JP4233382B2 - 免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬 - Google Patents
免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4233382B2 JP4233382B2 JP2003143835A JP2003143835A JP4233382B2 JP 4233382 B2 JP4233382 B2 JP 4233382B2 JP 2003143835 A JP2003143835 A JP 2003143835A JP 2003143835 A JP2003143835 A JP 2003143835A JP 4233382 B2 JP4233382 B2 JP 4233382B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- particles
- antigen
- carrier particles
- sample
- optical information
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血液、尿、腹水などの検体に含まれる物質に対する抗原又は抗体を感作した担体粒子の粒子凝集を用いた免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用して、血液等の検体から特定の物質を検出する免疫測定方法が、臨床検査の分野で広く用いられている。そのような方法としては、ラジオイムノアッセイ（RIA）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、フルオロイムノアッセイ（FIA）、粒子凝集法、等の様々な方法が知られている。粒子凝集法では、測定対象物を含むと思われる検体と、測定対象物に対応する抗体又は抗原を感作した担体粒子とを混和する。検体中に測定対象物が存在すると、抗原抗体反応により担体粒子が凝集するので、その凝集を光学的に検出する。
【０００３】
免疫検査の検体は、全血から血球を除去した血清又は血漿が一般的に用いられているが、除去されなかった赤血球、脂肪粒子、細菌などの粒子が含まれていると、担体粒子凝集の光学的検出に影響を与える。また全血には大量の赤血球が含まれており、全血を検体として用いると、担体粒子凝集の光学的検出に影響を与える。しかし、緊急検査等では血球除去の工程が不要な、全血を検体として用いる測定が望まれている。
【０００４】
全血を用いることが可能な、粒子凝集法による免疫測定方法としては、赤血球と大きさの異なる担体粒子を用いたカウンティングイムノアッセイによる免疫測定方法がある（例えば、特許文献１を参照）。但しこの方法を用いる場合は、担体粒子を選択する際に、赤血球と大きさが重ならないものを選択する必要がある。
【０００５】
一方、免疫検査の測定項目として感染症、腫瘍関連物質、ホルモン等多様な項目が測定されている。免疫検査に用いられる自動分析装置は、検体を測定項目数に応じて複数の反応容器に分取して、各測定項目に応じた試薬をそれぞれ分注し、所定の反応処理をそれぞれ施し、各反応試料をそれぞれ測定するような多項目自動分析装置が一般的となっている。このような多項目自動分析装置は、多くの測定試薬のセット部や反応容器を備えなければならず、機器の大型化、複雑化が伴っていた。そして、検査に用いられる検体量も測定項目が増えるに応じて必要量が多くなり、患者負担の一因となっていた。そこで一つの試料から複数の項目を同時に測定するための免疫測定方法が望まれている。そのような免疫測定方法としては、複数種類の抗体のそれぞれを粒径の異なるラテックス等の担体に感作した試薬と、標識物質で標識した標識抗体と、検体とを、抗体感作担体−測定対象の抗原−標識抗体の免疫複合体となるように反応させ、粒子の粒径と標識物質の情報を求めて、標識情報のある粒子を粒径によって測定項目別に分析する方法がある（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
しかし、上記方法の反応過程で、各担体が一つずつ免疫複合体を形成するわけではなく、測定対象の抗原が複数の担体の抗体と反応して担体の凝集が起こる。またラテックス粒子は、その表面荷電の影響などにより凝集を起こす。いずれの原因であれ担体が凝集すると、その担体の見かけ上の粒径は大きくなり、粒径による測定項目の弁別ができなくなってしまう。また抗原を検出するための試薬として、抗原に対応する抗体を感作した担体粒子の他に、標識物質で標識した抗体が必要となる。
【０００７】
【特許文献１】
国際公開第０１／９６８６８号パンフレット
【特許文献２】
特公平５−８８４２３号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の解決課題は、粒子凝集法を用いた免疫測定において、検体中に測定対象物質以外の粒子が含まれていてもその影響を受けることなく、また使用する担体粒子を選択する際に、大きさの観点で自由度が高い免疫測定方法、装置、及び試薬を提供することである。
【０００９】
また本発明の解決課題は、一つの試料から複数の項目を同時に測定することができ、また標識抗体を必要とせずに測定できる免疫測定方法、装置、及び試薬を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み本発明は、測定対象物質及び測定対象物質以外の粒子を含む検体と、測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された担体粒子と、を混和して試料を調製する工程と、前記工程にて調製された試料中の粒子から第一の光学的情報及び第一の光学的情報とは異なる第二の光学的情報を検出する工程と、前記工程にて検出された第一の光学的情報に基づき、担体粒子と、検体中の測定対象物質以外の粒子と、を弁別し、第二の光学的情報に基づき、担体粒子の凝集度を求める工程と、前記工程にて求められた担体粒子の凝集度に基づき、測定対象物質を検出する工程と、を有する免疫測定方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、測定対象物質及び測定対象物質以外の粒子を含む検体と、測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された担体粒子と、を混和して調製された試料中の粒子から、第一の光学的情報及び第一の光学的情報とは異なる第二の光学的情報を検出する光検出部と、光検出部が検出した光学的情報を解析する解析部と、を有する免疫測定装置であり、解析部は、光検出部が検出した第一の光学的情報に基づき担体粒子と検体中の測定対象物以外の粒子とを弁別し、光検出部が検出した第二の光学的情報に基づき担体粒子の凝集度を求めることを特徴とする、免疫測定装置を提供する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明における免疫測定方法はいわゆる粒子凝集法を用いるものである。担体粒子には、粒子凝集法で一般的に用いられているもの、例えばラテックス粒子、ポリスチレン粒子、磁性粒子、ガラス粒子、デンドリマーなどを用いることができる。
【００２０】
担体粒子に感作する抗原又は抗体には、測定対象物質が抗体であれば該抗体と特異的に抗原抗体反応する抗原が用いられ、測定対象物質が抗原であれば該抗原と特異的に抗原抗体反応する抗体が用いられる。例えば測定項目がCEA抗原（癌胎児性抗原）であれば抗CEA抗体が感作さる。測定項目が抗HBs抗体であればHBs抗原が感作される。
【００２１】
本発明では、担体粒子から物理的特性を検出する。検出した物理特性に基づき、担体粒子と、検体中に含まれる測定対象物質以外の粒子とを弁別する。複数の測定対象物質を検出するために担体粒子を複数種類用いる場合、担体粒子から検出した物理特性により、各種類の担体粒子同士も弁別される。上記物理的特性としては、前方散乱光、側方散乱光、蛍光、吸光度、燐光、化学発光、生物発光などの光学的情報がある。このような光学的情報を検出する装置としては、いわゆるフローサイトメータを利用できる。この装置はフローセルに担体粒子を含む試料を流し、そこへレーザ光を照射して、担体粒子がレーザ光を横切る際に生じる蛍光や前方散乱光を、光電変換素子によって受光・光電変換し、各粒子から検出される蛍光強度や前方散乱光強度や側方散乱光強度といった光学的情報を検出する。また電圧を印加した細孔に粒子を通過させ、粒子が細孔を通過する際に生じる電圧の変化を、物理的特性として利用できる。本発明では、上記のような物理的特性を各粒子から複数検出し、それらを組み合わせて粒子の弁別や、凝集度の検出を行う。
【００２２】
複数の物理的特性として、複数の光学的情報を用いる場合、第一の光学的情報に基づき、担体粒子と検体中の他の粒子とを弁別する。担体粒子には、蛍光色素、色素、発光基質等が適宜含有される。そのため、第一の光学的情報として蛍光、吸光度、燐光、化学発光、生物発光等を用いることにより、担体粒子からは高い信号強度が生じる。検体中の赤血球、血小板、カイロミクロン等、測定対象物質以外の粒子は、蛍光、吸光度、燐光、化学発光、生物発光等の強度が低いので、第一の光学的情報によって担体粒子と弁別される。このように本発明では、粒子の大きさを反映した物理特性を用いずに、粒子の弁別を行うため、担体粒子の大きさを選択する際、制限が少ないというメリットがある。例えば、血小板を含む検体を用いて免疫測定する際に、血小板と同程度の大きさの担体粒子を用いても、担体粒子から検出される蛍光等の物理特性により担体粒子と血小板を弁別することができる。このとき、担体粒子自体の物理的特性を検出するため、別途標識抗体等を用いる必要がない。
【００２３】
第二の光学的情報は、担体粒子の凝集度検出に用いる。担体粒子の凝集度とは、抗原抗体反応に基づく粒子凝集の度合いをいう。第二の光学的情報として、担体粒子の見かけ上の大きさを反映するような情報、例えば前方散乱光を用いれば、未凝集の担体粒子や凝集した担体粒子の識別ができ、担体粒子の凝集度を求められる。なお、担体粒子としてラテックス粒子のような均一な球形粒子を用いれば、側方散乱光も同様に担体粒子の大きさを反映する情報として用いることができる。この凝集度としては、以下の方法で求めた凝集率を用いることができる。フローサイトメータで粒子それぞれの散乱光強度を求める。
それぞれの粒子の散乱光強度によって、未凝集の単独粒子と、複数の担体粒子が凝集して生じた凝集粒子とを弁別して、単独粒子数(M)と凝集粒子数（P）を計数する。
MとPの合計である総粒子数（T）を得、P/Tを凝集率として算出する。
【００２４】
この方法では２個の担体粒子が凝集した段階で反応を捉えることができるため、非常に高感度な免疫測定が可能となる。この凝集度測定は測定対象物質の測定濃度範囲に応じて、各種の方法、例えば一定数以上凝集した粒子の度合いを測定する方法などを用いることができる。
【００２５】
本発明の測定例であるスキャッタグラムの一例を図１に示す。担体粒子として蛍光色素を含有させたラテックス粒子を血液検体に混和して試料液とした。フローサイトメータを用い、試料液から蛍光強度と前方散乱光強度を光学的情報として検出した。検出した光学的情報のうち、蛍光強度を縦軸に、前方散乱光強度を横軸にとって図１のスキャッタグラムを作成した。担体粒子は、未凝集の単独粒子１１、二個の担体粒子が凝集して生じた二個凝集粒子１２、三個の担体粒子が凝集して生じた三個凝集粒子１３というように、凝集の仕方によって前方散乱光強度が異なり、それぞれの集団に分離してスキャッタグラムに出現する。検体中の測定対象物質以外の粒子として、カイロミクロン１４、赤血球１５が出現するが、いずれも蛍光強度が低く、担体粒子と弁別することができる。
【００２６】
各担体粒子を囲むようにスキャッタグラム上で領域を設定し、設定した領域Ｇ１内に出現している担体粒子の粒度分布の例を、図２のヒストグラムに示す。縦軸に粒子の個数（度数）を、横軸に前方散乱光強度をとっている。前方散乱光強度について閾値を設定することにより、凝集粒子と単独粒子を弁別することができる。
【００２７】
また本発明では、第一の光学的情報に基づき、第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別する。第一の担体粒子と第二の担体粒子とには蛍光色素、色素、発光基質等を含有させるが、その種類や含有濃度を適宜選択し、第一の担体粒子と第二の担体粒子が区別されるようにする。第一の光学的情報として蛍光、吸光度、燐光、化学発光、生物発光等を用いることにより、第一の担体粒子と第二の担体粒子とが弁別される。
【００２８】
本発明の測定例であるスキャッタグラムの一例を図３に示す。蛍光色素を異なる濃度含有させた二種類のラテックス粒子を用い、それぞれ第一の担体粒子、第二の担体粒子とした。第一の担体粒子と第二の担体粒子とを検体に同時に反応させて試料液とし、フローサイトメータで蛍光強度と前方散乱光強度を光学的情報として検出した。検出した光学的情報のうち、蛍光強度を縦軸に、前方散乱光強度を横軸にとって図３のスキャッタグラムを作成した。
【００２９】
第一の担体粒子（３１、３２、３３）と第二の担体粒子（３４、３５、３６）は、含有する蛍光色素濃度の違いにより異なる蛍光強度を示し、スキャッタグラム上で異なる位置に出現する。このため、第一の担体粒子と第二の担体粒子をスキャッタグラム上で弁別することが可能である。また各担体粒子においては、未凝集の単独粒子、二個の担体粒子が凝集して生じた二個凝集粒子、三個の担体粒子が凝集して生じた三個凝集粒子が、前方散乱光強度の違いによりスキャッタグラム上の異なる位置にそれぞれ集団となって出現する。図中、第一の担体粒子の単独粒子３１、第一の担体粒子の二個凝集粒子３２、第一の担体粒子の三個凝集粒子３３は、前方散乱光強度の違いからそれぞれの集団に分離して出現する。同様に、第二の担体粒子の単独粒子３４、第二の担体粒子の二個凝集粒子３５、第二の担体粒子の三個凝集粒子３６も、前方散乱光強度の違いからそれぞれの集団に分離して出現する。
【００３０】
ここで第一・第二の担体粒子それぞれを囲むようにスキャッタグラム上で領域を設定し、各領域内に出現した担体粒子の粒度分布を表わすヒストグラムを作成する。図４は、第一の担体粒子の領域Ｇ３１内に出現した担体粒子の前方散乱光強度をもとに作成したヒストグラムの一例であり、縦軸に度数（粒子の個数）を、横軸に前方散乱光強度をとったものである。前方散乱光強度について閾値を設定することにより、凝集粒子と単独粒子を弁別することができる。
【００３１】
以下、本発明の実施例につき説明する。しかし本発明がこの実施例に限定されるわけではない。
【００３２】
担体粒子としては、レーザ光で励起可能な蛍光色素を所定濃度含有させたラテックス粒子（以下、「蛍光ラテックス粒子」という）を用いた。そして、担体粒子に、検出対象物質である抗原（又は抗体）に対応する抗体（又は抗原）を感作して、蛍光ラテックス試薬とした。測定対象物質である抗原（又は抗体）を含有する検体と、蛍光ラテックス試薬と、反応緩衝液を混合して測定用の試料液を調製し、試料液から前方散乱光及び蛍光を検出した。そして検出した前方散乱光信号及び蛍光信号をパラメータとした二次元スキャッタグラムを作成し、解析することで検体中の測定対象物質を検出した。
【００３３】
１．装置
本実施例では、市販のフローサイトメータであるFACSCalibur（ベクトン・ディッキンソン社製）と、本発明者が作製した自動免疫測定装置を使用した。FACSCaliburを使用する際は、予め手作業で検体と試薬を混合・インキュベートして試料液を調製する必要がある。調製した試料液をセットして測定動作を実行すると、試料液から前方散乱光及び蛍光の検出、二次元スキャッタグラムの作成を行う。一方、本発明者が作製した自動免疫測定装置は、自動的に試料液を調製する機能を有しており、試料液の調製から前方散乱光及び蛍光の検出、二次元スキャッタグラムの作成、解析に至る工程を自動的に行う。
【００３４】
本発明者が作製した自動免疫測定装置について説明する。この装置は一つの検体に対し４項目の免疫測定を同時に行うものであり、装置上で用いられる蛍光ラテックス試薬は、測定項目に応じた４種類の蛍光ラテックス粒子を含んでいる。４種類の蛍光ラテックス粒子は、種類毎に互いに異なった濃度の蛍光色素を含有し、また種類毎に測定項目に応じた抗体（又は抗原）が感作してある。この蛍光ラテックス試薬の詳細は後述する。図５は自動免疫測定装置１００の外観を示したものである。装置の前面には、各種設定入力を行ったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１０１、後述する試料調製部２００を覆うカバー１０２、スタートスイッチ１０３を備えている。図６は自動免疫測定装置１００の内部構成を示したものである。装置の右側のスペースには、装置の動作や解析処理を司る制御部４００が備えられている。装置の左下のスペースには、試料液から信号を検出するための光検出部３００が備えられている。また残りのスペースに、試料液を調製するための試料調製部２００が備えられている。
【００３５】
以下、試料調製部２００、光検出部３００、制御部４００の各部について説明する。
試料調製部２００の構成
図７は試料調製部２００を示す説明図である。試料調製部２００は、手前右側に検体セット部２２１、手前左側に試薬セット部２２２、奥側にインキュベータ２２３、を備えている。また上下左右に移動可能な分注装置２２４を備えている。前記図６のカバー１０２を開けることにより、図７に示した試料調製部２００が現れ、操作者は以下に説明する各種容器をセットするよう構成されている。検体セット部２２１には、検体の入った検体容器２２５を、インキュベータ２２３に反応容器２２６をセットするよう構成されている。また試薬セット部２２２には、蛍光ラテックス試薬の入った試薬容器２２７、反応緩衝液が入った試薬容器２３１をセットするよう構成されている。インキュベータ２２３は、セットされた反応容器２２６の中の液体を、所定の温度に保ちながら振盪撹拌するよう構成されている。分注装置２２４は、その先端から所定量の液体を吸引・吐出するようになっており、また図示しない駆動装置によって上下左右に移動可能に構成されている。試料容器２３３は、後述する光検出部３００のフローセル３０１と接続されている。
【００３６】
光検出部３００の構成
図８は光検出部３００の構成を示す説明図である。光検出部３００は、試料液を流すためのフローセル３０１を有する。フローセル３０１は、レーザ光が照射される部分であり内部流路が細く絞られているオリフィス部３０２、試料液をオリフィス部に向かって上方へ噴射するノズル３０３、シース液供給口３０４、排液口３０５を有する。また光検出部３００は、レーザ光を照射するためのレーザ光源３０６（波長６３５ｎｍのレーザ光を出射する赤色半導体レーザ光源である）、レーザ光源から照射されたレーザ光をシースフローセルへ集光するコンデンサレンズ３０７、粒子が発する前方散乱光を受光して電気信号に変換するフォトダイオード３０８、フォトダイオードへ前方散乱光を集光するためのコレクタレンズ３０９とピンホール３１０、蛍光を受光して電気信号に変換するフォトマルチプライヤチューブ３１１、フォトマルチプライヤチューブへ蛍光を集光するためのコレクタレンズ３１２、フィルタ３１３、ピンホール３１４、フォトダイオード３０８やフォトマルチプライヤチューブ３１１から出力された電気信号を増幅して制御部４００へ出力するアンプ３１５、３１６を有する。
【００３７】
制御部４００の構成
図９は制御部４００の構成、及び制御部４００と装置各部との関係を示すブロック図である。制御部４００は、中央演算装置（ＣＰＵ）やＲＯＭ・ＲＡＭ等の記憶装置を有するマイクロコンピュータ、光検出部３００から送られた信号を処理する回路などを有する。制御部４００は、格納部４４１、解析部４４２、動作制御部４４３としての機能を果たす。格納部４４１は、試料中の粒子から得た信号の解析に関する解析プログラムや、装置各部の動作を制御する制御プログラムを格納している。また光検出部３００で検出された信号のデータや、解析プログラムによる処理結果を記憶する。解析部４４２は、試料液を測定して光検出部３００で検出された信号を処理し、処理後の信号を解析する。解析部４４２での解析結果は、液晶タッチパネル１０１に出力される。動作制御部４４３は、格納部４４１に格納されている制御プログラムに基づき、装置各部の動作を制御する。
【００３８】
装置の動作
図１０は、制御プログラムによる自動免疫測定装置１００の全体制御を示すフローチャートである。操作者がスタートスイッチ１０３を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＳ１（試料調製部制御）、ステップＳ２（光検出部制御）、ステップＳ３（解析部制御）が順次実行される。これにより、試料調製部２００、光検出部３００、解析部４４２が制御され、自動免疫測定装置１００の一連の動作が自動的に行われる。上記ステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３による装置各部の動作を以下に説明する。
【００３９】
ステップＳ１（試料調製部制御）
試料調製部制御による試料調製部２００の動作を、図７を用いて説明する。まず分注装置２２４が、試薬セット部２２２の試薬容器２３１から反応緩衝液を８０μＬ吸引し、次に検体セット部２２１にセットされている検体容器２２５から検体を１０μＬ吸引する。そして吸引した反応緩衝液と検体を、インキュベータ２２３にセットされている反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は、試薬セット部２２２の試薬容器２２７から蛍光ラテックス試薬を１０μＬ吸引し、反応容器２２６に分注する。この後インキュベータ２２３が、検体・蛍光ラテックス試薬・反応緩衝液が入った反応容器２２６を、温度４５℃に保ちながら１５分間振盪撹拌することでインキュベートし、試料液を調製する。インキュベート後の試料液を分注装置２２４が吸引し、試料容器２３３に分注する。ここで試料容器２３３には予め希釈液が入っており、分注された試料液が５１倍に希釈される。試料容器２３３中で希釈された試料液は、光検出部３００のフローセル３０１に流される。
【００４０】
ステップＳ２（光検出部制御）
光検出部制御による光検出部３００の動作を、図８を用いて説明する。前記の通り試料容器２３３に試料液が供給されると、図示しないポンプやバルブの動作により試料液がノズル３０３へ導かれる。そして試料液がノズル３０３からフローセル３０１に吐出される。それと同時にシース液が、図示しないシース液容器からシース液供給口３０４を介してフローセル３０１に供給される。これによって試料液は、フローセル３０１内でシース液に包まれ、更にオリフィス部３０２で細く絞られて流れる。試料液の流れを、粒子径と同程度まで絞り込むことにより、試料液に含まれた粒子を一列に整列させてオリフィス部３０２に流すことができる。オリフィス部３０２を流れる試料液に対し、レーザ光源３０６から出射されたレーザ光がコンデンサレンズ３０７で絞られて照射される。レーザ光を受けた試料液中の粒子から発せられた前方散乱光はコレクタレンズ３０９により集光される。そしてピンホール３１０を通過した前方散乱光は、フォトダイオード３０８で受光、光電変換されて前方散乱光信号となる。レーザ光を受けた試料液中の粒子から発せられた蛍光は、コレクタレンズ３１２により集光される。そしてフィルタ３１３、ピンホール３１４を通過した蛍光は、フォトマルチプライヤチューブ３１１で受光、光電変換されて蛍光信号となる。前方散乱光信号及び蛍光信号は、それぞれアンプ３１５・３１６で増幅された後に制御部４００へ送られ、粒子毎のデータとして格納部４４１に記憶される。
【００４１】
ステップＳ３（解析部制御）
解析部制御の詳細について、図１１のフローチャートを用いて説明する。フローチャートの各ステップは以下の通りである。
【００４２】
ステップＳ１１：前方散乱光信号及び蛍光信号のデータを、格納部４４１から読み出す。続いてステップＳ１２へ進む。
ステップＳ１２：前方散乱光信号のピークレベルに基づき前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を、蛍光信号のピークレベルに基づき蛍光強度（Ｆｌ）を、各粒子毎に算出する。続いてステップＳ１３へ進む。
ステップＳ１３：ステップＳ１２で算出した粒子毎のＦｓｃ・Ｆｌをパラメータとした二次元スキャッタグラムを作成する。このスキャッタグラムには、測定項目に応じた４種類の蛍光ラテックス粒子がそれぞれ出現すると目される領域が予め設定されている。
ステップＳ１４：二次元スキャッタグラム上に予め設定されていた各領域内に出現した粒子のヒストグラムを作成し、粒度分布を得る。続いてステップＳ１５へ進む。
ステップＳ１５：粒度分布に基づき、各領域内の単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、各領域内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出する。続いてステップＳ１６へ進む。
ステップＳ１６：前記作成された二次元スキャッタグラム、各領域のヒストグラム及び算出した凝集率Ｐ／Ｔを液晶タッチパネル１０１に出力して表示する。
【００４３】
図１２は、ステップＳ１３で作成されたスキャッタグラム、ステップＳ１４で作成されたヒストグラム、ステップＳ１５で算出された凝集率Ｐ／Ｔを含む画面が、ステップＳ１６で液晶タッチパネル１０１に出力された様子を示す図である。この画面では二次元スキャッタグラムＳｃ１、Ｓｃ２が上下に２つ表示されている。これらは同じ検体から得た同じ測定結果を、表示方法を変えて出力したものである。いずれも横軸に前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を、縦軸に蛍光強度（Ｆｌ）をとっているが、二次元スキャッタグラムＳｃ２は、二次元スキャッタグラムＳｃ１の縦軸の値（蛍光強度（Ｆｌ））をlog変換して表示したものであるため、蛍光強度（Ｆｌ）の低値部分が高値部分と比べ相対的に拡大されて表示される。そこで蛍光ラテックス試薬に含まれる４種類の蛍光ラテックス粒子のうち、含有する蛍光色素の濃度が高い方の２種類の蛍光ラテックス粒子については、画面の上の方に表示した二次元スキャッタグラムＳｃ１に、各粒子の出現する領域が設定され、表示されている（領域▲１▼・領域▲２▼）。また含有する蛍光色素の濃度が低い方の２種類の蛍光ラテックス粒子については、画面の下の方に表示した二次元スキャッタグラムＳｃ２に、各粒子の出現する領域が設定され、表示されている（領域▲３▼・領域▲４▼）。領域▲１▼は４種類のうち最も蛍光色素の濃度が高い蛍光ラテックス粒子が出現する領域である。領域▲２▼は４種類のうち二番目に蛍光色素の濃度が高い蛍光ラテックス粒子が出現する領域である。領域▲３▼は４種類のうち三番目に蛍光色素の濃度が高い蛍光ラテックス粒子が出現する領域である。領域▲４▼は４種類のうち最も蛍光色素の濃度が低い蛍光ラテックス粒子が出現する領域である。また画面上には、▲１▼〜▲４▼の領域に対応するヒストグラム▲１▼〜▲４▼、及び算出された凝集率が表示されている。
【００４４】
２．試薬の調製
以下、Facscalibur及び自動免疫測定装置１００での免疫測定に用いた試薬として、蛍光ラテックス試薬、反応緩衝液、希釈液につき説明する。
【００４５】
蛍光ラテックス試薬
粒子径0.78μmで粒子表面がスルフェートのラテックス粒子に、赤色蛍光色素（波長640nmのレーザ光で励起可能）を所定濃度含有させた蛍光ラテックス粒子を担体粒子として用いた。そして担体粒子に、検出対象物質である抗原（又は抗体）に対応する抗体（又は抗原）を感作した。ここでは抗HBs抗体、TP抗原、抗CEA抗体、抗AFP抗体、HCV抗原、HIV抗原、抗FRN抗体、抗PSA抗体を、それぞれ異なった蛍光ラテックス粒子に疎水結合によって感作し、そそれらを単独又は一液中に混合させて組み合わせて各種蛍光ラテックス試薬を調製した。各蛍光ラテックス試薬の調製は以下の（１）〜（８）の通りに行った。
【００４６】
（１）HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製
HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬は、抗HBs抗体を蛍光色素濃度1％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まず抗HBs抗体（マウスモノクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1%(w/v) 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2）1mLを加えて、超音波処理し、分散させた。これをHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬とした。
【００４７】
（２）抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬の調製
抗TP抗体を検出するための蛍光ラテックス試薬は、TP抗原を蛍光色素濃度0.1％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まずTP抗原（市販品）50μgを含む10mM PBS、pH4.0 950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、4℃で24時間静置した。これを10000×g、10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1mg/mL 牛血清アルブミンを含む0.1M PBS緩衝液、pH7.0を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に1mg/mL 牛血清アルブミンを含む0.1M PBS緩衝液、pH7.0を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。これを抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬とした。
【００４８】
（３）AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製
AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬は、蛍光色素濃度0.01％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に抗AFP抗体を感作して調製した。まず、抗AFP抗体（ヤギポリクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、 pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1%(w/v) 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2） 1mLを加えて、超音波処理し、分散させた。これをAFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬とした。
【００４９】
（４）CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製
CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬は、抗CEA抗体を蛍光色素濃度0.001％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。抗CEA抗体（ウサギポリクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、 pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1% 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2）1mLを加えて、超音波処理し、分散させた。これをCEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬とした。
【００５０】
（５）感染症マーカー４項目同時測定用試薬の調製
HBs抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、抗TP抗体検出用の蛍光ラテックス粒子、抗HCV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子、抗HIV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子を調製し、それらを一液中に混合してHBs抗原、抗TP抗体、抗HCV抗体、抗HIV抗体を同時に検出するための蛍光ラテックス試薬を調製した。
【００５１】
HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬、及び抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬は、前記（１）、及び（２）で調製したものを用いた。
【００５２】
抗HCV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子は、HCV抗原を蛍光色素濃度3％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まずHCV 非構造領域のNS3由来のウイルス蛋白に相当する2種のリコンビナント抗原、NS4を含む由来のウイルス蛋白に相当する2種の合成ペプチド抗原、及びNS5由来のウイルス蛋白に相当する1種の合成ペプチド抗原、並びに構造領域のcore由来のウイルス蛋白に相当する3種の合成ペプチド抗原、の8種類の複合抗原を含む10mMグリシン緩衝液（pH2.0）950μLに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、37℃で1時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に2% 牛血清アルブミン（市販品）を含む1.2%(w/v)Tris緩衝液（pH8.0）を1mL加えて、超音波処理し、分散させ、45℃で2時間インキュベートしてブロッキング作業を行った。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含む1.2%(w/v)Tris緩衝液（pH8.0）1mLを加えて、超音波処理し、液中に抗HCV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子を分散させた。
【００５３】
抗HIV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子は、HIV抗原を蛍光色素濃度5％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まずHIV-1 gag(group specific antigen)領域抗原、HIV-1 env(envelope)領域抗原、HIV-1 pol(polymerase)領域抗原及びHIV-2 env(env)領域抗原を含む10mMグリシン緩衝液（pH2.0）950μLに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、37℃で1時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に2% 牛血清アルブミン（市販品）を含む1.2%(w/v)Tris緩衝液（pH8.0）を1mL加えて、超音波処理し、分散させ、45℃で2時間インキュベートしてブロッキング作業を行った。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含む1.2%(w/v)Tris緩衝液（pH8.0）1mLを加えて、超音波処理し、液中に抗HIV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子を分散させた。
【００５４】
上記調製した抗HCV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子が分散した液、抗HIV抗体検出用の蛍光ラテックス試薬が分散した液、及び前記調製したHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬と抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬を等量ずつ混合し、感染症マーカー４項目同時測定用蛍光ラテックス試薬とした。
【００５５】
（６）腫瘍マーカー４項目同時測定用試薬の調製
FRN抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、CEA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、AFP抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、PSA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子を調製し、それらを一液中に混合することにより、FRN抗原、CEA抗原、AFP抗原、PSA抗原を同時に検出するための蛍光ラテックス試薬を調製した。
【００５６】
FRN抗原検出用の蛍光ラテックス粒子は、抗FRN抗体を蛍光色素濃度0.1％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まず、抗FRN抗体（ヤギポリクローナル抗体、市販品）50μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、 pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1%(w/v) 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2） 1mLを加えて、超音波処理し、液中にFRN抗原検出用の蛍光ラテックス粒子を分散させた。
【００５７】
CEA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子は、蛍光色素濃度1％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に、抗CEA抗体を前記（４）のCEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製と同様の手順にて感作し、調製した。
【００５８】
AFP抗原検出用の蛍光ラテックス粒子は、蛍光色素濃度3％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に、抗AFP抗体を前記（３）のAFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製と同様の手順にて感作し、調製した。
【００５９】
PSA抗原検出用の蛍光ラテックス試薬は、抗PSA抗体を蛍光色素濃度5％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まず、抗PSA抗体（ウサギポリクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、 pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1% 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2）1mLを加えて、超音波処理し、液中にPSA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子を分散させた。
【００６０】
上記調製したFRN抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、CEA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、AFP抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、PSA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子がそれぞれ分散した液を等量ずつ混合し、腫瘍マーカー４項目同時測定用蛍光ラテックス試薬とした。
【００６１】
反応緩衝液
反応緩衝液は以下の通り調製した。1.6mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、1.1mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、18.18mg/mL トリス、5%(w/v) 牛血清アルブミン、0.6%(w/v) デキストラン（市販品）、15％(w/v)加熱処理牛血清アルブミン、40％(w/v)ペプシン処理牛血清アルブミン、0.4％(w/v)PVA(市販品) 0.15％（w/v）塩化ナトリウム、0.045％(w/v)アジ化ナトリウム、pH6.0を調製し、蛍光ラテックス試薬と共に測定対象となる検体へ添加するための反応緩衝液とした。
【００６２】
希釈液
自動免疫測定装置１００では、測定に先立ち試料容器２３３に希釈液を所定量入れておく。前記の通り検体を蛍光ラテックス試薬、反応緩衝液と混和・インキュベートして調製した試料液は、試料容器２３３に入れられることによって所定濃度に希釈される。この希釈液としてはクリンシース（シスメックス株式会社製）を用いた。
【００６３】
３．単項目測定
一種類の測定項目に対応した蛍光ラテックス試薬を用い、Facscaliburにて測定した結果を示す。なお、測定対象とした検体は以下の通り調製した。
【００６４】
検体
ヒト正常全血、及びヒト正常全血にHBs抗原を6段階の濃度別に添加したもの、を調製し、HBs抗原含有検体系列（HBs▲１▼〜HBs▲７▼）とした。HBs抗原含有検体系列における各検体中のHBs抗原濃度は以下の通りである。
HBs▲１▼：０U/mL、HBs▲２▼：１U/mL、HBs▲３▼：３U/mL、HBs▲４▼：９U/mL、HBs▲５▼：２７U/mL、HBs▲６▼：８１U/mL、HBs▲７▼：２４３U/mL。
【００６５】
またヒト正常全血、及びヒト正常全血に抗TP抗体を6段階の濃度別に添加したもの、を調製し、抗TP抗体含有検体系列（TP▲１▼〜TP▲７▼）とした。抗TP抗体含有検体系列における各検体中の抗TP抗体濃度は以下の通りである。
TP▲１▼：０mIU、TP▲２▼：１６.５ mIU、TP▲３▼：４１.２mIU、TP▲４▼：１０３.１mIU、TP▲５▼：２５７.６mIU、TP▲６▼：６４４mIU、TP▲７▼：１６１０mIU。
【００６６】
またヒト正常全血、及びヒト正常全血にAFP抗原を6段階の濃度別に添加したもの、を調製し、AFP抗原含有検体系列（AFP▲１▼〜AFP▲７▼）とした。AFP抗原含有検体系列における各検体中のAFP抗原濃度は以下の通りである。
AFP▲１▼：０ng/mL、AFP▲２▼：２ng/mL、AFP▲３▼：８ng/mL、AFP▲４▼：３２ng/mL、AFP▲５▼：１２８ng/mL、AFP▲６▼：５１２ng/mL、AFP▲７▼：２０４８ng/mL。
【００６７】
またヒト正常全血、及びヒト正常全血にCEA抗原を6段階の濃度別に添加したもの、を調製し、CEA抗原含有検体系列（CEA▲１▼〜CEA▲７▼）とした。CEA抗原含有検体系列における各検体中のCEA抗原濃度は以下の通りである。
CEA▲１▼：０ng/mL、CEA▲２▼：０.５ng/mL、CEA▲３▼：２ng/mL、CEA▲４▼：８ng/mL、CEA▲５▼：３２ng/mL、CEA▲６▼：１２８ng/mL、CEA▲７▼：５１２ng/mL。
【００６８】
またヒト正常全血に対し、HBs抗原、抗TP抗体、AFP抗原、CEA抗原の4種類の抗原又は抗体をいずれも前記各検体系列の▲４▼と同一濃度となるように調製した検体Ｓ１（つまり検体Ｓ１は、HBs抗原を９U/mL、抗TP抗体を１０３.１mIU、AFP抗原を３２ng/mL、CEA抗原を８ng/mL含有している）と、▲７▼と同一濃度となるように調製した検体Ｓ２（つまり検体Ｓ２は、HBs抗原を２４３U/mL、抗TP抗体を１６１０mIU、AFP抗原を２０４８ng/mL、CEA抗原を５１２ng/mL含有している）を用意した。
【００６９】
測定
上記調製した全28検体（それぞれ40μL）に、それぞれの検体系列に含まれる測定対象物質に対応する蛍光ラテックス試薬10μLと反応緩衝液350μLを45℃で15分間インキュベートした後、10mM PBS緩衝液で51倍に希釈して、測定用試料を全28試料調製した。調製した各試料液を、Facscaliburにセットし、測定した。
【００７０】
FACSCaliburは赤色半導体レーザ光源から波長635nmのレーザを照射し、蛍光ラテックス試薬を含む試料から前方散乱光信号及び側方蛍光信号を検出する機能を有するフローサイトメータである。図１３は、FACSCaliburの検出系を示す模式図である。担体粒子５１を含む試料はフローセル５２に導びかれ、試料流５３を形成する。赤色半導体レーザ光源５４から発せられたレーザ光はフローセル５２中の試料流５３を照射する。そして担体粒子５１がレーザ光の照射領域を横切る際に生じる蛍光はフォトマルチプライヤチューブ５５に、前方散乱光はフォトダイオード５６によってそれぞれ受光・光電変換されて電気信号となり、処理・解析される。このようにして各粒子から蛍光信号や前方散乱光信号が検出され、電気信号処理が行われる。
【００７１】
解析
各試料から検出した前方散乱光信号及び蛍光信号をパラメータとする二次元スキャッタグラムを作成した。図１４は、HBs抗原含有検体であるHBs▲４▼にHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬を添加した試料を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、縦軸は蛍光強度を、横軸は前方散乱光強度を表わす。前方散乱光強度の違いから、未凝集の単独粒子、二個凝集粒子、三個凝集粒子がそれぞれスキャッタグラム上で集団に分かれて出現している。検体に含まれる血小板は、蛍光強度をほとんど有さないため、出現位置が横軸と重なるほど蛍光強度が低値な位置となり、図１４のスキャッタグラムにおいては明確な集団として表示されなかった。検体中の赤血球も蛍光強度をほとんど有さない。また赤血球は担体粒子の三個凝集粒子より大きい。そのため、図１４のスキャッタグラムにおいては表示範囲からスケールアウトしている。
【００７２】
スキャッタグラム上に出現した担体粒子の各集団を囲むように領域Ｇ６を設定し、領域Ｇ６内の粒子の粒度分布を得た。図１５は、図１４の領域Ｇ６に対応するヒストグラムであり、縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。このヒストグラムに基づき、単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、領域Ｇ６内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出した。同様に、HBs抗原含有検体系列の他の濃度の検体を用いて調製した試料、及び他の種類の検体系列の各検体を用いて調製した各試料についても凝集率を得た。
【００７３】
HBs抗原含有検体系列（HBs▲１▼〜▲７▼）の各検体を用いて調製した試料を測定して得たHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
【００７５】
また抗TP抗体含有検体系列（TP▲１▼〜▲７▼）の各検体を用いて調製した試料を測定して得た抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表２に示す。
【００７６】
【表２】
【００７７】
またAFP抗原含有検体系列（AFP▲１▼〜▲７▼）の各検体を用いて調製した試料を測定して得たAFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表３に示す。
【００７８】
【表３】
【００７９】
またCEA抗原含有検体系列（CEA▲１▼〜▲７▼）の各検体を用いて調製した試料を測定して得たCEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表４に示す。
【００８０】
【表４】
【００８１】
上記測定結果よりわかるように、各測定項目において蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、試料に含まれる抗原（抗体）の濃度に依存して上昇している。また各測定項目においても、抗原（抗体）が含まれていない検体と抗原（抗体）が含まれている検体とで凝集率の差が得られた。これらのことより、各測定項目において凝集率より検量線を作成し、その検量線に基づき濃度換算することで、各免疫項目の抗原（抗体）濃度を得ることができるといえる。
【００８２】
４．多項目同時測定
一つの検体に対し複数種類の蛍光ラテックス試薬を用い、Facscaliburにて測定した結果を示す。なお、測定対象とした検体は以下の通り調製した。
【００８３】
検体
検体には、前記単項目測定と同様、HBs抗原含有検体HBs▲１▼〜HBs▲７▼、抗TP抗体含有検体TP▲１▼〜TP▲７▼、AFP抗原含有検体AFP▲１▼〜AFP▲７▼、CEA抗原含有検体CEA▲１▼〜CEA▲７▼、の全28検体を用いた。また、ヒト正常全血に対し、HBs抗原、抗TP抗体、AFP抗原、CEA抗原の4種類の抗原又は抗体をいずれも前記各検体系列の▲４▼と同一濃度となるように調製した検体Ｓ１（つまり検体Ｓ１は、HBs抗原を９U/mL、抗TP抗体を１０３.１mIU、AFP抗原を３２ng/mL、CEA抗原を８ng/mL含有している）と、▲７▼と同一濃度となるように調製した検体Ｓ２（つまり検体Ｓ２は、HBs抗原を２４３U/mL、抗TP抗体を１６１０mIU、AFP抗原を２０４８ng/mL、CEA抗原を５１２ng/mL含有している）を用いた。
【００８４】
測定
各検体40μLに対し、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬・抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬をそれぞれ10μLずつ（計40μLの蛍光ラテックス試薬）と反応緩衝液320μLを45℃で15分間インキュベーションした後、10mM PBS緩衝液で51倍に希釈して測定用試料とした。測定用試料から、前記同様、Facscaliburを用いて、蛍光強度・前方散乱光強度を得、スキャッタグラムを作成した。
【００８５】
解析
図１６は、HBs抗原含有検体であるHBs▲４▼に、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬・抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の４種類の蛍光ラテックス試薬を添加して調製した試料を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、縦軸は蛍光強度を、横軸は前方散乱光強度を表わす。蛍光強度の違いから、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬・抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の４種類の蛍光ラテックス試薬の粒子が縦軸方向に分離して現れている。ここでHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の単独粒子、二個凝集粒子、三個凝集粒子の集団を含むように領域Ｇ８１を設定し、領域Ｇ８１内の粒子の粒度分布を得る。同様に抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の各蛍光ラテックス試薬に関しても、それぞれ領域Ｇ８２・Ｇ８３・Ｇ８４を設定し、各領域内の粒子のヒストグラムを作成して粒度分布を得た。そこから単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、各領域内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出した。
【００８６】
図１７は検体Ｓ１に蛍光ラテックス試薬４種類を添加して調製した試料を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、縦軸は蛍光強度を、横軸は前方散乱光強度を表わす。蛍光強度の違いから、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬・抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の４種類の蛍光ラテックス試薬の粒子が縦軸方向に分離して現れ、また各蛍光ラテックス試薬においては前方散乱光強度の違いから未凝集の単独粒子、二個凝集粒子、三個凝集粒子が分離して集団を作り、スキャッタグラム上に出現している。ここでHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の単独粒子、二個凝集粒子、三個凝集粒子の集団を含むように領域Ｇ９１を設定し、領域Ｇ９１内の粒子の粒度分布を得る。同様に抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の各蛍光ラテックス試薬に関しても、それぞれ領域Ｇ９２・Ｇ９３・Ｇ９４を設定し、各領域内の粒子のヒストグラムを作成した。
【００８７】
図１８、図１９、図２０、図２１はそれぞれ、領域Ｇ９１・Ｇ９２・Ｇ９３・Ｇ９４に対応するヒストグラムであり、縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。これらのヒストグラムに基づき各領域内の粒度分布を得た。そこから単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、各領域内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出した。
【００８８】
検体HBs▲１▼〜HBs▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表５に示す。
【００８９】
【表５】
【００９０】
上記測定結果より、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は検体に含まれるHBs抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、検体に含まれるHBs抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【００９１】
検体TP▲１▼〜TP▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を、以下の表６に示す。
【００９２】
【表６】
【００９３】
上記測定結果より、抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は検体に含まれる抗TP抗体の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、検体に含まれる抗TP抗体の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【００９４】
検体AFP▲１▼〜▲７▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を、以下の表７に示す。
【００９５】
【表７】
【００９６】
上記測定結果より、AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は検体に含まれるAFP抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、検体に含まれるAFP抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【００９７】
検体CEA▲１▼〜▲７▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を、以下の表８に示す。
【００９８】
【表８】
【００９９】
上記測定結果より、CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は検体に含まれるCEA抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、検体に含まれるCEA抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１００】
Ｓ１、Ｓ２を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を、以下の表９に示す。
【０１０１】
【表９】
【０１０２】
上記測定結果に示す通り、全血を検体として用い、４項目を一つの反応系で同時に反応させて、各項目の凝集率が得られた。
【０１０３】
５．感染症マーカー４項目同時測定
自動免疫測定装置１００を用い、感染症マーカーである４項目（抗TP抗体、HBs抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体）の免疫測定を行った。検体は以下の通り調製した。
【０１０４】
検体
ランリームTP測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液に抗TP抗体を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、抗TP抗体含有検体系列（TP▲１▼〜TP▲７▼）とした。抗TP抗体含有検体系列における各検体中の抗TP抗体濃度は以下の通りである。
TP▲１▼：０mIU、TP▲２▼：１６.５ mIU、TP▲３▼：４１.２mIU、TP▲４▼：１０３.１mIU、TP▲５▼：２５７.６mIU、TP▲６▼：６４４mIU、TP▲７▼：１６１０mIU。
【０１０５】
ランリームHBsAg測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にHBs抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、HBs抗原含有検体系列（HBs▲１▼〜HBs▲７▼）とした。HBs抗原含有検体系列における各検体中のHBs抗原濃度は以下の通りである。
HBs▲１▼：０U/mL、HBs▲２▼：１U/mL、HBs▲３▼：３U/mL、HBs▲４▼：９U/mL、HBs▲５▼：２７U/mL、HBs▲６▼：８１U/mL、HBs▲７▼：２４３U/mL。
【０１０６】
ランリームHCV II ex測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（陰性コントロール、カットオフコントロール、陽性コントロールからなり、計３検体である。）を用い、抗HCV抗体含有検体系列（HCV▲１▼〜HCV▲３▼）とした。この抗HCV抗体含有検体系列（HCV▲１▼〜▲３▼）においては、HCV▲３▼が、最も高濃度の抗HCV抗体を含有する。HCV▲１▼は、抗HCV抗体の濃度が０U/mLである。
【０１０７】
三段階の濃度で抗HIV抗体を含有した検体系列として、HIV▲１▼〜HIV▲３▼を以下の通り調製した。まず、5.0%(w/v)ウシ血清アルブミンを含むPBS緩衝液(pH7.2)を調製した。これをHIV▲１▼とした。次に、抗HIVウサギ抗血清を前記調製したPBS緩衝液(=HIV▲１▼)で希釈し、これをHIV▲３▼とした。またHIV▲３▼をHIV▲１▼で100倍に希釈したものをHIV▲２▼とした。この抗HIV抗体含有検体系列（HIV▲１▼〜▲３▼）においては、HIV▲３▼が、最も高濃度の抗HIV抗体を含有する。HIV▲１▼は、抗HIV抗体の濃度が０U/mLである。
【０１０８】
測定
前記調製した感染症マーカー４項目同時測定用蛍光ラテックス試薬の入った試薬容器２２７と、反応緩衝液の入った試薬容器２３１を、自動免疫測定装置１００の試料調製部２００にある試薬セット部２２２にセットした。さらに、検体の入った検体容器２２５を検体セット部２２１にセットし、前記の通り自動免疫測定装置１００を動作させ、各検体を測定した。
【０１０９】
解析結果
図２２、図２３は、HBs抗原含有検体であるHBs▲７▼を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、横軸は前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を、縦軸は蛍光強度（Ｆｌ）を表わす。図２２・図２３の各スキャッタグラムは、同じ検体から測定した結果を、縦軸の表示方法を変えて出力したものであり、それぞれ前記図１２に示した自動免疫測定装置１００の表示画面例における二次元スキャッタグラムＳｃ１・Ｓｃ２に相当する。蛍光強度の違いから、抗TP抗体検出用蛍光ラテックス粒子・HBs抗原検出用蛍光ラテックス粒子・抗HCV抗体検出用蛍光ラテックス粒子・抗HIV抗体検出用蛍光ラテックス粒子、の４種類の蛍光ラテックス粒子が縦軸方向に分離し、それぞれ予め設定された領域内に出現している。抗TP抗体検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ１０１に、HBs抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ１０２に、抗HCV抗体検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ１０３に、抗HIV抗体検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ１０４に、それぞれ出現している。
【０１１０】
図２４、図２５、図２６、図２７はそれぞれ、図２２、図２３の二次元スキャッタグラム中の領域Ｇ１０１・Ｇ１０２・Ｇ１０３・Ｇ１０４に対応するヒストグラムであり、縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。
【０１１１】
検体TP▲１▼〜TP▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の
蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を以下の表１０に示す。
【０１１２】
【表１０】
【０１１３】
上記測定結果より、抗TP抗体検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれる抗TP抗体の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれる抗TP抗体の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１１４】
検体HBs▲１▼〜HBs▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１１に示す。
【０１１５】
【表１１】
【０１１６】
上記測定結果より、HBs抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるHBs抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるHBs抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１１７】
検体HCV▲１▼〜HCV▲３▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１２に示す。
【０１１８】
【表１２】
【０１１９】
上記測定結果より、抗HCV抗体検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれる抗HCV抗体の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれる抗HCV抗体の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１２０】
検体HIV▲１▼〜HIV▲３▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１３に示す。
【０１２１】
【表１３】
【０１２２】
上記測定結果より、抗HIV抗体検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれる抗HIV抗体の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれる抗HIV抗体の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１２３】
６．腫瘍マーカー４項目同時測定
自動免疫測定装置１００を用い、腫瘍マーカーである４項目（FRN抗原、CEA抗原、AFP抗原、PSA抗原）の免疫測定を行った。検体は以下の通り調製した。
【０１２４】
検体
ランリームFRN測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にFRN抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、FRN抗原含有検体系列（FRN▲１▼〜FRN▲７▼）とした。このFRN抗原含有検体系列における各検体中のFRN抗原濃度は以下の通りである。
FRN▲１▼：０ng/mL、FRN▲２▼：１.２５ng/mL、FRN▲３▼：５ng/mL、FRN▲４▼：２０ng/mL、FRN▲５▼：８０ng/mL、FRN▲６▼：３２０ng/mL、FRN▲７▼：１２８０ng/mL。
【０１２５】
ランリームCEA測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にCEA抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、CEA抗原含有検体系列（CEA▲１▼〜CEA▲７▼）とした。このCEA抗原含有検体系列における各検体中のCEA抗原濃度は以下の通りである。
CEA▲１▼：０ng/mL、CEA▲２▼：０.５ng/mL、CEA▲３▼：２ng/mL、CEA▲４▼：８ng/mL、CEA▲５▼：３２ng/mL、CEA▲６▼：１２８ng/mL、CEA▲７▼：５１２ng/mL。
【０１２６】
ランリームAFP測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にAFP抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、AFP抗原含有検体系列（AFP▲１▼〜AFP▲７▼）とした。このAFP抗原含有検体系列における各検体中のAFP抗原濃度は以下の通りである。
AFP▲１▼：０ng/mL、AFP▲２▼：２ng/mL、AFP▲３▼：８ng/mL、AFP▲４▼：３２ng/mL、AFP▲５▼：１２８ng/mL、AFP▲６▼：５１２ng/mL、AFP▲７▼：２０４８ng/mL。
【０１２７】
ランリームPSA測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にPSA抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、PSA抗原含有検体系列（PSA▲１▼〜PSA▲７▼）とした。このPSA抗原含有検体系列における各検体中のPSA抗原濃度は以下の通りである。
PSA▲１▼：０ng/mL、PSA▲２▼：０．１２５ng/mL、PSA▲３▼：０．５ng/mL、PSA▲４▼：２ng/mL、PSA▲５▼：８ng/mL、PSA▲６▼：３２ng/mL、PSA▲７▼：１２８ng/mL。
【０１２８】
測定
前記調製した腫瘍マーカー４項目同時測定用蛍光ラテックス試薬の入った試薬容器２２７と反応緩衝液の入った試薬容器２３１を、自動免疫測定装置１００の試料調製部２００にある試薬セット部２２２にセットした。さらに検体の入った検体容器２２５を検体セット部２２１にセットし、前記の通り自動免疫測定装置１００を動作させ、各検体を測定した。
【０１２９】
解析結果
図２８・図２９は、AFP含有検体であるAFP▲７▼を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、横軸は前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を、縦軸は蛍光強度（Ｆｌ）を表わす。図２８・図２９の各二次元スキャッタグラムは、同じ検体から測定した結果を、縦軸の表示方法を変えて出力したものであり、それぞれ前記図１２に示した自動免疫測定装置１００の表示画面例における二次元スキャッタグラムＳｃ１・Ｓｃ２に相当する。蛍光強度の違いから、FRN抗原検出用蛍光ラテックス粒子・CEA抗原検出用蛍光ラテックス粒子・AFP抗原検出用蛍光ラテックス粒子・PSA抗原検出用蛍光ラテックス粒子、の４種類の蛍光ラテックス粒子が縦軸方向に分離し、それぞれ予め設定された領域内に出現している。FRN抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ２０１に、CEA抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ２０２に、AFP抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ２０３に、PSA抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ２０４に、それぞれ出現している。
【０１３０】
図３０、図３１、図３２、図３３はそれぞれ、図２６・図２７の二次元スキャッタグラム中の領域Ｇ２０１・Ｇ２０２・Ｇ２０３・Ｇ２０４に対応するヒストグラムであり、縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。
【０１３１】
検体FRN▲１▼〜FRN▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を以下の表１４に示す。
【０１３２】
【表１４】
【０１３３】
上記測定結果より、FRN抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるFRN抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるFRN抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１３４】
検体CEA▲１▼〜CEA▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の凝集率（P/T）を、以下の表１５に示す。
【０１３５】
【表１５】
【０１３６】
上記測定結果より、CEA抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるCEA抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるCEA抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１３７】
検体AFP▲１▼〜AFP▲７▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１６に示す。
【０１３８】
【表１６】
【０１３９】
上記測定結果より、AFP抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるAFP抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるAFP抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１４０】
検体PSA▲１▼〜PSA▲７▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１７に示す。
【０１４１】
【表１７】
【０１４２】
上記測定結果より、PSA抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるPSA抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の凝集率は、検体に含まれるPSA抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１４３】
前記の感染症マーカー４項目同時測定では、TP抗原を感作した蛍光ラテックス粒子・抗HBs抗体を感作した蛍光ラテックス粒子・HCV抗原を感作した蛍光ラテックス粒子・抗HIV抗原を感作した蛍光ラテックス粒子を担体粒子として含む蛍光ラテックス試薬を用い、感染症に関連する複数の項目（抗TP抗体、HBs抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体）の免疫測定を、一つの検体に対し同時に行った。このように感染症に関連する項目に対応した蛍光ラテックス粒子を複数種類組み合わせることで、感染症マーカーの複数項目同時測定用試薬とすることができる。
【０１４４】
また前記の腫瘍マーカー４項目同時測定では、抗FRN抗体を感作した蛍光ラテックス粒子・抗CEA抗体を感作した蛍光ラテックス粒子・抗AFP抗体を感作した蛍光ラテックス粒子・抗PSA抗体を感作した蛍光ラテックス粒子を担体粒子として含む蛍光ラテックス試薬を用い、腫瘍に関連する複数の項目（FRN抗原、CEA抗原、AFP抗原、PSA抗原）の免疫測定を、一つの検体に対し同時に行った。このように腫瘍に関連する項目に対応した蛍光ラテックス粒子を複数種類組み合わせることで、腫瘍マーカー関連の複数項目同時測定用試薬とすることができる。
【０１４５】
上記の各４項目同時測定用試薬は、それぞれ感染症、腫瘍に関し複数項目を短時間で測定したい場合に有用である。しかし複数項目の同時測定を行う場合、測定項目の組み合わせは上記に限られる必要は無い。例えば、いわゆる免疫血清検査項目（CRP、RF、ASO、IgG、IgA、IgM、IgEなど）から選択される複数の項目を組み合わせてもよいし、内分泌検査項目（TSH、T4、T3、FT4など）から選択される複数の項目を組み合わせてもよい。また血中薬物検査項目（PHT、PB、PRM、CBZ、VPAなど）から選択される複数の項目を組み合わせてもよい。もちろん、それら検査のカテゴリーに関わらず、同時測定を望む項目を適宜組み合わせてもよい。
【０１４６】
上記感染症マーカー４項目項目同時測定、及び腫瘍マーカー４項目同時測定では、蛍光ラテックス試薬として、複数項目に対応した複数種類の蛍光ラテックス粒子を予め一液中に懸濁させた状態のものを用いた。従来、４項目の測定を行う場合、各項目に応じた測定用試薬をそれぞれ要していたが、本発明の実施例では各項目測定用の蛍光ラテックス試薬を一液で構成している。また反応緩衝液についても、４項目の同時測定を行う際に一種類の反応緩衝液のみを用いている。複数の測定項目毎に蛍光ラテックス試薬や反応緩衝液をそれぞれ用意する必要がないので、自動免疫測定装置において試薬をセットするためのスペースをよりコンパクトにでき、ひいては装置全体の小型化につながる。
【０１４７】
試薬の他の構成としては、測定項目毎の蛍光ラテックス試薬がそれぞれ用意され、検査オーダーに応じて所望の測定項目に応じた蛍光ラテックス試薬を選択し、組み合わせて用いるように構成される。図３４は、図７に示した自動免疫測定装置１００の試料調製部の変形例を示す図である。図３４の試料調製部２００は、複数種類の蛍光ラテックス試薬を組み合わせて複数項目の同時測定を行うことができるよう構成されている。試薬セット部２２２は、第一、第二、第三、第四の蛍光ラテックス試薬がそれぞれ入った試薬容器２７ａ・２７ｂ、２７ｃ、２７ｄをセットできるようになっている。第一から第四の蛍光ラテックス試薬は、それぞれ異なった測定項目に対応するものであり、かつ含有する蛍光ラテックス粒子は互いに異なった濃度の蛍光色素を含んでいる。試薬セット部２２２以外の構成については、図７に説明した構成と同様である。
【０１４８】
この変形例においては、自動免疫測定装置１００は二つの動作モードを選択できるようになっている。動作モードとしては、４項目同時測定モードと単項目測定モードがある。操作者は測定に先立ち、液晶タッチパネル１０１を用いていずれかの動作モードを選択する。４項目同時測定モードを選択した後、スタートスイッチ１０３を押すと、図３４の試料調製部２００は、装置の全体制御におけるステップＳ１（試料調製部制御）において、次のように動作する。
【０１４９】
まず分注装置２２４が、試薬セット部２２２の試薬容器２３１から反応緩衝液を８０μＬ吸引する。次に分注装置２２４は、検体セット部２２１にセットされている検体容器２２５から検体を１０μＬ吸引し、前記吸引した反応緩衝液と検体を、インキュベータ２２３にセットされている反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は試薬セット部２２２の試薬容器２２７ａから第一の蛍光ラテックス試薬を２．５μＬ吸引して反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は試薬セット部２２２の試薬容器２２７ｂから第二の蛍光ラテックス試薬を２．５μＬ吸引して反応容器２２６に分注する。分注装置２２４は、第三・第四の蛍光ラテックス試薬についても同様に２．５μＬずつを吸引し、反応容器２２６に分注する。この後インキュベータ２２３が、検体・蛍光ラテックス試薬・反応緩衝液が入った反応容器２２６を、温度４５℃に保ちながら１５分間振盪撹拌することでインキュベートし、検体と試薬を反応させて試料液を調製する。分注装置２２４は、インキュベート後の試料液を吸引し、試料容器２３３に供給する。ここで試料容器２３３には予め希釈液が入っており、分注された試料液が５１倍に希釈される。この後は、前記実施例に説明したのと同様に、光検出部・解析部の制御が行われる。
【０１５０】
測定に先立ち、単項目測定モードを選択した場合、試料調製部２００は次のように制御される。まず分注装置２２４は、上記同様に反応緩衝液と検体を吸引し、反応容器２２６に分注した後、オーダーがあった測定項目の蛍光ラテックス試薬を１０μＬ吸引し、反応容器２２６に分注する。その他の動作については、上記同様に制御される。
【０１５１】
【発明の効果】
本発明により、赤血球、血小板、カイロミクロン、細菌など担体粒子以外の粒子を含む検体や全血検体を用いても、検体中の抗原（又は抗体）を精度良く検出できる。本発明では、担体粒子として、検体中に含まれる担体粒子以外の粒子と大きさがオーバーラップするものを用いても、担体粒子のみを弁別して計数し、凝集度を求めることができ、担体粒子を選択する際、粒子の大きさ上の制限が減少する。本発明では、担体粒子と結合した測定対象物質を標識する標識抗体を用いないため、試薬の種類を少なくすることができる。
【０１５２】
また複数の測定対象物質についての粒子凝集反応をひとつの反応系で行い、それぞれの測定対象物質について同時に精度良く検出できる。そのため、緊急時などに複数の項目の免疫測定を短時間で行うことができる。
【０１５３】
また本発明により、感染症マーカー、腫瘍マーカーなどの複数項目につき、これら複数項目測定用の試薬を一つにすることで、自動免疫測定装置の小型化が可能となる。また測定項目毎の試薬を組み合わせて用いるように構成することで、単項目測定と複数項目同時測定の両方を実施できる。
【０１５４】
【図面の簡単な説明】
【図１】二次元スキャッタグラム上で、担体粒子と検体に含まれる担体粒子以外の粒子が異なる位置に出現した様子を説明する図である。
【図２】二次元スキャッタグラム中に設定された領域内に出現した粒子のヒストグラムを説明する図である。
【図３】二次元スキャッタグラム上で、第一の担体粒子と第二の担体粒子が異なる位置に出現した様子を説明する図である。
【図４】二次元スキャッタグラム中に設定された領域内に出現した粒子のヒストグラムを説明する図である。
【図５】本実施例の自動免疫測定装置の外観を説明する図である。
【図６】本実施例の自動免疫測定装置の内部構成を説明する図である。
【図７】本実施例の自動免疫測定装置の試料調製部を説明する図である。
【図８】本実施例の自動免疫測定装置の光検出部を説明する図である。
【図９】本実施例の自動免疫測定装置の制御部を説明する図である。
【図１０】 本実施例の自動免疫測定装置の全体制御を説明する図である。
【図１１】 本実施例の自動免疫測定装置の解析部の制御を説明する図である。
【図１２】本実施例の自動免疫測定装置の液晶タッチパネルに表示された画面の一例を示す図である。
【図１３】本実施例で用いたフローサイトメータの構成を示す模式図である。
【図１４】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図１５】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図１６】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図１７】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図１８】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図１９】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２０】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２１】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２２】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図２３】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図２４】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２５】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２６】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２７】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２８】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図２９】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図３０】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図３１】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図３２】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図３３】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図３４】図７に示した試料調製部の変形例を説明する図である。
【符号の説明】
１１ 担体粒子の単独粒子
１２ 担体粒子の二個凝集粒子
１３ 担体粒子の三個凝集粒子
１４ カイロミクロン
１５ 赤血球
３１ 第一の担体粒子の単独粒子
３２ 第一の担体粒子の二個凝集粒子
３３ 第一の担体粒子の三個凝集粒子
３４ 第二の担体粒子の単独粒子
３５ 第二の担体粒子の二個凝集粒子
３６ 第二の担体粒子の三個凝集粒子
Ｇ１ 担体粒子が出現する領域
Ｇ３１ 第一の担体粒子が出現する領域
Ｇ３２ 第二の担体粒子が出現する領域
１００ 自動免疫測定装置
２００ 試料調製部
３００ 光検出部
４００ 制御部
【発明の属する技術分野】
本発明は血液、尿、腹水などの検体に含まれる物質に対する抗原又は抗体を感作した担体粒子の粒子凝集を用いた免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用して、血液等の検体から特定の物質を検出する免疫測定方法が、臨床検査の分野で広く用いられている。そのような方法としては、ラジオイムノアッセイ（RIA）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、フルオロイムノアッセイ（FIA）、粒子凝集法、等の様々な方法が知られている。粒子凝集法では、測定対象物を含むと思われる検体と、測定対象物に対応する抗体又は抗原を感作した担体粒子とを混和する。検体中に測定対象物が存在すると、抗原抗体反応により担体粒子が凝集するので、その凝集を光学的に検出する。
【０００３】
免疫検査の検体は、全血から血球を除去した血清又は血漿が一般的に用いられているが、除去されなかった赤血球、脂肪粒子、細菌などの粒子が含まれていると、担体粒子凝集の光学的検出に影響を与える。また全血には大量の赤血球が含まれており、全血を検体として用いると、担体粒子凝集の光学的検出に影響を与える。しかし、緊急検査等では血球除去の工程が不要な、全血を検体として用いる測定が望まれている。
【０００４】
全血を用いることが可能な、粒子凝集法による免疫測定方法としては、赤血球と大きさの異なる担体粒子を用いたカウンティングイムノアッセイによる免疫測定方法がある（例えば、特許文献１を参照）。但しこの方法を用いる場合は、担体粒子を選択する際に、赤血球と大きさが重ならないものを選択する必要がある。
【０００５】
一方、免疫検査の測定項目として感染症、腫瘍関連物質、ホルモン等多様な項目が測定されている。免疫検査に用いられる自動分析装置は、検体を測定項目数に応じて複数の反応容器に分取して、各測定項目に応じた試薬をそれぞれ分注し、所定の反応処理をそれぞれ施し、各反応試料をそれぞれ測定するような多項目自動分析装置が一般的となっている。このような多項目自動分析装置は、多くの測定試薬のセット部や反応容器を備えなければならず、機器の大型化、複雑化が伴っていた。そして、検査に用いられる検体量も測定項目が増えるに応じて必要量が多くなり、患者負担の一因となっていた。そこで一つの試料から複数の項目を同時に測定するための免疫測定方法が望まれている。そのような免疫測定方法としては、複数種類の抗体のそれぞれを粒径の異なるラテックス等の担体に感作した試薬と、標識物質で標識した標識抗体と、検体とを、抗体感作担体−測定対象の抗原−標識抗体の免疫複合体となるように反応させ、粒子の粒径と標識物質の情報を求めて、標識情報のある粒子を粒径によって測定項目別に分析する方法がある（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
しかし、上記方法の反応過程で、各担体が一つずつ免疫複合体を形成するわけではなく、測定対象の抗原が複数の担体の抗体と反応して担体の凝集が起こる。またラテックス粒子は、その表面荷電の影響などにより凝集を起こす。いずれの原因であれ担体が凝集すると、その担体の見かけ上の粒径は大きくなり、粒径による測定項目の弁別ができなくなってしまう。また抗原を検出するための試薬として、抗原に対応する抗体を感作した担体粒子の他に、標識物質で標識した抗体が必要となる。
【０００７】
【特許文献１】
国際公開第０１／９６８６８号パンフレット
【特許文献２】
特公平５−８８４２３号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の解決課題は、粒子凝集法を用いた免疫測定において、検体中に測定対象物質以外の粒子が含まれていてもその影響を受けることなく、また使用する担体粒子を選択する際に、大きさの観点で自由度が高い免疫測定方法、装置、及び試薬を提供することである。
【０００９】
また本発明の解決課題は、一つの試料から複数の項目を同時に測定することができ、また標識抗体を必要とせずに測定できる免疫測定方法、装置、及び試薬を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み本発明は、測定対象物質及び測定対象物質以外の粒子を含む検体と、測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された担体粒子と、を混和して試料を調製する工程と、前記工程にて調製された試料中の粒子から第一の光学的情報及び第一の光学的情報とは異なる第二の光学的情報を検出する工程と、前記工程にて検出された第一の光学的情報に基づき、担体粒子と、検体中の測定対象物質以外の粒子と、を弁別し、第二の光学的情報に基づき、担体粒子の凝集度を求める工程と、前記工程にて求められた担体粒子の凝集度に基づき、測定対象物質を検出する工程と、を有する免疫測定方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、測定対象物質及び測定対象物質以外の粒子を含む検体と、測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された担体粒子と、を混和して調製された試料中の粒子から、第一の光学的情報及び第一の光学的情報とは異なる第二の光学的情報を検出する光検出部と、光検出部が検出した光学的情報を解析する解析部と、を有する免疫測定装置であり、解析部は、光検出部が検出した第一の光学的情報に基づき担体粒子と検体中の測定対象物以外の粒子とを弁別し、光検出部が検出した第二の光学的情報に基づき担体粒子の凝集度を求めることを特徴とする、免疫測定装置を提供する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明における免疫測定方法はいわゆる粒子凝集法を用いるものである。担体粒子には、粒子凝集法で一般的に用いられているもの、例えばラテックス粒子、ポリスチレン粒子、磁性粒子、ガラス粒子、デンドリマーなどを用いることができる。
【００２０】
担体粒子に感作する抗原又は抗体には、測定対象物質が抗体であれば該抗体と特異的に抗原抗体反応する抗原が用いられ、測定対象物質が抗原であれば該抗原と特異的に抗原抗体反応する抗体が用いられる。例えば測定項目がCEA抗原（癌胎児性抗原）であれば抗CEA抗体が感作さる。測定項目が抗HBs抗体であればHBs抗原が感作される。
【００２１】
本発明では、担体粒子から物理的特性を検出する。検出した物理特性に基づき、担体粒子と、検体中に含まれる測定対象物質以外の粒子とを弁別する。複数の測定対象物質を検出するために担体粒子を複数種類用いる場合、担体粒子から検出した物理特性により、各種類の担体粒子同士も弁別される。上記物理的特性としては、前方散乱光、側方散乱光、蛍光、吸光度、燐光、化学発光、生物発光などの光学的情報がある。このような光学的情報を検出する装置としては、いわゆるフローサイトメータを利用できる。この装置はフローセルに担体粒子を含む試料を流し、そこへレーザ光を照射して、担体粒子がレーザ光を横切る際に生じる蛍光や前方散乱光を、光電変換素子によって受光・光電変換し、各粒子から検出される蛍光強度や前方散乱光強度や側方散乱光強度といった光学的情報を検出する。また電圧を印加した細孔に粒子を通過させ、粒子が細孔を通過する際に生じる電圧の変化を、物理的特性として利用できる。本発明では、上記のような物理的特性を各粒子から複数検出し、それらを組み合わせて粒子の弁別や、凝集度の検出を行う。
【００２２】
複数の物理的特性として、複数の光学的情報を用いる場合、第一の光学的情報に基づき、担体粒子と検体中の他の粒子とを弁別する。担体粒子には、蛍光色素、色素、発光基質等が適宜含有される。そのため、第一の光学的情報として蛍光、吸光度、燐光、化学発光、生物発光等を用いることにより、担体粒子からは高い信号強度が生じる。検体中の赤血球、血小板、カイロミクロン等、測定対象物質以外の粒子は、蛍光、吸光度、燐光、化学発光、生物発光等の強度が低いので、第一の光学的情報によって担体粒子と弁別される。このように本発明では、粒子の大きさを反映した物理特性を用いずに、粒子の弁別を行うため、担体粒子の大きさを選択する際、制限が少ないというメリットがある。例えば、血小板を含む検体を用いて免疫測定する際に、血小板と同程度の大きさの担体粒子を用いても、担体粒子から検出される蛍光等の物理特性により担体粒子と血小板を弁別することができる。このとき、担体粒子自体の物理的特性を検出するため、別途標識抗体等を用いる必要がない。
【００２３】
第二の光学的情報は、担体粒子の凝集度検出に用いる。担体粒子の凝集度とは、抗原抗体反応に基づく粒子凝集の度合いをいう。第二の光学的情報として、担体粒子の見かけ上の大きさを反映するような情報、例えば前方散乱光を用いれば、未凝集の担体粒子や凝集した担体粒子の識別ができ、担体粒子の凝集度を求められる。なお、担体粒子としてラテックス粒子のような均一な球形粒子を用いれば、側方散乱光も同様に担体粒子の大きさを反映する情報として用いることができる。この凝集度としては、以下の方法で求めた凝集率を用いることができる。フローサイトメータで粒子それぞれの散乱光強度を求める。
それぞれの粒子の散乱光強度によって、未凝集の単独粒子と、複数の担体粒子が凝集して生じた凝集粒子とを弁別して、単独粒子数(M)と凝集粒子数（P）を計数する。
MとPの合計である総粒子数（T）を得、P/Tを凝集率として算出する。
【００２４】
この方法では２個の担体粒子が凝集した段階で反応を捉えることができるため、非常に高感度な免疫測定が可能となる。この凝集度測定は測定対象物質の測定濃度範囲に応じて、各種の方法、例えば一定数以上凝集した粒子の度合いを測定する方法などを用いることができる。
【００２５】
本発明の測定例であるスキャッタグラムの一例を図１に示す。担体粒子として蛍光色素を含有させたラテックス粒子を血液検体に混和して試料液とした。フローサイトメータを用い、試料液から蛍光強度と前方散乱光強度を光学的情報として検出した。検出した光学的情報のうち、蛍光強度を縦軸に、前方散乱光強度を横軸にとって図１のスキャッタグラムを作成した。担体粒子は、未凝集の単独粒子１１、二個の担体粒子が凝集して生じた二個凝集粒子１２、三個の担体粒子が凝集して生じた三個凝集粒子１３というように、凝集の仕方によって前方散乱光強度が異なり、それぞれの集団に分離してスキャッタグラムに出現する。検体中の測定対象物質以外の粒子として、カイロミクロン１４、赤血球１５が出現するが、いずれも蛍光強度が低く、担体粒子と弁別することができる。
【００２６】
各担体粒子を囲むようにスキャッタグラム上で領域を設定し、設定した領域Ｇ１内に出現している担体粒子の粒度分布の例を、図２のヒストグラムに示す。縦軸に粒子の個数（度数）を、横軸に前方散乱光強度をとっている。前方散乱光強度について閾値を設定することにより、凝集粒子と単独粒子を弁別することができる。
【００２７】
また本発明では、第一の光学的情報に基づき、第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別する。第一の担体粒子と第二の担体粒子とには蛍光色素、色素、発光基質等を含有させるが、その種類や含有濃度を適宜選択し、第一の担体粒子と第二の担体粒子が区別されるようにする。第一の光学的情報として蛍光、吸光度、燐光、化学発光、生物発光等を用いることにより、第一の担体粒子と第二の担体粒子とが弁別される。
【００２８】
本発明の測定例であるスキャッタグラムの一例を図３に示す。蛍光色素を異なる濃度含有させた二種類のラテックス粒子を用い、それぞれ第一の担体粒子、第二の担体粒子とした。第一の担体粒子と第二の担体粒子とを検体に同時に反応させて試料液とし、フローサイトメータで蛍光強度と前方散乱光強度を光学的情報として検出した。検出した光学的情報のうち、蛍光強度を縦軸に、前方散乱光強度を横軸にとって図３のスキャッタグラムを作成した。
【００２９】
第一の担体粒子（３１、３２、３３）と第二の担体粒子（３４、３５、３６）は、含有する蛍光色素濃度の違いにより異なる蛍光強度を示し、スキャッタグラム上で異なる位置に出現する。このため、第一の担体粒子と第二の担体粒子をスキャッタグラム上で弁別することが可能である。また各担体粒子においては、未凝集の単独粒子、二個の担体粒子が凝集して生じた二個凝集粒子、三個の担体粒子が凝集して生じた三個凝集粒子が、前方散乱光強度の違いによりスキャッタグラム上の異なる位置にそれぞれ集団となって出現する。図中、第一の担体粒子の単独粒子３１、第一の担体粒子の二個凝集粒子３２、第一の担体粒子の三個凝集粒子３３は、前方散乱光強度の違いからそれぞれの集団に分離して出現する。同様に、第二の担体粒子の単独粒子３４、第二の担体粒子の二個凝集粒子３５、第二の担体粒子の三個凝集粒子３６も、前方散乱光強度の違いからそれぞれの集団に分離して出現する。
【００３０】
ここで第一・第二の担体粒子それぞれを囲むようにスキャッタグラム上で領域を設定し、各領域内に出現した担体粒子の粒度分布を表わすヒストグラムを作成する。図４は、第一の担体粒子の領域Ｇ３１内に出現した担体粒子の前方散乱光強度をもとに作成したヒストグラムの一例であり、縦軸に度数（粒子の個数）を、横軸に前方散乱光強度をとったものである。前方散乱光強度について閾値を設定することにより、凝集粒子と単独粒子を弁別することができる。
【００３１】
以下、本発明の実施例につき説明する。しかし本発明がこの実施例に限定されるわけではない。
【００３２】
担体粒子としては、レーザ光で励起可能な蛍光色素を所定濃度含有させたラテックス粒子（以下、「蛍光ラテックス粒子」という）を用いた。そして、担体粒子に、検出対象物質である抗原（又は抗体）に対応する抗体（又は抗原）を感作して、蛍光ラテックス試薬とした。測定対象物質である抗原（又は抗体）を含有する検体と、蛍光ラテックス試薬と、反応緩衝液を混合して測定用の試料液を調製し、試料液から前方散乱光及び蛍光を検出した。そして検出した前方散乱光信号及び蛍光信号をパラメータとした二次元スキャッタグラムを作成し、解析することで検体中の測定対象物質を検出した。
【００３３】
１．装置
本実施例では、市販のフローサイトメータであるFACSCalibur（ベクトン・ディッキンソン社製）と、本発明者が作製した自動免疫測定装置を使用した。FACSCaliburを使用する際は、予め手作業で検体と試薬を混合・インキュベートして試料液を調製する必要がある。調製した試料液をセットして測定動作を実行すると、試料液から前方散乱光及び蛍光の検出、二次元スキャッタグラムの作成を行う。一方、本発明者が作製した自動免疫測定装置は、自動的に試料液を調製する機能を有しており、試料液の調製から前方散乱光及び蛍光の検出、二次元スキャッタグラムの作成、解析に至る工程を自動的に行う。
【００３４】
本発明者が作製した自動免疫測定装置について説明する。この装置は一つの検体に対し４項目の免疫測定を同時に行うものであり、装置上で用いられる蛍光ラテックス試薬は、測定項目に応じた４種類の蛍光ラテックス粒子を含んでいる。４種類の蛍光ラテックス粒子は、種類毎に互いに異なった濃度の蛍光色素を含有し、また種類毎に測定項目に応じた抗体（又は抗原）が感作してある。この蛍光ラテックス試薬の詳細は後述する。図５は自動免疫測定装置１００の外観を示したものである。装置の前面には、各種設定入力を行ったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１０１、後述する試料調製部２００を覆うカバー１０２、スタートスイッチ１０３を備えている。図６は自動免疫測定装置１００の内部構成を示したものである。装置の右側のスペースには、装置の動作や解析処理を司る制御部４００が備えられている。装置の左下のスペースには、試料液から信号を検出するための光検出部３００が備えられている。また残りのスペースに、試料液を調製するための試料調製部２００が備えられている。
【００３５】
以下、試料調製部２００、光検出部３００、制御部４００の各部について説明する。
試料調製部２００の構成
図７は試料調製部２００を示す説明図である。試料調製部２００は、手前右側に検体セット部２２１、手前左側に試薬セット部２２２、奥側にインキュベータ２２３、を備えている。また上下左右に移動可能な分注装置２２４を備えている。前記図６のカバー１０２を開けることにより、図７に示した試料調製部２００が現れ、操作者は以下に説明する各種容器をセットするよう構成されている。検体セット部２２１には、検体の入った検体容器２２５を、インキュベータ２２３に反応容器２２６をセットするよう構成されている。また試薬セット部２２２には、蛍光ラテックス試薬の入った試薬容器２２７、反応緩衝液が入った試薬容器２３１をセットするよう構成されている。インキュベータ２２３は、セットされた反応容器２２６の中の液体を、所定の温度に保ちながら振盪撹拌するよう構成されている。分注装置２２４は、その先端から所定量の液体を吸引・吐出するようになっており、また図示しない駆動装置によって上下左右に移動可能に構成されている。試料容器２３３は、後述する光検出部３００のフローセル３０１と接続されている。
【００３６】
光検出部３００の構成
図８は光検出部３００の構成を示す説明図である。光検出部３００は、試料液を流すためのフローセル３０１を有する。フローセル３０１は、レーザ光が照射される部分であり内部流路が細く絞られているオリフィス部３０２、試料液をオリフィス部に向かって上方へ噴射するノズル３０３、シース液供給口３０４、排液口３０５を有する。また光検出部３００は、レーザ光を照射するためのレーザ光源３０６（波長６３５ｎｍのレーザ光を出射する赤色半導体レーザ光源である）、レーザ光源から照射されたレーザ光をシースフローセルへ集光するコンデンサレンズ３０７、粒子が発する前方散乱光を受光して電気信号に変換するフォトダイオード３０８、フォトダイオードへ前方散乱光を集光するためのコレクタレンズ３０９とピンホール３１０、蛍光を受光して電気信号に変換するフォトマルチプライヤチューブ３１１、フォトマルチプライヤチューブへ蛍光を集光するためのコレクタレンズ３１２、フィルタ３１３、ピンホール３１４、フォトダイオード３０８やフォトマルチプライヤチューブ３１１から出力された電気信号を増幅して制御部４００へ出力するアンプ３１５、３１６を有する。
【００３７】
制御部４００の構成
図９は制御部４００の構成、及び制御部４００と装置各部との関係を示すブロック図である。制御部４００は、中央演算装置（ＣＰＵ）やＲＯＭ・ＲＡＭ等の記憶装置を有するマイクロコンピュータ、光検出部３００から送られた信号を処理する回路などを有する。制御部４００は、格納部４４１、解析部４４２、動作制御部４４３としての機能を果たす。格納部４４１は、試料中の粒子から得た信号の解析に関する解析プログラムや、装置各部の動作を制御する制御プログラムを格納している。また光検出部３００で検出された信号のデータや、解析プログラムによる処理結果を記憶する。解析部４４２は、試料液を測定して光検出部３００で検出された信号を処理し、処理後の信号を解析する。解析部４４２での解析結果は、液晶タッチパネル１０１に出力される。動作制御部４４３は、格納部４４１に格納されている制御プログラムに基づき、装置各部の動作を制御する。
【００３８】
装置の動作
図１０は、制御プログラムによる自動免疫測定装置１００の全体制御を示すフローチャートである。操作者がスタートスイッチ１０３を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＳ１（試料調製部制御）、ステップＳ２（光検出部制御）、ステップＳ３（解析部制御）が順次実行される。これにより、試料調製部２００、光検出部３００、解析部４４２が制御され、自動免疫測定装置１００の一連の動作が自動的に行われる。上記ステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３による装置各部の動作を以下に説明する。
【００３９】
ステップＳ１（試料調製部制御）
試料調製部制御による試料調製部２００の動作を、図７を用いて説明する。まず分注装置２２４が、試薬セット部２２２の試薬容器２３１から反応緩衝液を８０μＬ吸引し、次に検体セット部２２１にセットされている検体容器２２５から検体を１０μＬ吸引する。そして吸引した反応緩衝液と検体を、インキュベータ２２３にセットされている反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は、試薬セット部２２２の試薬容器２２７から蛍光ラテックス試薬を１０μＬ吸引し、反応容器２２６に分注する。この後インキュベータ２２３が、検体・蛍光ラテックス試薬・反応緩衝液が入った反応容器２２６を、温度４５℃に保ちながら１５分間振盪撹拌することでインキュベートし、試料液を調製する。インキュベート後の試料液を分注装置２２４が吸引し、試料容器２３３に分注する。ここで試料容器２３３には予め希釈液が入っており、分注された試料液が５１倍に希釈される。試料容器２３３中で希釈された試料液は、光検出部３００のフローセル３０１に流される。
【００４０】
ステップＳ２（光検出部制御）
光検出部制御による光検出部３００の動作を、図８を用いて説明する。前記の通り試料容器２３３に試料液が供給されると、図示しないポンプやバルブの動作により試料液がノズル３０３へ導かれる。そして試料液がノズル３０３からフローセル３０１に吐出される。それと同時にシース液が、図示しないシース液容器からシース液供給口３０４を介してフローセル３０１に供給される。これによって試料液は、フローセル３０１内でシース液に包まれ、更にオリフィス部３０２で細く絞られて流れる。試料液の流れを、粒子径と同程度まで絞り込むことにより、試料液に含まれた粒子を一列に整列させてオリフィス部３０２に流すことができる。オリフィス部３０２を流れる試料液に対し、レーザ光源３０６から出射されたレーザ光がコンデンサレンズ３０７で絞られて照射される。レーザ光を受けた試料液中の粒子から発せられた前方散乱光はコレクタレンズ３０９により集光される。そしてピンホール３１０を通過した前方散乱光は、フォトダイオード３０８で受光、光電変換されて前方散乱光信号となる。レーザ光を受けた試料液中の粒子から発せられた蛍光は、コレクタレンズ３１２により集光される。そしてフィルタ３１３、ピンホール３１４を通過した蛍光は、フォトマルチプライヤチューブ３１１で受光、光電変換されて蛍光信号となる。前方散乱光信号及び蛍光信号は、それぞれアンプ３１５・３１６で増幅された後に制御部４００へ送られ、粒子毎のデータとして格納部４４１に記憶される。
【００４１】
ステップＳ３（解析部制御）
解析部制御の詳細について、図１１のフローチャートを用いて説明する。フローチャートの各ステップは以下の通りである。
【００４２】
ステップＳ１１：前方散乱光信号及び蛍光信号のデータを、格納部４４１から読み出す。続いてステップＳ１２へ進む。
ステップＳ１２：前方散乱光信号のピークレベルに基づき前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を、蛍光信号のピークレベルに基づき蛍光強度（Ｆｌ）を、各粒子毎に算出する。続いてステップＳ１３へ進む。
ステップＳ１３：ステップＳ１２で算出した粒子毎のＦｓｃ・Ｆｌをパラメータとした二次元スキャッタグラムを作成する。このスキャッタグラムには、測定項目に応じた４種類の蛍光ラテックス粒子がそれぞれ出現すると目される領域が予め設定されている。
ステップＳ１４：二次元スキャッタグラム上に予め設定されていた各領域内に出現した粒子のヒストグラムを作成し、粒度分布を得る。続いてステップＳ１５へ進む。
ステップＳ１５：粒度分布に基づき、各領域内の単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、各領域内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出する。続いてステップＳ１６へ進む。
ステップＳ１６：前記作成された二次元スキャッタグラム、各領域のヒストグラム及び算出した凝集率Ｐ／Ｔを液晶タッチパネル１０１に出力して表示する。
【００４３】
図１２は、ステップＳ１３で作成されたスキャッタグラム、ステップＳ１４で作成されたヒストグラム、ステップＳ１５で算出された凝集率Ｐ／Ｔを含む画面が、ステップＳ１６で液晶タッチパネル１０１に出力された様子を示す図である。この画面では二次元スキャッタグラムＳｃ１、Ｓｃ２が上下に２つ表示されている。これらは同じ検体から得た同じ測定結果を、表示方法を変えて出力したものである。いずれも横軸に前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を、縦軸に蛍光強度（Ｆｌ）をとっているが、二次元スキャッタグラムＳｃ２は、二次元スキャッタグラムＳｃ１の縦軸の値（蛍光強度（Ｆｌ））をlog変換して表示したものであるため、蛍光強度（Ｆｌ）の低値部分が高値部分と比べ相対的に拡大されて表示される。そこで蛍光ラテックス試薬に含まれる４種類の蛍光ラテックス粒子のうち、含有する蛍光色素の濃度が高い方の２種類の蛍光ラテックス粒子については、画面の上の方に表示した二次元スキャッタグラムＳｃ１に、各粒子の出現する領域が設定され、表示されている（領域▲１▼・領域▲２▼）。また含有する蛍光色素の濃度が低い方の２種類の蛍光ラテックス粒子については、画面の下の方に表示した二次元スキャッタグラムＳｃ２に、各粒子の出現する領域が設定され、表示されている（領域▲３▼・領域▲４▼）。領域▲１▼は４種類のうち最も蛍光色素の濃度が高い蛍光ラテックス粒子が出現する領域である。領域▲２▼は４種類のうち二番目に蛍光色素の濃度が高い蛍光ラテックス粒子が出現する領域である。領域▲３▼は４種類のうち三番目に蛍光色素の濃度が高い蛍光ラテックス粒子が出現する領域である。領域▲４▼は４種類のうち最も蛍光色素の濃度が低い蛍光ラテックス粒子が出現する領域である。また画面上には、▲１▼〜▲４▼の領域に対応するヒストグラム▲１▼〜▲４▼、及び算出された凝集率が表示されている。
【００４４】
２．試薬の調製
以下、Facscalibur及び自動免疫測定装置１００での免疫測定に用いた試薬として、蛍光ラテックス試薬、反応緩衝液、希釈液につき説明する。
【００４５】
蛍光ラテックス試薬
粒子径0.78μmで粒子表面がスルフェートのラテックス粒子に、赤色蛍光色素（波長640nmのレーザ光で励起可能）を所定濃度含有させた蛍光ラテックス粒子を担体粒子として用いた。そして担体粒子に、検出対象物質である抗原（又は抗体）に対応する抗体（又は抗原）を感作した。ここでは抗HBs抗体、TP抗原、抗CEA抗体、抗AFP抗体、HCV抗原、HIV抗原、抗FRN抗体、抗PSA抗体を、それぞれ異なった蛍光ラテックス粒子に疎水結合によって感作し、そそれらを単独又は一液中に混合させて組み合わせて各種蛍光ラテックス試薬を調製した。各蛍光ラテックス試薬の調製は以下の（１）〜（８）の通りに行った。
【００４６】
（１）HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製
HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬は、抗HBs抗体を蛍光色素濃度1％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まず抗HBs抗体（マウスモノクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1%(w/v) 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2）1mLを加えて、超音波処理し、分散させた。これをHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬とした。
【００４７】
（２）抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬の調製
抗TP抗体を検出するための蛍光ラテックス試薬は、TP抗原を蛍光色素濃度0.1％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まずTP抗原（市販品）50μgを含む10mM PBS、pH4.0 950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、4℃で24時間静置した。これを10000×g、10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1mg/mL 牛血清アルブミンを含む0.1M PBS緩衝液、pH7.0を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に1mg/mL 牛血清アルブミンを含む0.1M PBS緩衝液、pH7.0を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。これを抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬とした。
【００４８】
（３）AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製
AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬は、蛍光色素濃度0.01％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に抗AFP抗体を感作して調製した。まず、抗AFP抗体（ヤギポリクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、 pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1%(w/v) 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2） 1mLを加えて、超音波処理し、分散させた。これをAFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬とした。
【００４９】
（４）CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製
CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬は、抗CEA抗体を蛍光色素濃度0.001％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。抗CEA抗体（ウサギポリクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、 pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1% 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2）1mLを加えて、超音波処理し、分散させた。これをCEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬とした。
【００５０】
（５）感染症マーカー４項目同時測定用試薬の調製
HBs抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、抗TP抗体検出用の蛍光ラテックス粒子、抗HCV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子、抗HIV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子を調製し、それらを一液中に混合してHBs抗原、抗TP抗体、抗HCV抗体、抗HIV抗体を同時に検出するための蛍光ラテックス試薬を調製した。
【００５１】
HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬、及び抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬は、前記（１）、及び（２）で調製したものを用いた。
【００５２】
抗HCV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子は、HCV抗原を蛍光色素濃度3％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まずHCV 非構造領域のNS3由来のウイルス蛋白に相当する2種のリコンビナント抗原、NS4を含む由来のウイルス蛋白に相当する2種の合成ペプチド抗原、及びNS5由来のウイルス蛋白に相当する1種の合成ペプチド抗原、並びに構造領域のcore由来のウイルス蛋白に相当する3種の合成ペプチド抗原、の8種類の複合抗原を含む10mMグリシン緩衝液（pH2.0）950μLに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、37℃で1時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に2% 牛血清アルブミン（市販品）を含む1.2%(w/v)Tris緩衝液（pH8.0）を1mL加えて、超音波処理し、分散させ、45℃で2時間インキュベートしてブロッキング作業を行った。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含む1.2%(w/v)Tris緩衝液（pH8.0）1mLを加えて、超音波処理し、液中に抗HCV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子を分散させた。
【００５３】
抗HIV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子は、HIV抗原を蛍光色素濃度5％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まずHIV-1 gag(group specific antigen)領域抗原、HIV-1 env(envelope)領域抗原、HIV-1 pol(polymerase)領域抗原及びHIV-2 env(env)領域抗原を含む10mMグリシン緩衝液（pH2.0）950μLに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、37℃で1時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に2% 牛血清アルブミン（市販品）を含む1.2%(w/v)Tris緩衝液（pH8.0）を1mL加えて、超音波処理し、分散させ、45℃で2時間インキュベートしてブロッキング作業を行った。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含む1.2%(w/v)Tris緩衝液（pH8.0）1mLを加えて、超音波処理し、液中に抗HIV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子を分散させた。
【００５４】
上記調製した抗HCV抗体検出用の蛍光ラテックス粒子が分散した液、抗HIV抗体検出用の蛍光ラテックス試薬が分散した液、及び前記調製したHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬と抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬を等量ずつ混合し、感染症マーカー４項目同時測定用蛍光ラテックス試薬とした。
【００５５】
（６）腫瘍マーカー４項目同時測定用試薬の調製
FRN抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、CEA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、AFP抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、PSA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子を調製し、それらを一液中に混合することにより、FRN抗原、CEA抗原、AFP抗原、PSA抗原を同時に検出するための蛍光ラテックス試薬を調製した。
【００５６】
FRN抗原検出用の蛍光ラテックス粒子は、抗FRN抗体を蛍光色素濃度0.1％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まず、抗FRN抗体（ヤギポリクローナル抗体、市販品）50μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、 pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1%(w/v) 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2） 1mLを加えて、超音波処理し、液中にFRN抗原検出用の蛍光ラテックス粒子を分散させた。
【００５７】
CEA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子は、蛍光色素濃度1％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に、抗CEA抗体を前記（４）のCEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製と同様の手順にて感作し、調製した。
【００５８】
AFP抗原検出用の蛍光ラテックス粒子は、蛍光色素濃度3％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に、抗AFP抗体を前記（３）のAFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬の調製と同様の手順にて感作し、調製した。
【００５９】
PSA抗原検出用の蛍光ラテックス試薬は、抗PSA抗体を蛍光色素濃度5％(w/v)の蛍光ラテックス粒子に感作して調製した。まず、抗PSA抗体（ウサギポリクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、 pH4.6）950μlに、蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1% 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2）1mLを加えて、超音波処理し、液中にPSA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子を分散させた。
【００６０】
上記調製したFRN抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、CEA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、AFP抗原検出用の蛍光ラテックス粒子、PSA抗原検出用の蛍光ラテックス粒子がそれぞれ分散した液を等量ずつ混合し、腫瘍マーカー４項目同時測定用蛍光ラテックス試薬とした。
【００６１】
反応緩衝液
反応緩衝液は以下の通り調製した。1.6mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、1.1mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、18.18mg/mL トリス、5%(w/v) 牛血清アルブミン、0.6%(w/v) デキストラン（市販品）、15％(w/v)加熱処理牛血清アルブミン、40％(w/v)ペプシン処理牛血清アルブミン、0.4％(w/v)PVA(市販品) 0.15％（w/v）塩化ナトリウム、0.045％(w/v)アジ化ナトリウム、pH6.0を調製し、蛍光ラテックス試薬と共に測定対象となる検体へ添加するための反応緩衝液とした。
【００６２】
希釈液
自動免疫測定装置１００では、測定に先立ち試料容器２３３に希釈液を所定量入れておく。前記の通り検体を蛍光ラテックス試薬、反応緩衝液と混和・インキュベートして調製した試料液は、試料容器２３３に入れられることによって所定濃度に希釈される。この希釈液としてはクリンシース（シスメックス株式会社製）を用いた。
【００６３】
３．単項目測定
一種類の測定項目に対応した蛍光ラテックス試薬を用い、Facscaliburにて測定した結果を示す。なお、測定対象とした検体は以下の通り調製した。
【００６４】
検体
ヒト正常全血、及びヒト正常全血にHBs抗原を6段階の濃度別に添加したもの、を調製し、HBs抗原含有検体系列（HBs▲１▼〜HBs▲７▼）とした。HBs抗原含有検体系列における各検体中のHBs抗原濃度は以下の通りである。
HBs▲１▼：０U/mL、HBs▲２▼：１U/mL、HBs▲３▼：３U/mL、HBs▲４▼：９U/mL、HBs▲５▼：２７U/mL、HBs▲６▼：８１U/mL、HBs▲７▼：２４３U/mL。
【００６５】
またヒト正常全血、及びヒト正常全血に抗TP抗体を6段階の濃度別に添加したもの、を調製し、抗TP抗体含有検体系列（TP▲１▼〜TP▲７▼）とした。抗TP抗体含有検体系列における各検体中の抗TP抗体濃度は以下の通りである。
TP▲１▼：０mIU、TP▲２▼：１６.５ mIU、TP▲３▼：４１.２mIU、TP▲４▼：１０３.１mIU、TP▲５▼：２５７.６mIU、TP▲６▼：６４４mIU、TP▲７▼：１６１０mIU。
【００６６】
またヒト正常全血、及びヒト正常全血にAFP抗原を6段階の濃度別に添加したもの、を調製し、AFP抗原含有検体系列（AFP▲１▼〜AFP▲７▼）とした。AFP抗原含有検体系列における各検体中のAFP抗原濃度は以下の通りである。
AFP▲１▼：０ng/mL、AFP▲２▼：２ng/mL、AFP▲３▼：８ng/mL、AFP▲４▼：３２ng/mL、AFP▲５▼：１２８ng/mL、AFP▲６▼：５１２ng/mL、AFP▲７▼：２０４８ng/mL。
【００６７】
またヒト正常全血、及びヒト正常全血にCEA抗原を6段階の濃度別に添加したもの、を調製し、CEA抗原含有検体系列（CEA▲１▼〜CEA▲７▼）とした。CEA抗原含有検体系列における各検体中のCEA抗原濃度は以下の通りである。
CEA▲１▼：０ng/mL、CEA▲２▼：０.５ng/mL、CEA▲３▼：２ng/mL、CEA▲４▼：８ng/mL、CEA▲５▼：３２ng/mL、CEA▲６▼：１２８ng/mL、CEA▲７▼：５１２ng/mL。
【００６８】
またヒト正常全血に対し、HBs抗原、抗TP抗体、AFP抗原、CEA抗原の4種類の抗原又は抗体をいずれも前記各検体系列の▲４▼と同一濃度となるように調製した検体Ｓ１（つまり検体Ｓ１は、HBs抗原を９U/mL、抗TP抗体を１０３.１mIU、AFP抗原を３２ng/mL、CEA抗原を８ng/mL含有している）と、▲７▼と同一濃度となるように調製した検体Ｓ２（つまり検体Ｓ２は、HBs抗原を２４３U/mL、抗TP抗体を１６１０mIU、AFP抗原を２０４８ng/mL、CEA抗原を５１２ng/mL含有している）を用意した。
【００６９】
測定
上記調製した全28検体（それぞれ40μL）に、それぞれの検体系列に含まれる測定対象物質に対応する蛍光ラテックス試薬10μLと反応緩衝液350μLを45℃で15分間インキュベートした後、10mM PBS緩衝液で51倍に希釈して、測定用試料を全28試料調製した。調製した各試料液を、Facscaliburにセットし、測定した。
【００７０】
FACSCaliburは赤色半導体レーザ光源から波長635nmのレーザを照射し、蛍光ラテックス試薬を含む試料から前方散乱光信号及び側方蛍光信号を検出する機能を有するフローサイトメータである。図１３は、FACSCaliburの検出系を示す模式図である。担体粒子５１を含む試料はフローセル５２に導びかれ、試料流５３を形成する。赤色半導体レーザ光源５４から発せられたレーザ光はフローセル５２中の試料流５３を照射する。そして担体粒子５１がレーザ光の照射領域を横切る際に生じる蛍光はフォトマルチプライヤチューブ５５に、前方散乱光はフォトダイオード５６によってそれぞれ受光・光電変換されて電気信号となり、処理・解析される。このようにして各粒子から蛍光信号や前方散乱光信号が検出され、電気信号処理が行われる。
【００７１】
解析
各試料から検出した前方散乱光信号及び蛍光信号をパラメータとする二次元スキャッタグラムを作成した。図１４は、HBs抗原含有検体であるHBs▲４▼にHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬を添加した試料を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、縦軸は蛍光強度を、横軸は前方散乱光強度を表わす。前方散乱光強度の違いから、未凝集の単独粒子、二個凝集粒子、三個凝集粒子がそれぞれスキャッタグラム上で集団に分かれて出現している。検体に含まれる血小板は、蛍光強度をほとんど有さないため、出現位置が横軸と重なるほど蛍光強度が低値な位置となり、図１４のスキャッタグラムにおいては明確な集団として表示されなかった。検体中の赤血球も蛍光強度をほとんど有さない。また赤血球は担体粒子の三個凝集粒子より大きい。そのため、図１４のスキャッタグラムにおいては表示範囲からスケールアウトしている。
【００７２】
スキャッタグラム上に出現した担体粒子の各集団を囲むように領域Ｇ６を設定し、領域Ｇ６内の粒子の粒度分布を得た。図１５は、図１４の領域Ｇ６に対応するヒストグラムであり、縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。このヒストグラムに基づき、単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、領域Ｇ６内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出した。同様に、HBs抗原含有検体系列の他の濃度の検体を用いて調製した試料、及び他の種類の検体系列の各検体を用いて調製した各試料についても凝集率を得た。
【００７３】
HBs抗原含有検体系列（HBs▲１▼〜▲７▼）の各検体を用いて調製した試料を測定して得たHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
また抗TP抗体含有検体系列（TP▲１▼〜▲７▼）の各検体を用いて調製した試料を測定して得た抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表２に示す。
【００７６】
【表２】
またAFP抗原含有検体系列（AFP▲１▼〜▲７▼）の各検体を用いて調製した試料を測定して得たAFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表３に示す。
【００７８】
【表３】
またCEA抗原含有検体系列（CEA▲１▼〜▲７▼）の各検体を用いて調製した試料を測定して得たCEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表４に示す。
【００８０】
【表４】
上記測定結果よりわかるように、各測定項目において蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、試料に含まれる抗原（抗体）の濃度に依存して上昇している。また各測定項目においても、抗原（抗体）が含まれていない検体と抗原（抗体）が含まれている検体とで凝集率の差が得られた。これらのことより、各測定項目において凝集率より検量線を作成し、その検量線に基づき濃度換算することで、各免疫項目の抗原（抗体）濃度を得ることができるといえる。
【００８２】
４．多項目同時測定
一つの検体に対し複数種類の蛍光ラテックス試薬を用い、Facscaliburにて測定した結果を示す。なお、測定対象とした検体は以下の通り調製した。
【００８３】
検体
検体には、前記単項目測定と同様、HBs抗原含有検体HBs▲１▼〜HBs▲７▼、抗TP抗体含有検体TP▲１▼〜TP▲７▼、AFP抗原含有検体AFP▲１▼〜AFP▲７▼、CEA抗原含有検体CEA▲１▼〜CEA▲７▼、の全28検体を用いた。また、ヒト正常全血に対し、HBs抗原、抗TP抗体、AFP抗原、CEA抗原の4種類の抗原又は抗体をいずれも前記各検体系列の▲４▼と同一濃度となるように調製した検体Ｓ１（つまり検体Ｓ１は、HBs抗原を９U/mL、抗TP抗体を１０３.１mIU、AFP抗原を３２ng/mL、CEA抗原を８ng/mL含有している）と、▲７▼と同一濃度となるように調製した検体Ｓ２（つまり検体Ｓ２は、HBs抗原を２４３U/mL、抗TP抗体を１６１０mIU、AFP抗原を２０４８ng/mL、CEA抗原を５１２ng/mL含有している）を用いた。
【００８４】
測定
各検体40μLに対し、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬・抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬をそれぞれ10μLずつ（計40μLの蛍光ラテックス試薬）と反応緩衝液320μLを45℃で15分間インキュベーションした後、10mM PBS緩衝液で51倍に希釈して測定用試料とした。測定用試料から、前記同様、Facscaliburを用いて、蛍光強度・前方散乱光強度を得、スキャッタグラムを作成した。
【００８５】
解析
図１６は、HBs抗原含有検体であるHBs▲４▼に、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬・抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の４種類の蛍光ラテックス試薬を添加して調製した試料を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、縦軸は蛍光強度を、横軸は前方散乱光強度を表わす。蛍光強度の違いから、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬・抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の４種類の蛍光ラテックス試薬の粒子が縦軸方向に分離して現れている。ここでHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の単独粒子、二個凝集粒子、三個凝集粒子の集団を含むように領域Ｇ８１を設定し、領域Ｇ８１内の粒子の粒度分布を得る。同様に抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の各蛍光ラテックス試薬に関しても、それぞれ領域Ｇ８２・Ｇ８３・Ｇ８４を設定し、各領域内の粒子のヒストグラムを作成して粒度分布を得た。そこから単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、各領域内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出した。
【００８６】
図１７は検体Ｓ１に蛍光ラテックス試薬４種類を添加して調製した試料を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、縦軸は蛍光強度を、横軸は前方散乱光強度を表わす。蛍光強度の違いから、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬・抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の４種類の蛍光ラテックス試薬の粒子が縦軸方向に分離して現れ、また各蛍光ラテックス試薬においては前方散乱光強度の違いから未凝集の単独粒子、二個凝集粒子、三個凝集粒子が分離して集団を作り、スキャッタグラム上に出現している。ここでHBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の単独粒子、二個凝集粒子、三個凝集粒子の集団を含むように領域Ｇ９１を設定し、領域Ｇ９１内の粒子の粒度分布を得る。同様に抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬・AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬・CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の各蛍光ラテックス試薬に関しても、それぞれ領域Ｇ９２・Ｇ９３・Ｇ９４を設定し、各領域内の粒子のヒストグラムを作成した。
【００８７】
図１８、図１９、図２０、図２１はそれぞれ、領域Ｇ９１・Ｇ９２・Ｇ９３・Ｇ９４に対応するヒストグラムであり、縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。これらのヒストグラムに基づき各領域内の粒度分布を得た。そこから単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、各領域内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出した。
【００８８】
検体HBs▲１▼〜HBs▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を以下の表５に示す。
【００８９】
【表５】
上記測定結果より、HBs抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は検体に含まれるHBs抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、検体に含まれるHBs抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【００９１】
検体TP▲１▼〜TP▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を、以下の表６に示す。
【００９２】
【表６】
上記測定結果より、抗TP抗体検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は検体に含まれる抗TP抗体の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、検体に含まれる抗TP抗体の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【００９４】
検体AFP▲１▼〜▲７▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を、以下の表７に示す。
【００９５】
【表７】
上記測定結果より、AFP抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は検体に含まれるAFP抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、検体に含まれるAFP抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【００９７】
検体CEA▲１▼〜▲７▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を、以下の表８に示す。
【００９８】
【表８】
上記測定結果より、CEA抗原検出用蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は検体に含まれるCEA抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率は、検体に含まれるCEA抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１００】
Ｓ１、Ｓ２を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の粒子の凝集率（P/T）を、以下の表９に示す。
【０１０１】
【表９】
上記測定結果に示す通り、全血を検体として用い、４項目を一つの反応系で同時に反応させて、各項目の凝集率が得られた。
【０１０３】
５．感染症マーカー４項目同時測定
自動免疫測定装置１００を用い、感染症マーカーである４項目（抗TP抗体、HBs抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体）の免疫測定を行った。検体は以下の通り調製した。
【０１０４】
検体
ランリームTP測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液に抗TP抗体を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、抗TP抗体含有検体系列（TP▲１▼〜TP▲７▼）とした。抗TP抗体含有検体系列における各検体中の抗TP抗体濃度は以下の通りである。
TP▲１▼：０mIU、TP▲２▼：１６.５ mIU、TP▲３▼：４１.２mIU、TP▲４▼：１０３.１mIU、TP▲５▼：２５７.６mIU、TP▲６▼：６４４mIU、TP▲７▼：１６１０mIU。
【０１０５】
ランリームHBsAg測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にHBs抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、HBs抗原含有検体系列（HBs▲１▼〜HBs▲７▼）とした。HBs抗原含有検体系列における各検体中のHBs抗原濃度は以下の通りである。
HBs▲１▼：０U/mL、HBs▲２▼：１U/mL、HBs▲３▼：３U/mL、HBs▲４▼：９U/mL、HBs▲５▼：２７U/mL、HBs▲６▼：８１U/mL、HBs▲７▼：２４３U/mL。
【０１０６】
ランリームHCV II ex測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（陰性コントロール、カットオフコントロール、陽性コントロールからなり、計３検体である。）を用い、抗HCV抗体含有検体系列（HCV▲１▼〜HCV▲３▼）とした。この抗HCV抗体含有検体系列（HCV▲１▼〜▲３▼）においては、HCV▲３▼が、最も高濃度の抗HCV抗体を含有する。HCV▲１▼は、抗HCV抗体の濃度が０U/mLである。
【０１０７】
三段階の濃度で抗HIV抗体を含有した検体系列として、HIV▲１▼〜HIV▲３▼を以下の通り調製した。まず、5.0%(w/v)ウシ血清アルブミンを含むPBS緩衝液(pH7.2)を調製した。これをHIV▲１▼とした。次に、抗HIVウサギ抗血清を前記調製したPBS緩衝液(=HIV▲１▼)で希釈し、これをHIV▲３▼とした。またHIV▲３▼をHIV▲１▼で100倍に希釈したものをHIV▲２▼とした。この抗HIV抗体含有検体系列（HIV▲１▼〜▲３▼）においては、HIV▲３▼が、最も高濃度の抗HIV抗体を含有する。HIV▲１▼は、抗HIV抗体の濃度が０U/mLである。
【０１０８】
測定
前記調製した感染症マーカー４項目同時測定用蛍光ラテックス試薬の入った試薬容器２２７と、反応緩衝液の入った試薬容器２３１を、自動免疫測定装置１００の試料調製部２００にある試薬セット部２２２にセットした。さらに、検体の入った検体容器２２５を検体セット部２２１にセットし、前記の通り自動免疫測定装置１００を動作させ、各検体を測定した。
【０１０９】
解析結果
図２２、図２３は、HBs抗原含有検体であるHBs▲７▼を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、横軸は前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を、縦軸は蛍光強度（Ｆｌ）を表わす。図２２・図２３の各スキャッタグラムは、同じ検体から測定した結果を、縦軸の表示方法を変えて出力したものであり、それぞれ前記図１２に示した自動免疫測定装置１００の表示画面例における二次元スキャッタグラムＳｃ１・Ｓｃ２に相当する。蛍光強度の違いから、抗TP抗体検出用蛍光ラテックス粒子・HBs抗原検出用蛍光ラテックス粒子・抗HCV抗体検出用蛍光ラテックス粒子・抗HIV抗体検出用蛍光ラテックス粒子、の４種類の蛍光ラテックス粒子が縦軸方向に分離し、それぞれ予め設定された領域内に出現している。抗TP抗体検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ１０１に、HBs抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ１０２に、抗HCV抗体検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ１０３に、抗HIV抗体検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ１０４に、それぞれ出現している。
【０１１０】
図２４、図２５、図２６、図２７はそれぞれ、図２２、図２３の二次元スキャッタグラム中の領域Ｇ１０１・Ｇ１０２・Ｇ１０３・Ｇ１０４に対応するヒストグラムであり、縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。
【０１１１】
検体TP▲１▼〜TP▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の
蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を以下の表１０に示す。
【０１１２】
【表１０】
上記測定結果より、抗TP抗体検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれる抗TP抗体の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれる抗TP抗体の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１１４】
検体HBs▲１▼〜HBs▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１１に示す。
【０１１５】
【表１１】
上記測定結果より、HBs抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるHBs抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるHBs抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１１７】
検体HCV▲１▼〜HCV▲３▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１２に示す。
【０１１８】
【表１２】
上記測定結果より、抗HCV抗体検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれる抗HCV抗体の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれる抗HCV抗体の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１２０】
検体HIV▲１▼〜HIV▲３▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１３に示す。
【０１２１】
【表１３】
上記測定結果より、抗HIV抗体検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれる抗HIV抗体の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれる抗HIV抗体の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１２３】
６．腫瘍マーカー４項目同時測定
自動免疫測定装置１００を用い、腫瘍マーカーである４項目（FRN抗原、CEA抗原、AFP抗原、PSA抗原）の免疫測定を行った。検体は以下の通り調製した。
【０１２４】
検体
ランリームFRN測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にFRN抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、FRN抗原含有検体系列（FRN▲１▼〜FRN▲７▼）とした。このFRN抗原含有検体系列における各検体中のFRN抗原濃度は以下の通りである。
FRN▲１▼：０ng/mL、FRN▲２▼：１.２５ng/mL、FRN▲３▼：５ng/mL、FRN▲４▼：２０ng/mL、FRN▲５▼：８０ng/mL、FRN▲６▼：３２０ng/mL、FRN▲７▼：１２８０ng/mL。
【０１２５】
ランリームCEA測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にCEA抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、CEA抗原含有検体系列（CEA▲１▼〜CEA▲７▼）とした。このCEA抗原含有検体系列における各検体中のCEA抗原濃度は以下の通りである。
CEA▲１▼：０ng/mL、CEA▲２▼：０.５ng/mL、CEA▲３▼：２ng/mL、CEA▲４▼：８ng/mL、CEA▲５▼：３２ng/mL、CEA▲６▼：１２８ng/mL、CEA▲７▼：５１２ng/mL。
【０１２６】
ランリームAFP測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にAFP抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、AFP抗原含有検体系列（AFP▲１▼〜AFP▲７▼）とした。このAFP抗原含有検体系列における各検体中のAFP抗原濃度は以下の通りである。
AFP▲１▼：０ng/mL、AFP▲２▼：２ng/mL、AFP▲３▼：８ng/mL、AFP▲４▼：３２ng/mL、AFP▲５▼：１２８ng/mL、AFP▲６▼：５１２ng/mL、AFP▲７▼：２０４８ng/mL。
【０１２７】
ランリームPSA測定試薬キット（シスメックス株式会社製）に含まれる検量線作成用キャリブレータ（検体希釈液、及び検体希釈液にPSA抗原を6段階の濃度別に添加したもの）を用い、PSA抗原含有検体系列（PSA▲１▼〜PSA▲７▼）とした。このPSA抗原含有検体系列における各検体中のPSA抗原濃度は以下の通りである。
PSA▲１▼：０ng/mL、PSA▲２▼：０．１２５ng/mL、PSA▲３▼：０．５ng/mL、PSA▲４▼：２ng/mL、PSA▲５▼：８ng/mL、PSA▲６▼：３２ng/mL、PSA▲７▼：１２８ng/mL。
【０１２８】
測定
前記調製した腫瘍マーカー４項目同時測定用蛍光ラテックス試薬の入った試薬容器２２７と反応緩衝液の入った試薬容器２３１を、自動免疫測定装置１００の試料調製部２００にある試薬セット部２２２にセットした。さらに検体の入った検体容器２２５を検体セット部２２１にセットし、前記の通り自動免疫測定装置１００を動作させ、各検体を測定した。
【０１２９】
解析結果
図２８・図２９は、AFP含有検体であるAFP▲７▼を測定して得られた二次元スキャッタグラムであり、横軸は前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を、縦軸は蛍光強度（Ｆｌ）を表わす。図２８・図２９の各二次元スキャッタグラムは、同じ検体から測定した結果を、縦軸の表示方法を変えて出力したものであり、それぞれ前記図１２に示した自動免疫測定装置１００の表示画面例における二次元スキャッタグラムＳｃ１・Ｓｃ２に相当する。蛍光強度の違いから、FRN抗原検出用蛍光ラテックス粒子・CEA抗原検出用蛍光ラテックス粒子・AFP抗原検出用蛍光ラテックス粒子・PSA抗原検出用蛍光ラテックス粒子、の４種類の蛍光ラテックス粒子が縦軸方向に分離し、それぞれ予め設定された領域内に出現している。FRN抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ２０１に、CEA抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ２０２に、AFP抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ２０３に、PSA抗原検出用蛍光ラテックス粒子は領域Ｇ２０４に、それぞれ出現している。
【０１３０】
図３０、図３１、図３２、図３３はそれぞれ、図２６・図２７の二次元スキャッタグラム中の領域Ｇ２０１・Ｇ２０２・Ｇ２０３・Ｇ２０４に対応するヒストグラムであり、縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。
【０１３１】
検体FRN▲１▼〜FRN▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を以下の表１４に示す。
【０１３２】
【表１４】
上記測定結果より、FRN抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるFRN抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるFRN抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１３４】
検体CEA▲１▼〜CEA▲７▼から調製した試料を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス試薬の凝集率（P/T）を、以下の表１５に示す。
【０１３５】
【表１５】
上記測定結果より、CEA抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるCEA抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるCEA抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１３７】
検体AFP▲１▼〜AFP▲７▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１６に示す。
【０１３８】
【表１６】
上記測定結果より、AFP抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるAFP抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるAFP抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１４０】
検体PSA▲１▼〜PSA▲７▼を測定して得た各測定項目の蛍光ラテックス粒子の凝集率（P/T）を、以下の表１７に示す。
【０１４１】
【表１７】
上記測定結果より、PSA抗原検出用蛍光ラテックス粒子の凝集率は検体に含まれるPSA抗原の濃度に依存して上昇しているが、他の蛍光ラテックス試薬の凝集率は、検体に含まれるPSA抗原の濃度にかかわらず変化がないことがわかる。
【０１４３】
前記の感染症マーカー４項目同時測定では、TP抗原を感作した蛍光ラテックス粒子・抗HBs抗体を感作した蛍光ラテックス粒子・HCV抗原を感作した蛍光ラテックス粒子・抗HIV抗原を感作した蛍光ラテックス粒子を担体粒子として含む蛍光ラテックス試薬を用い、感染症に関連する複数の項目（抗TP抗体、HBs抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体）の免疫測定を、一つの検体に対し同時に行った。このように感染症に関連する項目に対応した蛍光ラテックス粒子を複数種類組み合わせることで、感染症マーカーの複数項目同時測定用試薬とすることができる。
【０１４４】
また前記の腫瘍マーカー４項目同時測定では、抗FRN抗体を感作した蛍光ラテックス粒子・抗CEA抗体を感作した蛍光ラテックス粒子・抗AFP抗体を感作した蛍光ラテックス粒子・抗PSA抗体を感作した蛍光ラテックス粒子を担体粒子として含む蛍光ラテックス試薬を用い、腫瘍に関連する複数の項目（FRN抗原、CEA抗原、AFP抗原、PSA抗原）の免疫測定を、一つの検体に対し同時に行った。このように腫瘍に関連する項目に対応した蛍光ラテックス粒子を複数種類組み合わせることで、腫瘍マーカー関連の複数項目同時測定用試薬とすることができる。
【０１４５】
上記の各４項目同時測定用試薬は、それぞれ感染症、腫瘍に関し複数項目を短時間で測定したい場合に有用である。しかし複数項目の同時測定を行う場合、測定項目の組み合わせは上記に限られる必要は無い。例えば、いわゆる免疫血清検査項目（CRP、RF、ASO、IgG、IgA、IgM、IgEなど）から選択される複数の項目を組み合わせてもよいし、内分泌検査項目（TSH、T4、T3、FT4など）から選択される複数の項目を組み合わせてもよい。また血中薬物検査項目（PHT、PB、PRM、CBZ、VPAなど）から選択される複数の項目を組み合わせてもよい。もちろん、それら検査のカテゴリーに関わらず、同時測定を望む項目を適宜組み合わせてもよい。
【０１４６】
上記感染症マーカー４項目項目同時測定、及び腫瘍マーカー４項目同時測定では、蛍光ラテックス試薬として、複数項目に対応した複数種類の蛍光ラテックス粒子を予め一液中に懸濁させた状態のものを用いた。従来、４項目の測定を行う場合、各項目に応じた測定用試薬をそれぞれ要していたが、本発明の実施例では各項目測定用の蛍光ラテックス試薬を一液で構成している。また反応緩衝液についても、４項目の同時測定を行う際に一種類の反応緩衝液のみを用いている。複数の測定項目毎に蛍光ラテックス試薬や反応緩衝液をそれぞれ用意する必要がないので、自動免疫測定装置において試薬をセットするためのスペースをよりコンパクトにでき、ひいては装置全体の小型化につながる。
【０１４７】
試薬の他の構成としては、測定項目毎の蛍光ラテックス試薬がそれぞれ用意され、検査オーダーに応じて所望の測定項目に応じた蛍光ラテックス試薬を選択し、組み合わせて用いるように構成される。図３４は、図７に示した自動免疫測定装置１００の試料調製部の変形例を示す図である。図３４の試料調製部２００は、複数種類の蛍光ラテックス試薬を組み合わせて複数項目の同時測定を行うことができるよう構成されている。試薬セット部２２２は、第一、第二、第三、第四の蛍光ラテックス試薬がそれぞれ入った試薬容器２７ａ・２７ｂ、２７ｃ、２７ｄをセットできるようになっている。第一から第四の蛍光ラテックス試薬は、それぞれ異なった測定項目に対応するものであり、かつ含有する蛍光ラテックス粒子は互いに異なった濃度の蛍光色素を含んでいる。試薬セット部２２２以外の構成については、図７に説明した構成と同様である。
【０１４８】
この変形例においては、自動免疫測定装置１００は二つの動作モードを選択できるようになっている。動作モードとしては、４項目同時測定モードと単項目測定モードがある。操作者は測定に先立ち、液晶タッチパネル１０１を用いていずれかの動作モードを選択する。４項目同時測定モードを選択した後、スタートスイッチ１０３を押すと、図３４の試料調製部２００は、装置の全体制御におけるステップＳ１（試料調製部制御）において、次のように動作する。
【０１４９】
まず分注装置２２４が、試薬セット部２２２の試薬容器２３１から反応緩衝液を８０μＬ吸引する。次に分注装置２２４は、検体セット部２２１にセットされている検体容器２２５から検体を１０μＬ吸引し、前記吸引した反応緩衝液と検体を、インキュベータ２２３にセットされている反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は試薬セット部２２２の試薬容器２２７ａから第一の蛍光ラテックス試薬を２．５μＬ吸引して反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は試薬セット部２２２の試薬容器２２７ｂから第二の蛍光ラテックス試薬を２．５μＬ吸引して反応容器２２６に分注する。分注装置２２４は、第三・第四の蛍光ラテックス試薬についても同様に２．５μＬずつを吸引し、反応容器２２６に分注する。この後インキュベータ２２３が、検体・蛍光ラテックス試薬・反応緩衝液が入った反応容器２２６を、温度４５℃に保ちながら１５分間振盪撹拌することでインキュベートし、検体と試薬を反応させて試料液を調製する。分注装置２２４は、インキュベート後の試料液を吸引し、試料容器２３３に供給する。ここで試料容器２３３には予め希釈液が入っており、分注された試料液が５１倍に希釈される。この後は、前記実施例に説明したのと同様に、光検出部・解析部の制御が行われる。
【０１５０】
測定に先立ち、単項目測定モードを選択した場合、試料調製部２００は次のように制御される。まず分注装置２２４は、上記同様に反応緩衝液と検体を吸引し、反応容器２２６に分注した後、オーダーがあった測定項目の蛍光ラテックス試薬を１０μＬ吸引し、反応容器２２６に分注する。その他の動作については、上記同様に制御される。
【０１５１】
【発明の効果】
本発明により、赤血球、血小板、カイロミクロン、細菌など担体粒子以外の粒子を含む検体や全血検体を用いても、検体中の抗原（又は抗体）を精度良く検出できる。本発明では、担体粒子として、検体中に含まれる担体粒子以外の粒子と大きさがオーバーラップするものを用いても、担体粒子のみを弁別して計数し、凝集度を求めることができ、担体粒子を選択する際、粒子の大きさ上の制限が減少する。本発明では、担体粒子と結合した測定対象物質を標識する標識抗体を用いないため、試薬の種類を少なくすることができる。
【０１５２】
また複数の測定対象物質についての粒子凝集反応をひとつの反応系で行い、それぞれの測定対象物質について同時に精度良く検出できる。そのため、緊急時などに複数の項目の免疫測定を短時間で行うことができる。
【０１５３】
また本発明により、感染症マーカー、腫瘍マーカーなどの複数項目につき、これら複数項目測定用の試薬を一つにすることで、自動免疫測定装置の小型化が可能となる。また測定項目毎の試薬を組み合わせて用いるように構成することで、単項目測定と複数項目同時測定の両方を実施できる。
【０１５４】
【図面の簡単な説明】
【図１】二次元スキャッタグラム上で、担体粒子と検体に含まれる担体粒子以外の粒子が異なる位置に出現した様子を説明する図である。
【図２】二次元スキャッタグラム中に設定された領域内に出現した粒子のヒストグラムを説明する図である。
【図３】二次元スキャッタグラム上で、第一の担体粒子と第二の担体粒子が異なる位置に出現した様子を説明する図である。
【図４】二次元スキャッタグラム中に設定された領域内に出現した粒子のヒストグラムを説明する図である。
【図５】本実施例の自動免疫測定装置の外観を説明する図である。
【図６】本実施例の自動免疫測定装置の内部構成を説明する図である。
【図７】本実施例の自動免疫測定装置の試料調製部を説明する図である。
【図８】本実施例の自動免疫測定装置の光検出部を説明する図である。
【図９】本実施例の自動免疫測定装置の制御部を説明する図である。
【図１０】 本実施例の自動免疫測定装置の全体制御を説明する図である。
【図１１】 本実施例の自動免疫測定装置の解析部の制御を説明する図である。
【図１２】本実施例の自動免疫測定装置の液晶タッチパネルに表示された画面の一例を示す図である。
【図１３】本実施例で用いたフローサイトメータの構成を示す模式図である。
【図１４】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図１５】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図１６】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図１７】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図１８】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図１９】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２０】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２１】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２２】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図２３】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図２４】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２５】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２６】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２７】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図２８】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図２９】本実施例の二次元スキャッタグラムを説明する図である。
【図３０】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図３１】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図３２】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図３３】本実施例のヒストグラムを説明する図である。
【図３４】図７に示した試料調製部の変形例を説明する図である。
【符号の説明】
１１ 担体粒子の単独粒子
１２ 担体粒子の二個凝集粒子
１３ 担体粒子の三個凝集粒子
１４ カイロミクロン
１５ 赤血球
３１ 第一の担体粒子の単独粒子
３２ 第一の担体粒子の二個凝集粒子
３３ 第一の担体粒子の三個凝集粒子
３４ 第二の担体粒子の単独粒子
３５ 第二の担体粒子の二個凝集粒子
３６ 第二の担体粒子の三個凝集粒子
Ｇ１ 担体粒子が出現する領域
Ｇ３１ 第一の担体粒子が出現する領域
Ｇ３２ 第二の担体粒子が出現する領域
１００ 自動免疫測定装置
２００ 試料調製部
３００ 光検出部
４００ 制御部
Claims (12)
- 測定対象物質及び測定対象物質以外の粒子を含む検体と、測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された担体粒子と、を混和して試料を調製する工程と、
前記工程にて調製された試料中の粒子から第一の光学的情報及び第一の光学的情報とは異なる第二の光学的情報を検出する工程と、
前記工程にて検出された第一の光学的情報に基づき、担体粒子と、検体中の測定対象物質以外の粒子と、を弁別し、第二の光学的情報に基づき、担体粒子の凝集度を求める工程と、
前記工程にて求められた担体粒子の凝集度に基づき、測定対象物質を検出する工程と、
を有する免疫測定方法。 - 請求項１に記載の免疫測定方法において、前記検体は測定対象物質として第一及び第二の測定対象物質を含み、前記担体粒子は第一の測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された第一の担体粒子と、第二の測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された第二の担体粒子と、を含み、さらに、
前記担体粒子の凝集度を求める工程は、前記第一の光学的情報に基づき第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別し、第二の光学的情報に基づき第一の担体粒子の凝集度及び第二の担体粒子の凝集度を求める工程を含み、
前記測定対象物質を検出する工程は、前記工程にて求められた第一の担体粒子の凝集度及び第二の担体粒子の凝集度に基づき、第一の測定対象物質及び第二の測定対象物質を検出する工程を含む、免疫測定方法。 - 前記検体が全血であり、前記検体中の測定対象物質以外の粒子が赤血球又は血小板である請求項１又は２記載の免疫測定方法。
- 前記第一の光学的情報が蛍光、化学発光又は吸光度であることを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫測定方法。
- 前記第二の光学的情報が散乱光であることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫測定方法。
- 測定対象物質及び測定対象物質以外の粒子を含む検体と、測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された担体粒子と、を混和して調製された試料中の粒子から、第一の光学的情報及び第一の光学的情報とは異なる第二の光学的情報を検出する光検出部と、
光検出部が検出した光学的情報を解析する解析部と、を有する免疫測定装置であり、
解析部は、光検出部が検出した第一の光学的情報に基づき担体粒子と検体中の測定対象物以外の粒子とを弁別し、光検出部が検出した第二の光学的情報に基づき担体粒子の凝集度を求めることを特徴とする、免疫測定装置。 - 請求項６に記載の免疫測定装置において、前記検体は測定対象物質として第一及び第二の測定対象物質を含み、前記担体粒子は第一の測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された第一の担体粒子と、第二の測定対象物質に対する抗体又は抗原が感作された第二の担体粒子と、を含み、さらに、
前記解析部は、前記第一の光学的情報に基づき第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別し、第二の光学的情報に基づき第一の担体粒子の凝集度及び第二の担体粒子の凝集度を求める、免疫測定装置。 - 前記光検出部は、前記第一の光学的情報を検出するための第一の受光素子と、前記第二の光学的情報を検出するための第二の受光素子とを有する、請求項６又は７記載の免疫測定 装置。
- 前記第一の受光素子は蛍光を検出する、請求項８記載の免疫測定装置。
- 前記第二の受光素子は散乱光を受光する、請求項８又は９記載の免疫測定装置。
- 請求項１に記載の免疫測定方法に用いられる担体粒子を含むことを特徴とする、免疫測定用試薬。
- 請求項２に記載の免疫測定方法に用いられる第一の担体粒子及び第二の担体粒子を含むことを特徴とする、免疫測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003143835A JP4233382B2 (ja) | 2002-05-22 | 2003-05-21 | 免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002147085 | 2002-05-22 | ||
| JP2003143835A JP4233382B2 (ja) | 2002-05-22 | 2003-05-21 | 免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004045395A JP2004045395A (ja) | 2004-02-12 |
| JP4233382B2 true JP4233382B2 (ja) | 2009-03-04 |
Family
ID=31719609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003143835A Expired - Fee Related JP4233382B2 (ja) | 2002-05-22 | 2003-05-21 | 免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4233382B2 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4577873B2 (ja) * | 2004-04-09 | 2010-11-10 | 旭化成ファーマ株式会社 | 試薬の安定性を改善する方法 |
| JP2006226703A (ja) * | 2005-02-15 | 2006-08-31 | Sumitomo Metal Ind Ltd | 光ファイバーを利用した屈折率の異なる光透過性流体の混相流動状態の計測方法および装置 |
| EP1872128A4 (en) * | 2005-04-20 | 2008-09-03 | Becton Dickinson Co | MULTIPLEX MICROPARTICLE SYSTEM |
| JPWO2006129770A1 (ja) * | 2005-06-01 | 2009-01-08 | オリンパス株式会社 | 核酸の検出方法 |
| KR101396673B1 (ko) | 2006-11-02 | 2014-05-16 | 교와 메덱스 가부시키가이샤 | 측정 대상 성분의 면역 측정법 |
| JP4975600B2 (ja) * | 2007-03-16 | 2012-07-11 | シスメックス株式会社 | Ｈｃｖ抗体測定用試薬キット及びｈｃｖ抗体測定方法 |
| JP4975601B2 (ja) * | 2007-03-16 | 2012-07-11 | シスメックス株式会社 | Ｈｃｖ抗体測定用試薬キット及びｈｃｖ抗体測定方法 |
| EP2906947B1 (en) * | 2013-03-07 | 2016-11-23 | Rapid Pathogen Screening Inc. | Multiplanar lateral flow assay with diverting zone |
| EP3968029A4 (en) * | 2019-05-08 | 2023-01-18 | Hitachi High-Tech Corporation | PRETREATMENT PROCEDURE OF AN AUTOMATIC ANALYZER |
-
2003
- 2003-05-21 JP JP2003143835A patent/JP4233382B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004045395A (ja) | 2004-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1365240B1 (en) | Immunoassay methods, immunoassay apparatuses, and reagents for immunoassays | |
| JP4299597B2 (ja) | 血液分析装置及び方法 | |
| US9568488B2 (en) | Biological sample analyzing apparatus | |
| McHugh | Flow microsphere immunoassay for the quantitative and simultaneous detection of multiple soluble analytes | |
| US7390677B2 (en) | Immunoassay and immunoassay apparatus | |
| RU2251111C2 (ru) | Способы одновременного выявления обоих компонентов связывающейся пары | |
| JP2008507692A (ja) | 大型病原体を検出するための横流型装置 | |
| JPH04337446A (ja) | 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置 | |
| MXPA05001678A (es) | Dispositivos de ensayo a base de fluidicos. | |
| JP4233382B2 (ja) | 免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬 | |
| EP1361435A1 (en) | Specific binding analyzer and method of analyzing specific binding | |
| US8741218B2 (en) | Automatic analyzer | |
| JP4853666B2 (ja) | 標的物質の検出方法、混合粒子、および標的物質の検出試薬 | |
| JPH09504094A (ja) | 磁性ラテックス粒子および非磁性粒子を用いて免疫物質をアッセイする方法 | |
| WO2002023154A2 (en) | Aggregation-based assays | |
| JPH08262024A (ja) | 生体内物質の免疫測定用キットおよび免疫測定方法 | |
| JPWO2004111649A1 (ja) | 親和性物質の測定方法 | |
| JP3695178B2 (ja) | 抗原・抗体の測定方法 | |
| JPH05312811A (ja) | 生体微量成分検査装置 | |
| US20050106564A1 (en) | One-step, no-wash multiplex bead-based flow cytometric assay | |
| JP4054500B2 (ja) | 抗原、抗体及びｄｎａ等の核酸を検出用のプローブとして用いた多項目検査方法 | |
| JPH08146001A (ja) | 免疫測定法及びその装置 | |
| WO2024166695A1 (en) | Agglutination immunoassay avoiding detection of non-specific aggregates | |
| JPS6336151A (ja) | 微粒子の螢光強度測定による定量方法 | |
| JP2005172546A (ja) | 免疫測定方法、免疫測定装置、及び免疫測定用試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060518 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20080424 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080513 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080708 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081125 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081209 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111219 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111219 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141219 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |