BR112015021199B1

BR112015021199B1 - Método para determinar se uma infeção é bacteriana e/ou viral, e dispositivo de fluxo lateral para detecção de um analito em uma amostra

Info

Publication number: BR112015021199B1
Application number: BR112015021199-2A
Authority: BR
Inventors: Robert P. Sambursky; Robert W. Vandine; Uma Manesh Babu; Peter Condon
Original assignee: Rapid Pathogen Screening, Inc
Priority date: 2013-03-07
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2022-01-11
Also published as: JP2019164143A; EP2906947A4; ES2743128T3; HK1214308A1; EP2909331A1; EP3591397A1; EP2906947B1; KR20150130346A; DK2906947T3; KR20150125002A; EP2909331A4; KR20210013646A; AU2014226173B2; CA2897495C; CA2897494A1; KR102489679B1; KR102209489B1; EP2909331B1; CA2897495A1; BR112015021199A2

Abstract

método para determinar se uma infeção é bacteriana e/ou viral, dispositivo de fluxo lateral para detecção de um analito em uma amostra, e, dispositivo para detecção de um marcador bacteriano e/ou viral em uma amostra. um ensaio de fluxo lateral é capaz de detectar e diferenciar infecções virais e bacterianas. um ponto combinado de marcadores de testes em dispositivo de diagnóstico de tratamento da infecção viral e marcadores para infecção bacteriana, para ajudar eficazmente na rápida diferenciação de infecções virais e bacterianas. em algumas modalidades de realização, métodos e dispositivos bimodais determinam se uma infecção é bacteriana e/ou viral. um uso dual de dispositivo de análise de amostra de duas tiras inclui um primeiro teste de duas tiras cromatográficas de fluxo lateral para detectar mxa e um baixo nível de proteína c reativa e uma segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral para detectar altos níveis de proteína c reativa. em uma modalidade de realização preferida, a amostra é uma amostra de sangue de punção digital.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade dos seguintes pedidos pendentes:

[002] Pedido EUA Número de Série 13/788,616, apresentado em 7 de março de 2013, intitulado “MULTIPLANAR LATERAL FLOW ASSAY WITH DIVERTING ZONE”;

[003] Pedido EUA Número de Série 13/790,125, apresentado em 8 de março, 2013, intitulado “MÉTODO E DISPOSITIVO PARA DETECÇÃO COMBINADA DE INFEÇÕES VIRAIS E BACTERIANAS”.

[004] Pedido EUA Número de Série 13/790,160, apresentado em 8 de março, 2013, intitulado “MÉTODO E DISPOSITIVO PARA DETECÇÃO COMBINADA DE INFEÇÕES VIRAIS E BACTERIANAS”.

ANTECEDENTES DA INVENÇAO CAMPO DA INVENÇAO

[005] A invenção refere-se ao campo de imunoensaios de fluxo lateral. Mais especificamente, a invenção refere-se a um imunoensaio de fluxo lateral que detecta rapidamente a infecção viral e bacteriana.

DESCRIÇÃO E ARTE RELACIONADA

[006] A febre é uma causa comum das visitas de crianças aos centros de cuidados urgentes tanto de medicina familiar como de serviços pediátricos. Mais comumente, esta relaciona-se com uma infecção respiratória ou gastroenterite. A elevada incidência de febre em crianças e da administração de antibióticos desnecessários como precaução é a razão do desenvolvimento de um teste rápido de triagem dos biomarcadores que indicam a infecção viral e/ou bacteriana.

[007] É muitas vezes desafiador diferenciar as infeções virais das bacterianas. Isto é especialmente verdadeiro em crianças de tenra idade que não podem verbalizar seus sintomas e em ambiente ambulatorial, onde o acesso ao diagnóstico laboratorial é caro, moroso, e que requer vários dias para produzir um resultado. Mais recentemente, foram identificados diversos novos marcadores de diagnóstico. Vários destes marcadores mostram-se grandemente promissores para diferenciar as infecções virais bacterianas. Duas dessas proteínas incluem proteína MxA e C reativa (PCR). A maioria das infecções respiratórias estão relacionadas com faringites das quais 40% são causadas por vírus e 25-50% pelo grupo de estreptococos hemolíticos beta A. As causas menores são bronquiolite aguda e pneumonia.

[008] A pneumonia grave adquirida na comunidade é causada por infecções bacterianas em cerca de 60% dos casos, sendo necessário internamento em unidade de cuidados intensivos (UCI) para cerca de 10% dos pacientes. Os restantes 30% são relacionados com vírus respiratórios.

[009] Cerca de 80% de todos os agentes antimicrobianos são prescritos em cuidados primários, e até 80% desses são para indicações do trato respiratório. Infecções respiratórias são, de longe, a causa mais comum de tosse nos cuidados primários. Os antibióticos de largo espetro são frequentemente prescritos para a tosse, incluindo bronquite aguda, e muitas destas prescrições, quando muito, irão beneficiar os pacientes apenas marginalmente e podem causar efeitos colaterais e promover a resistência a antibióticos. Os fatores que impelem os médicos a dar antibióticos incluem a falta de um marcador de diagnóstico adequado para infecções bacterianas, a preocupação com a falta de seguimento dos pacientes, e a pressão de tempo.

[010] As proteínas Mx são membros da superfamília de GTPases de elevado peso molecular. Adequadamente, estas GTPases são reguladas positivamente pelos interferons tipo I alfa/beta ou tipo II (IFN). As GTPases Mx são expressas exclusivamente em células tratadas com IFN alfa/beta mas não com IFN gama. Os interferons Tipo I desempenham um papel importante em respostas imunes inatas e têm funções imunomoduladoras, antiproliferativas e antivirais. MxA humano, uma proteína de 78 kDa, acumula no citoplasma de células tratadas de IFN e inibe a replicação de uma ampla variedade de vírus. A proteína MxA podem oferecer certas vantagens como marcadores para infecções virais sobre as outras proteínas induzidas tais como 2', 5'-oligoadenilato sintetase, por causa da sua mais baixa concentração basal, meia-vida mais longa (2,3 dias) e indução rápida. mRNA MxA é detectável em glóbulos brancos do sangue periférico isolados estimulados com IFN em 1 a 2 h de indução de IFN, e a proteína MxA começa a acumular-se pouco tempo depois.

[011] Os estudos têm mostrado que a expressão da proteína MxA no sangue periférico é um marcador sensível e específico para a infecção viral. Os níveis mais elevados de MxA no grupo de infecção viral comparados com o grupo da infecção bacteriana podem ser explicados pelo fato de a proteína MxA ser induzida exclusivamente pelo IFN tipo I e não pelos IFN-gama, IL-1, TNF-alfa, ou qualquer das outras citocinas por infecção bacteriana. Os níveis de IFN sorotipo I permanecem dentro dos limites normais, mesmo em pacientes com infecções bacterianas graves.

[012] Da mesma forma, a maioria das infecções virais têm sido relatadas como causando pouca resposta de fase aguda, e têm sido usadas baixas concentrações de Proteína C Reativa (PCR) para distinguir as doenças de origem viral das de etiologia bacteriana. Uma vez que a concentração plasmática de PCR aumenta rapidamente após a estimulação e diminui rapidamente com uma meia-vida curta, a PCR pode ser uma ferramenta muito útil no diagnóstico e acompanhamento de infecções e doenças inflamatórias. Na Escandinávia, os teste de PCR nos locais de atendimento faz parte da avaliação de rotina de pacientes com infecções respiratórias em clínica geral, e seu uso tem-se mostrado rentável. Na prática geral, verificou-se que a PCR é valiosa no diagnóstico de doenças bacterianas e na diferenciação de infecções bacterianas e virais. Muitas vezes, o valor de diagnóstico da PCR verificou-se ser superior à da taxa de sedimentação de eritrócitos (TSE) e superior ou igual à da contagem dos glóbulos brancos (CGB).

[013] Clinicamente, esta pode ser desafiante para diferenciar certas infecções virais e bacterianas sistêmicas. As culturas de bactérias são usualmente realizadas em casos de infecções graves, tais como pneumonia, ou quando a consequência da falta de um diagnóstico pode levar a complicações graves, tais como garganta de Strep. Muitas vezes, as culturas são difíceis de obter. Infelizmente, as culturas virais não são realizadas como rotina dado o tempo significativo de demora na recepção dos resultados. Novos painéis de triagem viral por PCR são úteis mas são muito dispendiosos e não fornecem informação no local de atendimento. Assim, continua a existir uma necessidade de um teste de diagnóstico simples, fácil de usar que seja capaz de diferenciar as infecções viral e bacterianas.

SUMÁRIO DA INVENÇAO

[014] A presente invenção proporciona um ensaio de fluxo lateral, que é capaz de detectar e diferenciar infecções virais e bacterianas. Um ponto combinado de marcadores de testes em dispositivo de diagnóstico de tratamento pela infecção viral e marcadores para infecção bacteriana, para ajudar eficazmente na rápida diferenciação de infecções virais e bacterianas. Em uma modalidade de realização preferida, o marcador bacteriano é PCR. Em uma outra modalidade de realização preferida, o marcador viral é MxA. Em algumas modalidades de realização da invenção, não é necessário lisar as células na amostra antes da sua aplicação ao dispositivo.

[015] Em uma modalidade de realização preferida, um método determina se uma infecção é bacteriana e/ou viral colhendo primeiro uma amostra. A amostra é depois transferida para um dispositivo de análise de amostras de duas tiras de utilização dupla. O dispositivo de análise de amostra inclui uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral com uma primeira zona de reagente e uma segunda zona de reagente. A primeira zona de reagente inclui pelo menos um primeiro reagente específico a um nível baixo de proteína C reativa de tal modo que, quando a amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado se está presente o baixo nível de proteína C reativa na amostra. A segunda zona de reagente inclui pelo menos um segundo reagente específico para MxA de tal modo que, quando a amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado se MxA está presente na amostra. A primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral inclui também uma primeira zona de detecção compreendendo um primeiro parceiro de ligação o qual se liga ao primeiro complexo marcado; e um segundo parceiro de ligação o qual se liga ao segundo complexo marcado. O dispositivo de ensaio de fluxo lateral de duas fitas inclui também uma segunda tira de teste de fluxo lateral paralela em uma direção de fluxo lateral a uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral inclui pelo menos uma terceira zona de reagente incluindo pelo menos um terceiro reagente específico a um nível alto de proteína C reativa, de tal modo que, quando a amostra contata o terceiro reagente, forma-se um terceiro complexo marcado se está presente o alto nível de proteína C reativa na amostra. O terceiro reagente na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral detecta somente um nível de proteína C reativa que é mais alto que o nível de proteína C reativa detectado pelo segundo reagente na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral inclui também uma segunda zona de detecção com um terceiro parceiro de ligação o qual se liga ao terceiro complexo marcado. A amostra é também analisada quanto à presença do nível baixo de proteína C reativa, MxA, e o elevado nível de proteína C reativa.

[016] Em outra modalidade de realização preferida, um dispositivo de ensaio de fluxo lateral de duas fitas de utilização dupla detecta um marcador bacteriano e/ou viral em uma amostra. O dispositivo inclui uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral com uma primeira zona de reagente e uma segunda zona de reagente. A primeira zona de reagente inclui pelo menos um primeiro reagente específico a um nível baixo de proteína C reativa de tal modo que, quando a amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado se está presente o baixo nível de proteína C reativa na amostra. A segunda zona de reagente inclui pelo menos um segundo reagente específico para MxA de tal modo que, quando a amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado se MxA está presente na amostra. A primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral inclui também uma primeira zona de detecção compreendendo um primeiro parceiro de ligação o qual se liga ao primeiro complexo marcado; e um segundo parceiro de ligação o qual se liga ao segundo complexo marcado. O dispositivo de ensaio de fluxo lateral de duas tiras inclui também uma segunda tira de teste de fluxo lateral de duas tiras paralela à direção de fluxo lateral da primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral inclui pelo menos uma terceira zona de reagente compreendendo pelo menos um terceiro reagente específico para um nível alto de proteína C reativa, de tal modo que, quando a amostra contata o terceiro reagente, forma-se um terceiro complexo marcado se está presente o alto nível de proteína C reativa na amostra. O terceiro reagente na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral detecta somente um nível de proteína C reativa que é mais alto que o nível de proteína C reativa detectado pelo segundo reagente na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral inclui também uma segunda zona de detecção com um terceiro parceiro de ligação o qual se liga ao terceiro complexo marcado.

[017] Uma outra modalidade de realização preferida é um método para determinar se uma infecção é bacteriana e/ou viral, e inclui o passo de recolher uma amostra. A amostra é depois transferida para um dispositivo de análise de amostras. O dispositivo de análise de amostra inclui um compressor de amostra com uma primeira zona de reagente incluindo pelo menos um primeiro reagente específico para um nível baixo de proteína C reativa de tal modo que, quando a amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado se o baixo nível de proteína C reativa está presente na amostra, e pelo menos um segundo reagente específico para MxA de modo a que, quando a amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado se MxA está presente na amostra, e uma segunda zona de reagente incluindo pelo menos um terceiro reagente específico para um elevado nível de proteína C reativa, onde o terceiro reagente detecta somente um nível de proteína C reativa que é mais elevada que o nível de proteína C reativa detectada pelo segundo reagente, de modo a que, quando a amostra contata o terceiro reagente, forma-se um terceiro complexo marcado se o alto nível de proteína C reativa está presente na amostra. O dispositivo também inclui uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral que inclui uma primeira zona de detecção incluindo um primeiro parceiro de ligação o qual se liga ao primeiro complexo marcado, um segundo parceiro de ligação o qual se liga ao segundo complexo marcado e uma primeira zona de desvio localizada a montante da primeira zona de detecção na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A primeira zona de desvio interrompe o fluxo lateral na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. O dispositivo também inclui uma segunda tira de teste de fluxo lateral paralela em uma direção de fluxo lateral à primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral inclui uma segunda zona de detecção incluindo um terceiro parceiro de ligação o qual se liga ao terceiro complexo marcado e uma segunda zona de desvio localizada a montante da primeira zona de detecção na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A segunda zona de desvio interrompe o fluxo lateral na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. O dispositivo também inclui uma primeira zona de aplicação da amostra onde a amostra é colocada sobre o dispositivo de análise de amostra. A primeira zona de aplicação da amostra é colocada em uma posição selecionada partindo do grupo consistindo em: i) na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral a montante da zona de detecção e ii) na primeira zona de reagente do compressor da amostra. O dispositivo também inclui uma segunda zona de aplicação da amostra onde a amostra é colocada sobre o dispositivo de análise de amostra. A segunda zona de aplicação da amostra é colocada em uma posição selecionada partindo do grupo consistindo em: i) na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral a montante da zona de detecção e ii) na segunda zona de reagente do compressor da amostra. O compressor da amostra está em um plano diferente do tira de teste cromatográfico de fluxo lateral e uma segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A primeira zona de reagente do compressor da amostra cria uma ponte sobre a primeira zona de desvio e a segunda zona de reagente do compressor da amostra cria uma ponte sobre a segunda zona de desvio, desviando o fluxo para o compressor de amostra retornando o fluxo para a primeira tira de teste cromatográfico e as segundas tiras de teste cromatográfico no fim da primeira zona de desvio e a segunda zona de desvio. A amostra é analisada quanto à presença do nível baixo de proteína C reativa, MxA, e o elevado nível de proteína C reativa.

[018] Uma outra modalidade de realização preferida é um dispositivo de fluxo lateral para a detecção de uma substância a analisar em uma amostra. O dispositivo inclui um compressor de amostra com uma primeira zona de reagente incluindo pelo menos um primeiro reagente específico para um nível baixo de proteína C reativa de tal modo que, quando a amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado se o baixo nível de proteína C reativa está presente na amostra, e pelo menos um segundo reagente específico para MxA de modo a que, quando a amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado se MxA está presente na amostra, e uma segunda zona de reagente incluindo pelo menos um terceiro reagente específico para um elevado nível de proteína C reativa, onde o terceiro reagente detecta somente um nível de proteína C reativa que é mais elevada que o nível de proteína C reativa detectada pelo segundo reagente, de modo a que, quando a amostra contata o terceiro reagente, forma-se um terceiro complexo marcado se o alto nível de proteína C reativa está presente na amostra. O dispositivo também inclui uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral que inclui uma primeira zona de detecção incluindo um primeiro parceiro de ligação o qual se liga ao primeiro complexo marcado, um segundo parceiro de ligação o qual se liga ao segundo complexo marcado e uma primeira zona de desvio localizada a montante da primeira zona de detecção na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A primeira zona de desvio interrompe o fluxo lateral na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. O dispositivo também inclui uma segunda tira de teste de fluxo cromatográfico lateral paralela em uma direção de fluxo lateral a uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral inclui uma segunda zona de detecção compreendendo um terceiro parceiro de ligação o qual se liga ao terceiro complexo marcado e uma segunda zona de desvio localizada a montante da primeira zona de detecção na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A segunda zona de desvio interrompe o fluxo lateral na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. O dispositivo também inclui uma primeira zona de aplicação da amostra onde a amostra é colocada sobre o dispositivo de análise de amostra. A primeira zona de aplicação da amostra é colocada em uma posição selecionada partindo do grupo consistindo em: i) na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral a montante da zona de detecção e ii) na primeira zona de reagente do compressor da amostra. O dispositivo também inclui uma segunda zona de aplicação da amostra onde a amostra é colocada sobre o dispositivo de análise de amostra. A segunda zona de aplicação da amostra é colocada em uma posição selecionada partindo do grupo consistindo em: i) na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral a montante da zona de detecção e ii) na segunda zona de reagente do compressor da amostra. O compressor da amostra está em um plano diferente do tira de teste cromatográfico de fluxo lateral e uma segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral. A primeira zona de reagente do compressor da amostra cria uma ponte sobre a primeira zona de desvio e a segunda zona de reagente do compressor da amostra cria uma ponte sobre a segunda zona de desvio, desviando o fluxo para o compressor de amostra e retornando o fluxo para a primeira tira de teste cromatográfico e as segundas tiras de teste cromatográfico no fim da primeira zona de desvio e a segunda zona de desvio.

[019] Em outra modalidade de realização preferida, um método detectando simultaneamente pelo menos um analito extracelular e pelo menos um analito intracelular, coletando uma amostra e transferindo a amostra para um dispositivo de análise de amostra. A amostra também é lisada e o analito extracelular e o analito intracelular são simultaneamente detectados no mesmo dispositivo de análise de amostra. Em uma modalidade de realização preferida, o analito extracelular é proteína C reativa e o analito intracelular é proteína MxA.

[020] Em outra modalidade de realização preferida, um método para detectar proteína MxA e proteína C reativa em uma amostra inclui os passos de adicionar a amostra a uma mistura de um anticorpo contra a proteína MxA conjugada com um primeiro marcador e um anticorpo à proteína C reativa conjugada com um segundo marcador diferente a partir do primeiro marcador, detectar uma presença de proteína MxA determinando se o anticorpo a proteína MxA se aglutinou, e detectar uma presença da proteína C reativa conjugada detectando se o anticorpo contra a proteína C reativa se aglutinou.

[021] Em outra modalidade de realização preferida, um método para detectar a presença de uma infecção viral desconhecida em uma amostra primeiro recolhe-se a amostra. A amostra é depois transferida para uma zona de aplicação da amostra de um dispositivo de análise de amostra. O dispositivo de análise de amostra inclui uma zona conjugada incluindo uma nanomicela de ácido siálico com um marcador dentro do nanomicela e uma zona de detecção lateralmente a jusante da zona de aplicação de amostra, a qual inclui um homólogo da nanopartícula de ácido siálico. A amostra é analisada quanto ao resultado positivo na zona de detecção.

[022] Em outra modalidade de realização preferida, um método para detectar a presença de uma infecção viral desconhecida em uma amostra primeiro recolhe-se a amostra. A amostra é depois transferida para uma zona de aplicação de amostra de um dispositivo de análise de amostra. O dispositivo de análise de amostra inclui uma zona conjugada com uma molécula selecionada a partir do grupo constituído por: uma nanomicela incluindo um parceiro de ligação para um vírus específico que causa a infecção viral e um marcador e uma micela homóloga de ácido siálico incluindo um marcador dentro da nanomicela. O dispositivo de análise da amostra também inclui uma zona de detecção lateralmente a jusante da zona de aplicação de amostra, com uma nanopartícula específica para o vírus que causa a infeção viral. A amostra é analisada quanto ao resultado positivo na zona de detecção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[023] A Fig. 1 mostra os resultados dos testes visuais da janela de teste rápido de triagem para distinguir as infecções virais e bacterianas e uma interpretação desses resultados.

[024] A Fig. 2 mostra três cassetes de teste com diferentes linhas coloridas.

[025] A Fig. 3 mostra uma comparação de um detector de duas linhas, em que ambas as linhas são da mesma cor, e um detector de duas linhas extra-sensíveis, onde as duas linhas são de cores diferentes.

[026] A Fig. 4A mostra um dispositivo com uma linha de teste correspondente para a presença de um marcador viral e uma segunda linha de teste, separada que detecta a presença de um marcador bacteriano em uma modalidade de realização da presente invenção.

[027] A Fig. 4B mostra um dispositivo com uma linha de teste correspondente para a presença de um marcador viral e uma segunda linha de teste, separada, que detecta a presença de um marcador bacteriano em uma outra modalidade de realização da presente invenção.

[028] A Fig. 5A mostra um dispositivo de análise de amostra incluindo uma zona de lise localizada entre uma zona de aplicação e uma zona de reagente em uma modalidade de realização da presente invenção.

[029] A Fig. 5B mostra um dispositivo de análise de amostra incluindo uma zona de lise sobrepondo-se a uma zona de aplicação da amostra em uma modalidade de realização da presente invenção.

[030] A Fig. 5C mostra um dispositivo de análise de amostra incluindo uma zona de lise sobrepondo-se a uma zona de reagente em uma modalidade de realização da presente invenção.

[031] A Fig. 5D mostra um dispositivo de análise de amostra incluindo uma zona de lise localizada entre uma zona de aplicação e uma zona de reagente em uma modalidade de realização da presente invenção.

[032] A Fig. 6A mostra um dispositivo com uma linha de teste correspondente para a presença de um marcador bacteriano tais como níveis de PCR em uma modalidade de realização da presente invenção.

[033] A Fig. 6B mostra um dispositivo com uma linha de teste correspondente para a presença de um marcador bacteriano tais como altos níveis de PCR em uma outra modalidade de realização da presente invenção.

[034] A Fig. 7A mostra um dispositivo de análise de amostra incluindo uma zona de lise localizada entre uma zona de aplicação e uma zona de reagente em uma modalidade de realização da presente invenção.

[035] A Fig. 7B mostra um dispositivo de análise de amostra incluindo uma zona de lise sobrepondo-se a uma zona de aplicação da amostra em uma modalidade de realização da presente invenção.

[036] A Fig. 7C mostra um dispositivo de análise de amostra incluindo uma zona de lise sobrepondo-se a uma zona de reagente em uma modalidade de realização da presente invenção.

[037] A Fig. 7D mostra um dispositivo de análise de amostra incluindo uma zona de lise sobrepondo-se entre uma zona de aplicação e uma zona de reagente em uma modalidade de realização da presente invenção.

[038] A Fig. 8A mostra um dispositivo de análise de amostra totalmente aberto com as tiras de teste duais, bem como uma zona conjugada e uma zona de aplicação da amostra sobre um compressor de amostra em um plano separado a partir das tiras de teste em uma modalidade de realização da presente invenção.

[039] A Fig. 8B mostra o dispositivo de análise de amostra da Fig. 8A com parte do invólucro fechado, mas a zona conjugada ainda visível no lado esquerdo do dispositivo.

[040] A Fig. 8C mostra o dispositivo de análise de amostra da Fig. 8A após se ter iniciado o teste.

[041] A Fig. 9A mostra um resultado de teste negativo para ambas MxA e PCR em uma modalidade de realização da presente invenção.

[042] A Fig. 9B mostra um resultado de teste positivo para MxA e uma modalidade de realização da presente invenção.

[043] A Fig. 9C mostra um resultado de teste positivo para MxA em uma modalidade de realização da presente invenção.

[044] A Fig. 9D mostra um resultado de teste positivo para PCR e uma modalidade de realização da presente invenção.

[045] A Fig. 9E mostra um resultado de teste positivo para PCR e uma modalidade de realização da presente invenção.

[046] A Fig. 9F mostra um resultado de teste negativo para ambos PCR e MxA, indicando coinfeção em uma modalidade de realização da presente invenção.

[047] A Fig. 10A mostra um dispositivo de análise de amostra totalmente aberto com as tiras de teste duais e uma zona conjugada sobre um compressor de amostra em um plano separado a partir das tiras de teste em uma modalidade de realização da presente invenção.

[048] A Fig. 10B mostra o dispositivo de análise de amostra da Fig. 10A com parte do invólucro fechado, mas a zona conjugada ainda visível no lado esquerdo do dispositivo.

[049] A Fig. 10C mostra o dispositivo de análise de amostra da Fig. 10A após se ter iniciado o teste.

[050] A Fig. 11 mostra um kit para análise de amostras utilizando um dispositivo de análise de amostras em uma modalidade de realização da presente invenção.

[051] A Fig. 12 mostra um dispositivo de análise de amostras com tiras de teste duais uma outra modalidade de realização da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[052] A presente invenção proporciona um ensaio de fluxo lateral que é capaz de diferenciar entre infecções virais e bacterianas. Em vez de testar analitos específicos para uma infecção bacteriana ou viral específica, os ensaios de fluxo lateral aqui descritos testam os marcadores de diagnóstico que são especificamente produzidos em um hospedeiro em resposta a uma infecção bacteriana, inespecífica, geral e uma infecção viral, inespecífica, geral. Os marcadores de diagnóstico são preferencialmente marcadores de uma doença não especificada e/ou desconhecida de origem bacteriana ou viral. Em modalidades de realização preferidas, os marcadores de diagnóstico são marcadores específicos para uma resposta imune a uma doença não especificada e/ou desconhecida de origem bacteriana ou viral.

[053] Um ponto combinado de dispositivo de diagnóstico tratamento testa marcadores tanto para infecções virais como bacterianas e pode efetivamente ajudar na diferenciação rápida de infecções virais e bacterianas, por exemplo no gabinete de ambulatório ou durante uma visita de cuidados urgentes. Essa capacidade pode reduzir drasticamente os custos de cuidados de saúde, limitando os erros de diagnóstico e o subsequente uso excessivo de antibióticos. Uma prática dessas pode limitar as alergias aos antibióticos, eventos adversos e resistência a antibióticos. O resultado rápido obtido do teste também permite um diagnóstico enquanto o paciente ainda está sendo examinado pelo médico. Em uma modalidade de realização preferida, o resultado do teste é obtido em menos de 10 minutos após aplicar a amostra ao dispositivo, e é preferencialmente lido em aproximadamente 10 minutos. Em amostras que são altamente positivas, a tira de teste é visível em 1-5 minutos aproximadamente.

[054] Em uma modalidade de realização preferida da presente invenção, o dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral da presente invenção inclui um líquido de transporte de amostra, o qual pode ser um tampão, e uma tira de teste cromatográfico contendo um ou vários materiais do velo ou membranas com propriedades capilares através da qual a amostra flui. Alguns materiais preferidos e membranas para a tira de teste incluem, mas não estão limitados a, fibras de tereftalato de polietleno (PET), tais como fibras Dacron®, nitrocelulose, poliéster, nylon, acetato de celulose, polipropileno, fibras de vidro e combinações desses materiais e seus suportes. Em algumas modalidades de realização da invenção, não é necessário lisar as células na amostra ou tratar a amostra em qualquer via antes de as aplicar à tira de teste.

[055] Um método preferido da presente invenção usa um dispositivo de análise de amostra, por exemplo uma tira de teste cromatográfico, para determinar se uma infecção é bacteriana ou viral. Neste método, a amostra é recolhida e transferida para a tira de teste cromatográfico. Em uma modalidade de realização preferida, a amostra é uma amostra incluindo leucócitos. As tiras de teste incluem a zona de reagente. A zona de reagente preferencialmente inclui pelo menos um primeiro reagente específico de um marcador bacteriano de modo a que, quando o marcador bacteriano presente na amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado. A zona de reagente preferencialmente inclui também pelo menos um segundo reagente específico de um marcador viral de modo a que, quando o marcador viral presente na amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado. A zona de detecção inclui tanto um parceiro de ligação a marcador bacteriano o qual se liga ao primeiro complexo marcado como um parceiro de ligação a um marcador viral o qual se liga ao segundo complexo marcado. A amostra é então analisada quanto à presença do marcador viral e/ou do marcador bacteriano.

[056] Uma modalidade de realização preferida de um dispositivo da presente invenção inclui uma zona de aplicação de amostra. O dispositivo também inclui uma zona de reagente, a qual inclui pelo menos um primeiro reagente específico para um marcador bacteriano de modo a que, quando um marcador bacteriano presente na amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado e pelo menos um segundo reagente específico para um marcador viral de modo a que, quando o marcador viral presente na amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado. A zona de detecção no dispositivo inclui um parceiro de ligação a marcador bacteriano que se liga ao primeiro complexo marcado e um parceiro de ligação a marcador viral que se liga a um segundo complexo marcado. Um exemplo de um dispositivo que pode ser utilizado é uma tira de teste cromatográfico. Em outras modalidades de realização preferidas, algumas das zonas do dispositivo estão sobre uma ou mais tiras de teste cromatográfico, enquanto outras zonas (por exemplo, a zona de reagente, a zona de aplicação da amostra, e/ou o parceiro de ligação de controle) estão sobre um compressor de amostra, separado de e em um plano diferente da tira de teste cromatográfico.

[057] Em uma modalidade de realização preferida, a presença do marcador viral ou do marcador bacteriano é indicado por uma linha de teste visível a olho nu. A presença do marcador viral pode ser indicada através de uma primeira linha de teste enquanto a presença do marcador bacteriano é indicado por uma segunda linha de teste. Em algumas modalidades de realização, a primeira linha de teste apresenta uma primeira cor quando positiva e a segunda linha de teste exibe uma segunda cor diferente da primeira cor quando positiva. Em modalidades de realização em que tanto a primeira linha de teste como a segunda linha de teste são colocadas no mesmo espaço sobre o dispositivo de análise de amostra, uma terceira cor é preferencialmente formada quando tanto a primeira linha de teste como a segunda linha de teste são positivas. Em outras modalidades de realização, as duas linhas de teste são espacialmente separadas uma da outra no dispositivo.

[058] As infecções virais e bacterianas são altamente contagiosas e difíceis de diferenciar clinicamente devido a uma sobreposição significativa de sinais e sintomas, que muitas vezes levam à sobre prescrição de antibióticos sistêmicos e promove a resistência aos antibióticos. Nos países desenvolvidos, as infecções respiratórias agudas são a principal causa de morbidade, sendo responsável por: 20% das consultas médicas, 30% das faltas ao trabalho, e 75% de todas as prescrições de antibióticos. Nos EUA, há cerca de 76 milhões de visitas a consultórios médicos anualmente devido a infecção respiratória aguda. A capacidade de se detectar uma resposta imune a uma infecção ajuda na capacidade de diagnóstico clínico para diferenciar as infecções resultantes de uma etiologia viral e/ou bacteriana.

[059] Em uma modalidade de realização preferida, o marcador bacteriano é PCR. Em uma outra modalidade de realização preferida, o marcador viral é MxA. Em algumas modalidades de realização, a zona de detecção também inclui uma linha de controle que é visível a olho nu quando o dispositivo está a funcionar.

[060] Em uma modalidade de realização preferida, o marcador para a infecção viral é a MxA o marcador para a infecção bacteriana é a proteína C reativa (PCR). Os altos níveis de proteína MxA estão fortemente correlacionados com infecção viral sistêmica e o PCR aumentado está mais associado com infecções bacterianas. A presente invenção inclui um teste rápido de rastreio infeccioso para identificar MxA e PCR em amostras. A MxA está presente em leucócitos (glóbulos brancos). Portanto, a amostra pode ser feita em qualquer lugar em que os leucócitos estão disponíveis, por exemplo em uma amostra de sangue periférico, aspirados nasofaríngeos, lágrimas, fluído espinal, e aspirados do ouvido médio.

[061] Em algumas modalidades de realização com uma única tira de teste contendo PCR e MxA, a concentração limiar de PCR em uma amostra necessárias para eliciar um resultado positivo é aproximadamente 6-15 mg/l. Em outras modalidades de realização preferidas, a concentração limiar de MxA em uma amostra para eliciar um resultado positivo pode ser tão baixa quanto, aproximadamente, 15 ng/ml; porém, a concentração limiar pode ser maior, em uma gama desde aproximadamente 20 ng/ml até aproximadamente 250 ng/ml. A concentração limite pode depender do tamanho da amostra a ser aplicada às tiras de teste, assim como da sua diluição, se aplicável.

[062] Em algumas modalidades de realização, o dispositivo e métodos aqui descritos permitem a detecção rápida, visual, qualitativa in vitro tanto de MxA como de PCR diretamente a partir de sangue total periférico. Em uma modalidade de realização preferida, o teste mede uma resposta imunitária a uma suspeita de infecção viral e/ou bacteriana em doentes com idade acima de um ano que apresentem um surto de febre dentro de sete dias, com sintomas respiratórios compatíveis com a doença respiratória, e com suspeita de diagnóstico de faringite aguda ou pneumonia adquirida na comunidade. Resultados negativos não excluem necessariamente a infecção respiratória e não devem ser usados como a única base para o diagnóstico, tratamento, ou outras decisões de gestão. Em algumas modalidades de realização, o uso de testes de laboratório adicionais (por exemplo cultura bacteriana e viral, imunofluorescência, reação em cadeia da polimerase viral, e radiografia) e apresentação clínica é, de preferência, adicionalmente, usado para confirmar se existe ou não um patogêneo respiratório inferior ou faríngeo específico.

[063] Além disso, há algumas condições que levam a falsos positivos ou negativos erróneos. Estes incluem, mas não estão limitados a, utilização corrente de medicamentos imunossupressores pelo paciente proporcionando a amostra, uso corrente de medicamentos antiinfeciosos orais pelo paciente proporcionando a amostra, uso corrente de terapia com interferon (por exemplo para a esclerose múltipla, HIV, HBV, HCV) pelo paciente proporcionando a amostra e imunização viva viral dentro dos últimos 30 dias pelo paciente proporcionando a amostra. Tanto os falsos negativos como os falsos positivos são possíveis uma vez que os níveis podem variar devido à terapia.

[064] Em modalidades de realização preferidas, o dispositivo e métodos destinam-se a uma utilização profissional em um gabinete de ambulatório ou clínica de cuidados urgentes e deve ser utilizado em conjunto com outra informação clínica (laboratorial ou radiográfica) e epidemiológica.

[065] Em modalidades de realização preferidas, o duplo uso de ensaios de tiras de teste cromatográfico duais detecta-se a resposta imune do organismo e infecções virais e/ou bacterianas em pacientes usando um padrão multiplexado dos resultados. Em uma modalidade de realização específica preferida, os testes de ensaio para resistência a Myxovirus A (MxA), baixos níveis de proteína C reativa ("baixa" PCR), e altos níveis de proteína C reativa ("alta" PCR). Duas tiras de teste são preferencialmente utilizadas. Em algumas modalidades de realização, um compressor de amostra em um plano diferente do da tira de teste cromatográfico é também usado. Os primeiros ensaios de tira de teste para MxA e baixos níveis de Proteína C reativa, e a segunda tira de teste é um ensaio para níveis elevados de proteína C reativa. A primeira tira de teste e/ou o compressor da amostra incluem reagentes para detectar a proteína MxA e um baixo nível de proteína C reativa. A segunda tira de teste e/ou o compressor da amostra incluem reagentes para detectar um alto nível de proteína C reativa. As duas tiras de teste são preferencialmente corridas lado a lado, e cada tira inclui também preferencialmente uma linha de controle. Os reagentes de controle estão, de preferência, quer sobre as tiras de testes ou no compressor da amostra. Estes testes detectam e classificam infecções biológicas como virais, bacterianas, ou uma coinfeção de vírus e bactérias. Em algumas modalidades de realização preferidas, o uso duplo do ensaio de tiras de teste cromatográfico duais é utilizado para detectar amostras de pacientes com uma doença febril respiratória.

[066] Em algumas modalidades de realização com duas tiras de teste, sobre a primeira tira de teste, uma concentração limiar de PCR ("baixo" nível de PCR) de aproximadamente 6-15 mg/l (valor de corte sérico) na amostra é necessário para eliciar um resultado positivo e um limite de concentração de pelo menos 15 ng/ml de MxA em uma amostra é necessária para eliciar um resultado positivo. Em outras modalidades de realização preferidas, a concentração limite de MxA pode ser em uma gama desde aproximadamente 15 ng/ml até aproximadamente 250 ng/ml para eliciar um resultado positivo. A concentração limite pode depender do tamanho da amostra a ser aplicada às tiras de teste, assim como da sua diluição, se aplicável. Em uma modalidade de realização preferida, a concentração limiar de baixo PCR, por exemplo no soro extracelular de uma amostra de sangue, é 7 mg/L para um valor de corte de punção digital, que é equivalente a 10 mg/l para um valor de corte sérico. Em uma modalidade de realização preferida, a concentração de MxA, por exemplo nas células mononucleares do sangue periférico de uma amostra de sangue, é 40 ng/ml para um valor de corte de punção digital, que é equivalente a 40 ng/ml para um valor de corte do sangue venoso. Na segunda tira de teste, uma concentração limiar de PCR ("alto" nível de PCR) de aproximadamente 60-100 mg/l na amostra é necessária para eliciar um resultado positivo em algumas modalidades de realização. Em uma modalidade de realização particularmente preferida, uma concentração limiar de alto PCR na segunda tira de teste é aproximadamente 80 mg/l em um valor de corte de punção digital.

[067] Em outras modalidades de realização, outros marcadores para infecção viral e/ou infecção bacteriana podem ser utilizados. Por exemplo, aproximadamente 12% dos genes de hospedeiro alteram a sua expressão após infecção por Vírus da Coriomeningite Linfocitária (LCMV), e um subconjunto destes genes pode discriminar entre a infecção por LCMV virulento e não virulento. Grandes mudanças de transcrição têm dado confirmação preliminar por PCR quantitativa e estudos de proteína e são candidatas potencialmente valiosas como biomarcadores para doença por arenavírus. Outros marcadores para infecção bacteriana incluem, mas não estão limitados a, procalcitonina, inibidor de tripsina urinária (uTi), lipopolissacarídeo, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, ESR e uma contagem elevada de CGB (bandas aumentadas), Lactato, Troponina, fator de crescimento vascular endotelial, fator de crescimento derivado de plaquetas, cortisol, proadrenomedulina, marcador inibidor migratório de macrófagos, proteína C ativada, CD 4,8,13,14, ou 64, caspase, fator de crescimento derivado de placenta, peptídeo relacionado com gene calcitonina, grupo 1 de alta mobilidade, copeptina, peptídeos naturiéticos, proteína de ligação ao lipopolissacarídeo, fator de necrose tumoral alfa, células progenitoras endoteliais circulantes, complemento 3a, e receptor de desencadeamento expresso em células mielóides (trem-1).

[068] Em uma modalidade de realização, as infecções a distinguir são as infecções respiratórias. Em outras modalidades de realização, outros tipos de infecções, que podem ser de origem bacteriana ou viral, são diferenciadas utilizando o sistema da presente invenção. Alguns exemplos incluem, mas não estão limitados a, encefalite, meningite, gastroenterite, doença respiratória febril (incluindo bronquite, faringite, pneumonia), sinusite, otite média, infecções do trato urinário, e conjuntivite.

[069] São conhecidos dispositivos de fluxo lateral, e são descritos em, por exemplo, Publicação dos Pedidos de Patentes dos EUA Nos. 2005/0175992 e 2007/0059682. Os conteúdos destas duas patentes são aqui incorporados como referência. Outros dispositivos de fluxo lateral conhecidos na técnica podem em alternativa ser utilizados com os sistemas e métodos da presente invenção.

[070] O Pedido da Patente dos EUA Publicado No. 2007/0059682 divulga a detecção de um analito e uma amostra que também pode conter uma ou mais substâncias interferentes. Esta publicação ensina a separação do analito a partir das substâncias interferentes capturando as substâncias interferentes sobre o suporte cromatográfico, e detectando a substância a analisar com o transportador separado das substâncias interferentes.

[071] A Publicação do Pedido de Patente dos EUA No. 2005/0175992 divulga um método para detectar alvos, tais como patogêneos e/ou componentes associados a alergia, em um fluido corporal humano quando a amostra de fluido corporal é recolhida por um dispositivo de recolha, tal como um membro de zaragatoa. As amostras são transferidas a partir do membro de zaragatoa para um dispositivo de análise de amostras, em que uma análise dos alvos pode ocorrer por meios enzimáticos ou imunoquímicos. O resultado do teste pode ser apresentado em um período muito curto de tempo e pode ser lido diretamente pelo utilizador. Isso permite os testes no posto de atendimento com os resultados disponíveis durante uma visita do paciente. As invenções descritas neste pedido de patente copendente são particularmente vantajosas para o diagnóstico da conjuntivite.

[072] Em um método da invenção, a amostra a ser analisada é aplicada a um transportador cromatográfico. O transportador pode ser feito de um único material cromatográfico, ou de preferência, vários materiais ativos capilares feitos do mesmo ou de diferentes materiais e fixadas em um suporte transportador. Estes materiais estão em estreito contato uns com os outros de modo a formar um trajeto de transporte ao longo do qual um líquido acionado por forças capilares flui a partir de uma zona de aplicação, passando uma zona de reagente, no sentido de uma ou mais zonas de detecção e, opcionalmente, uma zona de resíduos na outra extremidade do transportador. Em outras modalidades de realização, o líquido passa a zona de reagente antes de fluir para uma zona de aplicação da amostra. Em uma modalidade de realização especialmente preferida, o transportador é uma tira de teste cromatográfico. Em outras modalidades de realização preferidas, a amostra pode ser aplicada a um compressor de amostra em um plano diferente do da tira de teste cromatográfico, e, em seguida, transferido para a tira de teste cromatográfico pelo compressor da amostra.

[073] Em algumas modalidades de realização, a amostra é aplicada diretamente ao transportador por meio de imersão da zona de aplicação do transportador na amostra. Em alternativa, a aplicação da amostra para o transportador pode ser levada a cabo através da recolha da amostra com um elemento de limpeza a seco ou molhado a partir do qual a amostra pode ser transferida, opcionalmente após umedecimento, à zona de aplicação do transportador. Usualmente, o elemento de limpeza é estéril e pode ser seco ou pré-tratado com um fluido antes do passo de recolha. Os materiais adequados para limpar os elementos de acordo com a invenção podem compreender materiais sintéticos, tecidos ou teias fibrosas. Alguns exemplos desses elementos de enxugo são descritos nas Patentes Alemãs DE 44 39 429 e DE 196 22 503, as quais são aqui incorporadas como referência. Em outras modalidades de realização, a amostra pode ser coletada por um receptáculo de recolha, tal como uma pipeta, e transferida diretamente para o transportador.

[074] Dependendo do tipo de método de detecção, diferentes reagentes estão presentes na zona de reagente do transportador, o qual, em algumas modalidades de realização, está de preferência localizado entre a zona de aplicação e a zona de detecção ou, em outras modalidades de realização, está, de preferência, localizado antes da zona de aplicação. Ainda em outras modalidades de realização, os reagentes podem estar sobre o compressor da amostra separado de e em um plano diferente desse do transportador incluindo a zona de detecção.

[075] Em um imunoensaio sanduíche, é preferível ter um reagente não imobilizado, marcado, na zona de reagente que seja específico para cada marcador bacteriano e viral que está sendo detectado. Assim, quando um marcador viral ou bacteriano presente na amostra contata o correspondente reagente viral ou bacteriano marcado presente na zona de reagente, se forma um complexo marcado entre o marcador e o correspondente reagente marcado. O complexo marcado, por sua vez é capaz de formar um complexo adicional com um parceiro de ligação a marcador viral ou bacteriano imobilizado na linha de teste na zona de detecção. Em um imunoensaio competitivo, a zona de reagente contém de preferência um análogo marcador marcado, não imobilizado que compete com o marcador para o parceiro de ligação a marcador imobilizado na zona de detecção. Os parceiros de ligação a marcador na zona de reagente e na zona de detecção são preferencialmente anticorpos monoclonais, policlonais ou recombinantes ou fragmentos de anticorpos capazes de ligação específica ao marcador correspondente.

[076] Em uma modalidade de realização preferida, a presente invenção proporciona a redução de substâncias interferentes que podem estar presentes na amostra a testar. Uma vez que uma substância interferente, por exemplo um anticorpo humano anti-camundongo (HAMA), pode também ser capaz de formar um complexo com o reagente não imobilizado, marcado, da zona de reagente e o parceiro de ligação imobilizado da zona de detecção, indicando desse modo um resultado positivo no imunoensaio, o transportador pode incluir adicionalmente pelo menos uma zona de captura. Cada zona de captura contendo um reagente de captura imobilizado ligando-se especificamente a uma determinada substância interferente, imobilizando desse modo a substância de interferência na zona de captura. Dado que a zona de captura está separada da zona de detecção pelo espaço, e a amostra começa a migrar sobre a zona de reagente e a zona de captura antes de atingir a zona de detecção do transportador, o método permite a separação da substância ou substâncias de interferência do analito ou analitos de interesse. Preferencialmente, a zona de captura localiza-se entre a zona de reagente e a zona de detecção. Porém, a zona de captura pode também ser localizada entre a zona de aplicação e a zona de reagente.

[077] A detecção do marcador pode ser atingida em uma zona de detecção. A molécula de ligação imobiliza o complexo marcado ou o análogo de marcador marcado por reação imune ou outra reação na zona de detecção, construindo assim uma linha de teste visível na zona de detecção durante o processo. Preferencialmente, o marcador é um marcador oticamente detectável. A formação de um complexo na linha de teste concentra e imobilizes o marcador e a linha de teste torna-se visível a olho nu, indicando um resultado de teste positivo. Os marcadores diretos são particularmente preferidos, e mais particularmente os marcadores de ouro que podem ser melhor reconhecidos a olho nu. Adicionalmente, um dispositivo de leitura eletrônico (por exemplo com base em um transdutor fotométrico, acústico, impedimétrico, potenciométrico e/ou amperométrico) pode ser usado para obter resultados mais precisos e uma semi-quantificação do analito. Outros marcadores podem ser látex, fluoróforos ou fosforóforos.

[078] Em uma modalidade de realização, a sensibilidade dos imunoensaios de escoamento lateral, de leitura visual, é aumentada pela adição de uma pequena quantidade de corante fluorescente ou grânulos de látex fluorescentes conjugados ao material inicial conjugado. Quando a linha de teste do espectro visível está visivelmente presente, o resultado do teste é observado e registrado. Porém, no caso de fracos positivos que não dão origem a uma linha de teste visual distinta, uma luz de um espectro adequado, tal como um espetro de UV, é lançado na linha de teste para excitar e fluorescer os grânulos de látex fluorescentes que estão ligados na linha de teste para aumentar a cor visível na linha de teste.

[079] Em uma modalidade de realização preferida, os reagentes são configurados tal como a linha de teste visível correspondendo à presença de marcador viral vai ser separado a partir da linha de teste correspondente à presença do marcador bacteriano. No entanto, se pode determinar facilmente se a amostra continha marcadores bacterianos ou virais (ou ambos) simplesmente pela localização do desenvolvimento das linhas de teste na zona de detecção. Em outra modalidade de realização preferida, os reagentes podem ser escolhidos assim como linhas de teste desenvolvidas de diferentes cores. Isto é, a presença de um marcador viral irá fazer com que o desenvolvimento de uma linha de cor diferente do que essa desenvolvida pela presença de um marcador bacteriano. Por exemplo, o rótulo correspondente ao reagente que reconhece o marcador viral pode ser vermelho, ao passo que o marcador correspondente ao reagente que reconhece o marcador bacteriano pode ser verde. De forma diferente são conhecidos marcadores coloridos que podem ser associadas ao reagente não imobilizado. Alguns exemplos incluem, mas não estão limitados a, ouro coloidal, selênio coloidal, carbono coloidal, grânulos de latex, grânulos paramagnéticos, marcadores fluorescentes e quimioluminescentes e misturas desses.

[080] As Figuras 4A e 4B mostram uma tira de teste cromatográfico (400) com uma linha de teste (402) correspondendo à presença de um marcador viral e uma segunda linha de teste, separada (403) que detecta a presença de um marcador bacteriano. A amostra é aplicada à zona de aplicação (401) da tira de teste cromatográfico (400). Como mostrado na Figura 4A, a amostra passa depois uma zona de reagente (460) contendo pelo menos um parceiro de ligação viral marcado e pelo menos um parceiro de ligação bacteriano marcado que é eluído e, em seguida, capaz de migrar com uma amostra de líquido de transporte (por exemplo uma solução tampão). Em alternativa, como mostrado na Figura 4B, a zona de reagente (460) está localizada a montante de uma zona de aplicação da amostra (401) de tal modo que os parceiros de ligação marcados na zona de reagente são eluidos pelo líquido de transporte de amostras e viajar para a amostra. O parceiro de ligação viral marcado é capaz de se ligar especificamente a um marcador viral de interesse para formar um complexo o qual por sua vez é capaz de se ligar especificamente a um outro reagente específico ou parceiro de ligação na zona de detecção. O parceiro de ligação viral marcado é capaz de se ligar especificamente a um marcador bacteriano de interesse para formar um complexo o qual por sua vez é capaz de se ligar especificamente a um outro reagente específico ou parceiro de ligação na zona de detecção. Embora não esteja representado nestas Figuras, uma almofada absorvente, bem como outros componentes de imunoensaio de fluxo lateral conhecidos incluindo, mas não limitado a, uma zona de resíduos, um suporte transportador, um invólucro, e uma abertura no alojamento para leitura de resultado, pode opcionalmente também ser um componente das tiras de teste (400) nestas modalidades de realização.

[081] As tiras de teste (400) também incluem uma zona de detecção (405) contendo pelo menos uma primeira secção para detecção de um marcador viral, por exemplo uma linha de teste (402), incluindo um parceiro de ligação específico imobilizado, complementar ao complexo do reagente viral formado pelo marcador viral e o seu parceiro de ligação marcado. Assim, na linha de teste (402), a zona de detecção dos parceiros de ligação aprisionam os parceiros de ligação virais marcados da zona de reagente (460) juntamente com os seus marcadores virais ligados. Esta localização do marcador viral com os seus parceiros de ligação marcados dá origem a uma indicação na linha de teste (402). Na linha de teste (402), a presença do marcador viral é determinada pela leitura qualitativa e/ou quantitativa da indicação da linha de teste (402) resultante da acumulação dos parceiros de ligação marcados.

[082] A zona de detecção (405) também inclui pelo menos uma segunda secção de detecção de um marcador bacteriano, por exemplo uma linha de teste (403), incluindo um parceiro de ligação específico imobilizado, complementar ao complexo do reagente bacteriano formado pelo marcador bacteriano e o seu parceiro de ligação marcado. Assim, na linha de teste (403), a zona de detecção dos parceiros de ligação aprisiona os parceiros de ligação bacteriana marcados da zona de reagente (460) juntamente com os seus marcadores bacterianos ligados. Esta localização do marcador bacteriano com os seus parceiros de ligação marcados dá origem a uma indicação na linha de teste (403). Na linha de teste (403), a presença do marcador bacteriano é determinada pela leitura qualitativa e/ou quantitativa da indicação da linha de teste (403) resultante da acumulação dos parceiros de ligação marcados. Enquanto a linha de teste (402) está a montante da linha de teste (403) em relação à direção do fluxo (408) nas figuras, em modalidades de realização alternativas, a linha de teste (403) está a montante da linha de teste (402). Ainda em outra modalidades de realização, as linhas de teste (402) e (403) estão localizadas na mesma localização nas tiras de teste.

[083] Opcionalmente, a zona de detecção (405) pode conter outras linhas de teste para detectar outros marcadores virais e/ou bacterianos, assim como uma linha de controle (404). A linha de controle (404) indica que o parceiro de ligação específico marcado viajou através do comprimento do ensaio, mesmo que não possa ter quaisquer marcadores virais ou bacterianos ligados, assim confirmando a operação adequada do ensaio. Como mostrado nas Figuras 4A até 4B, a zona de controle (404) está preferencialmente a jusante das linhas de teste (402) e (403). Porém, em outras modalidades de realização, a zona de controle (404) pode estar localizada a montante de cada uma ou as duas linhas de teste (402) e (403).

[084] Em uma modalidade de realização preferida, a linha de controle (404) inclui um anticorpo ou outra proteína recombinante que se liga a um componente do meio de eluição ou outra composição a ser utilizada no teste. Em modalidades de realização em que os ácidos nucleicos são os alvos, a linha de controle (404) preferencialmente inclui um ácido nucleico, complementarmente ao ácido nucleico marcado em utilização, como um parceiro de ligação para o ácido nucleico alvo.

[085] Apesar de apenas uma linha de teste ser mostrada nas figuras para cada um dos marcadores virais e bacterianos, múltiplas linhas de teste para ambos ou qualquer um dos marcadores virais e bacterianos podem ser usadas no espírito da invenção. Em algumas modalidades de realização onde existem vários alvos bacterianos e/ou virais, a presença de cada alvo preferencialmente corresponde a uma linha de teste separada (402) ou (403). Em outras modalidades de realização, ambos os marcadores bacteriano e viral são detectados em uma única linha teste. Nestas modalidades de realização, a presença de ambos os marcadores bacteriano e viral na mesma linha de teste tem características diferentes do que a presença de qualquer um dos marcadores bacteriano ou viral sozinhos. Por exemplo, a presença de ambos os marcadores bacteriano e viral na mesma linha de teste pode ser visualmente indicada por uma cor diferente do que a presença de qualquer um marcador bacteriano ou marcador viral sozinho.

[086] Amostras totais de sangue fresco de pacientes que apresentem sintomas de infecções virais (sintomas do tipo gripal e febre de > 100,5°F) foram testadas para determinar quais os níveis de MxA no sangue podem ser detectados com os testes de fluxo lateral aqui descritos. Os ensaios de fluxo laterais usados nestes experimentos tinham uma configuração similar como o dispositivo mostrado na Figure 4B descrita acima, sem uma segunda linha de teste para a presença de um marcador bacteriano. Mais especificamente, as tiras de teste incluem uma zona de reagente a montante de uma zona de aplicação de amostra. A zona de reagente inclui anticorpos mobilizáveis para MxA (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd., Tóquio, Japão) marcados com ouro coloidal. As tiras de teste incluem também uma linha de teste na zona de detecção. A linha de teste incluiu um anticorpo imobilizado para MxA (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd., Tóquio, Japão). A linha de controle na zona de detecção incluiu anticorpo de coelho anti-galinha mais Ig de coelho (para um efeito estabilizador adicional), que se liga a IgY de frango mobilizado marcado com grânulos de latex azuis.

[087] As amostras de sangue total foram colhidas com EDTA como anticoagulante. Nestes testes, a quantidade de proteína MxA nas amostras de sangue foi determinada usando um Kit de teste ELISA de Proteína MxA (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd., Tóquio, Japão). O sangue foi lisado 1:10 com solução de lise provida no kit, antes de ser aplicado nas tiras de teste. 100 μl de sangue lisado foram testados no ensaio ELISA. 10 μl de sangue lisado foram usados como amostra no teste de fluxo lateral de MxA.

[088] As amostras de sangue lisado foram aplicadas na zona de aplicação das tiras de teste. Os anticorpos de MxA marcados no reagente foram eluídos pelo líquido de transporte de amostras e transportados para as amostras de sangue. Na linha de teste, o anticorpo imobilizado MxA aprisionou qualquer anticorpo de MxA marcado na zona de reagente ligada a MxA. Esta localização da MxA com o seu anticorpo marcado deu origem a uma indicação visual a vermelho na linha de teste caso houvesse uma concentração suficiente de MxA. TABELA 1

[089] A Tabela 1 mostra os padrões do kit ELISA de MxA executado de acordo com as instruções de teste. Como mostrado na Tabela 1, uma concentração de MxA de 24 ng/ml produziu um resultado positivo no teste de fluxo lateral. O kit padrão foi utilizado para gerar a curva padrão a partir da qual as concentrações de MxA foram determinadas.

[090] A Tabela 2 mostra os resultados das amostras clínicas de sangue fresco total de pacientes mostrando sintomas de infecções virais (sintomas gripais e febre de > 100,5°F). TABELA 2

[091] Os valores de DO (densidade óptica) foram utilizados em combinação com a curva padrão do padrão do kit a fim de determinar a concentração de MxA nas amostras. A concentração na coluna (ng/ml) foi a concentração de diluição com o agente de lise. A concentração x diluição (10x) na coluna (ng/ml) foi a concentração real na amostra de sangue total. Como mostrado na tabela, o teste de fluxo lateral produziu um resultado positivo para MxA nas amostras C e F, as quais tinham aproximadamente 105 ng/ml de MxA e aproximadamente 22 ng/ml de MxA, respectivamente, nas amostras.

[092] A Tabela 3 mostra os resultados de amostras totais congeladas de indivíduos normais do banco de sangue do Tennessee. Nenhuma das amostras de sangue tinha quaisquer quantias perceptíveis de MxA, e todas elas foram negativas no teste de fluxo lateral. TABELA 3

[093] A Tabela 4 mostra amostras de sangue completo fresco congelado da BioReclamation (BioReclamation, Hicksville, NY) de pacientes mostrando sintomas visíveis de infeções virais (sintomas gripais e febre de >100,5°F). Nenhum desses pacientes tinha DOs correspondendo a níveis de MxA mais altos que aproximadamente 8 ng/ml. Estas amostras foram negativas no teste de fluxo lateral. TABELA 4

[094] Os resultados destes testes indicam que os testes de fluxo lateral aqui descritos podem detectar níveis de MxA de pelo menos tão baixos como aproximadamente 20 ng/ml em uma amostra de 10 μl (diluída de 1:10) .

[095] Um exemplo de um teste rápido de triagem para distinguir infecções virais e bacterianas é mostrado na Figura 1. Como discutido acima, MxA é um marcador de diagnóstico para a infecção viral, enquanto o PCR é um marcador de diagnóstico para infecção bacteriana. Neste exemplo, a linha azul ("linha de controle" em A-D da Figura) representa o controle. A linha verde representa um nível de proteína C reativa (PCR) > 15 mg/l ("teste de PCR" em A-D da figura). A linha vermelha representa um nível MxA >20 ng/ml ("teste MxA" em A-D da figura). Um resultado positivo para a proteína MxA, com um resultado negativo para a proteína PCR indica somente um infecção viral (Resultado de Teste Visual A). Um resultado positivo para a (PCR) com um resultado negativo para a proteína MxA indica somente uma infecção bacteriana (Resultado de Teste Visual B). Um resultado positivo para as duas MxA e PCR indica coinfeção (infecção com as bactérias e vírus) (Resultado de Teste Visual C). Nenhuma infecção bacteriana ou viral é indicada pelo resultado negativo para ambas MxA e PCR (Resultado de Teste Visual D). Enquanto determinadas linhas de cor são discutidas neste exemplo, outras cores, ou as mesmas cores em diferentes locais sobre as tiras de teste para indicar marcadores virais ou bacterianos, estão dentro do espírito da presente invenção.

[096] Quando o desenvolvimento de diferentes linhas coloridas é utilizado, as linhas podem ou não ser separadas por um espaço. Neste último caso, são escolhidos os marcadores de modo a que a cor vista quando ambos os marcadores estão presentes seja diferente das cores vistas quando estão presentes os marcadores individuais. Por exemplo, a presença de marcador viral pode ser indicada pela linha vermelha; a presença do marcador bacteriano pela linha azul; e a presença de ambas pela linha púrpura (vermelho e azul combinados).

[097] A utilização de duas cores para distinguir infecção aguda e crônica é mostrada na Figura 2. No primeiro cassete, estão presentes somente anticorpos IgM, os quais indicam uma infecção aguda. Neste cassete, a linha de teste é vermelha. No segundo cassete, a linha de teste é azul porque as imunoglobulinas são IgG. O terceiro cassete mostra um caso intermédio, onde os anticorpos IgM e IgG estão ambos presentes. Consequentemente, a linha de teste é púrpura. Enquanto este exemplo é mostrado para testar IgM e IgG, o mesmo conceito é alternativamente utilizado com uma única linha que detecta ambos os marcadores virais e bacterianos para a infecção.

[098] Em outra modalidade de realização preferida, a tira de teste pode também incluir uma secção de controle a qual indica a funcionalidade das tiras de teste. A Figura 1 mostra uma linha de controle. A Figura 2 mostra um exemplo em que há uma secção de controle para todos os três cassetes. Se presente, a secção de controle pode ser concebida para transmitir um sinal ao utilizador de que o dispositivo funcionou. Por exemplo, a secção de controle pode conter um reagente (por exemplo, um anticorpo) que se ligarão aos reagentes marcados da zona de reagente. Em uma modalidade de realização preferida, galinha anti coelho é usada como a linha de controle e IgY de galinha conjugada a um marcador, por exemplo grânulos de latex azul, é o conjugado de controle. Em alternativa, a secção de controle pode conter um reagente anidro que, quando umedecido, produz uma alteração de cor ou formação de cor, por exemplo, sulfato de cobre anidro que fica azul quando umedecida por uma amostra aquosa. Como uma outra alternativa, a secção de controle pode conter marcadores virais e bacterianos imobilizados que irão reagir com o excesso de reagente marcado da zona de reagente. A secção de controle pode ser colocada a montante ou a jusante na zona de detecção. Um indicador de controle positivo informa ao usuário que a amostra tem permeado a distância exigida ao longo do dispositivo de ensaio.

[099] A Figura 3 compara duas tiras de teste, o "Adeno 1" e o "Adeno HS", que incluem as duas linha de controle. No Adeno 1, as duas linhas do controle (linha superior em cada cassete) e a de teste (linha inferior em cada cassete) são vermelhas. No Adeno HS, a linha de controle é azul e a linha de teste é vermelha. Em modalidades de realização onde a linha de controle é de uma cor diferente da linha de teste, é mais fácil distinguir entre as duas linhas, e assegurar que o teste está a funcionar.

[0100] Em algumas modalidades de realização, o dispositivo e métodos da presente Invenção incluem a zona de lise para ajudar a diferenciar as infecções virais e as bacterianas. Nestas modalidades de realização, a amostra que foi recolhida não é lisada antes da coleta e transferência para o dispositivo de análise de amostra. Isso diminui o número de passos necessários para recolher e preparar a amostra para análise. Uma situação em que um agente de lise melhora a eficiência do ensaio é quando se ensaia a presença de MxA. Como aqui discutido, a presença desta proteína pode ajudar a distinguir entre a infecção bacteriana e viral em crianças febris. Na lise in situ utilizando uma combinação de 1 % a 6% peso/volume de CHAPS e 0,5% a 2% peso/volume de NP40 como agente de lise melhora a detecção de MxA em sangue completo fresco ou congelado.

[0101] Nas modalidades de realização utilizando um agente de lise, a seguir à carga da amostra, a amostra mobilizada com o líquido de transporte (tampão) irá encontrar o agente de lise. O agente de lise deverá ser preferencialmente pré carregado nas tiras de teste e é eluido pelo líquido de transporte. Em algumas modalidades de realização o agente de lise foi seco na tira de teste. Alternativamente, o agente de lise pode ser pré-seco por criodessecação ou liofilização e depois pré-carregado na tira de teste. Em outras modalidades de realização, o agente de lise pode ser absorvido, adsorvido, embebido, ou aprisionado sobre a tira de teste. O agente de lise inicialmente seco está localizado, preferencialmente, entre a zona de aplicação da amostra e uma zona de reagente. Em modalidades de realização onde a zona de reagente está a montante da zona de aplicação da amostra, a zona de lise está a jusante da zona de aplicação da amostra. O agente de lise é preferencialmente solúvel no líquido de transporte de amostra, e o agente de lise é solubilizado e ativado após contato com o líquido de transporte de amostra. O líquido de transporte de amostra contém então o agente de lise tanto em solução como suspensão e os componentes de amostra em suspensão. Quaisquer componentes suscetíveis a lise na amostra, sendo então expostos em suspensão ao agente de lise, são eles próprios lisados in situ. O tampão de corrida transporta depois o analito, incluindo os componentes sem lise, para a zona de detecção.

[0102] O local onde o agente de lise é pré- carregado e seco pode variar conforme necessário. De modo a maximizar o tempo que a amostra tem para interagir com o agente de lise assim como para minimizar a quantidade de agente de lise atingindo a zona de detecção, o agente lise seco, absorvido, adsorvido, incorporado ou aprisionado pode estar localizado a jusante ou mesmo na zona de aplicação da amostra. Ou, de modo a minimizar a distância ao longo da qual o produto de lise deve viajar antes de atingir a zona de reagente, o agente de lise seco pode estar localizado mais perto a zona de reagente. Em outras modalidades de realização, o agente de lise pode estar incluído no tampão de corrida.

[0103] A concentração do agente de lise pré- carregado em uma tira de teste está preferencialmente entre 0,001 % e 5 % peso/volume. O volume a ser pré-carregado depende de onde o agente de lise é pré-carregado. Intervalos apropriadas são 1 a 10 microlitros quando pré-carregados no velo coletor de amostra (a zona de aplicação de amostra) ou 5 a 50 microlitros quando pré-carregados na almofada absorvente ou em outras localizações dentro da tira de teste. Idealmente, a quantidade pré-carregada deve ser aproximadamente 3 microlitros pré-carregados no velo do coletor de amostra ou aproximadamente 10 microlitros pré- carregados na almofada absorvente ou em outras localizações dentro da tira de teste.

[0104] A seleção de um ambiente de lise específico e do agente dependerá dos marcadores virais e bacterianos e do ensaio. O pH e a força iônica são a chave para o ambiente de lise. Conforme o pH estabelecido pelo agente de lise, um pH abaixo de 4,0 tende a precipitar os materiais, especialmente proteínas. O pH mais elevado, acima de aproximadamente de 10,0, tende a lisar materiais tais como proteínas e paredes celulares. Portanto, um pH de aproximadamente 10,0 ou acima é preferencial para muitas aplicações. Alternativamente, pH mais baixo pode ser preferencial para alvos de ácido nucleico.

[0105] Tal como a força iônica estabelecida pelo agente de lise, tanto a alta como a baixa força iônica podem ser usadas para a lise. Por exemplo, uma força iônica mais baixa (hipotônica) tende a desagregar eritrócitos. Por exemplo, a água por ela própria consegue lisar eritrócitos. Ambientes com força iônica mais elevada podem ser usados para romper certas paredes e membranas de células.

[0106] Quanto a agentes de lise específicos, podem ser agrupados e selecionados com base nas suas propriedades: sais, agentes anfotéricos e catiônicos, e detergentes iônicos e não iônicos. O sal, Cloreto de Amônio (NH4Cl) lisa eritrócitos. Outros sais, incluindo, mas não se limitando a, elevadas concentrações de Cloreto de Sódio (NaCl) e Cloreto de Potássio (KCl), podem romper certas paredes e membranas celulares. Outros agentes de lise são agentes anfotéricos incluindo, mas não se limitando a, Lyso PC, CHAPS, e Zwittergent. Alternativamente, agentes catiônicos incluindo, mas não se limitando a, C16 TAB e Cloreto de Benzalcônio podem ser usados como um agente de lise. Detergentes tanto iônicos como não iônicos são frequentemente usados para desagregar ou lisar os componentes de paredes celulares ou membranas celulares tais como lipoproteínas e glicoproteínas. Detergentes iônicos comuns incluem, mas não estão limitados a, SDS, Colato, e Deoxicolato. Detergentes iônicos são bons agentes de solubilização. Os anticorpos retêm a sua atividade em SDS a 0,1 % ou menos. Detergentes não iônicos comuns incluem, mas não estão limitados a, Octilglucosídeo, Digitonina, C12E8, Lubrol, Triton X-100, Noniodet P-40, Tween 20, e Tween 80. Detergentes não iônicos e ligeiramente iônicos são desnaturantes mais fracos e são frequentemente usados para solubilizar proteínas membranares tais como proteínas superficiais virais. Agentes de lise adicionais incluem, mas não estão limitados a, uréia e enzimas. Combinações de diferentes agentes de lise podem ser usadas para otimizar o ambiente de lise.

[0107] Os tensioativos geralmente são agentes molhantes e diminuem a tensão superficial de um líquido. Isto permite então espalhamento mais fácil por diminuição da tensão interfacial entre líquidos. Logo, os tensioativos conseguem interferir com a ligação natural de antigênio e anticorpo ou ligando e receptores. As concentrações são, portanto, experimentalmente escolhidas para cada classe de agente de lise. Logo que ocorre a lise é importante que as reações de ligação desejadas não são prejudicadas. Geralmente, a concentração de agente de lise de 0,001 % é considerada o limite inferior, e o limite superior é aproximadamente 1 %. Existe um efeito aditivo ou sinérgico quando são usadas combinações de agentes de lise. Isto expande a gama de trabalho das concentrações de operação a partir de aproximadamente 0,001 % até 1 %. Finalmente, alguma ligação não específica indesejável pode ser prevenida a uma concentração de Tween 20 de 5 %. Em todos os casos, a quantidade total de agente de lise pré-carregado em todas as localizações de uma tira de teste individual tem de ser suficiente para lisar barreiras para imunodetecção, permitindo operação prática da tira de teste.

[0108] O próprio agente de lise não deve interferir com quaisquer outros agentes detectores ou indicadores de ensaio e logo não interferir com quaisquer outras interações e reações de ensaio em uma medida que possa prevenir a operacionalidade prática do ensaio. Um agente de lise deve ter vida de prateleira suficiente para permitir a fabricação, distribuição, e armazenamento antes do uso de uma tira de teste em testes no local de atendimento.

[0109] Em modalidades de realização preferidas onde MxA é o marcador viral, na lise in situ utilizando uma combinação de 1 % a 6% peso/volume de CHAPS e 0,5% a 2% peso/volume de NP40 como agente de lise é preferencialmente usada. Como um exemplo específico, 2 microlitros de tampão HEPES 100 mM (pH 8,0) contendo 5% de CHAPS e 2% de NP-40 com Cloreto de Sódio 150 mM, 0,1% de BSA, e 0,1% de Azida de Sódio (todas as percentagens de peso/volume) são secos na zona de lise da tira de teste.

[0110] Em uma modalidade de realização preferida, como mostrado na Figuras 5A até 5D, a amostra é aplicada à zona de aplicação (201) sobre uma tira de teste cromatográfico (200). A amostra passa a zona de lise (250), onde o agente de lise terá sido preferencialmente pré carregado nas tiras de teste e é eluida pelo líquido de transporte. O agente de lise lisa quaisquer componentes suscetíveis de lise na amostra in situ.

[0111] A tira de teste cromatográfico contém uma zona de aplicação de amostra (201), a zona de lise (250) contendo um agente de lise, e uma zona de reagente (260) contendo pelo menos um parceiro de ligação marcado que se liga a um marcador viral e pelo menos um parceiro de ligação marcado que se liga a um marcador bacteriano que são eluídos por e depois capazes de migrar com uma amostra de líquido de transporte (por exemplo uma solução tampão). Enquanto a zona de reagente (260) é mostrada a jusante da zona de aplicação da amostra nestas figuras, em modalidades de realização alternativas, a zona de reagente (260) pode estar a montante da zona de aplicação da amostra (ver Figura 4B), desde que os reagentes encontrem a amostra em algum ponto depois de a amostra atingir a zona de lise e é eficazmente lisada. O parceiro de ligação viral marcado é capaz de se ligar especificamente a um marcador viral ou bacteriano de interesse para formar um complexo o qual por sua vez é capaz de se ligar especificamente a um outro reagente específico ou parceiro de ligação na zona de detecção. Embora não seja mostrado nestas Figuras, uma almofada absorvente, bem como outros componentes de imunoensaio de fluxo lateral conhecidos incluindo, mas não limitado a, uma zona de resíduos, um suporte transportador, um invólucro, e uma abertura no alojamento para leitura de resultado, pode opcionalmente também ser um componente das tiras de teste (200) nestas modalidades de realização.

[0112] Em uma modalidade de realização preferida, o agente de lise está localizado na zona de lise (250) entre a zona de aplicação da amostra (201) e a zona de reagente (260). O agente de lise é preferencialmente solúvel ou miscível no líquido de transporte de amostra, e o agente de lise é solubilizado e ativado após contato com o líquido de transporte de amostra. O líquido de transporte de amostra contém então o agente de lise tanto em solução como suspensão e os componentes de amostra em suspensão. Quaisquer componentes suscetíveis a lise em uma amostra, sendo então expostos em suspensão ao agente de lise, são eles próprios lisados in situ. O tampão de corrida transporta depois a amostra, incluindo qualquer dos componentes sem lise, para a zona de detecção (205).

[0113] A zona de lise (250) está preferencialmente localizada entre a zona de aplicação da amostra (201) e a zona de reagente (260), como mostrado na Figura 5A. Em outras modalidades de realização, a zona de lise (250) sobrepõe-se à zona de aplicação da amostra (201), à zona de reagente (260) ou a ambas a zona de aplicação da amostra (201) e a zona de reagente (260) como mostrado nas Figuras 5B, 5C, e 5D, respectivamente. Note-se que as figuras são esquemáticas, e não são desenhadas à escala. A quantidade de sobreposição entre as diferentes zonas (como mostrado nas Figuras 5B até 5D) pode ser altamente variável.

[0114] As tiras de teste (200) também incluem uma zona de detecção (205) contendo uma primeira secção para detecção de pelo menos um marcador bacteriano, por exemplo, uma linha de teste (203), incluindo um parceiro de ligação específico imobilizado, complementar ao complexo bacteriano formado pelo marcador bacteriano e o seu parceiro de ligação marcado. Assim, na linha de teste (203), a zona de detecção dos parceiros de ligação aprisiona os parceiros de ligação bacteriana marcados da zona de reagente (260) juntamente com os seus marcadores bacterianos ligados. Esta localização dos marcadores bacterianos com os seus parceiros de ligação marcados dá origem a uma indicação na linha de teste (203). Na linha de teste (203), a presença de um marcador bacteriano é determinada pela leitura qualitativa e/ou quantitativa da indicação da linha de teste (203) resultante da acumulação dos parceiros de ligação marcados.

[0115] A zona de detecção (205) também inclui uma segunda secção para detecção de pelo menos um marcador viral, por exemplo uma linha de teste (202), incluindo um parceiro de ligação específico imobilizado, complementar ao conjugado viral formado pelo marcador viral e o seu parceiro de ligação marcado. Assim, na linha de teste (202), a zona de detecção dos parceiros de ligação aprisiona os parceiros de ligação viral marcados da zona de reagente (260) juntamente com os seus marcadores virais ligados. Esta localização dos marcadores virais com os seus parceiros de ligação marcados dá origem a uma indicação na linha de teste (202). Na linha de teste (202), a presença de um marcador viral é determinada pela leitura qualitativa e/ou quantitativa da indicação da linha de teste (202) resultante da acumulação dos parceiros de ligação marcados. Enquanto a linha de teste (203) está a montante da linha de teste (202) em relação à direção de escoamento (208) nas figuras, em modalidades de realização alternativas, a linha de teste (202) está a montante da linha de teste (203). Ainda em outras modalidades de realização, as linhas de teste (202) e (203) estão localizadas na mesma localização nas tiras de teste.

[0116] Opcionalmente, a zona de detecção (205) pode conter outras linhas de teste para detectar outros marcadores bacterianos e/ou virais, assim como uma linha de controle (204). A linha de controle (204) indica que o parceiro de ligação específico marcado viajou através do comprimento do ensaio, mesmo que não possa ter quaisquer marcadores ligados, assim confirmando a operação adequada do ensaio. Como mostrado nas Figuras 5A até 5D, a zona de controle (204) está preferencialmente a jusante das linhas de teste (203) e (202). Porém, em outras modalidades de realização, a zona de controle (204) pode estar localizada a montante de cada uma ou ambas das linhas de teste (203) e (202).

[0117] Em uma modalidade de realização preferida, a linha de controle (204) inclui um anticorpo ou outra proteína recombinante que se liga a um componente do meio de eluição ou outra composição a ser utilizada no teste. Em modalidades de realização em que os ácidos nucleicos são os alvos, a linha de controle (204) preferencialmente inclui um ácido nucleico, complementarmente ao ácido nucleico marcado em utilização, como um parceiro de ligação para o ácido nucleico alvo.

[0118] Embora apenas uma linha de teste seja mostrada nas figuras, várias linhas de teste estão no espírito da presente invenção. Em algumas modalidades de realização onde existem alvos múltiplos, a presença de cada alvo preferencialmente corresponde a uma linha de teste separada (202). Em outras modalidades de realização onde existem alvos múltiplos, a presença de alvos múltiplos pode ser indicada na mesma linha de teste de tal modo que a presença de mais de um alvo tenha características diferentes das presenças de um único alvo. Por exemplo, a presença de múltiplos alvos na mesma linha de teste pode ser visualmente indicada por uma cor diferente do que a da presença de cada um dos alvos sozinhos.

[0119] Em outras modalidades de realização, é possível ter um ou mais agentes de lise leves no próprio tampão de corrida. Nestas modalidades de realização, nenhum efeito adverso na zona de reagente a qual deverá estar a jusante e a amostra pode estar a montante ou a jusante da zona de reagente. Uma enzima de lise no tampão de corrida pode "visar" o seu substrato e cortá-lo para abrir a membrana celular ou a parede celular. Como um exemplo, a penicilina pode extirpar ou “fazer um buraco” em bactérias suscetíveis. Em outras modalidades de realização, quando o agente de lise é aplicado para o material de recolha de amostras, então a zona de reagente pode estar a montante da zona de aplicação da amostra.

[0120] Como um exemplo, um ou mais agentes de lise são secos na zona de aplicação da amostra de uma tira de fluxo lateral. Em uma base por tira, o agente de lise é constituído por aproximadamente 2 microlitros de 100 mM de tampão HEPES (pH 8,0) contendo 5% de CHAPS e 2% de NP-40 com Cloreto de Sódio 150 mM, 0,1% de BSA, e 0,1% de Azida de Sódio (todas as percentagens em peso/volume). Até 10 microlitros de sangue completo são depois adicionados à zona de aplicação da amostra a ser lisada in situ. A proteína MxA é liberada partindo do interior dos glóbulos brancos para reagir com um anticorpo monoclonal de MxA em um marcador visual (ouro coloidal ou grânulos de latex visíveis). Este complexo cruza-se com um tampão de funcionamento contendo Triton X-100 e é capturado por anticorpos monoclonais MxA imobilizados na linha de teste da membrana de nitrocelulose. Esta ligação na linha de teste dá origem a uma indicação visível.

DISPOSITIVO DE ANÁLISE DE AMOSTRAS COM TIRAS DE TESTE BIMODAL DUPLAS

[0121] MxA é uma derivativa das células de interferon alfa/beta que se eleva na presença de infecções virais mas não é específico para um tipo particular de vírus. A expressão da proteína MxA no sangue periférico é um marcador sensível e específico para a infecção viral.

[0122] A MxA inibe a replicação de uma ampla variedade de vírus. A MxA tem uma baixa concentração basal [menos de 50 ng/ml] e uma indução rápida [1-2 horas]. Atinge um pico às 16 horas e permanece elevada, na presença de interferon elevado. A MxA também tem uma meia-vida longa [2,3 dias] e os títulos constantes na presença de interferonemia. As infecções virais elevam os níveis MxA enquanto têm apenas um modesto aumento nos níveis de PCR.

[0123] Em um ensaio clínico prospectivo usando ELISA (Towbin H et al. J Interferon Res 1992;12:67-74, aqui incorporado como referência), o estudo incluiu 87 adultos saudáveis normais. Os níveis MxA foram medidos para serem < 5 ng/ml em 66% dos adultos, entre 5-50 ng/ml em 29% dos adultos, e acima de 50 ng/ml em 5% dos adultos.

[0124] Outro ensaio clínico prospectivo utilizando ELISA (Chieux V et al., J Virol Methods 1998;70:183-191, aqui incorporado como referência) envolveu 174 crianças. 45 dessas crianças tinham febre aguda (infecção respiratória e/ou gastroenterite) e havia 30 controles pareados por idade. Os valores de MxA foram 7 ng/ml ±7 ng/ml nos 30 controles pareados por idade. Os valores MxA foram 10 ng/ml ±6 ng/ml em 13 infecções bacterianas confirmadas.

[0125] Outro ensaio clínico prospectivo utilizando ELISA envolveu 60 pacientes (Kawamura M et al. J Clin Lab Anal 2012;26: 174-183, aqui incorporado como referência). 42 desses pacientes tinham febre aguda (infecção respiratória e/ou gastroenterite) e havia 18 controles pareados por idade. O valor médio MxA foi 110,0 ng/ml em 31 infecções virais confirmadas. O valor médio MxA foi 10,6 ng/ml em 11 infecções bacterianas confirmadas. O valor médio MxA foi 2,0 ng/ml nos 18 controles pareados por idade. O teste ELISA tinha uma sensibilidade se 87,1 % e uma especificidade de 90,9% para diferenciar a infecção viral da bacteriana, mas só foram testados os valores MxA para fazer essa determinação. Os pacientes com infecção viral foram nitidamente distinguidos dos controles saudáveis com 100% de sensibilidade e especificidade. Foi usado um ponto de corte de 36,7 ng/ml de MxA para determinar a infecção viral por ELISA neste estudo.

[0126] Outro ensaio clínico prospectivo usando ELISA envolveu 174 crianças (Nakabayashi Met al., Pediatr Res 2006;60:770-774, aqui incorporado como referência, dados corrigidos para o padrão ELISA recalibrado). 122 dessas crianças tinham febre aguda (infecção respiratória e/ou gastroenterite) e havia 52 controles pareados por idade. Os valores médios de MxA foram 123,7 ng/ml ± 83,0 ng/ml em 95 infecções virais confirmadas. Os valores médios de MxA foram 12,3 ng/ml ± 10,0 ng/ml em 27 infecções bacterianas confirmadas. O valor médio de MxA foi 14,5 ng/ml ± 11,0 nos 52 controles pareados por idade. O teste mostrou uma especificidade de 92,6% e uma razão de probabilidade positiva de 13,1 para identificar com precisão a infecção viral. Foi usado um ponto de corte de 36,7 ng/ml de MxA para determinar a infecção viral por ELISA neste estudo.

[0127] O ponto de corte no teste ELISA é artificial e é escolhido para discriminar entre positivo e negativo. Portanto, é preferível atribuir rotineiramente 10% CV partindo deste ponto de corte. Em um ponto de teste de tratamento, 100% das pessoas podem ver claramente a linha de teste a >40 ng/ml, mas algumas pessoas podem ver um resultado positivo a níveis mais baixos.

[0128] A PCR torna-se elevada na presença de infecções bacterianas mas não é específica para um tipo específico de bactérias. A PCR é um indicador não específico para a presença de inflamação aguda e está elevada na presença de infecções bacterianas. A PCR é uma proteína de fase aguda sintetizada pelo fígado. IL-6 é o mediador primário da produção de PCR. A infecção bacteriana é um potente estímulo de elevação de PCR marcada. Na sequência de tratamento antibiótico, os níveis de PCR caem rapidamente. As infecções bacterianas elevam drasticamente os níveis de PCR enquanto os níveis de MxA permanecem baixos. A infecção bacteriana é um estímulo potente da PCR com elevação marcada nos níveis séricos de PCR ocorrendo em algumas horas. Os níveis de PCR elevam-se em 4-6 horas após a estimulação e atingem um pico após 36 horas. A concentração sérica de PCR é normalmente inferior a 3 mg/l. Com infecção ou inflamação grave, a PCR pode subir acima de 500 mg/l.

[0129] A pneumonia tem níveis elevados da PCR sérica (> 10 mg/L). Os níveis séricos de PCR são tipicamente maiores que 100 mg/L para pneumonia grave. 32% dos pacientes com bacteremia pneumocócica tiveram PCR sérico de menos de 60 mg/l. Nas infecções virais a PCR sérica usualmente não se eleva acima da 10 mg/l. Adenovírus invasivo e Influenza podem aumentar a PCR até 10-80 mg/l. Muito raramente, os níveis da PCR excedem 60 mg/l nas infecções virais.

[0130] A análise meta de dez estudos (Aouifi et al., Crit Care Med. 2000, 28:3171-6; Hatherill et al., Arch Dis Child 1999: 81: 417-21; Muller et al., Crit Care Med. 2000, 28: 977-83; Penel et al., Rev Med Interne 2001:22: 706714; Rothenberger et al., Clin Chem Lab Med, 1999, 37: 275-9; Schwarz et al., Crit Care Med 2000, 28: 1828-32; Selberg et al., Crit Care Med 2000, 28: 2793-8; Suprin et al., Intensive Care Med 2000, 26: 1232-8; Ugarte et al., Crit Care Med 1999, 27: 498-504; Viallon et al., Intensive Care Med 2000, 26: 1082-8, todos aqui incorporados como referência) que visou um único valor da PCR sérica a ser utilizado como um ponto de corte para a doença bacteriana resultou em um resultado bimodal. Três dos estudos (Aouifi et al., Crit Care Med. 2000, 28:3171-6; Penel et al., Rev Med Interne 2001:22: 706714; Schwarz et al., Crit Care Med 2000, 28: 1828-32) recomendaram que o valor de corte de CPR fosse ajustado a 615 mg/L, enquanto os outros sete estudos (Hatherill et al., Arch Dis Child 1999: 81: 417-21; Muller et al., Crit Care Med. 2000, 28: 977-83; Rothenberger et al., Clin Chem Lab Med, 1999, 37: 275-9; Selberg et al., Crit Care Med 2000, 28: 2793-8; Suprin et al., Intensive Care Med 2000, 26: 1232-8; Ugarte et al., Crit Care Med 1999, 27: 498-504; Viallon et al., Intensive Care Med 2000, 26: 1082-8) recomendavam um corte de 60-100 mg/L.

[0131] Em isolamento, nem a MxA nem a PCR sozinhas são sensíveis ou específicas na identificação de infecção tanto viral como bacteriana. Valores limiares baixos de PCR mostram elevada sensibilidade e baixa especificidade quanto à detecção de infecção bacteriana. Valores limiares elevados de PCR mostram baixa sensibilidade e elevada especificidade quanto à detecção de infecção bacteriana. MxA é específica para identificar infecção viral, mas não é sensível à infecção bacteriana. Um padrão multiplexado de resultados incluindo pontos de decisão médica refletiu que níveis limiares de baixa PCR, elevada PCR, e MxA em conjunto proporcionam um modo sensível e específico para identificar uma resposta imune a uma infecção viral e/ou bacteriana.

[0132] Em uma modalidade de realização preferencial de um imunoensaio de fluxo lateral multiplexado, o padrão de sangue por punção digital de resultados de teste mostra um resultado positivo com uma equivalência no soro a um nível limiar baixo de PCR de aproximadamente 10 mg/l, uma equivalência no soro a um nível limiar elevado de PCR de aproximadamente 80 mg/l, e um corte de MxA de aproximadamente 40 ng/ml. Estes valores preferidos são mostrados na Tabela 5. TABELA 5

[0133] A especificidade do teste é ainda reforçada pela restrição do uso pretendido. Por exemplo, em modalidades de realização preferidas, apenas determinadas idades da população de pacientes são testadas (preferencialmente um ano de idade ou mais velhos) e/ou pacientes com condições de limite específicas que podem levar a fatores de confusão são de preferência não dados deste teste.

[0134] Um rápido, imunoensaio de MxA no ponto de atendimento foi desenvolvido e comparado com o ensaio ELISA de MxA em 25 amostras de sangue periférico dos pacientes com doença respiratória febril, como mostrado na Tabela 6. A Tabela 7 ordena os mesmos dados das menores para as maiores quantidades de MxA no teste ELISA.

[0135] O valor de corte MxA do ELISA foi 36,7 ng/ml (+/- 10%CV = 33 ng/ml a 40/5 ng/ml). O paciente 19 teve um resultado positivo no teste rápido MxA no ponto de atendimento, mesmo considerando que os resultados de ELISA eram muito inferiores a 40 ng/ml (15 ng/ml). Porem, o imunoensaio MxA demonstrou 100% (9/9) de sensibilidade e 94% (15/16) de especificidade. TABELA 6

TABELA 7

[0136] Imunoensaios rápidos, do nível de PCR baixa no ponto de atendimento e nível de PCR elevada foram desenvolvidos e comparados com a PCR de ELISA em 25 amostras de sangue periférico de pacientes com uma doença febril respiratória. Estes pacientes são os mesmos pacientes que foram testados para MxA nas Tabelas 6 e 7. Estes valores preferidos são mostrados na Tabela 8. TABELA 8

[0137] Os pacientes números 6 e 8 mostraram um resultado de PCR positivo mesmo considerando que os resultados do ELISA eram inferiores a 80 mg/l. O paciente 23 mostrou um resultado negativo mesmo quando os resultados de ELISA eram exatamente 80 mg/l. O paciente número 9 mostrou um resultado negativo do teste de baixa PCR, apesar de resultados de ELISA para aquele paciente ser acima de 10 mg/l. Mas, no geral, os valores de PCR se correlacionavam bem com o ELISA de PCR em ambos os valores de corte.

[0138] Usando um ELISA de MxA e PCR, RPS analisaram 25 amostras do banco de sangue normal, saudável, quanto à presença ou ausência de elevada MxA e PCR. A concentração média no plasma de PCR demonstrou ser 1,6 mg/l. Os níveis de PCR mostraram variar na gama desde 0,1 a 3,7 mg/L. Os resultados são mostrados na Tabela 9. TABELA 9

[0139] As tiras de teste bimodal dual podem ser usadas para diferenciar infecção bacteriana e viral em humanos, mas podem ser também usadas em aplicações veterinárias para animais. Uma vez que a PCR difere dependendo da espécie, não existem anticorpos comuns para PCR entre as espécies. Portanto, os testes veterinários necessitam de incluir PCR específica para à espécie particular sendo testada. MxA está bem conservada entre espécies, logo é possível usar MxA de humano em testes veterinários. Porém, a MxA para uma espécie particular poderia em alternativa ser usadas para tentar adicionalmente aumentar a especificidade. Testes veterinários usando as tiras de teste bimodais duais aqui descritos podem ser desenvolvidos para uma espécie específica, incluindo, mas não se limitando a, gatos, cães, coelhos, porcos, ovelhas, cavalo, vacas, macacos, chimpanzés, babuínos, e orangotangos.

[0140] A tira com MxA e baixa PCR poderia ser feita com qualquer configuração, por exemplo as configurações mostradas nas Figuras 4A e 4B, ou Figuras 5A até 5D, onde MxA é o marcador viral sendo detectado e níveis relativamente baixos de PCR é o marcador bacteriano sendo detectado. Em outras modalidades de realização, a linha de teste MxA e a linha de teste PCR pode sobrepor, ou estar no mesmo local das tiras de teste. Nestas modalidades de realização, a presença de PCR e MxA na mesma linha de teste tem características diferentes do da presença de qualquer um dos marcadores bacteriano ou viral sozinhos. Por exemplo, a presença da PCR baixa e da MxA na mesma linha de teste pode ser visualmente indicada por uma cor diferente do que a presença de MxA ou PCR baixa sozinhas. Nestas modalidades de realização, um resultado positivo para MxA daria uma cor ou uma indicação diferente da de um resultado positivo para baixa PCR, de modo que a pessoa que lê o ensaio pode distinguir entre um resultado completamente negativo, um resultado positivo para MxA, um resultado positivo para baixa PCR, e um resultado positivo tanto para MxA como para baixa PCR. Por exemplo, um resultado positivo para MxA pode resultar na linha de teste vermelha, e um resultado positivo para baixo PCR pode resultar em uma linha de teste azul. Assim, quando uma amostra é positiva tanto para a baixa PCR e MxA, a linha é visivelmente roxa.

[0141] Algumas modalidades de realização para dispositivos de ensaio de fluxo lateral que detectam altos níveis de PCR são mostrados nas Figuras 6A-6B e 7A-7D. Estas configurações são semelhantes às configurações mostradas nas Figuras 4A-4B e 5A-5D, sem uma linha de teste para um marcador viral, e as mesmas referências numéricas são usadas para os mesmos componentes da tira (600), (700).

[0142] As Figuras 6A e 6B mostram uma tira de teste cromatográfico (600) com uma linha de teste (623) que detecta a presença de um marcador bacteriano, tal como os elevados níveis de PCR. A amostra é aplicada à zona de aplicação (401) da tira de teste cromatográfico (600). Como mostrado na Figura 6A, a amostra passa depois uma zona de reagente (660) contendo pelo menos um parceiro de ligação bacteriano marcado e que é eluído por e, em seguida, capaz de migrar com o líquido de transporte da amostra (por exemplo uma solução tampão). Em alternativa, como mostrado na Figura 6B, a zona de reagente (660) está localizada a montante de uma zona de aplicação da amostra (401) tal como os parceiros de ligação marcados na zona de reagente são eluidos pelo líquido transporte de amostras e viajar para a amostra. O parceiro de ligação bacteriano marcado é capaz de se ligar especificamente a um marcador bacteriano de interesse, por exemplo elevados níveis de PCR, para formar um complexo o qual por sua vez é capaz de se ligar especificamente a um outro reagente específico ou parceiro de ligação na zona de detecção. Embora não esteja representado nestas Figuras, uma almofada absorvente, bem como outros componentes de imunoensaio de fluxo lateral conhecidos incluindo, mas não limitado a, uma zona de resíduos, um suporte transportador, um invólucro, e uma abertura no alojamento para leitura de resultado, pode opcionalmente também ser um componente das tiras de teste (600) nestas modalidades de realização.

[0143] As tiras de teste (600) também incluem uma zona de detecção (605) contendo uma secção para detecção de um marcador bacteriano, por exemplo uma linha de teste (623), incluindo um parceiro de ligação específico imobilizado, complementar ao complexo do reagente bacteriano formado pelo marcador bacteriano e o seu parceiro de ligação marcado. Assim, na linha de teste (623), a zona de detecção dos parceiros de ligação aprisiona os parceiros de ligação bacteriana marcados da zona de reagente (660) juntamente com os seus marcadores bacterianos ligados. Esta localização do marcador bacteriano com os seus parceiros de ligação marcados dá origem a uma indicação na linha de teste (623). Na linha de teste (623), a presença do marcador bacteriano é determinada pela leitura qualitativa e/ou quantitativa da indicação da linha de teste (623) resultante da acumulação dos parceiros de ligação marcados.

[0144] Opcionalmente, a zona de detecção (605) pode conter outras linhas de teste para detectar outros marcadores bacterianos e/ou virais, assim como uma linha de controle (404). A linha de controle (404) indica que o parceiro de ligação específico marcado viajou ao longo do ensaio, mesmo que não possa ter quaisquer marcadores ligados, assim confirmando a operação adequada do ensaio. Como mostrado nas Figuras 6A até 6B, a zona de controle (404) está preferencialmente a jusante das linhas de teste (623). Porém, em outras modalidades de realização, a zona de controle (404) pode estar localizada a montante da linha de teste (623).

[0145] Em uma modalidade de realização preferida, a linha de controle (404) inclui um anticorpo ou outra proteína recombinante que se liga a um componente do meio de eluição ou outra composição a ser utilizada no teste. Em modalidades de realização em que os ácidos nucleicos são os alvos, a linha de controle (404) preferencialmente inclui um ácido nucleico, complementarmente ao ácido nucleico marcado em utilização, como um parceiro de ligação para o ácido nucleico alvo.

[0146] Em outras modalidades de realização preferidas para testar um marcador bacteriano, tais como níveis de PCR, como mostrado na Figuras 7A até 7D, a amostra passa a zona de lise (250), onde um agente de lise terá preferencialmente sido pré-carregada sobre as tiras de teste e é eluído pelo transporte líquido. O agente de lise lisa quaisquer componentes suscetíveis de lise na amostra in situ.

[0147] A tira de teste cromatográfico (700) contém uma zona de aplicação de amostra (201), a zona de lise (250) contendo um agente de lise, e uma zona de reagente (760) contendo pelo menos um parceiro de ligação marcado que se liga a um marcador bacteriano, por exemplo altos níveis de PCR, que é eluído em e depois capaz de migrar com a amostra de líquido de transporte (por exemplo uma solução tampão). Enquanto a zona de reagente (760) é mostrada a jusante da zona de aplicação da amostra nestas figuras, em modalidades de realização alternativas, a zona de reagente (760) pode estar a montante da zona de aplicação da amostra (ver Figura 6B), desde que os reagentes encontrem a amostra em algum ponto depois de a amostra atingir a zona de lise e é eficazmente lisada. O parceiro de ligação marcado é capaz de se ligar especificamente a um marcador bacteriano de interesse, por exemplo, altos níveis de PCR, para formar um complexo o qual por sua vez é capaz de se ligar especificamente a um outro reagente específico ou parceiro de ligação na zona de detecção. Embora não esteja representada nestas Figuras, uma almofada absorvente, bem como outros componentes de imunoensaio de fluxo lateral conhecidos incluindo, mas não limitados a, uma zona de resíduos, um suporte transportador, um invólucro, e uma abertura no alojamento para leitura de resultado, pode opcionalmente também ser um componente das tiras de teste (700) nestas modalidades de realização.

[0148] Em uma modalidade de realização preferida, o agente de lise está localizado na zona de lise (250) entre a zona de aplicação da amostra (201) e a zona de reagente (760). O agente de lise é preferencialmente solúvel ou miscível no líquido de transporte de amostra, e o agente de lise é solubilizado e ativado após contato com o líquido de transporte de amostra. O líquido de transporte de amostra contém então o agente de lise tanto em solução como suspensão e componentes de amostra em suspensão. Quaisquer componentes suscetíveis a lise em uma amostra, sendo então expostos em suspensão ao agente de lise, são eles próprios lisados in situ. O tampão de corrida transporta depois a amostra, incluindo qualquer dos componentes sem lise, para a zona de detecção (705).

[0149] A zona de lise (250) está preferencialmente localizada entre a zona de aplicação da amostra (201) e a zona de reagente (760), como mostrado na Figura 7A. Em outras modalidades de realização, a zona de lise (250) sobrepõe-se à zona de aplicação da amostra (201), à zona de reagente (760) ou a ambas as zonas de aplicação da amostra (201) e a zona de reagente (260) como mostrado na Figuras 7B, 7C, e 7D, respectivamente. Note-se que as figuras são esquemáticas, e não são desenhadas à escala. A quantidade de sobreposição entre as diferentes zonas (como mostrado nas Figuras 7B até 7D) pode ser altamente variável.

[0150] As tiras de teste (700) também incluem uma zona de detecção (705) contendo uma primeira secção para detecção de pelo menos um marcador bacteriano, por exemplo uma linha de teste (723), incluindo um parceiro de ligação específico imobilizado, por exemplo, um parceiro de ligação específico para um elevado nível de PCR, complementar ao conjugado bacteriano formado pelo marcador bacteriano e o seu parceiro de ligação marcado. Assim, na linha de teste (723), a zona de detecção dos parceiros de ligação aprisiona os parceiros de ligação bacteriana marcados da zona de reagente (760) juntamente com os seus marcadores bacterianos ligados. Esta localização dos marcadores bacterianos com os seus parceiros de ligação marcados dá origem a uma indicação na linha de teste (723). Na linha de teste (723), a presença de um marcador bacteriano é determinada pela leitura qualitativa e/ou quantitativa da indicação da linha de teste (723) resultante da acumulação dos parceiros de ligação marcados.

[0151] Opcionalmente, a zona de detecção (705) pode conter outras linhas de teste para detectar outros marcadores bacterianos e/ou virais, assim como uma linha de controle (204). A linha de controle (204) indica que o parceiro de ligação específico marcado viajou através do comprimento do ensaio, mesmo que não possa ter quaisquer marcadores ligados, assim confirmando a operação adequada do ensaio. Como mostrado nas Figuras 7A até 7D, a zona de controle (204) está preferencialmente a jusante das linhas de teste (723). Porém, em outras modalidades de realização, a zona de controle (204) pode estar localizada a montante da linha de teste (723).

[0152] Em uma modalidade de realização preferida, a linha de controle (204) inclui um anticorpo ou outra proteína recombinante que se liga a um componente do meio de eluição ou outra composição a ser utilizada no teste. Em modalidades de realização em que os ácidos nucleicos são os alvos, a linha de controle (204) preferencialmente inclui um ácido nucleico, complementarmente ao ácido nucleico marcado em utilização, como um parceiro de ligação para o ácido nucleico alvo.

[0153] Uma configuração preferida de uma tira de teste do dispositivo de análise de amostra dupla bimodal é mostrado na Figuras 8A até 8C. O dispositivo de análise de amostra ou cartão de teste (800) inclui um invólucro confinável (835) com dois lados (836), (837) e uma porção de coluna ou em gonzo (831). Em uma modalidade de realização preferencial, o cartão de teste (800) tem aproximadamente 11,5 cm de comprimento (L) x 7 cm de largura (W) quando os dois lados (836), (837) são fechados. No entanto pode ser usado cartão de teste (800) com qualquer tamanho que acomode todos os componentes. Dentro do primeiro lado (836) do invólucro (835), existem duas tiras de teste (815), (825), cada incluindo uma almofada receptora (845), uma zona de desvio (850), uma almofada de transferência (855) e uma zona de detecção (805). O primeiro lado (836) inclui também uma almofada absorvente (840) e preferencialmente uma almofada de resíduos (860). A primeira tira de teste (815) inclui preferencialmente uma zona de detecção (805) com uma linha de teste de MxA (802), uma linha de teste de PCR baixa (803) e uma linha de controle (804). A segunda tira de teste (825) inclui preferencialmente uma zona de detecção (805) com uma linha de teste de PCR elevada (823) e uma linha de controle (804). Todas as linhas de teste são visíveis através das janelas (865) no segundo lado (837) do invólucro (835) quando o invólucro (835) está fechado. A almofada absorvente (840) é preferencialmente uma almofada única à qual o tampão de funcionamento é adicionado para iniciar o fluxo lateral. Similarmente, a almofada de resíduos (860) é preferencialmente uma almofada única que coleta o tampão de funcionamento em excesso no final do teste. No entanto, em outras modalidades de realização, cada tira poderia ter uma almofada absorvente (840) e/ou almofada de resíduos (860).

[0154] O segundo lado (837) do invólucro (835) inclui três secções separadas (838), (839) e (870). A porção do meio, um compressor de amostra ou aba (870), inclui preferencialmente duas zonas conjugadas (872), (874), cada uma incluindo um marcador de ligação marcado para pelo menos um analito, e um controle marcado. Uma janela (843) é colocada na porção inferior (838) do segundo lado (837) do invólucro de modo a que o tampão possa ser adicionado à almofada absorvente (840) quando o invólucro (835) está fechado. As janelas de visualização (865) para as zonas de detecção (805) estão na porção superior (839) do segundo lado (837) do invólucro (835).

[0155] A porção superior (839) e a porção inferior (838) do segundo lado (837) do invólucro (835) incluem cada uma preferencialmente também pelo menos um botão, pega ou saliência (875) que corresponde a um ou mais buracos (895) de tal modo que as porções inferiores e superiores (838), (839) possam ser facilmente fixadas no primeiro lado (836) do invólucro (835). Em uma modalidade de realização preferencial, existem duas pegas (875) na porção inferior (838) que correspondem a dois buracos (895) flanqueando a almofada absorvente (840) no primeiro lado (836) do invólucro (835) e duas pegas (875) na porção superior (839) que correspondem a dois buracos (895) flanqueando a almofada de resíduos (860) no primeiro lado (836) do invólucro (835). Em outras modalidades de realização, os buracos (895) estão no segundo lado (837) do invólucro (835) e as pegas (875) estão no primeiro lado (836) do invólucro (835). Ainda em outras modalidades de realização, outros mecanismos de fixação reversíveis poderiam ser usados para fixar a porção superior (838) e/ou porção inferior (839) do segundo lado (837) do invólucro (835) ao primeiro lado (836) do invólucro (835). Em outras modalidades de realização, as secções superiores e inferiores (838), (839) estão permanentemente fechadas, por exemplo usando um adesivo, antes do uso.

[0156] A aba (870), também conhecida como um compressor de amostra, no segundo lado (837) do invólucro inclui duas zonas de conjugado (872), (874) e duas zonas de aplicação de amostra (873), (876), e pode ser facilmente aberta e fechada. A aba (870) inclui também preferencialmente pelo menos um botão, pega ou saliência (875) que corresponde a um ou mais buracos (895) de tal modo que a aba (870) seja facilmente corretamente fechada no primeiro lado (836) do invólucro (835) após a amostra ter sido adicionada às zonas de aplicação de amostra (873), (876). Em outras modalidades de realização, os buracos (895) estão no segundo lado (837) do invólucro (835) e as pegas (875) estão no primeiro lado (836) do invólucro (835). Ainda em outras modalidades de realização, outros mecanismos de fixação reversíveis poderiam ser usados para fixar a aba (870) ao primeiro lado (836) do invólucro (835).

[0157] As zonas de conjugado (872), (874) e as zonas de aplicação de amostra (873), (876) se sobrepõem preferencialmente. Em modalidades de realização preferenciais, as zonas de conjugado (872), (874) são coloridas devido aos corantes nos conjugados de amostra e conjugados de controle, e a amostra é colocada diretamente na porção colorida da aba (870). Em uma modalidade de realização preferencial, a zona de conjugado (872) que é usada para a primeira tira de teste (815) contém um parceiro de ligação a MxA que é marcado com um corante vermelho, um parceiro de ligação a PCR baixa que é marcado com um corante preto, e um parceiro de ligação de controle que é marcado com um corante azul. Em esta modalidade de realização, a zona de conjugado (872) aparece arroxeada. A outra zona de conjugado (874) contém um parceiro de ligação a PCR elevada que é marcado com um corante preto e um parceiro de ligação de controle que é marcado com um corante azul. Em esta modalidade de realização, a zona de conjugado (874) aparece azulada.

[0158] A zona de desvio (850) inclui preferencialmente uma fenda ou barreira que interrompe o fluxo lateral, desviando o tampão de funcionamento para a aba (870) que inclui as zonas de conjugado (872), (874) e as zonas de aplicação de amostra (873), (876).

[0159] Em atuação, as porções superiores e inferiores (838), (839) do segundo lado (837) do invólucro (835) são mantidas fechadas antes do uso por fixação das pegas (875) aos buracos (895). O dispositivo de análise de amostra, ou cartão de teste (800) está preferencialmente colocado em uma superfície plana. Se a aba (870) não estiver já aberta, o usuário abre-a para aceder às zonas de aplicação de amostra (873), (876). Uma amostra de sangue a ser testada é retirada do paciente. A amostra pode ser retirada por qualquer procedimento conhecido na técnica. Em uma modalidade de realização preferencial, uma amostra de 5 μl de sangue é adicionada a cada uma das zonas de aplicação de amostra (873), (876) e depois a aba (870) é fechada. Cada uma das amostras de 5 μl é preferencialmente coletada independentemente uma da outra. As amostras de sangue são preferencialmente diretamente adicionadas ao dispositivo (800), sem qualquer pré-tratamento.

[0160] Para assegurar que o compressor de amostra ou aba (870) foi corretamente fechado é preferencialmente aplicada pressão ao invólucro (835) acima das pegas (875) para manter as pegas (875) fechadas. O topo da aba (870) necessita de estar alinhado com o topo do resto do segundo lado (837) do invólucro (835) para que o teste funcione corretamente. O tampão de funcionamento é adicionado à almofada absorvente (840), que inicia o fluxo lateral (885). Em modalidades de realização preferenciais, o tampão de funcionamento inclui um ou mais agentes de lise, por exemplo detergentes, para lisar a amostra de sangue e expor a MxA intracelular na amostra. Quando o tampão de funcionamento alcança a zona de desvio (850) é desviado para a aba (870). Viaja através das zonas de conjugado (872), (874), coletando quaisquer complexos formados entre o parceiro de ligação a MxA e MxA na amostra, o parceiro de ligação a PCR baixa e baixos níveis de PCR na amostra, o parceiro de ligação a PCR elevada e elevados níveis de PCR na amostra, bem como o conjugado de controle.

[0161] Uma vez que as zonas de conjugado (872), (874) formam uma ponte sobre a zona de desvio (850) nas tiras de teste de fluxo lateral (815), (825), o tampão de funcionamento, que contém agora amostra, conjugado, e os complexos descritos acima, viaja então para a almofada de transferência (855), e para as zonas de detecção (805) em cada uma das tiras de teste (815), (825). Se MxA estiver presente na amostra, a linha de teste de MxA (802) na primeira linha de teste (815) será vermelha. Se um nível baixo limiar de PCR estiver presente na amostra, a linha de teste de PCR baixa (803) na primeira linha de teste (815) será preta. Se um nível elevado limiar de PCR estiver presente na amostra, a linha de teste de PCR elevada (823) na primeira linha de teste (825) será preta. Se o teste for corretamente operado, as linhas de controle (804) tanto na primeira tira (815) como na segunda tira de teste (825) serão azuis. Em modalidades de realização preferenciais, os níveis de detecção são 40 ng/ml para MxA, 10 mg/l para PCR baixa na primeira tira de teste (815) e 80 mg/l para PCR elevada na segunda tira de teste (825). Os resultados do teste devem ser visíveis após aproximadamente 5-20 minutos, preferencialmente no espaço de cerca de 10 minutos.

[0162] Uma vez que o parceiro de ligação de controle está no compressor de amostra ou aba (870) e não em qualquer uma das tiras de teste (815), (825) existe um verdadeiro controle processual para esta configuração. Se a aba (870) não for apropriadamente fechada, nada aparecerá na zona de detecção (805), indicando que o teste foi impropriamente operado.

[0163] As Figuras 9A até 9F mostram resultados de teste usando o dispositivo (800) mostrado nas Figuras 8A até 8C, com duas tiras de teste (815), (825) lado a lado, onde uma primeira tira de teste (815) testa a presença tanto de MxA e baixos níveis de PCR e a segunda tira de teste (825) testa quanto a elevados níveis de PCR.

[0164] A Figura 9A mostra um resultado negativo na linha de teste de MxA (802) e um resultado negativo na linha de teste de PCR baixa (803) na primeira linha de teste (815), bem como um resultado negativo na linha de teste de PCR elevada (823) na segunda tira de teste (825). Mais especificamente, as únicas linhas visíveis na zona de detecção (805) do ensaio de fluxo lateral (800) são as duas linhas de controle azuis (804). Este resultado indica que a amostra é negativa quanto à infecção viral e bacteriana.

[0165] As Figuras 9B e 9C são positivas quanto a infecção viral. Na Figura 9B, a presença de duas linhas de controle azuis (804) e uma linha de MxA vermelha (802) indica uma infecção viral. Na Figura 8C, a presença de duas linhas de controle azuis (804) e uma linha de MxA vermelha (802) indica uma infecção viral. Uma vez que existe também uma linha de PCR baixa preta (803) na Figura 9C, existe uma possibilidade de coinfeção bacteriana, embora exista uma ausência de uma linha de PCR elevada (823).

[0166] As Figuras 9D e 9E são positivas quanto a infecção viral. Na Figura 9D, a presença de duas linhas de controle azuis (804) e uma linha de PCR baixa preta (803) indica uma infecção bacteriana. Na Figura 9E, a presença de duas linhas de controle azuis (804), uma linha de PCR baixa preta (803), e uma linha de PCR elevada preta (823) indica também uma infecção bacteriana. A linha de MxA está ausente em ambas as Figuras 9D e 9E, indicando uma ausência de uma infecção viral.

[0167] A Figura 9F indica coinfeção (infecção bacteriana e viral). A presença de duas linhas de controle azuis (804), uma linha de MxA preta (802), uma linha de PCR baixa preta (803), e uma linha de PCR elevada preta (823) indica a presença de infecção viral e bacteriana.

[0168] Outra configuração preferencial para um dispositivo de análise de amostra com tira de teste bimodal dual (1000) é mostrada nas Figuras 10A até 10C. Esta configuração é similar à configuração (800) mostrada nas Figuras 8A até 8C, mas as zonas de aplicação de amostra (1073), (1076) estão localizadas em cada uma das tiras de teste (1015), (1025), a jusante da zona de desvio (850). O dispositivo de análise de amostra ou cartão de teste (1000) inclui um invólucro fichável (835) com dois lados (836), (837) e uma porção de coluna ou em gonzo (831). Em uma modalidade de realização preferencial, o cartão de teste (1000) tem aproximadamente 11,5 cm de comprimento (L) x 7 cm de largura (W) quando os dois lados (836), (837) são fechados. No entanto, pode ser usado cartão de teste (1000) com qualquer tamanho que acomode todos os componentes. Dentro do primeiro lado (836) do invólucro (835), existem duas tiras de teste (1015), (1025), cada incluindo uma almofada receptora (845), uma zona de desvio (850), uma almofada de transferência (1055) e uma zona de detecção (805). O primeiro lado (836) inclui também uma almofada absorvente (840) e preferencialmente uma almofada de resíduos (860). A primeira tira de teste (1015) inclui preferencialmente uma zona de detecção (805) com uma linha de teste de MxA (802), uma linha de teste de PCR baixa (803) e uma linha de controle (804). A segunda tira de teste (1025) inclui preferencialmente uma zona de detecção (805) com uma linha de teste de PCR elevada (823) e uma linha de controle (804). Todas as linhas de teste são visíveis através das janelas (865) no segundo lado (837) do invólucro (835) quando o invólucro (835) está fechado. A almofada absorvente (840) é preferencialmente uma almofada única à qual o tampão de funcionamento é adicionado para iniciar o fluxo lateral. Similarmente, a almofada de resíduos (860) é preferencialmente uma almofada única que coleta o tampão de funcionamento em excesso no final do teste. No entanto, em outras modalidades de realização, cada tira poderia ter uma almofada absorvente (840) e/ou almofada de resíduos (860).

[0169] O segundo lado (837) do invólucro (835) inclui três secções separadas (838), (839) e (1070). A porção do meio, ou aba (1070), também conhecida como um compressor de amostra, inclui preferencialmente duas zonas de conjugado (872), (874), incluindo cada uma um marcador de ligação marcado para pelo menos um analito, e um controle marcado. Uma janela (843) está localizada na porção inferior (838) do segundo lado (837) do invólucro de tal modo que o tampão possa ser adicionado quando o invólucro (835) está fechado. As janelas de visualização (865) para as zonas de detecção (805) estão na porção superior (839) do segundo lado (837) do invólucro (835).

[0170] A porção superior (839) e a porção inferior (838) do segundo lado (837) do invólucro (835) incluem cada uma preferencialmente também pelo menos um botão, pega ou saliência (875) que corresponde a um ou mais buracos (895) de modo a que as porções inferiores e superiores (838), (839) possam ser facilmente fixadas no primeiro lado (836) do invólucro (835). Em uma modalidade de realização preferencial, existem duas pegas (875) na porção inferior (838) que correspondem a dois buracos (895) flanqueando a almofada absorvente (840) no primeiro lado (836) do invólucro (835) e duas pegas (875) na porção superior (839) que correspondem a dois buracos (895) flanqueando a almofada de resíduos (860) no primeiro lado (836) do invólucro (835). Em outras modalidades de realização, os buracos (895) estão no segundo lado (837) do invólucro (835) e as pegas (875) estão no primeiro lado (836) do invólucro (835). Ainda em outras modalidades de realização, outros mecanismos de fixação reversíveis poderiam ser usados para fixar a porção superior (838) e/ou porção inferior (839) do segundo lado (837) do invólucro (835) ao primeiro lado (836) do invólucro (835). Em outras modalidades de realização, as secções superiores e inferiores (838), (839) estão permanentemente fechadas, por exemplo usando um adesivo, antes do uso.

[0171] A aba (1070) no segundo lado (837) do invólucro inclui duas zonas de conjugado (872), (874) e pode ser facilmente aberta e fechada. A aba (1070) inclui também preferencialmente pelo menos um botão, pega ou saliência (875) que corresponde a um ou mais buracos (895) tal que a aba (1070) seja facilmente corretamente fechada no primeiro lado (836) do invólucro (835) após ter sido adicionada a amostra às zonas de aplicação de amostra (1073), (1076) nas tiras de teste (1015), (1025). Em outras modalidades de realização, os buracos (895) estão no segundo lado (837) do invólucro (835) e as pegas (875) estão no primeiro lado (836) do invólucro (835). Ainda em outras modalidades de realização, outros mecanismos de fixação reversíveis poderiam ser usados para fixar a aba (1070) ao primeiro lado (836) do invólucro (835).

[0172] Em modalidades de realização preferenciais, as zonas de conjugado (872), (874) são coloridas devido aos corantes nos conjugados de amostra e conjugados de controle. Em uma modalidade de realização preferencial, a zona de conjugado (872) que é usada para a primeira tira de teste (1015) contém um parceiro de ligação a MxA que é marcado com um corante vermelho, um parceiro de ligação a PCR baixa que é marcado com um corante preto, e um parceiro de ligação de controle que é marcado com um corante azul. Em esta modalidade de realização, a zona de conjugado (872) aparece arroxeada. A outra zona de conjugado (874) contém um parceiro de ligação a PCR elevada que é marcado com um corante preto e um parceiro de ligação de controle que é marcado com um corante azul. Em esta modalidade de realização, a zona de conjugado (874) aparece azulada.

[0173] A zona de desvio (850), que inclui preferencialmente uma fenda ou barreira, interrompe o fluxo lateral, desviando o tampão de funcionamento para a aba (1070) que inclui as zonas de conjugado (872), (874).

[0174] Em operação, as porções superiores e inferiores (838), (839) do segundo lado (837) do invólucro (835) são mantidas fechadas antes do uso por fixação das pegas (875) aos buracos (895). O dispositivo de análise de amostra, ou cartão de teste (1000) está preferencialmente colocado em uma superfície plana. Se a aba (1070) não estiver já aberta, o usuário abre-a para aceder às zonas de aplicação de amostra (1073), (1076). As zonas de aplicação de amostra (1073), (1076) podem estar localizadas em qualquer porção da almofada de transferência (1055). Uma amostra de sangue a ser testada é retirada do paciente. A amostra pode ser retirada por qualquer procedimento conhecido na técnica. Em uma modalidade de realização preferencial, uma amostra de 5 μl de sangue é adicionada a cada uma das zonas de aplicação de amostra (1073), (1076) e depois a aba (1070) é fechada. Cada uma das amostras de 5 μl é preferencialmente coletada independentemente uma da outra. O sangue é preferencialmente diretamente adicionado ao dispositivo (1000), sem qualquer pré-tratamento. Em modalidades de realização preferenciais, uma seta (1002) ou outra indicação (mostrada na Figura 10A), por exemplo as palavras "adicionar amostra aqui", mostra ao usuário onde colocar a amostra nas tiras de teste (1015), (1025).

[0175] Para assegurar que a aba (1070) foi corretamente fechada é preferencialmente aplicada pressão ao invólucro (835) acima das pegas (875) para fechar as pegas (875). O topo da aba (1070) necessita de estar alinhado com o topo do resto do segundo lado (837) do invólucro (835) para que o teste funcione corretamente. O tampão de funcionamento é adicionado à almofada absorvente (840), que inicia o fluxo lateral (885). Em modalidades de realização preferenciais, o tampão de funcionamento inclui um ou mais agentes de lise, por exemplo detergentes, para lisar a amostra de sangue e expor a MxA intracelular na amostra. Quando o tampão de funcionamento alcança a zona de desvio (850) é desviado para a aba (1070). Viaja através das zonas de conjugado (872), (874), coletando os parceiros de ligação a MxA, os parceiros de ligação a PCR baixa, e os parceiros de ligação a PCR elevada, bem como o conjugado de controle.

[0176] Uma vez que as zonas de conjugado (872), (874) formam uma ponte sobre a zona de desvio (850) nas tiras de teste de fluxo lateral (1015), (1025), o tampão de funcionamento, que contém agora conjugado, viaja então para a almofada de transferência (1055), que inclui as zonas de aplicação de amostra (1073), (1076), e para as zonas de detecção (805) em cada uma das tiras de teste (1015), (1025). Se MxA estiver presente na amostra, a linha de teste de MxA (802) na primeira linha de teste (1015) será vermelha. Se um nível baixo limiar de PCR estiver presente na amostra, a linha de teste de PCR baixa (803) na primeira linha de teste (1015) será preta. Se um nível elevado limiar de PCR estiver presente na amostra, a linha de teste de PCR elevada (823) na segunda linha de teste (1025) será preta. Em modalidades de realização preferenciais, os níveis de detecção são 40 ng/ml para MxA, 10 mg/l para PCR baixa na primeira tira de teste (1015) e 80 mg/l para PCR elevada na segunda tira de teste (1025). Os resultados do teste devem ser visíveis após aproximadamente 5-20 minutos, preferencialmente no espaço de cerca de 10 minutos. Se o teste foi corretamente operado, as linhas de controle (804) tanto na primeira tira (815) como na segunda tira de teste (825) serão azuis.

[0177] Uma vez que o parceiro de ligação de controle está na aba (1070) e não em qualquer uma das tiras de teste (1015), (1025) existe um verdadeiro controle processual para esta configuração. Se a aba (1070) não for apropriadamente fechada, nada aparecerá na zona de detecção (805), indicando que o teste foi impropriamente operado.

[0178] Em uma modalidade de realização alternativa, as zonas de aplicação de amostra (1073), (1076) estão localizadas na almofada receptora (845), antes da zona de desvio (850). Em esta modalidade de realização, o tampão de funcionamento viaja através das zonas de aplicação de amostra (1073), (1076), e depois desviado para a aba (1070).

[0179] Em modalidades de realização preferenciais das configurações mostradas nas Figuras 8A até 8C e 10A até 10C, mais de aproximadamente 1,2 ml de tampão de funcionamento são colocados na almofada absorvente (840). Se menos do que 1,0 ml for adicionado em modalidades de realização onde a zona de desvio (850) é uma fenda, o tampão fica estagnado na fenda porque a fenda suporta aproximadamente 1,0 ml.

[0180] Como mostrado na Figura 11, em uma modalidade de realização preferencial, um estojo (1100) inclui o dispositivo de análise de amostra (800), (1000), uma lancete (1102), uma ou mais pipetas (1101), e um tampão de funcionamento (1103). A lanceta (1102) é usada para fazer uma punção na pele e uma ou mais pipetas (1101) são usadas para retirar o sangue do local de punção. Em uma modalidade de realização preferencial, 5 μl de sangue são transferidos de uma primeira pipeta (1101) para a primeira zona de conjugado (872) e outros 5 μl de sangue são transferidos de uma segunda pipeta (1101) e adicionados à segunda zona de conjugado (874). A aba (870) é fechada, e o tampão de funcionamento (1103) é adicionado à almofada absorvente (840), como descrito na descrição das Figs. 8A até 8C e 10A até 10C.

[0181] A zona de desvio (850) inclui preferencialmente pelo menos uma característica que interrompe o fluxo no plano no qual o fluxo está ocorrendo. A zona de desvio pode incluir uma barreira, uma fenda, uma vala, ou qualquer combinação de estas características. A barreira é preferencialmente uma membrana impermeável (ou membrana substancialmente impermeável) que pode ser feita de qualquer material que previna o fluxo de líquido de continuar a fluir no mesmo plano. Alguns materiais para a barreira incluem, mas não estão limitados a, materiais inertes, materiais semipermeáveis, plásticos, hidrocarbonetos, metal, materiais hidrofóbicos, Sephadex, Sepharose, acetato de celulose, um material higroscópico (por exemplo, CaCl2, CaSO4 ou sílica gel), ou hidrogéis. A fenda ou vala é qualquer quebra no plano da tira de teste do fluxo lateral que se estenda até uma profundidade suficiente para parar o fluxo. Em uma modalidade de realização preferencial, a fenda tem preferencialmente uma profundidade de aproximadamente 0,1 mm.

[0182] A zona de desvio (850) nas Figuras 8A até 8C e 10A a 10C retarda ou para completamente o fluxo até o compressor/aba de amostra (870), (1070) ser colocado em contato com o resto do dispositivo, e cria uma ponte ao longo da qual o fluido consegue fluir. O compressor de amostra (870), (1070) atua como uma ponte e redireciona o fluxo para um plano diferente. O fluxo é desviado para o compressor de amostra (870), (1070). Isto aumenta a coleta dos reagentes no compressor de amostra (870), (1070). Por exemplo, em modalidades de realização onde o conjugado esteja no compressor de amostra (870), (1070), a coleta do conjugado aumenta em dispositivos com uma zona de desvio (850). Em modalidades de realização onde tanto a zona de aplicação de amostra (873), (876), (1073), (1076) e o conjugado estejam no compressor de amostra (870), (1070), a amostra e o conjugado encontram ambos o tampão de funcionamento quando são desviados para o compressor de amostra (870), (1070) , e uma ^ sanduíche ou sanduíche completa (dependendo de onde o segundo parceiro de ligação para o analito esteja localizado no dispositivo de análise de amostra) é formada antes de o tampão de funcionamento ser desviado de volta para a tira de teste se o analito estiver presente na amostra. Modalidades de realização com uma zona de desvio (850) e um compressor de amostra (870), (1070) aumentam a velocidade, permitem interações melhores entre o conjugado e a amostra, e permitem mais sensibilidade porque mais conjugado está colocado no fluido. Em estas modalidades de realização, todo o fluido interage preferencialmente com o conjugado. Isto é uma melhoria significativa em relação a modalidades de realização de compressor sem redirecionamento, onde aproximadamente 2030 % do fluido interage com o conjugado.

[0183] Outra configuração preferencial para um dispositivo de análise de amostra com tira de teste bimodal dual (1200) é mostrada na Figura 12. Esta configuração é semelhante às configurações (800), (1000) mostradas nas Figuras 8A até 8C e Figuras 10A e 10C, sem uma segunda secção (837) do alojamento (1235) ou uma zona de desvio (850). Em vez disso, todos os componentes do teste encontram-se no mesmo plano e o fluxo prossegue lateralmente a partir da almofada absorvente (840) para a almofada de resíduos (860). Note-se que esta modalidade de realização também pode incluir um invólucro com uma janela para facilitar a aplicação do tampão para a almofada absorvente (840), a uma janela localizada acima de cada zona de aplicação da amostra (1273), (1276) para aplicar a amostra ao dispositivo (1200), e janelas de visualização para a zona de detecção (805). Em uma modalidade de realização preferida, o dispositivo de análise de amostra (1200) é aproximadamente 11,5 cm comprimento (L) x 7 cm largura (W). No entanto, pode ser usado cartão de teste (1200) com qualquer tamanho que acomode todos os componentes. Existem duas tiras de teste (1215), (1225), cada uma incluindo uma almofada de recepção (845), uma zona de conjugado (1272), (1274), uma almofada de transferência (1240) contendo uma zona de aplicação de amostra (1273), (1276), uma zona de detecção (805) e uma almofada resíduos (860). O dispositivo (1200) inclui também preferencialmente uma almofada absorvente (840) e uma almofada de resíduos (860). Enquanto as zonas de conjugado (1272), (1274) são mostradas a montante da zona de aplicação da amostras (1273), (1276) nesta figura, em outras modalidades de realização, uma ou ambas as zonas conjugadas (1272), (1274) estão localizadas a jusante da zona de aplicação da amostras (1273), (1276). A zona de detecção (805) da primeira tira de teste (1215) inclui preferencialmente uma linha de teste de MxA (802), uma PCR baixa (803) e uma linha de controle (804). A zona de detecção (805) na segunda tira de teste (1225) inclui também preferencialmente uma linha de teste de PCR elevada (823) e a linha de controle (804). A almofada absorvente (840) é preferencialmente uma almofada única à qual o tampão de funcionamento é adicionado para iniciar o fluxo lateral. Similarmente, a almofada de resíduos (860) é preferencialmente uma almofada única que coleta o tampão de funcionamento em excesso no final do teste. No entanto, em outras modalidades de realização, cada tira poderia ter uma almofada absorvente (840) e/ou almofada de resíduos (860) separadas.

[0184] Em modalidades de realização preferenciais, as zonas de conjugado (1272), (1274) são coloridas devido aos corantes nos conjugados de amostra e conjugados de controle. Em uma modalidade de realização preferencial, a zona de conjugado (1272) que é usada para a primeira tira de teste (1215) contém um parceiro de ligação a MxA que é marcado com um corante vermelho, um parceiro de ligação a PCR baixa que é marcado com um corante preto, e um parceiro de ligação de controle que é marcado com um corante azul. Em esta modalidade de realização, a zona de conjugado (1272) aparece arroxeada. A outra zona de conjugado (1274) contém um parceiro de ligação a PCR elevada que é marcado com um corante preto e um parceiro de ligação de controle que é marcado com um corante azul. Em esta modalidade de realização, a zona de conjugado (1274) aparece azulada.

[0185] Na operação, uma amostra de sangue a ser testada é retirada do paciente. A amostra pode ser retirada por qualquer procedimento conhecido na técnica. Em uma modalidade de realização preferencial, uma amostra de 5 μl de sangue é adicionada a cada uma das zonas de aplicação de amostra (1273), (1276). Cada uma das amostras de 5 μl é preferencialmente coletada independentemente uma da outra. Em modalidades de realização preferenciais, uma seta (1002) ou outra indicação (mostrada na Figura 10A), por exemplo as palavras "adicionar amostra aqui", mostra ao usuário onde colocar a amostra nas tiras de teste (1215), (1225).

[0186] O sangue é preferencialmente diretamente adicionado ao dispositivo (1200), sem qualquer pré- tratamento. O tampão de funcionamento é adicionado à almofada absorvente (840), que inicia o fluxo lateral (1285). Em modalidades de realização preferenciais, o tampão de funcionamento inclui um ou mais agentes de lise, por exemplo, detergentes, para lisar a amostra de sangue e expor a MxA intracelular na amostra. Esta viaja através das zonas de conjugado (1272), (1274), coletando os parceiros de ligação a MxA, os parceiros de ligação a PCR baixa, e os parceiros de ligação a PCR elevada, bem como o conjugado de controle.

[0187] O tampão de corrida, que agora contém conjugado, em seguida, desloca-se para a almofada de transferência (1255), a qual inclui as zonas de aplicação da amostra (1273), (1276), e às zonas de detecção (805) em cada uma das tiras de testes (1215), (1225). Se MxA estiver presente na amostra, a linha de teste de MxA (802) na primeira linha de teste (1215) será vermelha. Se um nível baixo limiar de PCR estiver presente na amostra, a linha de teste de PCR baixa (803) na primeira linha de teste (1215) será preta. Se um nível elevado limiar de PCR estiver presente na amostra, a linha de teste de PCR elevada (823) na segunda linha de teste (1225) será preta. Em modalidades de realização preferenciais, os níveis de detecção são 40 ng/ml para MxA, 10 mg/l para PCR baixa na primeira tira de teste (1215) e 80 mg/l para PCR elevada na segunda tira de teste (1225). Os resultados do teste devem ser visíveis após aproximadamente 5-20 minutos, preferencialmente no espaço de cerca de 10 minutos. Se o teste foi corretamente operado, as linhas de controle (804) tanto na primeira tira (1215) como na segunda tira de teste (1225) serão azuis.

[0188] Em uma modalidade de realização alternativa, as zonas de aplicação de amostra (1273), (1276) estão localizadas a montante das zonas de conjugados (1272), (1274). Em esta modalidade de realização, o tampão de funcionamento viaja através das zonas de aplicação de amostra (1273), (1276), e depois desviado para as zonas de conjugados (1272),(1274). Ainda em outra modalidades de realização, as zonas conjugadas (1272), (1274) sobrepõe uma zona de aplicação da amostras (1273), (1276). Ainda em outra modalidades de realização, as zonas conjugadas (1272), (1274), e/ou a zona de aplicação da amostras (1273), (1276) podem ser localizadas na almofada de recepção (845).

[0189] Em modalidades de realização preferidas das configurações mostradas nas Figuras 4A até 8C, 10A até 10C e 12 o controle é anti-galinha de coelho e o conjugado de controle são grânulos de latex azuis acoplados a IgY de frango. Em outras modalidades de realização preferidas, é pelo menos um agente de lise, preferencialmente um detergente, no tampão de corrida.

DETECÇÃO SIMULTÂNEA DE PROTEÍNAS INTRACELULARES E EXTRACELULARES

[0190] Existem analitos extracelulares e existem analitos intracelulares. A detecção de cada uma é frequentemente um evento separado. O analito intracelular tem de ser extraído por lise das células de modo a que o analito internalizado é externalizado e disponível para o teste.

[0191] Os métodos aqui divulgados detectam simultaneamente pelo menos um analito extracelular e pelo menos um analito intracelular. Um alvo ou analito "intracelular", como descrito nesta modalidade de realização, é um analito que está dentro da célula e não toca em nada dentro da célula (tal como proteínas de superfície, a parede celular, ou superfícies internas). Um alvo ou analito "extracelular", como descrito nesta modalidade de realização, é um analito completamente extracelular, que não entra em contato com nada fora da célula. Por exemplo, o analito extracelular está no plasma, que não contem células. A célula pode ser removida por completo, e o analito extracelular ainda pode ser coletado.

[0192] Em contraste, as partículas virais, enquanto estão fora da célula, estão fixadas à parede celular. É bem conhecido na técnica a mistura de um cocktail de anticorpos para detectar uma fração ligada intracelular e uma fração ligada à superfície. Mas, os métodos aqui descritos são diferentes, e detectam uma porção lisada, intracelular e uma proteína sérica dissociada.

[0193] Em uma modalidade de realização preferida, o analito extracelular é proteína C reativa e o analito intracelular é proteína MxA. Este é um teste serológico para a detecção de antigênios de PCR e MxA. MxA é uma proteína intracelular dentro dos glóbulos brancos. PCR é uma proteína extracelular encontrada no sangue completo, plasma e soro.

[0194] Em um método preferido, fibras de vidro, tais como filtros Whatman GD, aprisionam fisicamente os eritrócitos. Lectinas e/ou anticorpos de ligação de eritrócitos específicos podem ser adicionados para se ligarem fisicamente aos eritrócitos na matriz de fibra de vidro. Soluções de lise de leucócitos, que lisam os leucócitos para libertar a MxA intracelular, podem ser incorporados nos filtros de fibra de vidro.

[0195] Em algumas modalidades de realização, a amostra de sangue completo é adicionada ao filtro de vidro. O sangue líquido dissolve os agentes de lises embebidos, que lisam os leucócitos. A imunocromatografia de fluxo lateral é iniciada pela adição do tampão de funcionamento. O tampão de corrida em seguida, carrega os conjugados de anticorpos apropriados que se ligam ao PCR extracelular e a recentemente liberada MxA intracelular. A totalidade dos movimentos complexos na zona de detecção onde anticorpos específicos imobilizados capturam os respectivos complexos de modo a formar a sanduíche. Diferentes linhas de teste são formadas com MxA e PCR. Esta linha de testes pode ser visual, fluorescente, fosforescente, quimioluminescente, paramagnética, ou quaisquer combinações destas. Diferentes corantes podem ser incorporados para distinguir as linha de testes MxA e PCR. Qualquer dos ensaios de fluxo laterais e configurações aqui descritas podem ser usados para detectar simultaneamente MxA e PCR ou outros analitos intracelulares e extracelulares.

AGLUTINAÇÃO DE MXA E PCR

[0196] Algumas modalidades de realização incluem um teste de aglutinação simples para MxA e PCR no sangue. Como uma analogia, os presentes inventores acreditam que o cimento em uma parede de tijolos está segurando os tijolos separados em vez de mantê-los juntos. O raciocínio é que, se o cimento é removido, os tijolos se aglutinam e caem juntos em um montão. Portanto, se o cimento é "inativado" ou removido, os tijolos individuais coalescem em conjunto.

[0197] Conjugados de ouro e grânulos de latex são partículas coloidais que repelem um ao outro e, portanto, são reunidos em suspensão. Se a força de repulsão é removida, ou as partículas coloidais individuais são reticuladas juntas, elas aglutinam-se e podem visualizar-se as partículas aglutinadas. A reticulação para superar esta repulsa natural é conseguida pela presença da substância a analisar antigênio em questão.

[0198] Em uma modalidade de realização preferida, a MxA monoclonal KM 1124 e/ou KM 1135 é conjugada em partículas coloidais de ouro vermelhas. Anticorpos monoclonais anti-PCR são conjugados com grânulos de latex verdes de tamanho adequado. Na presença de MxA, o anticorpo monoclonal KM 1124 e/ou KM 1135 liga-se e, uma vez que existe uma multiplicidade dos epítopos reconhecidos pelos KM 1124 e/ou KM 1135, uma reticulação natural do ouro coloidal tem lugar e vê-se a aglomeração das partículas coloidais de ouro vermelho. Este processo é dependente de antigênio e bastante rápido, ocorrendo geralmente dentro de um ou dois minutos. O mesmo fenômeno ocorre com os grânulos de latex coloidais verdes revestidos com anticorpos monoclonais adequados, na presença de um analito de PCR.

[0199] A aglomeração de partículas de ouro vermelho significa que pelo menos uma quantidade limite da MxA está na amostra, indicando uma infecção viral. A aglomeração de contas verdes significa que pelo menos uma quantidade limiar de PCR está na amostra, indicando a infecção bacteriana. A aglomeração das partículas de vermelhas e verdes significa ou uma coinfeção ou é indicativa de um resultado indeterminado. A ausência de qualquer aglutinação indica que a amostra é negativa para as infecções virais e bacterianas.

[0200] Em uma modalidade de realização preferida, a concentração limiar de proteína C reativa é igual a ou maior que aproximadamente 6-15 mg/l de proteína C reativa e a concentração limite de proteína MxA é igual a ou maior que um equivalente de soro de aproximadamente 15-250 ng/ml. Uma vez que a MxA é um biomarcador intracelular, a amostra de sangue é preferencialmente lisadas durante o ensaio para lisar os glóbulos brancos e externalizar o antígeno MxA. Em outras modalidades de realização, a amostra é lisada antes da realização do ensaio. Qualquer formato de imunoensaio conhecido na arte pode ser utilizado para o ensaio de aglutinação. Os reagentes são adicionados, e em seguida, o utilizador espera para ver se os reagentes se aglutinam na presença da amostra.

NANOPARTÍCULAS NO DIAGNÓSTICO DE VÍRUS

[0201] Os níveis de MxA são elevados em algumas, mas não em todas as infecções virais. Algumas exceções aos níveis elevados de MxA durante a infecção são a Hepatite B e essas infecções virais crônicas, incluindo, possivelmente HIV e hepatite C. O ácido siálico está na maioria dos vírus. Mas, o ácido siálico não está em alguns vírus, tais como o vírus Cox.

[0202] Os dispositivos combinados de detector MxA-PCR descritos acima são preferencialmente usados em pessoas com febre para distinguir entre infecções virais e bacterianas. O teste de nanopartículas do ácido siálico é preferencialmente usado em todos os outros suspeitos de infecções virais (acompanhadas ou não de febre), incluindo infecções virais crônicas. Porém, em algumas modalidades de realização, o ácido siálico substitui MxA nos métodos e dispositivos aqui descritos.

[0203] Em outra modalidade de realização preferida, um teste inclui MxA, PCR, e um homólogo de nanopartículas o ácido siálico.

[0204] Em uma modalidade de realização preferida, a linha de teste é uma nanopartícula específica para um determinado vírus. Alguns exemplos incluem, mas não estão limitados a, gripe das aves, e vírus que causam infecção crônica, como o HIV ou hepatite C. O conjugado é tanto a) uma nanomicela específica de vírus com um corante no interior ou b) uma nanomicela homóloga de ácido siálico com um corante no interior.

[0205] Por exemplo, Nanoviricides, Inc. (West Haven, Connecticut) é uma Nanopartícula específica da Gripe das Aves. Essas nanopartículas podem ser utilizadas na Linha de teste e uma nanomicela homóloga do ácido siálico como o conjugado para detectar a Gripe das Aves.

[0206] Uma outra modalidade de realização inclui um detector viral de largo espetro. Nesta modalidade de realização, a linha de teste é uma nanopartícula homóloga do ácido siálico que capta todos os vírus e o conjugado é um nanomicela do ácido siálico com corante no interior.

[0207] Em modalidades de realização preferidas, a linha de teste é feita de nanopartículas, não nanomicelas que contém as nanopartículas. O conjugado, por outro lado, é preferencialmente uma nanomicela (análoga a uma bolha de sabão) que leva os corantes dentro da micela. A porção de lípido da micela é que é responsável pela propriedade "limosa" da micela.

[0208] As modalidades de realização de ácido siálico podem utilizar qualquer das configurações de tiras de teste aqui descritas, ou conhecidas na arte, incluindo essas mostradas nas Figuras 4-8 e 10-12, ou outras configurações de ensaios conhecidos na arte.

[0209] Em conformidade, é para ser entendido que as modalidades de realização da invenção aqui descritas são meramente ilustrativas da aplicação dos princípios da invenção. A referência aqui a detalhes das modalidades de realização ilustradas não se destina a limitar o escopo das reivindicações, as quais elas próprias expressam essas características consideradas como essenciais à invenção.

Claims

1. MÉTODO PARA DETERMINAR SE UMA INFEÇÃO É BACTERIANA E/OU VIRAL, caracterizado por compreender as etapas de: a) recolha de uma amostra; b) transferência da amostra para um dispositivo de análise de amostra (800, 1000) compreendendo: i) um compressor de amostra (870, 1070) compreendendo: A) uma primeira zona de reagente compreendendo, pelo menos, um primeiro reagente específico para proteína C reativa, de modo a que, quando a amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado se um baixo nível de proteína C reativa estiver presente na amostra e pelo menos um segundo reagente específico para MxA, de modo a que, quando a amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado se MxA estiver presente na amostra; e B) uma segunda zona de reagente compreendendo pelo menos um terceiro reagente específico para proteína C reativa, em que o terceiro reagente detecta somente um nível de proteína C reativa, que é mais alto que nível de proteína C reativa detectado pelo primeiro reagente, de modo a que, quando a amostra contata o terceiro reagente, forma-se um terceiro complexo marcado se o nível de proteína C reativa estiver presente na amostra; ii) uma primeira tira de teste (815, 1015) de fluxo cromatográfico lateral compreendendo: A) uma primeira zona de detecção compreendendo um primeiro parceiro de ligação o qual se liga ao primeiro complexo marcado; e um segundo parceiro de ligação o qual se liga ao segundo complexo marcado; e B) uma primeira zona de desvio (850) localizada a montante da primeira zona de detecção na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, em que a primeira zona de desvio interrompe o fluxo lateral na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral; e iii) uma segunda tira de teste (825, 1225) cromatográfico de fluxo lateral paralela em uma direção de fluxo lateral a uma primeira tira de teste (815) cromatográfico de fluxo lateral, compreendendo: A) uma segunda zona de detecção compreendendo um terceiro parceiro de ligação que se liga ao terceiro complexo marcado; e B) uma segunda zona de desvio localizada a montante da primeira zona de detecção na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, em que zona de desvio interrompe o fluxo lateral na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral; iv) uma primeira zona de aplicação da amostra (873, 1073), onde a amostra é colocada no dispositivo de análise de amostra, em que a primeira zona de aplicação da amostra é colocada na localização selecionada do grupo consistindo em: i) na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral a montante da zona de detecção e ii) na primeira zona de reagente do compressor da amostra; e v) uma segunda zona de aplicação da amostra (876, 1076) onde a amostra é colocada no dispositivo de análise da amostra, em que a segunda zona de aplicação da amostra é colocada em uma localização selecionada do grupo consistindo em: i) na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral a montante da zona de detecção e ii) na segunda zona de reagente do compressor da amostra; em que o compressor da amostra está em um plano diferente do da tira de teste cromatográfico de fluxo lateral e uma segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral; em que a primeira zona de reagente do compressor da amostra cria uma ponte sobre a primeira zona de desvio e a segunda zona de reagente do compressor da amostra cria uma ponte sobre a segunda zona de desvio, desviando o fluxo para o compressor de amostra e retornando o fluxo para a primeira tira de teste cromatográfico e as segundas tiras de teste cromatográficas no fim da primeira zona de desvio e a segunda zona de desvio; e c) analisar a amostra quanto à presença do nível de proteína C reativa, MxA, e o maior nível de proteína C reativa.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dispositivo de análise de amostra compreender ainda um primeiro parceiro de ligação de controle localizado em cada uma das primeira zona de reagente e da segunda zona reagente do compressor de amostra e um segundo parceiro de ligação de controle imobilizado em uma zona de controle de cada uma das primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral e das segundas tiras de teste cromatográfico de fluxo lateral, em que o primeiro parceiro de ligação de controle é um parceiro de ligação para o segundo parceiro de ligação de controle.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender a etapa de: a) recolha de uma amostra; b) transferência da amostra para um dispositivo de análise de amostra compreendendo: i) uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreendendo: uma primeira zona de reagente compreendendo pelo menos um primeiro reagente específico de um primeiro nível de proteína C reativa de tal modo que, quando a amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado se um baixo nível de proteína C reativa estiver presente na amostra; uma segunda zona de reagente compreendendo pelo menos um segundo reagente específico para MxA de tal modo que, quando a amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado se MxA está presente na amostra; e uma primeira zona de detecção compreendendo um primeiro parceiro de ligação o qual se liga ao primeiro complexo marcado; e um segundo parceiro de ligação o qual se liga ao segundo complexo marcado; e ii) uma segunda tira de teste de fluxo cromatográfico lateral paralela em uma direção de fluxo lateral a uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, compreendendo: pelo menos uma terceira zona de reagente compreendendo: pelo menos um terceiro reagente específico para um segundo nível de proteína C reativa, em que o terceiro reagente detecta somente um nível de proteína C reativa, que é mais alto que o nível de proteína C reativa detectado pelo primeiro reagente, de modo que, quando a amostra contata o terceiro reagente, forma-se um terceiro complexo marcado se o alto nível de proteína C reativa estiver presente na amostra; e uma zona de detecção compreendendo um terceiro parceiro de ligação que se liga ao terceiro complexo marcado; e c) analisar a amostra quanto à presença do baixo nível de proteína C reativa, MxA, e o alto nível de proteína C reativa.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por um limiar de concentração para se obter um resultado positivo para o baixo nível de proteína C reativa na zona de detecção da primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral é igual a ou superior a um equivalente de soro de 6-15 mg/l de proteína C reativa, e preferivelmente igual a ou superior a um equivalente de soro de aproximadamente 10 mg/l de proteína C reativa.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por um limiar de concentração para se obter um resultado positivo para o alto nível de proteína C reativa na zona de detecção da primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral ser igual a ou superior a um equivalente de soro de 60-100 mg/l, e preferivelmente igual ou superior a um equivalente de soro de aproximadamente 80 mg/l.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por um limiar de concentração para se obter um resultado positivo para MxA na zona de detecção da primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral ser igual a ou superior a 15-250 ng/ml, e preferivelmente igual a ou superior a aproximadamente de 40 ng/l.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pela etapa c) compreender as subetapas de: i) eluir a amostra no dispositivo de análise de amostra; e ii) determinar visualmente um resultado para a zona de detecção.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pela presença de MxA ser indicada por uma primeira linha de teste (202) localizada na zona de detecção da primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral e a presença do baixo nível da proteína C reativa ser indicada por uma segunda linha de teste (203) localizada na zona de detecção da primeira zona da tira de teste cromatográfico de fluxo lateral.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela primeira linha de teste apresentar uma primeira cor quando positiva e a segunda linha de teste exibir uma segunda cor diferente da primeira cor quando positiva, e em que opcionalmente tanto a primeira linha de teste como a segunda linha de teste são colocadas no mesmo espaço sobre o dispositivo de análise de amostra, de modo a que uma terceira cor seja formada quando tanto a primeira linha de teste como a segunda linha de teste são positivas.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela primeira linha de teste estar separada espacialmente da segunda linha de teste na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado por a amostra ser uma amostra de sangue ou a amostra conter leucócitos.

12. DISPOSITIVO DE FLUXO LATERAL PARA DETECÇÃO DE UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender: a) um compressor de amostra (870, 1070) compreendendo: i) uma primeira zona de reagente compreendendo, pelo menos, um primeiro reagente específico para uma proteína C reativa, de modo a que, quando a amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado se um baixo nível de proteína C reativa estiver presente na amostra e pelo menos um segundo reagente específico para MxA de modo a que, quando a amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado se MxA estiver presente na amostra; e ii) uma segunda zona de reagente compreendendo pelo menos um terceiro reagente específico para proteína C reativa, que detecta somente um nível de proteína C reativa, que é mais alto que o nível de proteína C reativa detectado pelo segundo reagente, de modo que, quando a amostra contata o terceiro reagente, forma-se um terceiro complexo marcado se o alto nível de proteína C reativa estiver presente na amostra; b) uma primeira tira de teste (815, 1215) cromatográfico de fluxo lateral compreendendo: i) uma primeira zona de detecção compreendendo um primeiro parceiro de ligação o qual se liga ao primeiro complexo marcado; e um segundo parceiro de ligação o qual se liga ao segundo complexo marcado; e ii) uma primeira zona de desvio (850) localizada a montante da primeira zona de detecção na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, em que a primeira zona de desvio interrompe o fluxo lateral na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral; e c) uma segunda tira de teste (825, 1225) cromatográfico de fluxo lateral paralela na direção do fluxo lateral à primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, compreendendo: i) uma segunda zona de detecção compreendendo um terceiro parceiro de ligação que se liga ao terceiro complexo marcado; e ii) uma segunda zona de desvio localizada a montante da primeira zona de detecção na tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, em que a segunda zona de desvio interrompe o fluxo lateral na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral; e d) uma primeira zona de aplicação da amostra (1273) onde a amostra é colocada no dispositivo de análise de amostra, em que a primeira zona de aplicação da amostra é colocada na localização selecionada do grupo consistindo em: i) na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral a montante da zona de detecção e ii) na primeira zona de reagente do compressor da amostra; e) uma segunda zona de aplicação da amostra (1276) onde a amostra é colocada no dispositivo de análise da amostra, onde a segunda zona de aplicação da amostra é colocada em uma localização selecionada do grupo consistindo em: i) na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral a montante da zona de detecção e ii) na segunda zona de reagente do compressor da amostra; em que o compressor da amostra está em um plano diferente do da tira de teste cromatográfico de fluxo lateral e uma segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral; em que a primeira zona de reagente do compressor da amostra cria uma ponte sobre a primeira zona de desvio e a segunda zona de reagente do compressor da amostra cria uma ponte sobre a segunda zona de desvio, desviando o fluxo para o compressor de amostra e retornando o fluxo para a primeira tira de teste cromatográfico e as segundas tiras de teste cromatográfico no fim da primeira zona de desvio e da segunda zona de desvio.

13. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo dispositivo de análise de amostra compreender ainda um primeiro parceiro de ligação de controle localizado em cada uma das primeiras zonas de reagente e a segunda zona de reagente do compressor da amostra e um segundo parceiro de ligação de controle imobilizado em uma zona de controle (204) de cada uma das primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral e da segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, onde o primeiro parceiro de ligação de controle é um parceiro de ligação ao segundo parceiro de ligação de controle.

14. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender: a) uma primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreendendo: uma primeira zona de reagente compreendendo pelo menos um primeiro reagente específico a proteína C reativa de tal modo que, quando quando a amostra contata o primeiro reagente, forma-se um primeiro complexo marcado se um baixo nível de proteína C reativa está presente na amostra; uma segunda zona de reagente compreendendo pelo menos um segundo reagente específico para MxA de tal modo que, quando a amostra contata o segundo reagente, forma-se um segundo complexo marcado se MxA está presente na amostra; e uma primeira zona de detecção compreendendo um primeiro parceiro de ligação o qual se liga ao primeiro complexo marcado; e um segundo parceiro de ligação o qual se liga ao segundo complexo marcado; e b) uma segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral paralela na direção de fluxo lateral à primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral, compreendendo: pelo menos uma terceira zona de reagente compreendendo pelo menos um terceiro reagente específico para proteína C reativa, em que o terceiro reagente somente detecta um nível de proteína C reativa, que é mais alto que o nível de proteína C reativa detectado pelo primeiro reagente, de modo a que, quando a amostra contata o terceiro reagente, forma-se um terceiro complexo marcado se o alto nível de proteína C reativa estiver presente na amostra; e uma segunda zona de detecção compreendendo um terceiro parceiro de ligação que se liga ao terceiro complexo marcado.

15. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pela primeira zona de detecção da primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreender a primeira linha de teste para detectar um resultado positivo para MxA na amostra e uma segunda linha de teste para detectar um resultado positivo para o baixo nível de proteína C reativa na amostra.

16. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela primeira linha de teste apresentar uma primeira cor quando positiva e a segunda linha de teste exibir uma segunda cor diferente da primeira cor quando positiva; e opcionalmente tanto a primeira linha de teste como a segunda linha de teste serem colocadas no mesmo espaço na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral de modo a que uma terceira cor seja formada quando tanto a primeira linha de teste, como a segunda linha de teste são positivas.

17. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela primeira linha de teste ser separada espacialmente da segunda linha de teste na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral.

18. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pela primeira zona de detecção e a segunda zona de detecção cada uma compreender uma linha de controle que é visível a olho nu quando o dispositivo está a funcionar.

19. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pela primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreender ainda uma primeira zona de aplicação da amostra a montante da primeira zona de reagente, a segunda zona de reagente, e a primeira zona de detecção é a jusante da primeira zona de reagente e da segunda zona de reagente.

20. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pela segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreender ainda uma segunda zona de aplicação da amostra a montante da terceira zona de reagente, e a segunda zona de detecção, e a segunda zona de detecção é a jusante da terceira zona de reagente.

21. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pela primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreender ainda uma zona de lise compreendendo pelo menos um agente de lise, em que o agente de lise contata a amostra na primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral.

22. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pela segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreender ainda uma zona de lise compreendendo pelo menos um agente de lise, em que o agente de lise contata a amostra na segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral.

23. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pela primeira tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreender ainda uma primeira zona de aplicação da amostra a jusante da primeira zona de reagente e a segunda zona de reagente, a montante da primeira zona de detecção.

24. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pela segunda tira de teste cromatográfico de fluxo lateral compreender ainda uma segunda zona de aplicação da amostra a jusante da terceira zona de reagente e a montante da segunda zona de detecção.