석의 적절한 작동을 확인시킨다. 도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이, 대조 구역(404)은 바람직하게는 시험 라인(402 및 403)의 하류 측에 있다. 그러나 다른 실시예에서, 대조 구역(404)은 시험 라인(402 및 403) 중 어느 하나 또는 모두의 상류측에 위치될 수도 있다.

바람직한 실시예에서, 대조 라인(404)은, 시험에 사용되는 용출 매체 또는 다른 합성물의 성분과 결합되는 항체 또는 다른 재조합 단백질을 포함한다. 핵산이 표적인 실시예에서, 대조 라인(404)은 바람직하게는 표적 핵산에 대한 결합 파트너로서 사용되는 표지식 핵산에 상보적인 핵산을 포함한다.

도면에는, 바이러스 또는 박테리아 마커의 각각에 대한 하나의 시험 라인만이 도시되어 있지만, 바이러스 및 박테리아 마커 중 어느 하나 또는 모두에 대한 다수의 시험 라인이 본 발명의 사상 내에서 사용될 수도 있다. 다수의 박테리아 및/또는 바이러스 표적이 있는 일부 실시예에서, 각 표적의 존재는 바람직하게는 별개의 시험 라인(402 또는 403)에 대응한다. 다른 실시예에서, 박테리아 마커 및 바이러스 마커 모두는 단일의 시험 라인 상에서 검출된다. 이들 실시예에서, 동일한 시험 라인 상에 박테리아 마커 및 바이러스 마커 모두가 존재하면, 박테리아 마커 또는 바이러스 마커 중 어느 하나만이 존재하는 경우와는 상이한 특성을 갖는다. 예를 들면, 동일한 시험 라인 상에 박테리아 마커 및 바이러스 마커 모두가 존재하면, 박테리아 마커 또는 바이러스 마커 중 어느 하나만이 존재하는 경우와는 상이한 색상에 의해 시각적으로 표시될 수 있다.

바이러스 감염의 증상(감기 유사 증상 및 100.5℉ 초과의 발열)을 나타내는 환자의 신선한 전혈 샘플은 혈액 내의 MxA의 어떤 레벨이 본 명세서에 설명된 측방향 유동 시험으로 검출될 수 있는지를 결정하도록 시험되었다. 이와 같은 실험에 사용된 측방향 유동 분석은 박테리아 마커의 존재를 위한 제2 시험 라인을 갖지 않는, 상기에서 설명된 도 4b에 도시된 장치와 유사한 구성을 갖는다. 보다 구체적으로는, 시험 스트립은 샘플 적용 구역의 상류 측에 시약 구역을 포함한다. 시약 구역은 콜로이드 금으로 표지화된 MxA에 대한 이동 가능한 항체(일본 도쿄에 소재하는 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.)를 포함한다. 시험 스트립은 또한 검출 구역에 시험 라인을 포함한다. 시험 라인은 MxA에 대한 고정화된 항체(일본 도쿄에 소재하는 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.)를 포함한다. 검출 구역 내의 대조 라인은 청색 라텍스 비드로 표지화된 기동화 치킨(chicken) IgY에 결합되는 (여분의 안정화 효과를 위한) 래빗(rabbit) Ig 및 래빗 항-치킨 항체를 포함한다.

전혈 샘플은 항응고제(anticoagulant)로서의 EDTA로 채취되었다. 이와 같은 시험에서, 전혈 샘플 내의 MxA 단백질의 양은 MxA Protein ELISA Test 키트(일본 도쿄에 소재하는 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.)를 이용하여 결정되었다. 혈액은 시험 스트립에 적용하기 전에 키트에 제공된 용해 용액에 의해 1:10으로 용해되었다. 용해된 혈액의 100 ㎕가 ELISA 시험에서 시험되었다. 용해된 혈액의 10 ㎕는 MxA 측방향 유동 시험의 샘플로서 사용되었다.

용해된 혈액 샘플은 시험 스트립의 적용 구역에 적용되었다. 시약 내의 표지식 MxA 항체는 샘플 이송 액체에 의해 용출되어 혈액 샘플로 이동되었다. 시험 라인에서, 고정화된 MxA 항체는 MxA에 결합된 시약 구역으로부터 임의의 표지식 MxA 항체를 포착하였다. 그 표지식 항체를 갖는 MxA의 이와 같은 국소화는 MxA의 충분한 농도가 있다면 시험 라인에서 적색의 시각적 표시를 발생시킨다.

표 1은 시험 지시에 따라 진행된 MxA ELISA 키트 표준을 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 24 ng/㎖의 MxA 농도가 측방향 유동 시험에서 양성 결과를 생성하였다. 키트 표준은 MxA 농도를 결정하는 표준 곡선을 생성하는데 사용되었다.

표 2는 바이러스 감염의 증상(감기 유사 증상 및 100.5℉ 초과의 발열)을 나타내는 환자의 임상적인 신선한 전혈 샘플의 결과를 나타낸다.

OD(광학 밀도(optical density))는 샘플 내의 MxA 농도를 결정하기 위해 키트 표준으로부터의 표준 곡선과 조합하여 사용되었다. 농도(ng/㎖)의 열은 용해제로 희석된 농도이다. 농도 x 희석(10x)(ng/㎖)의 열은 전혈 샘플에서의 실제 농도이다. 표에 나타낸 바와 같이, 측방향 유동 시험은 샘플 내에 약 105 ng/㎖의 MxA 및 약 22 ng/㎖의 MxA를 각각 갖는 샘플 C 및 F에서 MxA에 대해 양성 결과를 생성하였다.

표 3은 테네시(Tennessee) 혈액 은행으로부터 입수한 정상 개체로부터의 동결된 전혈 샘플의 결과를 나타낸다. 혈액 샘플 모두가 MxA의 어떠한 인식 가능한 양을 갖지 않고, 그들 모두는 측방향 유동 시험에서 음성이었다.

표 4는 바이러스 감염의 외관 증상(감기 유사 증상 및 100.5℉ 초과의 발열)을 나타내는 환자의 BioReclamation(뉴욕주 힉스빌 소재의 BioReclamation)으로부터의 신선하게 동결된 전혈 샘플을 나타낸다. 이들 환자 모두가 약 8 ng/㎖보다 높은 MxA 레벨에 대응하는 OD를 갖는다. 이들 샘플은 모두 측방향 유동 시험에서 음성이었다.

이들 시험 결과는 본 명세서에 설명된 측방향 유동 시험이 10 ㎕ 샘플(1:10 희석됨)에서 적어도 약 20 ng/㎖만큼 낮은 MxA 레벨을 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.

도 1에는, 바이러스 감염과 박테리아 감염을 구별하기 위한 신속한 스크리닝 시험의 하나의 예가 도시되어 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, MxA는 바이러스 감염에 대한 진단 마커인 한편, CRP는 박테리아 감염에 대한 진단 마커이다. 이와 같은 예에서, 청색 라인(도면의 A 내지 D에서의 "대조 라인")은 대조를 나타낸다. 녹색 라인은 C-반응성 단백질(CRP) 레벨 > 15 mg/L(도면의 A 내지 D에서의 "CRP 시험")을 나타낸다. 적색 라인은 MxA 레벨 > 20 ng/㎖(도면의 A 내지 D에서의 "MxA 시험")를 나타낸다. MxA 단백질에 대한 양성 결과 및 CRP 단백질에 대한 음성 결과는 바이러스 감염만을 나타낸다(외관 시험 결과 A). CRP 단백질에 대한 양성 결과 및 MxA 단백질에 대한 음성 결과는 박테리아 감염만을 나타낸다(외관 시험 결과 B). MxA 및 CRP 모두에 대한 양성 결과는 동시 감염(박테리아 및 바이러스 모두에 의한 감염)을 나타낸다(외관 시험 결과 C). 박테리아 감염도 바이러스 감염도 아닌 경우에는, MxA 및 CRP 모두에 대한 음성 결과로 나타난다(외관 시험 결과 D). 본 예에서는 특정 색상 라인이 논의되지만, 바이러스 또는 박테리아 마커를 나타내기 위해 다른 색상, 또는 시험 스트립 상의 상이한 위치에서의 동일한 색상도 본 발명의 사상 내에 있다.

상이한 색상의 라인의 현색이 이용되는 경우, 라인은 공간에 의해 분리될 수 있거나 분리되지 않을 수도 있다. 후자의 예에서는, 표지는, 양쪽의 마커가 존재할 때에 보이는 색상이 개별 마커가 존재할 때에 보이는 색상과 상이하도록 선택된다. 예를 들면, 바이러스 마커의 존재는 적색 라인에 의해 나타나고, 박테리아 마커의 존재는 청색 라인에 의해 나타나고, 양쪽 마커의 존재는 보라색(적색과 청색의 조합)의 라인에 의해 나타날 수 있다.

도 2에는, 급성 감염과 만성 감염을 구별하기 위해 2개의 색상을 사용하는 것이 도시되어 있다. 제1 카세트에서는, IgM 항체만이 존재하고, 이것은 급성 감염을 나타낸다. 이와 같은 카세트에서, 시험 라인은 적색이다. 제2 카세트에서는, 면역글로불린(immunoglobulin)이 IgG이기 때문에, 시험 라인은 청색이다. 제3 카세트는 IgM 및 IgG 항체 모두가 존재하는 중간 경우를 나타낸다. 결과적으로, 시험 라인은 보라색이다. 이와 같은 예가 IgM 및 IgG를 위한 시험에 대해 나타내고 있지만, 대안적으로 동일한 개념이 감염에 대한 바이러스 및 박테리아 마커 모두를 검출하는 단일 라인과 함께 사용된다.

다른 바람직한 실시예에서, 시험 스트립은 또한 이 시험 스트립의 기능을 나타내는 대조 구역을 포함할 수도 있다. 도 1은 대조 라인을 도시한다. 도 2는 3개의 카세트 모두에 대해 대조 섹션이 있는 예를 도시한다. 대조 섹션은, 존재한다면, 장치가 동작했다는 신호를 사용자에게 전하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 대조 섹션은 시약 구역으로부터의 표지식 시약에 결합되는 시약(예를 들면, 항체)을 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시예에서, 래빗 항 치킨은 대조 라인으로서 사용되고, 표지, 예를 들어 청색 라텍스 비드에 접합된 치킨 IgY는 대조 컨쥬게이트이다. 대안적으로, 대조 섹션은, 습윤 시에 변색 또는 발색을 생성하는 무수 시약, 예를 들어 수성 샘플에 의해 습윤되었을 때 청색으로 변하는 무수 황산구리를 포함할 수도 있다. 다른 대안으로서, 대조 섹션은 시약 구역으로부터의 과잉의 표지식 시약과 반응하는 고정화된 바이러스 및 박테리아 마커를 포함할 수 있다. 대조 섹션은 검출 구역으로부터 상류 측 또는 하류 측에 위치될 수도 있다. 양성의 대조 지표(control indicator)는 샘플이 시험 장치를 통해 요구 거리를 침투했다는 것을 사용자에게 알려준다.

도 3은 대조 라인을 포함하는 2개의 시험 스트립, 즉 "Adeno 1" 및 "Adeno HS"를 비교한다. Adeno 1에서, 대조 라인(각 카세트 상의 상측 라인) 및 시험 라인(각 카세트 상의 하측 라인) 모두가 적색이다. Adeno HS에서는, 대조 라인은 청색이고, 시험 라인은 적색이다. 대조 라인이 시험 라인과는 상이한 색상인 실시예에서, 2개의 라인을 구별하여, 시험이 동작하고 있다는 것을 보장하는 것을 보다 용이하게 한다.

일부의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 장치 및 방법은 바이러스 감염과 박테리아 감염을 구별하는 것을 돕는 용해 구역을 포함한다. 이들 실시예에서, 채취된 샘플은 채취 및 샘플 분석 장치로의 이송 이전에는 용해되지 않는다. 이것은 분석을 위한 샘플을 채취 및 준비하는 데 필요한 단계의 수를 감소시킨다. 용해제가 분석의 효율을 향상시키는 하나의 상황은 MxA의 존재에 대해 분석할 때이다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 이와 같은 단백질의 존재는 발열 중인 소아에 있어서의 박테리아 감염과 바이러스 감염을 구별하는데 도움을 줄 수 있다. 용해제로서, 1% 내지 6% 중량/체적의 CHAPS 및 0.5% 내지 2% 중량/체적의 NP40의 조합을 사용하는 현장 용해가 신선한 전혈 또는 동결된 전혈에서의 MxA의 검출을 향상시킨다.

샘플 로딩에 이어서 용해제를 사용하는 실시예에서, 이송 액체(버퍼)와 함께 이동하는 샘플이 용해제와 만난다. 용해제는 바람직하게는 시험 스트립 상에 사전 로딩될 것이며, 이송 액체에 의해 용출된다. 일부의 바람직한 실시예에서, 용해제는 시험 스트립 내에서 건조되었다. 대안적으로, 용해제는 냉동 건조 또는 동결 건조에 의해 사전 건조되고, 그 후에 시험 스트립 내로 사전 로딩될 수 있다. 다른 실시예에서, 용해제는 시험 스트립 상에 흡수, 흡착, 매립 또는 포착될 수 있다. 초기에 건조된 용해제는 바람직하게는 샘플 적용 구역과 시약 구역 사이에서 국소화된다. 시약 구역이 샘플 적용 구역의 상류 측에 있는 실시예에서, 용해 구역은 샘플 적용 구역의 하류 측에 있다. 용해제는 바람직하게는 샘플 이송 액체에 가용성이고, 용해제는 샘플 이송 액체와 접촉하면 가용화 및 활성화된다. 그리고 샘플 이송 액체는 용액이나 현탁액 내의 용해제 및 현탁액 내의 샘플 성분 모두를 함유한다. 샘플 내의 임의의 용해하기 쉬운 성분은 그 후에 현탁액에서 용해제에 대해 노출되어, 그 자체가 현장 용해된다. 런닝 버퍼(running buffer)는 그 후에 임의의 용해되지 않은 성분을 포함하는 분석물을 검출 구역으로 운반한다.

용해제가 사전 로딩되어 건조되는 위치는 필요에 따라 변경될 수 있다. 샘플이 용해제와 상호작용해야 하는 시간을 최대화할 뿐만 아니라, 검출 구역에 도달하는 용해제의 양을 최소화하기 위해서, 건조, 흡수, 흡착, 매립 또는 포착된 용해제가 샘플 적용 구역에 또는 그 바로 하류 측에 위치될 수도 있다. 혹은, 용해 생성물이 시약 구역에 도달하는 전에 이동해야 하는 거리를 최소화하기 위해서, 건조된 용해제가 시약 구역에 보다 근접하게 위치될 수도 있다. 다른 실시예에서, 용해제는 런닝 버퍼에 포함될 수도 있다.

시험 스트립 상에 사전 로딩된 용해제의 농도는 바람직하게는 0.001% 내지 5% 중량/체적이다. 사전 로딩될 체적은 용해제가 사전 로딩되는 곳에 따라 달라진다. 적절한 범위는 샘플 채취기 플리스(샘플 적용 구역) 내로 사전 로딩될 때 1 내지 10 마이크로리터이거나, 흡수 패드 내로 또는 시험 스트립 내의 다른 위치로 사전 로딩될 때 5 내지 50 마이크로리터이다. 이상적으로는, 사전 로딩되는 양은 샘플 채취기 플리스 내로 사전 로딩되는 약 3 마이크로리터이어야 하거나, 흡수 패드 내로 또는 시험 스트립 내의 다른 위치로 사전 로딩되는 약 10 마이크로리터이어야 한다.

특정의 용해 환경 및 용해제의 선택은 바이러스 및 박테리아 마커와, 분석에 의존한다. pH 및 이온 강도는 용해 환경의 열쇠이다. 용해제에 의해 설정되는 pH에 대해서는, 4.0 미만의 pH가 재료, 특히 단백질을 침전시키는 경향이 있다. 약 10.0 초과의 보다 높은 pH는 단백질 및 세포벽과 같은 재료를 용해시키는 경향이 있다. 그러므로 약 10.0 이상의 pH가 많은 적용에 대해 바람직할 수 있다. 대안적으로, 보다 낮은 pH가 핵산 표적에 대해 바람직할 수도 있다.

용해제에 의해 설정된 이온 강도에 대해서는, 높은 이온 강도 및 낮은 이온 강도 모두가 용해시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 보다 낮은 이온 강도(저장성(hypotonic))는 적혈구를 파괴하는 경향이 있다. 예를 들면, 물은 그 자체로 적혈구를 용해시킬 수 있다. 보다 높은 이온 강도 환경이 특정 세포벽 및 막을 파열하는데 사용될 수도 있다.

특정 용해제에 대해서는, 이들 용해제는 그 특성에 기초하여 그룹화 및 선택될 수 있다: 염, 양쪽성(amphoteric) 및 양이온(cationic) 제제, 이온성 및 비이온성 세제. 염, 즉 염화암모늄(NH4Cl)은 적혈구를 용해시킨다. 고농도의 염화나트륨 (NaCl)과 염화칼륨(KCl)을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 다른 염은 특정의 세포벽 및 막을 파열시킬 수 있다. 다른 용해제는 Lyso PC, CHAPS 및 양쪽성 이온 세제(Zwittergent)를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 양쪽성 제제이다. 대안적으로, C16 TAB 및 염화벤잘코늄(Benzalkonium Chloride)을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 양이온 제제가 용해제로 사용될 수 있다. 이온성 및 비이온성 세제는 흔히 지질단백질 및 당단백질과 같은 세포벽 또는 세포막 성분을 파괴 또는 용해시키는 데 사용된다. 통상의 이온성 세제는 SDS, 콜레이트(Cholate) 및 디옥시콜레이트 (Deoxycholate)를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 이온성 세제는 양호한 가용화제이다. 항체는 0.1% SDS 이하에서 그 활성을 유지한다. 통상의 비이온성 세제는 옥틸클루코사이드(Octylglucoside), 디기토닌(Digitonin), C12E8, 루브롤 (Lubrol), Triton X-100, Noniodet P-40, Tween 20 및 Tween 80을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 비이온성 및 마일드 이온성 세제는 보다 약한 변성제이며, 흔히 바이러스성 표면 단백질과 같은 막 단백질을 가용화하는 데 사용된다. 추가적인 용해제는 요소 및 효소를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 상이한 용해제의 조합이 용해 환경을 최적화하는데 사용될 수도 있다.

계면활성제는 일반적으로 습윤제이고 액체의 표면 장력을 낮춘다. 그리고 이것은 액체 사이의 계면 장력을 낮춤으로써 보다 용이한 확산을 가능하게 한다. 따라서, 계면활성제는 항원과 항체 또는 리간드와 수용체의 자연적인 결합을 방해할 수 있다. 그러므로 농도는 각 종류의 용해제에 대해 실험적으로 선택된다. 일단 용해가 발생하면, 원하는 결합 반응이 방해되지 않는 것이 중요하다. 일반적으로, 0.001%의 용해제 농도가 하한으로 고려되고, 상한은 약 1%이다. 용해제의 조합이 사용되는 경우에 상가 효과 또는 시너지 효과가 있다. 이것은 약 0.001% 내지 1%에서 작용하도록 농도의 작용 범위를 확장시킨다. 최종적으로, 일부의 바람직하지 않은 비특이적 결합이 5%의 Tween 20 농도에서 방지될 수 있다. 모든 경우에 있어서, 개별 시험 스트립의 모든 위치상에 사전 로딩된 용해제의 전체 양은 면역검출에 대한 배리어를 용해시키기에 충분해서, 시험 스트립의 실제 작용을 가능하게 해야 한다.

용해제 자체는 임의의 다른 분석 검출기 또는 지시제(indicator agent)를 방해하지 않아야 하며, 그에 따라 분석의 실제 작용을 방해하도록 하는 정도까지 임의의 다른 분석 상호작용 및 반응을 방해하지 않는다. 용해제는 현장 검사에서 시험 스트립의 사용 전의 제조, 분배 및 보관을 허용하기에 충분한 자체 수명을 가져야 한다.

MxA가 바이러스 마커인 바람직한 실시예에서, 용해제로서, 1% 내지 6% 중량/체적의 CHAPS 및 0.5% 내지 2% 중량/체적의 NP40의 조합을 사용하는 현장 용해가 사용되는 것이 바람직하다. 보다 특정된 예로서, 150 mM의 염화나트륨을 갖는 5%의 CHAPS 및 2%의 NP-40과, 0.1%의 BSA와, 0.1%의 아지드화 나트륨(Sodium Azide)(모든 비율이 중량/체적임)을 함유하는 2 마이크로리터의 100 mM의 HEPES 버퍼(pH 8.0)는 시험 스트립의 용해 구역 상에서 건조된다.

바람직한 실시예에서, 도 5a 내지 도 5d에 도시된 바와 같이, 샘플은 크로마토그래피 시험 스트립(200) 상의 적용 구역(201)에 적용된다. 샘플은, 용해제가 바람직하게는 시험 스트립 상에 사전 로딩되는 용해 구역(250)을 통과하고, 이송 액체에 의해 용출된다. 용해제는 현장에서 샘플 내의 임의의 용해하기 쉬운 성분을 용해한다.

크로마토그래피 시험 스트립은, 샘플 적용 구역(201), 용해제를 포함하는 용해 구역(250), 및 바이러스 마커에 결합되는 적어도 하나의 표지식 결합 파트너 및 박테리아 마커에 결합되는 적어도 하나의 표지식 결합 파트너를 포함하는 시약 구역(260)을 포함하며, 이들 결합 파트너는 샘플 이송 액체(예를 들면, 버퍼 용액)에 의해 용출된 후에 이 샘플 이송 액체와 함께 이동할 수 있다. 이들 도면에는 시약 구역(260)이 샘플 적용 구역의 하류 측에 도시되어 있지만, 대안적인 실시예에 있어서, 샘플이 용해 구역에 도달하여 효과적으로 용해된 후에, 시약이 일부 지점에서 샘플과 만나는 한에는, 시약 구역(260)이 샘플 적용 구역의 상류 측에 있을 수 있다(도 4b 참조). 표지식 결합 파트너는 관심의 대상인 바이러스 또는 박테리아 마커에 특이적으로 결합되어 복합체를 형성할 수 있으며, 이와 같은 복합체는 검출 구역 내의 다른 특정 시약 또는 결합 파트너와 특이적으로 결합될 수 있다. 도면에 도시되어 있지 않지만, 흡수 패드뿐만 아니라, 폐기물 구역, 캐리어 백킹부, 하우징, 및 결과 판독을 위한 하우징 내의 개구부를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 다른 알려진 측방향 유동 면역분석 구성요소는 또한 선택적으로는 이와 같은 실시예에서의 시험 스트립(200)의 구성요소일 수도 있다.

바람직한 실시예에서, 용해제는 샘플 적용 구역(201)과 시약 구역(260) 사이의 용해 구역(250)에 국소화된다. 용해제는 바람직하게는 샘플 이송 액체에 가용성이거나 혼화성이고, 용해제는 샘플 이송 액체와 접촉하면 가용화 및 활성화된다. 그리고 샘플 이송 액체는 용액이나 현탁액 내의 용해제 및 현탁액 내의 샘플 성분 모두를 함유한다. 샘플 내의 임의의 용해하기 쉬운 성분은 그 후에 현탁액에서 용해제에 대해 노출되어, 그 자체가 현장 용해된다. 런닝 버퍼는 그 후에 임의의 용해되지 않은 성분을 포함하는 샘플을 검출 구역(205)으로 운반한다.

용해 구역(250)은, 도 5a에 도시된 바와 같이, 바람직하게는 샘플 적용 구역 (201)과 시약 구역(260) 사이에 위치된다. 다른 실시예에서, 용해제(250)는, 도 5b, 도 5c 및 도 5d에 각각 도시된 바와 같이, 샘플 적용 구역(201), 시약 구역 (260), 또는 샘플 적용 구역(201)과 시약 구역(260) 모두와 중첩한다. 도면이 개략적이고 일정한 축척으로 도시되어 있지 않다는 것에 주목하자. 상이한 구역들 사이의 중첩 양(도 5b 내지 도 5d에 도시됨)은 매우 가변적일 수 있다.

시험 스트립(200)은, 박테리아 마커 및 그것의 표지식 결합 파트너에 의해 형성된 박테리아 컨쥬게이트에 상보적인 고정화된 특정 결합 파트너를 포함하는, 적어도 하나의 박테리아 마커, 예를 들어 시험 라인(203)의 검출을 위한 제1 섹션을 포함하는 검출 구역(205)을 또한 포함한다. 따라서, 시험 라인(203)에서, 검출 구역 결합 파트너는 결합된 박테리아 마커와 함께 시약 구역(260)으로부터 박테리아 표지식 결합 파트너를 포착한다. 그것의 표지식 결합 파트너에 의한 박테리아 마커의 이와 같은 국소화는 시험 라인(203)에서 표시를 발생시킨다. 시험 라인 (203)에서, 박테리아 마커의 존재는 표지식 결합 파트너의 축적으로 생기는 시험 라인(203) 표시의 정성적 및/또는 정량적 판독에 의해 결정된다.

검출 구역(205)은 바이러스 마커 및 그것의 표지식 결합 파트너에 의해 형성된 바이러스 컨쥬게이트에 상보적인 고정화된 특정 결합 파트너를 포함하는, 적어도 하나의 바이러스 마커, 예를 들어 시험 라인(202)의 검출을 위한 제2 섹션을 또한 포함한다. 따라서, 시험 라인(202)에서, 검출 구역 결합 파트너는 결합된 바이러스 마커와 함께 시약 구역(260)으로부터 바이러스 표지식 결합 파트너를 포착한다. 그것의 표지식 결합 파트너에 의한 바이러스 마커의 이와 같은 국소화는 시험 라인(202)에서 표시를 발생시킨다. 시험 라인(202)에서, 바이러스 마커의 존재는 표지식 결합 파트너의 축적으로 생기는 시험 라인(202) 표시의 정성적 및/또는 정량적 판독에 의해 결정된다. 시험 라인(203)이 도면에서의 유동 방향(208)에 대해 시험 라인(202)의 상류 측에 있지만, 대안적인 실시예에서, 시험 라인(202)은 시험 라인(203)의 상류 측에 있다. 또 다른 실시예에서, 시험 라인(202 및 203)은 시험 스트립 상의 동일한 위치에 위치된다.

선택적으로, 검출 구역(205)은 다른 박테리아 및/또는 바이러스 마커를 검출하는 추가적인 시험 라인뿐만 아니라, 대조 라인(204)을 포함할 수 있다. 대조 라인(204)은, 표지식 특정 결합 파트너가 어떠한 마커와도 결합하지 않을 수 있더라도 분석의 길이를 통해 이동하였다는 것을 나타내고, 그에 따라 분석의 적절한 작동을 확인시킨다. 도 5a 내지 도 5d에 도시된 바와 같이, 대조 구역(204)은 바람직하게는 시험 라인(203 및 202)의 하류 측에 있다. 그러나 다른 실시예에서, 대조 구역(204)은 시험 라인(203 및 202) 중 어느 하나 또는 모두의 상류 측에 위치될 수도 있다.

바람직한 실시예에서, 대조 라인(204)은, 시험에 사용되는 용출 매체 또는 다른 합성물의 성분과 결합되는 항체 또는 다른 재조합 단백질을 포함한다. 핵산이 표적인 실시예에서, 대조 라인(204)은 바람직하게는 표적 핵산에 대한 결합 파트너로서 사용되는 표지식 핵산에 상보적인 핵산을 포함한다.

도면에는, 하나의 시험 라인만이 도시되어 있지만, 다수의 시험 라인이 본 발명의 사상 내에 있다. 다수의 표적이 있는 일부 실시예에서, 각 표적의 존재는 바람직하게는 별개의 시험 라인(202)에 대응한다. 다수의 표적이 있는 다른 실시예에서, 다수의 표적은 2개 이상의 표적의 존재가 단일 표적의 존재와는 상이한 특성을 갖도록 동일한 시험 라인 상에 표시될 수 있다. 예를 들면, 동일한 시험 라인 상에 다수의 표적이 존재하면, 각각의 표적이 단독으로 존재하는 경우와는 상이한 색상에 의해 시각적으로 표시될 수 있다.

다른 실시예에서, 런닝 버퍼 자체에 하나 이상의 약한 용해제를 갖는 것이 가능하다. 이들 실시예에서, 하류 측에 있는 시약 구역에는 악영향이 없고, 샘플은 시약 구역의 상류 측 또는 하류 측에 있을 수 있다. 런닝 버퍼 내의 용해 효소는 그 기질을 「표적」으로 삼고, 그것을 절단하여 세포막 또는 세포벽을 열도록 할 수 있다. 예로서, 페니실린(penicillin)은 감수성 박테리아를 절개하거나 "구멍을 낼" 수 있다. 다른 실시예에서, 용해제는 샘플 채취 재료에 적용되는 경우, 이때, 시약 구역은 샘플 적용 구역의 상류측에 있을 수 있다.

예로서, 하나 이상의 용해제는 측방향 유동 스트립의 샘플 적용 구역 상에서 건조된다. 스트립마다, 용해제는, 150 mM의 염화나트륨을 갖는 5%의 CHAPS 및 2%의 NP-40과, 0.1%의 BSA와, 0.1%의 아지드화 나트륨(모두의 비율이 중량/체적임)을 함유하는 약 2 마이크로리터의 100 mM의 HEPES 버퍼(pH 8.0)로 이루어진다. 그리고 전혈의 10 마이크로리터까지는 현장에서 용해될 샘플 적용 구역에 추가된다. MxA 단백질은 백혈구 세포의 내부로부터 해제되어, 시각적 태그(tag)(콜로이드 금 또는 가시적 라텍스 비드) 상의 MxA 단일클론 항체와 반응한다. 이와 같은 복합체는, Triton X-100을 함유하는 런닝 버퍼와 함께 횡단하여, 니트로셀룰로오스 막의 시험 라인에 고정화된 MxA 단일클론 항체에 의해 포획된다. 시험 라인에서의 이와 같은 결합은 가시적 표시를 발생시킨다.

바이모달 이중 시험 스트립을 갖는 샘플 분석 장치

MxA는 바이러스 감염의 존재 시에 상승하게 되지만 특정 타입의 바이러스에 대해 특이적이지 않는 인터페론 알파/베타 세포의 유도체이다. 말초 혈액에서의 MxA 단백질 발현은 바이러스 감염에 대한 민감하고 특이적인 마커이다.

MxA는 광범위한 바이러스의 복제를 억제한다. MxA는 낮은 기초 농도(50 ng/㎖ 미만) 및 빠른 유도(1 내지 2시간)를 갖는다. MxA는 16시간에 최고에 달하고, 상승된 인터페론의 존재 시에 상승된 상태로 남아 있다. MxA는 또한 혈액중 인터페론의 존재 시에 긴 반감기(2.3일) 및 일정한 역가(titre)를 갖는다. 바이러스 감염은 CRP 레벨을 그다지 증가하지 않으면서 MxA 레벨을 상승시킨다.

ELISA를 사용한 하나의 전향적 임상 시험(Towbin H et al. J Interferon Res 1992;12:67-74, 본 명세서에 참고로 합체됨)에 있어서, 이와 같은 시험은 87명의 보통의 건강한 성인을 참가시켰다. MxA 레벨은 성인의 66%에서 5 ng/㎖ 미만, 성인의 29%에서 5 내지 50 ng/㎖, 성인의 5%에서 50 ng/㎖ 초과인 것으로 측정되었다.

ELISA를 사용한 다른 전향적 임상 시험(Chieux V et al., J Virol Methods 1998;70:183-191, 본 명세서에 참고로 합체됨)은 174명의 소아를 참가시켰다. 이들 소아 중 45명은 급성 발열(호흡기 감염 및/또는 위장염)을 갖고, 30명의 동일 연령 대조군이 있었다. MxA 값은 30명의 동일 연령 대조군에서 7 ng/㎖±7 ng/㎖이었다. MxA 값은 13명의 확인된 박테리아 감염자에서 10 ng/㎖±6 ng/㎖이었다.

ELISA를 사용한 다른 전향적 임상 시험은 60명의 환자를 참가시켰다(Kawamura M et al. J Clin Lab Anal 2012;26:174-183, 본 명세서에 참고로 합체됨). 환자 중 42명은 급성 발열(호흡기 감염 및/또는 위장염)을 갖고, 18명의 동일 연령 대조군이 있었다. 평균 MxA 값은 31명의 확인된 바이러스 감염자에서 110.0 ng/㎖이었다. 평균 MxA 값은 11명의 확인된 박테리아 감염자에서 10.6 ng/㎖이었다. 평균 MxA 값은 18명의 동일 연령 대조군에서 2.0 ng/㎖이었다. ELISA 시험은 바이러스 감염과 박테리아 감염을 구별하기 위한 87.1%의 감도 및 90.9%의 특이도를 가질 뿐만 아니라, 이와 같은 결정을 실행하기 위해 MxA 값만을 시험하였다. 바이러스 감염을 갖는 환자는 100%의 감도 및 특이도를 갖는 건강한 대조군과 뚜렷하게 구별되었다. 36.7 ng/㎖의 컷오프가 이와 같은 연구에서의 ELISA에 의해 바이러스 감염을 결정하는데 사용되었다.

ELISA를 사용한 다른 전향적 임상 시험은 174명의 소아를 참가시켰다 (Nakabayashi M et al., Pediatr Res 2006;60:770-774, 본 명세서에 참고로 합체되고, 데이터가 재교정된 ELISA 표준에 대해 수정되었음). 소아 중 122명은 급성 발열(호흡기 감염 및/또는 위장염)을 갖고, 52명의 동일 연령 대조군이 있었다. 평균 MxA 값은 95명의 확인된 바이러스 감염자에서 123.7 ng/㎖±83.0 ng/㎖이었다. 평균 MxA 값은 27명의 확인된 박테리아 감염자에서 12.3 ng/㎖±10.0 ng/㎖이었다. 평균 MxA 값은 52명의 동일 연령 대조군에서 14.5 ng/㎖±11.0 ng/㎖이었다. 시험은 바이러스 감염을 정확하게 식별하기 위한 92.6%의 특이도 및 13.1의 양성 우도비(likelihood)를 나타냈다. 36.7 ng/㎖의 컷오프가 이와 같은 연구에서의 ELISA에 의해 바이러스 감염을 결정하는데 사용되었다.

ELISA에서의 컷오프는 인위적이고, 양성과 음성을 구별하도록 선택된다. 그러므로 이와 같은 컷오프로부터 10%CV를 일상적으로 부여하는 것이 바람직하다. 현장 검사에서, 100%의 사람은 40 ng/㎖ 초과에서 시험 라인을 가시적으로 나타낼 수 있지만, 일부 사람은 보다 낮은 레벨에서 양성 결과를 나타낼 수 있다.

CRP는 박테리아 감염의 존재 시에 상승하게 되지만, 특정 타입의 박테리아에 대해 특이적이지 않다. CRP는 급성 염증의 존재에 대한 비특이적 지표이고, 박테리아 감염의 존재 시에 상승된다. CRP는 간에 의해 합성된 급성기 단백질(acute-phase protein)이다. IL-6은 CRP 생성의 주요 매개체이다. 박테리아 감염은 현저한 CRP 상승의 강력한 자극제이다. 항생제 치료 후에, CRP 레벨은 빨리 떨어진다. 박테리아 감염은 CRP 레벨을 급격하게 상승시키는 한편, MxA 레벨은 낮은 상태로 남아있다. 박테리아 감염은 혈청 CRP 레벨의 현저한 상승이 몇 시간 내에 발생하는 CRP의 강력한 자극제이다. CRP 레벨은 자극 후에 4 내지 6시간 내에 상승하고 36시간 후에 최고에 이른다. CRP의 혈청 농도는 통상 3 mg/L 미만이다. 심각한 감염 또는 염증의 경우, CRP는 500 mg/L 이상으로 상승할 수 있다.

폐렴은 혈청 CRP 레벨을 상승시켰다(10 mg/L 초과). 혈청 CRP 레벨은 전형적으로 심각한 폐렴에서 100 mg/L보다 높다. 환자의 32%는 폐렴구균 균열증 (pneumococcal bacteremia)은 60 mg/L 미만의 혈청 CRP를 가졌다. 혈청 CRP는 통상 바이러스 감염 시에 10 mg/L 이상으로 상승되지 않는다. 침습성(invasive) 아데노바이러스(Adenovirus) 및 인플루엔자(Influenza)는 CRP를 10 내지 80 mg/L까지 상승시킬 수 있다. 매우 드물게, CRP 레벨은 바이러스 감염 시에 60 mg/L을 초과한다.

박테리아 질환을 위한 컷오프로서 사용될 혈청 CRP에 대한 단일 값을 찾는 10개의 연구(Aouifi et al., Crit care Med. 2000, 28: 3171-6; Hatherill et al., Arch Dis Child 1999: 81: 417-21; Muller et al., Crit Care Med. 2000, 28: 977-83; Penel et al., Rev Med Interne 2001: 22: 706-714; Rothenberger et al., Clin Chem Lab Med, 1999, 37: 275-9; Schwarz et al., Crit Care Med 2000, 28: 1828-32; Selberg et al., Crit Care Med 2000, 28: 2793-8; Suprin et al., Intensive Care Med 2000, 26: 1232-8; Ugarte et al., Crit Care Med 1999, 27: 498-504; Viallon et al., Intensive Care Med 2000, 26: 1082-8, 모두가 본 명세서에 참고로 합체됨)의 메타 분석(meta analysis)은 바이모달 결과를 나타냈다. 3개의 연구(Aouifi et al., Crit care Med. 2000, 28: 3171-6; Penel et al., Rev Med Interne 2001: 22: 706-714; Schwarz et al., Crit Care Med 2000, 28: 1828-32)는 CRP 컷오프 값을 6 내지 15 mg/L로 설정할 것을 추천한 반면, 다른 몇몇 연구(Hatherill et al., Arch Dis Child 1999: 81: 417-21; Muller et al., Crit Care Med. 2000, 28: 977-83; Rothenberger et al., Clin Chem Lab Med, 1999, 37: 275-9; Selberg et al., Crit Care Med 2000, 28: 2793-8; Suprin et al., Intensive Care Med 2000, 26: 1232-8; Ugarte et al., Crit Care Med 1999, 27: 498-504; Viallon et al., Intensive Care Med 2000, 26: 1082-8)는 60 내지 100 mg/L의 컷오프를 추천했다.

분리 시에, MxA도 CRP도 단독으로는 바이러스 및 박테리아 감염 모두를 식별하는데 민감하거나 특이적이지 않다. CRP의 낮은 컷오프 값(cut-off value)은 박테리아 감염을 검출하는 데 높은 감도 및 낮은 특이도를 나타낸다. CRP의 높은 컷오프 값은 박테리아 감염을 검출하는 데 낮은 감도 및 높은 특이도를 나타낸다. MxA는 바이러스 감염을 식별하는 데 특이적이지만, 박테리아 감염에 민감하지 않다. 저CRP, 고CRP 및 MxA의 의료적 결정점(medical decision point)이 반영된 절단 레벨을 포함하는 결과의 다중화된 패턴은 바이러스 및/또는 박테리아 감염에 대한 면역 반응을 식별하기 위한 민감하고 특이적인 방식을 제공한다.

다중화된 측방향 유동 면역분석의 하나의 바람직한 실시예에서, 시험 결과의 핑거스틱(fingerstick) 혈액 패턴은 약 10 mg/L의 저CRP 레벨 컷오프에 대한 혈청 등가량(equivalence), 약 80 mg/L의 고CRP 레벨 컷오프에 대한 혈청 등가량, 및 약 40 ng/㎖의 MxA 컷오프를 갖는 양성 결과를 나타낸다. 이들 바람직한 값은 표 5에 나타나 있다.

시험의 특이도는 의도된 용도를 제한함으로써 더욱 향상된다. 예를 들면, 바람직한 실시예에서, 환자 개체군의 특정 연령만이 시험되고(바람직하게는 1세 이상), 및/또는 교란 인자(confounding factor)를 야기할 수 있는 특정의 기저 조건을 갖는 환자는 바람직하게는 이번 시험에 참여되지 않았다.

신속한 현장 검사용 MxA 면역분석이 개발되었고, 표 6에 나타낸 바와 같이, 발열성 호흡기 질병을 갖는 환자로부터의 25개의 말초 혈액 샘플 내의 MxA ELISA와 비교되었다. 표 7은 ELISA 시험에서 MxA의 가장 낮은 양으로부터 가장 높은 양까지 샘플 데이터를 분류하고 있다.

MxA ELISA 컷오프 값은 36.7 ng/㎖(±10%CV = 33 ng/㎖ 내지 40/5 ng/㎖)이었다. 환자 19는 ELISA 결과가 40 ng/㎖(15 ng/㎖)보다 훨씬 작았지만 MxA의 신속한 현장 검사에서 양성 결과를 나타냈다. 그러나 MxA 면역분석은 100%(9/9)의 감도 및 94%(15/16)의 특이도를 입증하였다.

신속한 현장 검사용 저CRP 레벨 및 고CRP 레벨 면역분석이 개발되었고, 발열성 호흡기 질병을 갖는 환자로부터의 25개의 말초 혈액 샘플 내의 CRP ELISA와 비교되었다. 이들 환자는 표 6 및 표 7에서 MxA에 대해 시험된 샘플 환자이다. 그 결과가 표 8에 나타나 있다.

환자 번호 6 및 8은 ELISA 결과가 80 mg/L 미만이었지만 양성의 CRP 결과를 나타냈다. 환자 번호 23은 ELISA 결과가 정확하게 80 mg/L이었지만 음성 결과를 나타냈다. 환자 번호 9는 그 환자에 대한 ELISA 결과가 10 mg/L 초과이었지만 음성의 CRP 검사 결과를 나타냈다. 그러나 전반적으로 CRP 값은 양쪽 컷오프 값에서 CRP ELISA와 잘 상관되었다.

MxA 및 CRP ELISA를 사용하여, RPS는 상승된 MxA 및 CRP의 존재 또는 부존재에 대해 25개의 건강한 정상 혈액 은행 샘플을 분석했다. 혈장 내의 평균 CRP 농도는 1.6 mg/L인 것으로 나타났다. CRP 레벨은 0.1 내지 3.7 mg/L의 범위인 것으로 나타났다. 그 결과가 표 9에 나타나 있다.

바이모달 이중 시험 스트립은 인간의 박테리아 및 바이러스 감염을 구별하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 또한 동물에 대한 수의학적 응용에 사용될 수도 있다. CRP가 종에 따라 상이하기 때문에, 종들 사이에는 CRP에 대한 공통 항체가 존재하지 않는다. 그러므로 수의학적 시험은 시험될 특정 종에 특이적인 CRP를 포함할 필요가 있다. MxA는 종들 사이에서 잘 보존되고, 따라서 수의학적 시험에 인간 MxA를 사용하는 것이 가능하다. 그러나 대안적으로 특이도의 더욱 증대를 도모하기 위해서 특정 종에 대한 MxA가 사용될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바이모달 이중 시험 스트립을 사용한 수의학적 시험은 고양이, 개, 토끼, 돼지, 양, 말, 소, 원숭이, 침팬지, 개코원숭이(baboon) 및 오랑우탄을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 특정 종에 대해 전개될 수 있다.

MxA 및 저CRP를 갖는 스트립은 임의의 구성, 예를 들어 도 4a 및 도 4b, 또는 도 5a 내지 도 5d에 도시된 구성으로 이루어질 수 있으며, 여기서 MxA는 검출될 바이러스 마커이고, 비교적 낮은 레벨의 CRP는 검출될 박테리아 마커이다. 다른 실시예에서, MxA 시험 라인 및 CRP 시험 라인은 중첩하거나, 시험 스트립 상의 동일한 위치에 있을 수 있다. 이들 실시예에서, 동일한 시험 라인 상의 저CRP 및 MxA의 존재는 박테리아 마커 또는 바이러스 마커가 단독으로 존재하는 것과는 상이한 특성을 갖는다. 예를 들면, 동일한 시험 라인 상에 저CRP 및 MxA 모두가 존재하면, MxA 또는 저CRP가 단독으로 존재하는 것과는 상이한 색상으로 가시적으로 표시될 수 있다. 이들 실시예에서, MxA에 대한 양성 결과는 저CRP에 대한 양성 결과와는 상이한 색상 또는 표시를 제공하고, 그에 따라 분석을 판독하는 사람은 완전 음성 결과, MxA에 대한 양성 결과, 저CRP에 대한 양성 결과 및 MxA 및 저CRP 모두에 대한 양성 결과를 구별할 수 있다. 예를 들면, MxA에 대한 양성 결과는 적색의 시험 라인으로 나타날 수 있고, 저CRP에 대한 양성 결과는 청색의 시험 라인으로 나타날 수 있다. 그래서, 샘플이 MxA 및 저CRP 모두에 대해 양성인 경우, 라인은 가시적으로 보라색이다.

도 6a 및 도 6b, 및 도 7a 내지 도 7d에는, 높은 레벨의 CRP를 검출하는 측방향 유동 분석 장치에 대한 일부 실시예가 도시되어 있다. 이들 구성은, 바이러스 마커에 대한 시험 라인을 갖지 않고, 도 4a 및 도 4b, 및 도 5a 내지 도 5d에 도시된 구성과 유사하며, 동일한 참조부호가 스트립(600, 700)의 동일한 구성요소에 사용된다.

도 6a 및 도 6b는 높은 레벨의 CRP와 같은 박테리아 마커의 존재를 검출하는 시험 라인(623)을 갖는 크로마토그래피 시험 스트립(600)을 도시한다. 샘플은 크로마토그래피 시험 스트립(600)의 적용 구역(401)에 적용된다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 그 후에 샘플은 적어도 하나의 표지식 박테리아 결합 파트너를 포함하는 시약 구역(660)을 통과하고, 이와 같은 결합 파트너는 샘플 이송 액체(예를 들면, 버퍼 용액)에 의해 용출된 후에 이 샘플 이송 액체와 함께 이동할 수 있다. 대안적으로, 도 6b에 도시된 바와 같이, 시약 구역(660)은 시약 구역 내의 표지식 결합 파트너가 샘플 이송 액체에 의해 용출되어 샘플로 이동하도록 샘플 적용 구역(401)의 상류 측에 위치된다. 표지식 박테리아 결합 파트너는 관심의 대상인 박테리아 마커, 예를 들어 높은 레벨의 CRP에 특이적으로 결합되어 복합체를 형성할 수 있으며, 이와 같은 복합체는 검출 구역 내의 다른 특정 시약 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합될 수 있다. 도면에 도시되어 있지 않지만, 흡수 패드뿐만 아니라, 폐기물 구역, 캐리어 백킹부, 하우징, 및 결과 판독을 위한 하우징 내의 개구부를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 다른 알려진 측방향 유동 면역분석 구성요소는 또한 선택적으로는 이와 같은 실시예에서의 시험 스트립(600)의 구성요소일 수도 있다.

시험 스트립(600)은, 박테리아 마커 및 그것의 표지식 결합 파트너에 의해 형성된 박테리아 시약 복합체에 상보적인 고정화된 특정 결합 파트너를 포함하는, 박테리아 마커, 예를 들어 시험 라인(623)의 검출을 위한 섹션을 포함하는 검출 구역(605)을 또한 포함한다. 따라서, 시험 라인(623)에서, 검출 구역 결합 파트너는 결합된 박테리아 마커와 함께 시약 구역(660)으로부터 표지식 박테리아 결합 파트너를 포착한다. 그것의 표지식 결합 파트너에 의한 박테리아 마커의 이와 같은 국소화는 시험 라인(623)에서 표시를 발생시킨다. 시험 라인(623)에서, 박테리아 마커의 존재는 표지식 결합 파트너의 축적으로 생기는 시험 라인(623) 표시의 정성적 및/또는 정량적 판독에 의해 결정된다.

선택적으로, 검출 구역(605)은 다른 박테리아 및/또는 바이러스 마커를 검출하는 추가적인 시험 라인뿐만 아니라, 대조 라인(404)을 포함할 수 있다. 대조 라인(404)은, 표지식 특정 결합 파트너가 어떠한 박테리아 마커와도 결합하지 않을 수 있더라도 분석의 길이를 통해 이동하였다는 것을 나타내고, 그에 따라 분석의 적절한 작동을 확인시킨다. 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이, 대조 구역(404)은 바람직하게는 시험 라인(623)의 하류 측에 있다. 그러나 다른 실시예에서, 대조 구역(404)은 시험 라인(623)의 상류측에 위치될 수도 있다.

바람직한 실시예에서, 대조 라인(404)은, 시험에 사용되는 용출 매체 또는 다른 합성물의 성분과 결합되는 항체 또는 다른 재조합 단백질을 포함한다. 핵산이 표적인 실시예에서, 대조 라인(404)은 바람직하게는 표적 핵산에 대한 결합 파트너로서 사용되는 표지식 핵산에 상보적인 핵산을 포함한다.

고CRP 레벨과 같은 박테리아 마커에 대해 시험하는 다른 바람직한 실시예에서, 도 7a 내지 도 7d에 도시된 바와 같이, 샘플은, 용해제가 바람직하게는 시험 스트립 상에 사전 로딩되는 용해 구역(250)을 통과하고, 이송 액체에 의해 용출된다. 용해제는 현장에서 샘플 내의 임의의 용해하기 쉬운 성분을 용해한다.

크로마토그래피 시험 스트립(700)은, 샘플 적용 구역(201), 용해제를 포함하는 용해 구역(250), 및 박테리아 마커, 예를 들어 높은 레벨의 CRP에 결합되는 적어도 하나의 표지식 결합 파트너를 포함하는 시약 구역(760)을 포함하며, 이와 같은 결합 파트너는 샘플 이송 액체(예를 들면, 버퍼 용액)에 의해 용출된 후에 이 샘플 이송 액체와 함께 이동할 수 있다. 이들 도면에는 시약 구역(760)이 샘플 적용 구역의 하류 측에 도시되어 있지만, 대안적인 실시예에 있어서, 샘플이 용해 구역에 도달하여 효과적으로 용해된 후에, 시약이 일부 지점에서 샘플과 만나는 한에는, 시약 구역(760)이 샘플 적용 구역의 상류 측에 있을 수 있다(도 6b 참조). 표지식 결합 파트너는 관심의 대상인 박테리아 마커, 예를 들어 높은 레벨의 CRP에 특이적으로 결합되어 복합체를 형성할 수 있으며, 이와 같은 복합체는 검출 구역 내의 다른 특정 시약 또는 결합 파트너와 특이적으로 결합될 수 있다. 도면에 도시되어 있지 않지만, 흡수 패드뿐만 아니라, 폐기물 구역, 캐리어 백킹부, 하우징, 및 결과 판독을 위한 하우징 내의 개구부를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 다른 알려진 측방향 유동 면역분석 구성요소는 또한 선택적으로는 이와 같은 실시예에서의 시험 스트립(700)의 구성요소일 수도 있다.

바람직한 실시예에서, 용해제는 샘플 적용 구역(201)과 시약 구역(760) 사이의 용해 구역(250)에 국소화된다. 용해제는 바람직하게는 샘플 이송 액체에 가용성이거나 혼화성이고, 용해제는 샘플 이송 액체와 접촉하면 가용화 및 활성화된다. 그리고 샘플 이송 액체는 용액이나 현탁액 내의 용해제 및 현탁액 내의 샘플 성분 모두를 함유한다. 샘플 내의 임의의 용해하기 쉬운 성분은 그 후에 현탁액에서 용해제에 대해 노출되어, 그 자체가 현장 용해된다. 런닝 버퍼는 그 후에 임의의 용해되지 않은 성분을 포함하는 샘플을 검출 구역(705)으로 운반한다.

용해 구역(250)은, 도 7a에 도시된 바와 같이, 바람직하게는 샘플 적용 구역 (201)과 시약 구역(760) 사이에 위치된다. 다른 실시예에서, 용해제(250)는, 도 7b, 도 7c 및 도 7d에 각각 도시된 바와 같이, 샘플 적용 구역(201), 시약 구역 (760), 또는 샘플 적용 구역(201)과 시약 구역(760) 모두와 중첩한다. 도면이 개략적이고 일정한 축척으로 도시되어 있지 않다는 것에 주목하자. 상이한 구역들 사이의 중첩 양(도 7b 내지 도 7d에 도시됨)은 매우 가변적일 수 있다.

시험 스트립(700)은, 박테리아 마커 및 그것의 표지식 결합 파트너에 의해 형성된 박테리아 컨쥬게이트에 상보적인 고정화된 특정 결합 파트너, 예를 들어 높은 레벨의 CRP에 대한 특정 결합 파트너를 포함하는, 적어도 하나의 박테리아 마커, 예를 들어 시험 라인(723)의 검출을 위한 섹션을 포함하는 검출 구역(705)을 또한 포함한다. 따라서, 시험 라인(723)에서, 검출 구역 결합 파트너는 결합된 박테리아 마커와 함께 시약 구역(760)으로부터 박테리아 표지식 결합 파트너를 포착한다. 그것의 표지식 결합 파트너에 의한 박테리아 마커의 이와 같은 국소화는 시험 라인(723)에서 표시를 발생시킨다. 시험 라인(723)에서, 박테리아 마커의 존재는 표지식 결합 파트너의 축적으로 생기는 시험 라인(723) 표시의 정성적 및/또는 정량적 판독에 의해 결정된다.

선택적으로, 검출 구역(705)은 다른 박테리아 및/또는 바이러스 마커를 검출하는 추가적인 시험 라인뿐만 아니라, 대조 라인(204)을 포함할 수 있다. 대조 라인(204)은, 표지식 특정 결합 파트너가 어떠한 마커와도 결합하지 않을 수 있더라도 분석의 길이를 통해 이동하였다는 것을 나타내고, 그에 따라 분석의 적절한 작동을 확인시킨다. 도 7a 내지 도 7d에 도시된 바와 같이, 대조 구역(204)은 바람직하게는 시험 라인(723)의 하류 측에 있다. 그러나 다른 실시예에서, 대조 구역 (204)은 시험 라인(723)의 상류측에 위치될 수도 있다.

바람직한 실시예에서, 대조 라인(204)은, 시험에 사용되는 용출 매체 또는 다른 합성물의 성분과 결합되는 항체 또는 다른 재조합 단백질을 포함한다. 핵산이 표적인 실시예에서, 대조 라인(204)은 바람직하게는 표적 핵산에 대한 결합 파트너로서 사용되는 표지식 핵산에 상보적인 핵산을 포함한다.

바이모달 이중 시험 스트립 샘플 분석 장치에 대한 하나의 바람직한 구성이 도 8a 내지 도 8c에 도시되어 있다. 샘플 분석 장치 또는 시험 카드(800)는 2개의 측면(836, 837) 및 스플라인 또는 힌지 부분(831)을 갖는 폐쇄 가능한 하우징(835)을 포함한다. 하나의 바람직한 실시예에서, 시험 카드(800)는 2개의 측면(836, 837)이 폐쇄된 경우 약 11.5 ㎝의 길이(L) x 7 ㎝의 폭(W)을 갖는다. 그러나 모든 구성요소를 수용하는 임의의 크기의 시험 카드(800)가 사용될 수 있다. 하우징 (835)의 제1 측면(836) 내에는, 2개의 시험 스트립(815, 825)이 있으며, 이들 시험 스트립 각각은 수용 패드(845), 전환 구역(850), 이송 패드(855) 및 검출 구역 (805)을 포함한다. 제1 측면(836)은 또한 흡수 패드(840) 및 바람직하게는 폐기물 패드(860)를 포함한다. 제1 시험 스트립(815)은 바람직하게는 MxA 시험 라인(802), 저CRP 시험 라인(803) 및 대조 라인(804)을 갖는 검출 구역(805)을 포함한다. 제2 시험 스트립(825)은 바람직하게는 고CRP 시험 라인(823) 및 대조 라인(804)을 갖는 검출 구역(805)을 포함한다. 모든 시험 라인은 하우징(835)이 폐쇄되는 경우 하우징(835)의 제2 측면(837) 상의 윈도우(865)를 통해 보인다. 흡수 패드(840)는 바람직하게는 런닝 버퍼가 측방향 유동을 개시하도록 추가되는 단일 패드이다. 유사하게, 폐기물 패드(860)는 바람직하게는 시험의 종료 시에 과잉의 런닝 버퍼를 채취하는 단일 패드이다. 그러나 다른 실시예에서, 각각의 스트립은 별개의 흡수 패드 (840) 및/또는 폐기물 패드(860)를 가질 수 있다.

하우징(835)의 제2 측면(837)은 3개의 분리된 섹션(838, 839, 870)을 포함한다. 중간 부분, 즉 샘플 압축기 또는 플랩(870)은 바람직하게는 2개의 컨쥬게이트 구역(872, 874)을 포함하고, 이들 컨쥬게이트 구역 각각은 적어도 하나의 분석물을 위한 표지식 결합 파트너 및 표지식 대조를 포함한다. 윈도우(843)는 하우징의 제2 측면(837)의 하측 부분(838)에 위치되어, 하우징(835)이 폐쇄될 때 버퍼가 흡수 패드(840)에 추가될 수 있다. 검출 구역(805)을 위한 관찰 윈도우(865)는 하우징 (835)의 제2 측면(837)의 상측 부분(839) 상에 있다.

하우징(835)의 제2 측면(837)의 상측 부분(839) 및 하측 부분(838)은 또한 바람직하게는 하나 이상의 구멍(895)과 정합하는 적어도 하나의 노브(knob), 페그 (peg) 또는 돌기(875)를 각각 포함하고, 그에 따라 상측 부분(839) 및 하측 부분 (838)은 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에 용이하게 체결될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에서 흡수 패드(840) 옆에 있는 2개의 구멍(895)과 정합하는 하측 부분(838) 상의 2개의 페그(875), 및 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에서 폐기물 패드(860) 옆에 있는 2개의 구멍(895)과 정합하는 상측 부분(839) 상의 2개의 페그(875)가 있다. 다른 실시예에서, 구멍(895)은 하우징 (835)의 제2 측면(837) 상에 있고, 페그(875)는 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에 있다. 또 다른 실시예에서, 하우징(835)의 제2 측면(837)의 상측 부분(838) 및/또는 하측 부분(839)을 하우징(835)의 제1 측면(836)에 고정하는데 다른 가역적인 체결 메커니즘이 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 상측 및 하측 섹션(839, 838)은 사용 전에 예를 들어 접착제를 사용하여 영구적으로 폐쇄된다.

하우징의 제2 측면(837) 상의, 샘플 압축기로도 알려진 플랩(870)은 2개의 컨쥬게이트 구역(872, 874) 및 2개의 샘플 적용 구역(873, 876)을 포함하고, 용이하게 개방 및 폐쇄될 수 있다. 플랩(870)은 또한 바람직하게는 하나 이상의 구멍 (895)과 정합하는 적어도 하나의 노브, 페그 또는 돌기(875)를 포함하고, 그에 따라 플랩(870)은 샘플이 샘플 적용 구역(873, 876)에 추가된 후에 하우징(835)의 제1 측면(836) 상으로 용이하고 정확하게 폐쇄된다. 다른 실시예에서, 구멍(895)은 하우징(835)의 제2 측면(837) 상에 있고, 페그(875)는 하우징(835)의 제1 측면 (836) 상에 있다. 또 다른 실시예에서는, 플랩(870)을 하우징(835)의 제1 측면 (836)에 고정하기 위해 다른 가역적인 체결 메커니즘이 사용될 수 있다.

컨쥬게이트 구역(872, 874) 및 샘플 적용 구역(873, 876)은 바람직하게는 중첩한다. 바람직한 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(872, 874)은 샘플 컨쥬게이트 및 대조 컨쥬게이트 내의 염료로 인해 착색되며, 샘플은 플랩(870)의 착색된 부분 상에 직접 배치된다. 하나의 바람직한 실시예에서, 제1 시험 스트립(815)에 사용되는 컨쥬게이트 구역(872)은 적색 염료로 표지화된 MxA 결합 파트너, 흑색 염료로 표지화된 저CRP 결합 파트너, 및 청색 염료로 표지화된 대조 결합 파트너를 함유한다. 이와 같은 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(872)은 자줏빛을 띤다. 다른 컨쥬게이트 구역(874)은 흑색 염료로 표지화된 고CRP 결합 파트너, 및 청색 염료로 표지화된 대조 결합 파트너를 함유한다. 이와 같은 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(874)은 푸른빛을 띤다.

전환 구역(850)은 바람직하게는 측방향 유동을 차단하여 컨쥬게이트 구역 (872, 874) 및 샘플 적용 구역(873, 876)을 포함하는 플랩(870)으로 런닝 버퍼를 상방으로 전환하는 갭 또는 배리어를 포함한다.

작동 시에, 하우징(835)의 제2 측면(837)의 상측 및 하측 부분(839, 838)은 바람직하게는 페그(875)를 구멍(895)에 고정함으로써 사용 전에 폐쇄 상태로 스냅 결합된다. 샘플 분석 장치 또는 시험 카드(800)는 바람직하게는 편평한 표면상에 배치된다. 플랩(870)이 사전에 개방되어 있지 않으면, 사용자는 플랩(870)을 개방하여 샘플 적용 구역(873, 876)에 접근한다. 시험될 혈액 샘플이 환자로부터 취해진다. 샘플은 본 기술분야에 알려진 임의의 절차에 의해 취해질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 5 ㎕의 혈액 샘플이 각각의 샘플 적용 구역(873, 876)에 추가되고, 그 후에 플랩(870)이 폐쇄된다. 5 ㎕의 샘플 각각은 바람직하게는 서로 독립적으로 채취된다. 혈액 샘플은 바람직하게는 어떠한 전처리도 없이 장치(800)에 직접 추가된다.

샘플 압축기 또는 플랩(870)이 정확하게 폐쇄되었다는 것을 보장하기 위해서, 압력이 바람직하게는 페그(875) 위에서 하우징(835)에 가해져서 페그(875)를 폐쇄 상태로 스냅 결합한다. 플랩(870)의 상부는 시험을 적절하게 진행하기 위해 하우징(835)의 제2 측면(837)의 나머지의 상부와 동일면 상에 있을 필요가 있다. 런닝 버퍼가 흡수 패드(840)에 추가되어 측방향 유동(885)을 개시한다. 바람직한 실시예에서, 런닝 버퍼는 혈액 샘플을 용해하여 샘플 내의 세포내 MxA를 노출시키기 위해 하나 이상의 용해제, 예를 들어 세제를 포함한다. 런닝 버퍼는 전환 구역(850)에 도달하면 플랩(870) 내로 상방으로 전환된다. 런닝 버퍼는 컨쥬게이트 구역(872, 874)을 통해 이동하여, 대조 컨쥬게이트뿐만 아니라, MxA 결합 파트너와 샘플 내의 MxA 사이, 저CRP 결합 파트너와 샘플 내의 낮은 레벨의 CRP 사이, 고CRP 결합 파트너와 샘플 내의 높은 레벨의 CRP 사이에 형성된 임의의 복합체를 채취한다.

컨쥬게이트 구역(872, 874)이 측방향 유동 시험 스트립(815, 825) 상에서 전환 구역(850)을 브리징하기 때문에, 그 후에, 상기에서 설명된 샘플, 컨쥬게이트 및 복합체를 이제 함유하는 런닝 버퍼는 이송 패드(855) 내로 이동하고 각각의 시험 스트립(815, 825) 상의 검출 구역(805)까지 이동한다. MxA가 샘플 내에 존재한다면, 제1 시험 스트립(815) 상의 MxA 시험 라인(802)은 적색이 된다. 임계의 낮은 레벨의 CRP가 샘플 내에 존재한다면, 제1 시험 스트립(815) 상의 저CRP 시험 라인 (803)은 흑색이 된다. 임계의 높은 레벨의 CRP가 샘플 내에 존재한다면, 제2 시험 스트립(825) 상의 고CRP 시험 라인(823)은 흑색이 된다. 시험이 정확하게 진행되었다면, 제1 시험 스트립(815) 및 제2 시험 스트립(825) 모두 상의 대조 라인(804)은 청색이 된다. 바람직한 실시예에서, 검출 레벨은 MxA에 대해 40 ng/㎖이고, 제1 시험 스트립(815) 상의 저CRP에 대해 10 mg/L이고, 제2 시험 스트립(825) 상의 고CRP에 대해 80 mg/L이다. 시험 결과는 약 5 내지 20분 후에, 바람직하게는 약 10분 내에 보여야 한다.

대조 결합 파트너가 샘플 압축기 또는 플랩(870) 상에는 있지만 시험 스트립 (815, 825)의 어디 상에도 없기 때문에, 이와 같은 구성에 대한 올바른 절차 대조가 있다. 플랩(870)이 적절하게 폐쇄되지 않으면, 검출 구역(805)에서 어떤 것도 나타나지 않아, 시험이 부적절하게 진행되었다는 것을 나타낸다.

도 9a 내지 도 9f는 도 8a 내지 도 8c에 도시된 장치(800)를 사용한 시험 결과를 나타내고, 2개의 시험 스트립(815, 825)이 나란히 있고, 여기서 제1 시험 스트립(815)은 MxA 및 낮은 레벨의 CRP 모두의 존재에 대해 시험하고, 제2 시험 스트립(825)은 높은 레벨의 CRP에 대해 시험한다.

도 9a는 제1 시험 스트립(815) 상의 MxA 시험 라인(802)에서의 음성 결과 및 저CRP 시험 라인(803)에서의 음성 결과뿐만 아니라, 제2 시험 스트립(825) 상의 고CRP 시험 라인(823)에서의 음성 결과를 나타낸다. 보다 구체적으로는, 측방향 유동 분석(800)의 검출 구역(805)에서 단지 보이는 라인은 2개의 청색 대조 라인(804)이다. 이와 같은 결과는 샘플이 바이러스 및 박테리아 감염 모두에 대해 음성인 것을 나타낸다.

도 9b 및 도 9c는 바이러스 감염에 대해 양성이다. 도 9b에서, 2개의 청색 대조 라인(804) 및 적색 MxA 라인(802)의 존재는 바이러스 감염을 나타낸다. 도 9c에서, 2개의 청색 대조 라인(804) 및 적색 MxA 라인(802)의 존재는 바이러스 감염을 나타낸다. 또한, 도 9c에는 흑색 저CRP 라인(803)이 있기 때문에, 박테리아 동시 감염의 가능성이 있지만, 고CRP 라인(823)이 존재하지 않는다.

도 9d 및 도 9e는 박테리아 감염에 대해 양성이다. 도 9d에서, 2개의 청색 대조 라인(804) 및 흑색 저CRP 라인(803)의 존재는 박테리아 감염을 나타낸다. 도 9e에서, 2개의 청색 대조 라인(804), 흑색 저CRP 라인(803) 및 흑색 고CRP 라인 (823)의 존재는 또한 박테리아 감염을 나타낸다. 도 9d 및 도 9e 모두에서 MxA 라인이 존재하지 않아, 바이러스 감염의 부존재를 나타낸다.

도 9f는 동시 감염(박테리아 및 바이러스 감염 모두)을 나타낸다. 2개의 청색 대조 라인(804), 적색 MxA 라인(802), 흑색 저CRP 라인(803) 및 흑색 고CRP 라인(823)의 존재는 바이러스 및 박테리아 감염 모두의 존재를 나타낸다.

바이모달 이중 시험 스트립 샘플 분석 장치(1000)에 대한 다른 바람직한 구성이 도 10a 내지 도 10c에 도시되어 있다. 이와 같은 구성(1000)은 도 8a 내지 도 8c에 도시된 구성(800)과 유사하지만, 샘플 적용 구역(1073, 1076)은 전환 구역 (850)의 하류 측의 각각의 시험 스트립(1015, 1025) 상에 위치된다. 샘플 분석 장치 또는 시험 카드(1000)는 2개의 측면(836, 837) 및 스플라인 또는 힌지 부분 (831)을 갖는 폐쇄 가능한 하우징(835)을 포함한다. 하나의 바람직한 실시예에서, 시험 카드(1000)는 2개의 측면(836, 837)이 폐쇄된 경우 약 11.5 ㎝의 길이(L) x 7 ㎝의 폭(W)을 갖는다. 그러나 모든 구성요소를 수용하는 임의의 크기의 시험 카드 (1000)가 사용될 수 있다. 하우징(835)의 제1 측면(836) 내에는, 2개의 시험 스트립(1015, 1025)이 있으며, 이들 시험 스트립 각각은 수용 패드(845), 전환 구역 (850), 이송 패드(1055) 및 검출 구역(805)을 포함한다. 제1 측면(836)은 또한 흡수 패드(840) 및 바람직하게는 폐기물 패드(860)를 포함한다. 제1 시험 스트립 (1015)은 바람직하게는 MxA 시험 라인(802), 저CRP 시험 라인(803) 및 대조 라인 (804)을 갖는 검출 구역(805)을 포함한다. 제2 시험 스트립(1025)은 바람직하게는 고CRP 시험 라인(823) 및 대조 라인(804)을 갖는 검출 구역(805)을 포함한다. 모든 시험 라인은 하우징(835)이 폐쇄되는 경우 하우징(835)의 제2 측면(837) 상의 윈도우(865)를 통해 보인다. 흡수 패드(840)는 바람직하게는 런닝 버퍼가 측방향 유동을 개시하도록 추가되는 단일 패드이다. 유사하게, 폐기물 패드(860)는 바람직하게는 시험의 종료 시에 과잉의 런닝 버퍼를 채취하는 단일 패드이다. 그러나 다른 실시예에서, 각각의 스트립은 별개의 흡수 패드(840) 및/또는 폐기물 패드(860)를 가질 수 있다.

하우징(835)의 제2 측면(837)은 3개의 분리된 섹션(838, 839, 1070)을 포함한다. 중간 부분, 또는 샘플 압축기로도 알려진 플랩(1070)은 바람직하게는 2개의 컨쥬게이트 구역(872, 874)을 포함하고, 이들 컨쥬게이트 구역 각각은 적어도 하나의 분석물을 위한 표지식 결합 파트너 및 표지식 대조를 포함한다. 윈도우(843)는 하우징의 제2 측면(837)의 하측 부분(838)에 위치되어, 하우징(835)이 폐쇄될 때 버퍼가 추가될 수 있다. 검출 구역(805)을 위한 관찰 윈도우(865)는 하우징(835)의 제2 측면(837)의 상측 부분(839) 상에 있다.

하우징(835)의 제2 측면(837)의 상측 부분(839) 및 하측 부분(838)은 또한 바람직하게는 하나 이상의 구멍(895)과 정합하는 적어도 하나의 노브, 페그 또는 돌기(875)를 각각 포함하고, 그에 따라 상측 부분(839) 및 하측 부분(838)은 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에 용이하게 체결될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에서 흡수 패드(840) 옆에 있는 2개의 구멍(895)과 정합하는 하측 부분(838) 상의 2개의 페그(875), 및 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에서 폐기물 패드(860) 옆에 있는 2개의 구멍(895)과 정합하는 상측 부분(839) 상의 2개의 페그(875)가 있다. 다른 실시예에서, 구멍(895)은 하우징(835)의 제2 측면(837) 상에 있고, 페그(875)는 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에 있다. 또 다른 실시예에서, 하우징(835)의 제2 측면(837)의 상측 부분(838) 및/또는 하측 부분 (839)을 하우징(835)의 제1 측면(836)에 고정하는데 다른 가역적인 체결 메커니즘이 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 상측 및 하측 섹션(839, 838)은 사용 전에 예를 들어 접착제를 사용하여 영구적으로 폐쇄된다.

하우징의 제2 측면(837) 상의 플랩(1070)은 2개의 컨쥬게이트 구역(872, 874)을 포함하고, 용이하게 개방 및 폐쇄될 수 있다. 플랩(1070)은 또한 바람직하게는 하나 이상의 구멍(895)과 정합하는 적어도 하나의 노브, 페그 또는 돌기(875)를 포함하고, 그에 따라 플랩(1070)은 샘플이 시험 스트립(1015, 1025) 상의 샘플 적용 구역(1073, 1076)에 추가된 후에 하우징(835)의 제1 측면(836) 상으로 용이하고 정확하게 폐쇄된다. 다른 실시예에서, 구멍(895)은 하우징(835)의 제2 측면 (837) 상에 있고, 페그(875)는 하우징(835)의 제1 측면(836) 상에 있다. 또 다른 실시예에서, 플랩(1070)을 하우징(835)의 제1 측면(836)에 고정하기 위해 다른 가역적인 체결 메커니즘이 사용될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(872, 874)은 샘플 컨쥬게이트 및 대조 컨쥬게이트 내의 염료로 인해 착색된다. 하나의 바람직한 실시예에서, 제1 시험 스트립(1015)에 사용되는 컨쥬게이트 구역(872)은 적색 염료로 표지화된 MxA 결합 파트너, 흑색 염료로 표지화된 저CRP 결합 파트너, 및 청색 염료로 표지화된 대조 결합 파트너를 함유한다. 이와 같은 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(872)은 자줏빛을 띤다. 다른 컨쥬게이트 구역(874)은 흑색 염료로 표지화된 고CRP 결합 파트너, 및 청색 염료로 표지화된 대조 결합 파트너를 함유한다. 이와 같은 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(874)은 푸른빛을 띤다.

바람직하게는 갭 또는 배리어를 포함하는 전환 구역(850)은 측방향 유동을 차단하여 컨쥬게이트 구역(872, 874)을 포함하는 플랩(1070)으로 런닝 버퍼를 상방으로 전환한다.

작동 시에, 하우징(835)의 제2 측면(837)의 상측 및 하측 부분(839, 838)은 바람직하게는 페그(875)를 구멍(895)에 고정함으로써 사용 전에 폐쇄 상태로 스냅 결합된다. 샘플 분석 장치 또는 시험 카드(1000)는 바람직하게는 편평한 표면상에 배치된다. 플랩(1070)이 사전에 개방되어 있지 않으면, 사용자는 플랩(1070)을 개방하여 샘플 적용 구역(1073, 1076)에 접근한다. 샘플 적용 구역(1073, 1076)은 이송 패드(1055)의 임의의 부분에 위치될 수 있다. 시험될 혈액 샘플이 환자로부터 취해진다. 샘플은 본 기술분야에 알려진 임의의 절차에 의해 취해질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 5 ㎕의 혈액 샘플이 각각의 샘플 적용 구역(1073, 1076)에 추가되고, 그 후에 플랩(1070)이 폐쇄된다. 5 ㎕의 샘플 각각은 바람직하게는 서로 독립적으로 채취된다. 혈액은 바람직하게는 어떠한 전처리도 없이 장치(1000)에 직접 추가된다. 바람직한 실시예에서, 화살표(1002)(도 10a에 도시됨) 또는 다른 표시, 예를 들어 "여기에 샘플을 추가하라"는 문구는 사용자가 시험 스트립(1015, 1025) 상에 샘플을 배치하는 위치를 나타낸다.

플랩(1070)이 정확하게 폐쇄되었다는 것을 보장하기 위해서, 압력이 바람직하게는 페그(875) 위에서 하우징(835)에 가해져서 페그(875)를 폐쇄 상태로 스냅 결합한다. 플랩(1070)의 상부는 시험을 적절하게 진행하기 위해 하우징(835)의 제2 측면(837)의 나머지의 상부와 동일면 상에 있을 필요가 있다. 런닝 버퍼가 흡수 패드(840)에 추가되어 측방향 유동(885)을 개시한다. 바람직한 실시예에서, 런닝 버퍼는 혈액 샘플을 용해하여 샘플 내의 세포내 MxA를 노출시키기 위해 하나 이상의 용해제, 예를 들어 세제를 포함한다. 런닝 버퍼는 전환 구역(850)에 도달하면 플랩 (870) 내로 상방으로 전환된다. 런닝 버퍼는 컨쥬게이트 구역(872, 874)을 통해 이동하여, 대조 컨쥬게이트뿐만 아니라, MxA 결합 파트너, 저CRP 결합 파트너 및 고CRP 결합 파트너를 채취한다.

컨쥬게이트 구역(872, 874)이 측방향 유동 시험 스트립(1015, 1025) 상에서 전환 구역(850)을 브리징하기 때문에, 그 후에, 컨쥬게이트를 이제 함유하는 런닝 버퍼는 샘플 적용 구역(1073, 1076)을 포함하는 이송 패드(1055) 내로 이동하고 각각의 시험 스트립(1015, 1025) 상의 검출 구역(805)까지 이동한다. MxA가 샘플 내에 존재한다면, 제1 시험 스트립(1015) 상의 MxA 시험 라인(802)은 적색이 된다. 임계의 낮은 레벨의 CRP가 샘플 내에 존재한다면, 제1 시험 스트립(1015) 상의 저CRP 시험 라인(803)은 흑색이 된다. 임계의 높은 레벨의 CRP가 샘플 내에 존재한다면, 제2 시험 스트립(1025) 상의 고CRP 시험 라인(823)은 흑색이 된다. 바람직한 실시예에서, 검출 레벨은 MxA에 대해 40 ng/㎖이고, 제1 시험 스트립(1015) 상의 저CRP에 대해 10 mg/L이고, 제2 시험 스트립(1025) 상의 고CRP에 대해 80 mg/L이다. 시험 결과는 약 5 내지 20분 후에, 바람직하게는 약 10분 내에 보여야 한다. 시험이 정확하게 진행되었다면, 제1 시험 스트립(815) 및 제2 시험 스트립(825) 모두 상의 대조 라인(804)은 청색이 된다.

대조 결합 파트너가 플랩(1070) 상에는 있지만 시험 스트립(1015, 1025)의 어디 상에도 없기 때문에, 이와 같은 구성에 대한 올바른 절차 대조가 있다. 플랩 (1070)이 적절하게 폐쇄되지 않으면, 검출 구역(805)에서 어떤 것도 나타나지 않아, 시험이 부적절하게 진행되었다는 것을 나타낸다.

대안적인 실시예에서, 샘플 적용 구역(1073, 1076)은 전환 구역(850) 앞의 수용 패드(845) 상에 위치된다. 이와 같은 실시예에서, 런닝 버퍼는 샘플 적용 구역(1073, 1076)을 통해 이동한 후에, 플랩(1070) 내로 전환된다.

도 8a 내지 도 8c 및 도 10a 내지 도 10c에 도시된 구성의 바람직한 실시예에서, 약 1.2 ㎖ 초과의 러닝 버퍼가 흡수 패드(840) 상에 배치된다. 전환 구역 (850)이 갭인 실시예에서 1.0 ㎖ 미만이 추가되면, 갭이 약 1.0 ㎖를 유지하기 때문에 버퍼는 갭에서 멈추게 된다.

도 11에 도시된 바와 같이, 하나의 바람직한 실시예에서, 키트(1100)는 샘플 분석 장치(800, 1000), 랜싯(1102), 하나 이상의 피펫(1101) 및 런닝 버퍼(1103)를 포함한다. 랜싯(1102)은 피부에 상처를 내는 데 사용되고, 하나 이상의 피펫(1101)은 상처 부위로부터 혈액을 채취하는 데 사용된다. 바람직한 실시예에서, 5 ㎕의 혈액이 제1 피펫(1101)으로부터 제1 컨쥬게이트 구역(872)으로 이송되고, 5 ㎕의 다른 혈액이 제2 피펫(1101)으로부터 이송되어 제2 컨쥬게이트 구역(874)에 추가된다. 도 8a 내지 도 8c 및 도 10a 내지 도 10c의 설명에서 기재된 바와 같이, 플랩 (870)이 폐쇄되고, 런닝 버퍼(1103)가 흡수 패드(840)에 추가된다.

전환 구역(850)은 바람직하게는 유동이 발생하고 있는 평면 내에서의 유동을 차단하는 적어도 하나의 특징부를 포함한다. 전환 구역은 배리어, 갭, 디치(ditch) 또는 이들 특징부의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 배리어는 바람직하게는 액체의 유동이 동일한 평면 내에서 계속해서 유동하는 것을 저지하는 임의의 재료로 이루어질 수 있는 불투과성 막(또는 실질적인 불투과성 막)이다. 배리어를 위한 일부 재료는 불활성 재료, 반투과성 재료, 플라스틱, 탄화수소, 금속, 소수성 재료, 세파덱스(Sephadex) 또는 세파로오스(Sepharose), 셀룰로오스 아세테이트, 흡습성 재료(예를 들면, CaCl2, CaSO4 또는 실리카겔) 또는 하이드로겔을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 갭 또는 디치는 유동을 중단시키기에 충분한 깊이까지 연장되는 측방향 유동 시험 스트립의 평면에서의 임의의 갈라진 틈이다. 하나의 바람직한 실시예에서, 갭은 깊이가 바람직하게 적어도 약 0.1 ㎜이다.

도 8a 내지 도 8c 및 도 10a 내지 도 10c에 있어서의 전환 구역(850)은 샘플 압축기/플랩(870, 1070)이 장치의 나머지와 접촉하게 될 때까지 유동을 지연시키거나 완전히 중단시키고, 유체를 유동시킬 수 있는 브리지(bridge)를 생성한다. 샘플 압축기(870, 1070)는 브리지로서 작용하고, 유동을 상이한 평면으로 재지향시킨다. 유동은 샘플 압축기(870, 1070)로 전환된다. 이것은 샘플 압축기(870, 1070) 상에의 시약의 채취를 증대시킨다. 예를 들면, 컨쥬게이트가 샘플 압축기(870, 1070) 상에 있는 실시예에서, 컨쥬게이트의 채취는 전환 구역(850)을 갖는 장치에서 증가한다. 샘플 적용 구역(873, 876, 1073, 1076) 및 컨쥬게이트 모두가 샘플 압축기 (870, 1070) 상에 있는 실시예에서, 샘플 및 컨쥬게이트 모두는 샘플 압축기(870, 1070)로 전환될 때 런닝 버퍼와 만나고, ½ 샌드위치 또는 완전한 샌드위치(분석물을 위한 제2 결합 파트너가 샘플 분석 장치상에 위치되는 곳에 의존함)는 분석물이 샘플 내에 존재하는 경우에 런닝 버퍼가 시험 스트립으로 다시 전환하기 전에 형성된다. 전환 구역(850) 및 샘플 압축기(870, 1070)를 갖는 실시예는 속도를 증가시키고, 컨쥬게이트와 샘플 사이의 보다 양호한 상호작용을 허용하며, 보다 많은 컨쥬게이트가 유체 내에 배치되기 때문에 보다 높은 감도를 허용한다. 이들 실시예에서, 모든 유체는 바람직하게는 컨쥬게이트와 상호작용한다. 이것은 약 20% 내지 30%의 유체가 컨쥬게이트와 상호작용하는 재지향이 없는 압축기 실시예에 비해 상당한 개선점이다.

바이모달 이중 시험 스트립 샘플 분석 장치(1200)에 대한 다른 바람직한 구성이 도 12에 도시되어 있다. 이와 같은 구성은 하우징(1235)의 제2 섹션(837) 또는 전환 구역(850)을 갖지 않고, 도 8a 내지 도 8c 및 도 10a 내지 도 10c에 도시된 구성(800, 1000)과 유사하다. 대신에, 시험의 모든 구성요소는 동일한 평면 내에 위치되고, 유동은 흡수 패드(840)로부터 폐기물 패드(860)까지 측방향으로 진행한다. 이와 같은 실시예는 흡수 패드(840)에의 버퍼의 적용을 용이하게 하는 윈도우, 샘플을 장치(1200)에 적용하기 위한 각각의 샘플 적용 구역(1273, 1276) 위에 위치된 윈도우, 및 검출 구역(805)을 위한 관찰 윈도우를 갖는 하우징을 또한 포함한다는 것에 주목하자. 하나의 바람직한 실시예에서, 샘플 분석 장치(1200)는 약 11.5 ㎝의 길이(L) x 7 ㎝의 폭(W)을 갖는다. 그러나 모든 구성요소를 수용하는 임의의 크기의 시험 카드(1200)가 사용될 수 있다. 2개의 시험 스트립(1215, 1225)이 있으며, 이들 시험 스트립 각각은 수용 패드(845), 컨쥬게이트 구역(1272, 1274), 샘플 적용 구역(1273, 1276)을 포함하는 이송 패드(1240), 및 검출 구역(805) 및 폐기물 패드(860)를 포함한다. 이 장치(1200)는 또한 바람직한 흡수 패드(840) 및 폐기물 패드(860)를 포함한다. 이와 같은 도면에는, 컨쥬게이트 구역(1272, 1274)이 샘플 적용 구역(1273, 1276)의 상류 측에 도시되어 있지만, 다른 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(1272, 1274) 중 하나 또는 모두는 샘플 적용 구역(1273, 1276)의 하류 측에 위치된다. 제1 시험 스트립(1215)의 검출 구역(805)은 바람직하게는 MxA 시험 라인(802), 저CRP 시험 라인(803) 및 대조 라인(804)을 포함한다. 제2 시험 스트립(1225) 상의 검출 구역(805)은 또한 바람직하게는 고CRP 시험 라인(823) 및 대조 라인(804)을 포함한다. 흡수 패드(840)는 바람직하게는 런닝 버퍼가 측방향 유동을 개시하도록 추가되는 단일 패드이다. 유사하게, 폐기물 패드(860)는 바람직하게는 시험의 종료 시에 과잉의 런닝 버퍼를 채취하는 단일 패드이다. 그러나 다른 실시예에서, 각각의 스트립은 별개의 흡수 패드(840) 및/또는 폐기물 패드(860)를 가질 수 있다.

바람직한 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(1272, 1274)은 샘플 컨쥬게이트 및 대조 컨쥬게이트 내의 염료로 인해 착색된다. 하나의 바람직한 실시예에서, 제1 시험 스트립(1215)에 사용되는 컨쥬게이트 구역(1272)은 적색 염료로 표지화된 MxA 결합 파트너, 흑색 염료로 표지화된 저CRP 결합 파트너, 및 청색 염료로 표지화된 대조 결합 파트너를 함유한다. 이와 같은 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(1272)은 자줏빛을 띤다. 다른 컨쥬게이트 구역(1274)은 흑색 염료로 표지화된 고CRP 결합 파트너, 및 청색 염료로 표지화된 대조 결합 파트너를 함유한다. 이와 같은 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(1274)은 푸른빛을 띤다.

작동 시에, 시험될 혈액 샘플이 환자로부터 취해진다. 샘플은 본 기술분야에 알려진 임의의 절차에 의해 취해질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 5 ㎕의 혈액 샘플이 각각의 샘플 적용 구역(1273, 1276)에 추가된다. 5 ㎕의 샘플 각각은 바람직하게는 서로 독립적으로 채취된다. 바람직한 실시예에서, 화살표(1002)(도 10a에 도시됨) 또는 다른 표시, 예를 들어 "여기에 샘플을 추가하라"는 문구는 사용자가 시험 스트립(1215, 1225) 상에 샘플을 배치하는 위치를 나타낸다.

혈액은 바람직하게는 어떠한 전처리도 없이 장치(1200)에 직접 추가된다. 런닝 버퍼가 흡수 패드(840)에 추가되어 측방향 유동(1285)을 개시한다. 바람직한 실시예에서, 런닝 버퍼는 혈액 샘플을 용해하여 샘플 내의 세포내 MxA를 노출시키기 위해 하나 이상의 용해제, 예를 들어 세제를 포함한다. 런닝 버퍼는 컨쥬게이트 구역(1272, 1274)을 통해 이동하여, 대조 컨쥬게이트뿐만 아니라, MxA 결합 파트너, 저CRP 결합 파트너 및 고CRP 결합 파트너를 채취한다.

그 후에, 컨쥬게이트를 이제 함유하는 런닝 버퍼는 샘플 적용 구역(1273, 1276)을 포함하는 이송 패드(1255) 내로 이동하고 각각의 시험 스트립(1215, 1225) 상의 검출 구역(805)까지 이동한다. MxA가 샘플 내에 존재한다면, 제1 시험 스트립 (1215) 상의 MxA 시험 라인(802)은 적색이 된다. 임계의 낮은 레벨의 CRP가 샘플 내에 존재한다면, 제1 시험 스트립(1215) 상의 저CRP 시험 라인(803)은 흑색이 된다. 임계의 높은 레벨의 CRP가 샘플 내에 존재한다면, 제2 시험 스트립(1225) 상의 고CRP 시험 라인(823)은 흑색이 된다. 바람직한 실시예에서, 검출 레벨은 MxA에 대해 40 ng/㎖이고, 제1 시험 스트립(1215) 상의 저CRP에 대해 10 mg/L이며, 제2 시험 스트립(1225) 상의 고CRP에 대해 80 mg/L이다. 시험 결과는 약 5 내지 20분 후에, 바람직하게는 약 10분 내에 보여야 한다. 시험이 정확하게 진행되었다면, 제1 시험 스트립(1215) 및 제2 시험 스트립(1225) 모두 상의 대조 라인(804)은 청색이 된다.

대안적인 실시예에서, 샘플 적용 구역(1273, 1276)은 컨쥬게이트 구역(1272, 1274)의 상류 측에 위치된다. 이와 같은 실시예에서, 런닝 버퍼는 샘플 적용 구역 (1273, 1276)을 통해 이동한 후에, 컨쥬게이트 구역(1272, 1274)까지 이동한다. 또 다른 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(1272, 1274)은 샘플 적용 구역(1273, 1276)과 중첩한다. 또 다른 실시예에서, 컨쥬게이트 구역(1272, 1274) 및/또는 샘플 적용 구역(1273, 1276)은 수용 패드(845) 내에 위치될 수도 있다.

도 4a 내지 도 8c, 도 10a 내지 도 10c 및 도 12에 도시된 구성의 바람직한 실시예에서, 대조는 래빗 항-치킨이고, 대조 컨쥬게이트는 치킨 IgY에 결합되는 청색 라텍스 비드이다. 다른 바람직한 실시예에서, 런닝 버퍼 내에 적어도 하나의 용해제, 바람직하게는 세제가 있다.

세포내 및 세포외 단백질의 동시 검출

세포외 분석물이 있고, 세포내 분석물이 있다. 각각의 검출은 흔히 별개의 사건이다. 세포외 분석물은 세포를 용해함으로써 추출되어야 하고, 따라서 내재화된 분석물이 외재화되어 시험에 이용 가능하다.

본 명세서에 개시된 방법은 적어도 하나의 세포외 분석물 및 적어도 하나의 세포내 분석물을 동시에 검출한다. "세포내" 표적 또는 분석물은, 본 실시예에 개시된 바와 같이, 세포 내에 있고 세포 내의 어떤 것(예를 들면, 표면 단백질, 세포벽 또는 내부 표면)과도 접촉하지 않는 분석물이다. "세포외" 표적 또는 분석물은, 본 실시예에 개시된 바와 같이, 세포 외측의 어떤 것과도 접촉하지 않는 완전한 세포외 분석물이다. 예를 들면, 세포외 분석물은 혈장 내에 있고 세포를 포함하지 않는다. 세포는 완전히 제거될 수 있으며, 세포외 분석물은 여전히 채취될 수 있다.

그에 반해서, 세포 외측에 있는 동안의 바이러스 입자는 세포벽에 부착된다. 항체의 칵테일을 혼합하여 세포내 결합 부분 및 표면 결합 부분을 검출하는 것이 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 그러나 본 명세서에 개시된 방법은 상이하며, 용해된 세포내 부분 및 분리된 혈청 단백질을 검출한다.

하나의 바람직한 실시예에서, 세포외 분석물은 C-반응성 단백질이고, 세포내 분석물은 MxA 단백질이다. 이것은 CRP 및 MxA 항원의 검출을 위한 혈청학적 검사이다. MxA는 백혈구 내측의 세포내 단백질이다. CRP는 전혈, 혈장 및 혈청에 있는 세포외 단백질이다.

하나의 바람직한 방법에서, Whatman GD 필터와 같은 유리 섬유는 적혈구를 물리적으로 포착한다. 특이적 적혈구-결합 렉틴 및/또는 항체는 유리 섬유 매트릭스 내의 적혈구에 물리적으로 결합하도록 추가될 수 있다. 세포내 MxA를 방출하도록 백혈구를 용해하는 백혈구 용해 용액이 유리 섬유 필터 내에 포함될 수도 있다.

일부의 바람직한 실시예에서, 전혈 샘플이 유리 섬유 필터에 추가된다. 액체 혈액은 백혈구를 용해하는 매립된 용해제를 용해시킨다. 측방향 유동 면역크로마토그래피는 런닝 버퍼를 추가함으로써 개시된다. 그 후에, 런닝 버퍼는 세포외 CRP 및 새롭게 방출된 세포내 MxA에 결합되는 적합한 항체 컨쥬게이트를 운반한다. 전체 복합체는 고정화된 특정 항체가 각각의 복합체를 포획하여 샌드위치를 형성하는 검출 구역으로 이동한다. 상이한 시험 라인이 MxA 및 CRP에 의해 형성된다. 이들 시험 라인은 시각성, 형광성, 인광성, 화학발광성, 인광성, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상이한 염료가 MxA 및 CRP 시험 라인을 구별하도록 포함될 수도 있다. 본 명세서에서 설명된 임의의 측방향 유동 분석 및 구성은 MxA 및 CRP, 또는 다른 세포내 및 세포외 분석물을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다.

MxA 및 CRP의 응집반응

일부 실시예는 혈액에서의 MxA 및 CRP에 대한 간단한 응집반응 검사를 포함한다. 유사하게, 본 발명자는 벽돌 벽에서의 시멘트가 벽돌을 함께 유지하는 대신에 벽돌을 따로따로 유지하고 있다고 여긴다. 이론적 근거는, 시멘트가 제거되면 벽돌이 합체되어 함께 무더기를 이룬다는 것이다. 그러므로 시멘트가 "비활성화"되거나 또는 제거되면, 개별 벽돌이 함께 합체된다.

금 컨쥬게이트 및 라텍스 비드는 서로 반발하여 현탁액에서 함께 있게 되는 콜로이드 입자이다. 반발력이 제거되면, 또는 개별 콜로이드 입자가 서로 교차 결합되면, 이들은 합체하여 응집된 입자를 가시화시킨다. 이와 같은 자연적인 반발을 극복하는 가교 결합은 문제가 되는 항원 분석물의 존재에 의해 수행된다.

하나의 바람직한 실시예에서, MxA 단일클론 KM 1124 및/또는 KM 1135는 적색 콜로이드 금 입자에 접합된다. 항-CRP 단일클론 항체는 적합한 크기의 녹색 라텍스 비드에 접합된다. MxA의 존재 시에, 단일클론 항체 KM 1124 및/또는 KM 1135가 결합되고, KM 1124 및/또는 KM 1135에 의해 인식된 다수의 에피토프(epitope)가 있으므로, 콜로이드 금의 자연적인 가교 결합이 발생하여 적색 콜로이드 금 입자의 군집(clumping)을 볼 수 있다. 이와 같은 과정은 항원 의존성이고 상당히 빨라서 대체로 1분 또는 2분 내에 이루어진다. CRP 분석물의 존재 시에 적합한 단일클론 항체로 코팅된 녹색 콜로이드 라텍스 비드에 의해 동일한 현상이 발생한다.

적색 금 입자의 군집은 적어도 임계량의 MxA가 샘플 내에 있어 바이러스 감염을 나타낸다는 것을 의미한다. 녹색 비드의 군집은 적어도 임계량의 CRP가 샘플 내에 있어 박테리아 감염을 나타낸다는 것을 의미한다. 적색 및 녹색 입자 모두의 군집은 동시 감염을 의미하거나, 또는 불확정적 결과를 나타낸다. 임의의 군집의 부존재는 샘플이 바이러스 및 박테리아 감염에 대해 음성이라는 것을 나타낸다.

하나의 바람직한 실시예에서, C-반응성 단백질의 임계 농도는 C-반응성 단백질의 약 6 내지 15 mg/L 이상이며, MxA 단백질의 임계 농도는 약 15 내지 250 ng/㎖의 혈청 당량 이상이다. MxA가 세포내 바이오마커이므로, 혈액 샘플은 바람직하게는 백혈구를 용해하고 MxA 항원을 외재화하도록 분석 동안에 용해된다. 다른 실시예에서, 샘플은 분석을 수행하기 전에 용해된다. 본 기술분야에 알려진 임의의 면역분석 방식은 응집반응 분석에 사용될 수 있다. 시약이 추가된 후에, 사용자는 시약이 샘플의 존재 시에 응집하는지를 보기 위해 대기한다.

바이러스 진단에서의 나노입자

MxA 레벨은 모두는 아니지만 상당수의 바이러스 감염에서 상승된다. 감염 중에 상승되는 MxA 레벨에 대한 일부 예외로서, B형 간염(Hepatitis B), 및 아마도 HIV 및 C형 간염을 포함하는 이와 같은 만성적인 바이러스 감염이 있다. 시알산 (sialic acid)이 다수의 바이러스에 있다. 그러나 시알산은 Cox 바이러스와 같은 몇몇 바이러스에는 없다.

상기에서 설명된 조합 MxA-CRP 검출기 장치는 바람직하게는 바이러스 감염과 박테리아 감염을 구별하기 위해 발열이 있는 사람에게 사용된다. 시알산 나노입자 검사는 바람직하게는 만성적인 바이러스 감염을 비롯하여, (발열을 수반하거나 수반하지 않는) 모든 다른 의심되는 바이러스 감염에 사용된다. 그러나 일부 바람직한 실시예에서, 시알산은 본 명세서에서 설명된 방법 및 장치에서의 MxA를 대체한다.

다른 바람직한 실시예에서, 시험은 MxA, CRP 및 시알산 동족체(homolog) 나노입자를 포함한다.

하나의 바람직한 실시예에서, 시험 라인은 특정 바이러스에 대해 특이적인 나노입자이다. 일부 예는 조류 인플루엔자, 및 HIV 및 C형 간염과 같은 만성적인 감염을 야기하는 바이러스를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 컨쥬게이트는 a) 염료를 내측에 갖는 바이러스 특이적 나노마이셀(nanomicelle), 또는 b) 염료를 내측에 갖는 시알산 동족체 나노마이셀이다.

예를 들면, Nanoviricides, Inc.(코네티컷주의 웨스트 해븐 소재)는 조류 인플루엔자 특이적 나노입자를 갖는다. 이와 같은 나노입자가 시험 라인에 사용되고, 조류 인플루엔자를 검출하는 컨쥬게이트로서 시알산 동족체 나노마이셀에 사용될 수 있다.

다른 실시예는 광범위한 스펙트럼 바이러스 검출기를 포함한다. 이와 같은 실시예에서, 시험 라인은 모든 바이러스를 포획하는 시알산 동족체 나노입자이고, 컨쥬게이트는 염료를 내측에 갖는 시알산 나노마이셀이다.

바람직한 실시예에서, 시험 라인은 나노입자로 이루어지지만, 나노입자를 함유하는 나노마이셀로 이루어지지는 않는다. 한편, 컨쥬게이트는 바람직하게는 마이셀 내측에 염료를 갖는 나노마이셀(비누 거품과 유사함)이다. 마이셀의 지질 부분 (lipid portion)은 마이셀의 "슬라이밍(sliming)"에 대한 책임을 지는 것이다.

시알산 실시예는, 도 4 내지 도 8 및 도 10 내지 도 12에 도시된 것을 비롯하여, 본 명세서에서 설명되거나 본 기술분야에 알려진 임의의 시험 스트립 구성, 또는 본 기술분야에 알려진 다른 분석 구성을 사용할 수도 있다.

따라서, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 실시예는 단지 본 발명의 원리의 적용을 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서의 예시된 실시예의 상세사항에 대한 언급은, 그 자체가 본 발명에 필수적인 것으로 간주되는 이들 특징을 기재하고 있는 청구항의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

Claims (12)

1. 적어도 하나의 세포외 분석물 및 적어도 하나의 세포내 분석물을 동시에 검출하는 방법으로서,
   a) 샘플을 채취하는 단계;
   b) 샘플을 2개의 시험 스트립을 갖는 샘플 분석 장치로 이송하는 단계;
   c) 샘플을 용해시키는 단계; 및
   d) 2개의 시험 스트립 상의 샘플 분석 장치에서 세포외 분석물 및 세포내 분석물을 동시에 검출하는 단계를 포함하며,
   여기서 적어도 6 내지 15 mg/L의 낮은 레벨 및 60 내지 100 mg/L의 높은 레벨의 세포외 분석물이 모두 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
2. 제 1항에 있어서, 세포외 분석물은 C-반응성 단백질이고, 세포내 분석물은 MxA 단백질인 것을 특징으로 하는, 방법.
3. 제 1항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는, 방법.
4. 제 1항에 있어서, 세포외 분석물은 샘플 분석 장치의 제1 형광성 시험 라인의 존재에 의해 검출되고, 세포내 분석물은 샘플 분석 장치의 제2 형광성 시험 라인의 존재에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
5. 제 1항에 있어서, 세포외 분석물은 샘플 분석 장치의 제1 화학발광성 시험 라인의 존재에 의해 검출되고, 세포내 분석물은 샘플 분석 장치의 제2 화학발광성 시험 라인의 존재에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
6. 제 1항에 있어서, 세포외 분석물은 인터루킨-6 (IL-6)이고, 세포내 분석물은 MxA 단백질인 것을 특징으로 하는, 방법.
7. 적어도 하나의 세포외 분석물 및 적어도 하나의 세포내 분석물을 동시에 검출하는 방법으로서,
   a) 샘플을 채취하는 단계;
   b) 샘플을 샘플 분석 장치로 이송하는 단계;
   c) 샘플을 용해시키는 단계; 및
   d) 샘플 분석 장치에서 세포외 분석물 및 세포내 분석물을 동시에 검출하는 단계를 포함하며,
   여기서 적어도 6 내지 15 mg/L의 낮은 레벨 및 60 내지 100 mg/L의 높은 레벨의 세포외 분석물이 모두 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
8. 제 7항에 있어서, 세포외 분석물은 C-반응성 단백질이고, 세포내 분석물은 MxA 단백질인 것을 특징으로 하는, 방법.
9. 제 7항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는, 방법.
10. 제 7항에 있어서, 세포외 분석물은 샘플 분석 장치의 제1 형광성 시험 라인의 존재에 의해 검출되고, 세포내 분석물은 샘플 분석 장치의 제2 형광성 시험 라인의 존재에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
11. 제 7항에 있어서, 세포외 분석물은 샘플 분석 장치의 제1 화학발광성 시험 라인의 존재에 의해 검출되고, 세포내 분석물은 샘플 분석 장치의 제2 화학발광성 시험 라인의 존재에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
12. 제 7항에 있어서, 세포외 분석물은 인터루킨-6 (IL-6)이고, 세포내 분석물은 MxA 단백질인 것을 특징으로 하는, 방법.

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