JP2000502452A - 糞便の試験方法及び用具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 糞便サンプル中の分析対象物の存在または量を測定する方法が開示される。好ましい態様においては、高い濃度の界面活性剤を含む免疫クロマトグラフィーアッセイストリップに接触する吸収性フィルターに糞便サンプルを適用する。界面活性剤により腸内病原体から表面抗原を抽出し、コロイド状金及びコロイド状セレンの反応系により色が生成される。

Description

【発明の詳細な説明】 糞便の試験方法及び用具 発明の分野 本発明は、糞便のサンプルを分析するための改善された方法に関する。特に本 発明は、免疫クロマトグラフィーアッセイ用に糞便のサンプルを準備するための 簡略化された方法、及びストリップの形態で行われる、金粒子を使用した改良さ れた免疫クロマトグラフィーアッセイに関する。 発明の背景 糞便、即ち大便サンプルは、ウイルス、細菌、寄生虫、その他の生物、及びそ のような生物から放出される抗原の存在について日常的に試験されている。その ようなアッセイを行うための方法は、糞便の収集に始まり、通常は多くの糞便の サンプルを操作する段階を含み、典型的には最後に例えばシグナル発生手段内で の色の形成のようなシグナルを発生させ、試験分析対象物の存在または非存在を 示すものである。 糞便収集は、通常非侵襲的であり、サルモネラやコレラ菌(Vibrio cholerae) 等のようなある種の消化器疾患生物のサンプルを得るのに理想的である。糞便は 検査時にスワブで集めることができ、直接試験表面あるいは容量中に適用できる 。 従来の糞便検査は、複雑な化学的及び微生物学的方法を使用するものであった 。このような方法はイムノアッセイ法により置き換えられている。イムノアッセ イ法は非常に感度が高く、わずかのサンプルしか必要としない。ラテックス凝集 反応、エンザイムイムノアッセイのようなある種のイムノアッセイ法は、検査結 果を得るために特定の方法で組合わせられるバイアルと試薬液を含む試験キット で行うことができる。 多くのイムノアッセイ法はそれを使用するために電子機器類あるいは熟練した 臨床医を必要としないが、近代的な用具や技術があまり理解されていない世界の 未開発地域においては容易に実行できないものである。最も単純なイムノアッセ イでも、通常は試験サンプルへの時間を決めた試薬の添加と、適当な順序で合わ せなければならないプラスチックの試験部品の操作を必要とする。 特に糞便の分析にイムノアッセイ技術を応用することはいくつかの理由のため に困難なものとなっている。糞便を取り扱うことは、不愉快であり、危険である 。糞便処理のための衛生的で害にならない手順は、行いにくく複雑なものである ことが多い。そのような手順は、秤量、遠心分離及び貯蔵を含み得、適した装置 、保護設備を備え、熟練した専門家を擁する臨床検査室以外では困難である。 しかし糞便サンプルは、イムノアッセイで使用する前に妨害物質を除去するた めに処理しなければならない。この処理は試験方法に複雑さをもたらし得、処理 のための機器や試薬が存在しない田舎の低開発地域にコレラ試験がより広く普及 することを妨げている。 糞便の試験を行うのに必要な工程数を減少させること、試験オペレーターと試 験物質との間の接触の減少させることは、いかなる場合も、このような領域、特 にコレラ菌のような致命的な疾患要因が存在する領域で試験を行うことに恵みと なり得る。そのような進歩はコレラの早期のより完全な試験を可能とすることに より、直接健康を増進させる。 糞便標本を取り扱う方法上の問題を軽減する試みが行われている。例えば、Ｍ .Ａ．Growら、米国特許第 5,198,365 号は、10〜100 倍の糞便標本の希釈を必要 とするヘモグロビンイムノアッセイのための糞便のサンプルの取り扱い方法を記 載している。希釈によりアッセイ手順はおそらく単純化し得るが、希釈倍率によ り感度が下がる。コレラ菌のような感染症要因については最も早期の臨床期間に おいて検出するためにより高い試験感度が要求されるので、10〜100 倍の希釈段 階はこれらの要因についての多くの試験には特に容認できない。 一方、サンプルを有意に希釈（すなわち３倍以上）せずに試験すると、Vellac ott ら、Lancet(Jan.3,1981)及びJikunenら、the Scand.J.Infect.Dis.17:245(1 985)により記載されているように、遠心分離及び／または濾過の段階が一般に必 要である。 糞便標本を試験する際の複雑さの問題を除去するための最近の試みがＪ.Ａ.Ｘ .Hasan らによりＪ.Clin.Micro.32:249(1994)に記載されている。この文献は、 臨床標本中のコレラ菌 01 の存在を検出するための、迅速な比色免疫診断キット を記載している。 この方法においては、糞便標本は、他のキット成分とは独立したフィルターに 通される。糞便濾液の４滴を、２滴の再構成された金標識抗コレラ菌抗体に加え る。スワブを最初に前記溶液に加え、その後イムノアッセイ試験用具中に置く。 用具内において、形成された免疫複合体は、固定された抗コレラ菌抗体を含む多 孔性膜上に捕捉される。 残念ながら、この手順の独立した濾過段階により試験時間が長引いている。こ の試験は多くの訓練されていない人々にとっては複雑すぎ、２つのバイアル、１ つのバイアルキャップ、スワブ及びイムノアッセイ装置の個別の操作を必要とす る。さらに、多くの操作を必要とする試験キット及び方法はより多くのエラーソ ースを有することになり、より高いエラー率を生じる。さらに、多数の部品と別 々の試薬を試験キットに含めると製造コストが高くなる。 糞便の試験は、大腸菌株 Ｏ157、サルモネラ、シジェラ、レジオネラ、ヘリコ バクター、カンピロバクター及びその他の腸内微生物のような病原体からの抗原 を試験するために特に重要である。これらの抗原の中で、コレラ菌 01 のすべて の血清型に共通なコレラ菌 01 のリポ多糖体Ａ鎖がコレラの試験に特に重要であ る。 これらのイムノアッセイ試験は、特定の方法で組合せられる多くの試薬と部品 を必要とする。そのような操作は、訓練されたオペレーターによって行われるの が最も信頼できる。より単純な試験用具が作られ、一以上の部品及び／または流 体の付加段階を除去できれば、コレラ菌のためのイムノアッセイ試験はこの疾患 を監視するためにより多く使用できるであろう。 多くのその他の腸疾患のように、コレラは糞便サンプルを試験することによっ て判定しなければならない。これは、不愉快なことであり、危険であり得る。糞 便標本処理のための衛生的で害にならない手順は、行いにくく複雑なものである ことが多い。典型的には、糞便サンプルは秤量、抽出及び遠心分離段階の組合せ により処理される。濾過（特に圧力手段を使用するもの）や遠心分離のようなサ ンプルの操作はエーロゾルを発生させ、同時に試験者を汚染することが多い。従 って多くの試験は、適した装置が利用でき、熟練した専門家がいる臨床検査室に 限定されるものである。 コレラ菌試験の複雑さの問題を除去するための最近の試みがＪ.Ａ.Ｘ.Hasan らによりＪ.Clin.Micro.32:249(1994)に記載されている。この文献は、臨床標本 中のコレラ菌 01 の存在を検出するための、迅速な比色免疫診断キットを記載し ている。この報告された方法においては、糞便標本をバイアル上のフィルターキ ャップに、バイアルに圧力をかけることにより通す。糞便濾液の４滴を、別の容 器中の２滴の再構成された金標識抗コレラ菌抗体に加える。スワブを前記溶液中 に入れ、その後イムノアッセイ試験用具に移す。用具内において、形成された免 疫複合体は、固定された抗コレラ菌抗体を含む多孔性膜上に捕捉される。 残念なことに、この手順の独立した濾過段階が試験時間を長引かせている。さ らにこの試験は多くの訓練されていない人々にとっては複雑すぎ、２つのバイア ル、１つのバイアルキャップ、スワブ及びイムノアッセイ装置の個別の操作を必 要とする。多くの操作を必要とするこのような試験キット及び方法はより多くの エラーソースを有することになり、注意が払われないと高いエラー率を生じる。 さらに、多数の部品と試薬を含む試験キットは製造コストがより高くなる傾向が ある。 抽出やその他の試験手順が便利な試験形態にあまり導入されなかった１つの理 由は、ニトロセルロース膜のような固相媒体中にある界面活性剤やタンパク質の ような化合物がその後溶液相に存在した場合、異なる挙動を示すということであ る。一般に、界面活性剤やタンパク質を溶液相から固相に移す場合、特に物質を 試験に使用する際に迅速に再溶解しなければならない場合には、界面活性剤やタ ンパク質の濃度を低くしなければならない。１つの問題は、水溶解性のために水 溶性の試験試薬の使用が制限されると予測される固相アッセイに有用な、試薬及 び試薬濃度についての知識の不足であった。 上記のように、複雑さと生物学的危険の問題により、糞便の標本について試験 をより頻繁に使用することが妨げられてきた。より安全でより使用しやすい、感 度の高い腸内病原体試験用具の必要性が存在する。 発明の概要 従って本発明の目的は、糞便のサンプルから腸内疾患を試験するための方法及 びキットの複雑さを除去するか、または減少させることである。 本発明の第二の目的は、試験方法自体により糞便のサンプル中に存在する疾患 の蔓延を制限するのに役立てることである。 さらに本発明の第三の目的は、比較的使用しやすく比較的安価な糞便サンプル 試験を提供することである。 これらの目的及びその他の目的の達成において、本発明の一つの形態は、糞便 のサンプル中の分析対象物を検出するための方法を提供する。該方法は、Ａ）少 くとも一種の界面活性剤と少くとも一種のバッファーを含む抽出試薬と糞便サン プルを接触させて混合物を形成し；Ｂ）免疫クロマトグラフィーアッセイストリ ップに近接しているかあるいは接触している吸収性フィルターに混合物を適用し てサンプル中に存在する分析対象物を免疫クロマトグラフィーアッセイストリッ プに移し；Ｃ）免疫クロマトグラフィーアッセイストリップ中で分析対象物の存 在を検出する段階を含む。 該方法の一つの好ましい態様においては、免疫クロマトグラフィーアッセイス トリップは、ａ）分析対象物を特異的に認識することができる結合成分を結合し て有する粒子の第一の群、及び ｂ）前記分析対象物を特異的に認識することが できる結合成分を結合して有する粒子の第二の群を含む多孔性のストリップを含 み、第一の群の粒子の平均粒径が第二の群の粒子の平均粒径よりも大きいもので ある。 特に好ましいのは、より大きい粒子がセレンを含み、より小さい粒子が金を含 む態様である。 別の態様は、糞便のサンプル中でコレラ菌(Vibrio cholerae)を検出するため の方法である。該方法は、Ａ）少くとも一種の界面活性剤と少くとも一種のバッ ファーを含む抽出試薬と糞便サンプルを接触させて混合物を形成し；Ｂ）免疫ク ロマトグラフィーアッセイに近接しているかあるいは接触している吸収性フィル ターに混合物を適用してサンプル中に存在する分析対象物を免疫クロマトグラフ ィーアッセイに移し；Ｃ）免疫クロマトグラフィーアッセイ中でコレラ菌の存在 を検出する段階を含む。 該方法の一つの好ましい態様においては、免疫クロマトグラフィーアッセイは 、a）コレラ菌抗原を特異的に認識することができる結合成分を結合して有する 粒 子の第一の群、及び ｂ）前記コレラ菌抗原を特異的に認識することができる結 合成分を結合して有する粒子の第二の群を含む多孔性のストリップを含み、第一 の群の粒子の平均粒径が第二の群の粒子の平均粒径よりも大きいものである。用 語「ストリップ」は、本発明において使用されるように、毛管作用によりサンプ ルがその中を流れる一以上の固相素材を意味する。好ましい態様においては、ス トリップは互いに物理的に接触している２つ以上の素材を含む。 本発明はまた、Ａ）少くとも一種の界面活性剤と少くとも一種のバッファーを 含む凍結乾燥した抽出試薬を含み、サンプル中に存在するコレラ菌抗原を検出す るための免疫試薬を含む免疫クロマトグラフィーアッセイストリップに近接して いるかあるいは接触している吸収性フィルターを含む、コレラ菌抗原を検出する ための試験キットを提供する。 該キットの一つの好ましい態様においては、前記クロマトグラフィーストリッ プは、Ａ）コレラ菌抗原に対する抗体で被覆された金粒子；及びＢ）ストリップ の領域内に固定されたコレラ菌抗原に対する抗体を含む。 別の好ましい態様は、Ａ）少くとも一種の界面活性剤と少くとも一種のバッフ ァーを含む抽出試薬、Ｂ）サンプル中に存在するコレラ菌抗原を検出するための 免疫試薬を含む免疫クロマトグラフィーアッセイストリップに近接しているかあ るいは接触している吸収性フィルターを含む、コレラ菌抗原を検出するための試 験キットである。 該キットの一つの好ましい態様においては、前記クロマトグラフィーストリッ プは、Ａ）コレラ菌抗原に対する抗体で被覆された金粒子；及びＢ）ストリップ の領域内に固定されたコレラ菌抗原に対する抗体を含む。 好ましい態様においては、病原体抗原の抽出は、試験において使用される固相 に1.0％重量/容量を越える濃度で適用され、乾燥された、Tween-20 のようなポ リオキシエチレンソルビタン-脂肪酸化合物により行われる。最も好ましいのは 、1.5パーセントを越え2.0パーセント未満の濃度の Tween-20 であるが、その他 のポリオキシエチレンソルビタン-脂肪酸化合物もこのような高濃度で使用する ことができる。 本発明の方法とキットによれば、先行技術のアッセイ方法に見られた複雑さの 殆どが除去あるいは緩和され、その結果オペレーターを訓練する必要性が簡略化 され、糞便のサンプル中の分析対象物を検出するコストが下げられる。さらに、 糞便サンプル及び処理された糞便サンプルとの偶発的な接触による感染から試験 のユーザーを保護するのに役立つ。 これらの利点は、糞便試験自体を単純化することによって可能となったもので ある。本発明のアッセイにおいては、サンプル抽出段階は、免疫クロマトグラフ ィーアッセイ自体の部分とした糞便フィルターを使用する。この組み合わせによ り、他の試験に存在する一以上の冗長なサンプル調製とアッセイ操作段階が除去 される。 これらの変更により、糞便アッセイは実行するのがより容易になり、診断キッ トにおいて必要とされる部品はより少なくなる。例えば、一つのサンプル容器（ 例えばチューブ）のみを使用してサンプル抽出を行うことができる。さらに、独 立したメンブランフィルターチューブ、フィルターキャップ、及び遠心分離段階 は必要でない。また、洗浄段階のような追加的な流体添加段階は必要ない。 本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な記載から明らとなるで あろう。但し、詳細な説明と具体例は本発明の好ましい態様を示しているものの 、例示のみのために示したものであると理解されなければならない。本発明の概 念及び範囲内における種々の変形や改変がこの詳細な説明から当業者に明らかで あるからである。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の用具の一つの態様の分解図である。 図２は、本発明の用具の別の態様の分解図である。 図３は、本発明の用具の別の態様の分解図である。 図４は、本発明の用具の別の態様の分解図である。 図５は、本発明の用具の別の態様の分解図である。好ましい態様の詳細な説明 本発明者らは、驚くべきことに、免疫クロマトグラフィーアッセイを糞便の濾 過用具と組み合わせることによって糞便サンプル試験が単純化され得ることを見 出した。さらに本発明者らは、適当な抽出試薬を使用して糞便のサンプルと接触 させると、妨害物質及び破片はフィルター上で遅延されるということを見出した 。この結果、追加のサンプル調製と操作の段階が除去された。 本発明者らは、驚くべきことに、７種の異なる界面活性剤による実地試験の間 に、１％を越える濃度、好ましくは約 2% 重量/容量の濃度の Tween-20 が試験 性能を大きく改善するということを偶然に発見した。本発明者らは、Tween-20 を乾燥した形態でアッセイ用具自体に組込むことができた。この好ましい「−段 階」の態様においては、分析対象物からの、あるいは分析対象物抽出流体混合物 からの液体が Tween-20 を再湿潤させ、これにより該界面活性剤が試験標本から 抗原を抽出することを可能とするものである。 本発明者らはまた、驚くべきことに、大きいセレン粒子と小さい金粒子の混合 物を使用することによりアッセイ感度が大きく改善されることを発見した。 用語「免疫クロマトグラフィーアッセイ」は、（1）特異的なエピトープに結 合する抗体を使用して選択性を得、（2）試験分析対象物及び／または試験試薬 が一つ以上の固相素材中で移動することを可能として連続的な反応を可能とする アッセイを意味する。本発明においては、「免疫クロマトグラフィーアッセイ」 はまた、反応の一つとして、試験分析対象物の存在に応答して金またはセレン粒 子のようなシグナル発生物質が固相アッセイ用具の領域内に付着させられる結合 反応を含む。 本発明は、免疫クロマトグラフィーアッセイがストリップ形態であることによ り他の免疫クロマトグラフィーアッセイとは異なる。このストリップは、ディッ プスティックとして使用することができ、その場合、これは試験されるサンプル に単に浸すだけである。あるいは、サンプルをピペット、試験管、あるいはその 他の手段によりストリップにもたらしてもよい。実際には、コレラのような腸内 疾患について試験される殆どの糞便サンプルは水分が多く、用具に直接適用され る。一方、固体の糞便のサンプルは水あるいは抽出試薬と混合することにより、 分散させなければならない。固体サンプルの少量を、水溶液中に界面活性剤とバ ッファーを含む抽出試薬の約５倍過剰と混合するのが好ましい。 糞便サンプルからの分析対象物の検出において使用されるように、本発明の方 法は、1）分析対象物を含むことが疑われる糞便サンプルを抽出試薬と接触させ て混合物を形成し；2）免疫クロマトグラフィーアッセイに近接しているかある いは接触している吸収性フィルターに混合物を適用してサンプル中に存在する分 析対象物を免疫クロマトグラフィーアッセイに移し；3）分析対象物の存在を免 疫クロマトグラフィーアッセイにより、例えば該アッセイ中における発色により 検出する段階を含む。 好ましい態様においては、単一の吸収性フィルターが、糞便のサンプルを濾過 すること、及び免疫クロマトグラフィーアッセイの支持体を提供することの両方 に機能する。この場合、吸収性フィルターの多孔度は、用具を使用する間の、妨 害糞便物質からの試験分析対象物の最適な分離に基づいて選択することができる 。 多孔性のプラスチック、プラスチック膜、ガラス線維等が吸収性フィルターに適 している。例えば、繊維フィルターを使用する場合、フィルターの粒子保持サイ ズは0.1μｍ〜20μｍ、好ましくは0.4μｍ〜5μｍの間で選択することができる 。当業者であればこれらの目的に許容できるフィルターを容易に決定できるであ ろう。 別の好ましい態様においては、吸収性のフィルターは、免疫クロマトグラフィ ーアッセイ用の別の多孔性のストリップに近接して置かれ、あるいはそれに結合 される。抽出された分析対象物はその後フィルターを通り、免疫クロマトグラフ ィーアッセイストリップに入る。吸収性フィルターの種類は、それが糞便物質を 分析対象物からいかにうまく分離するかに基づいて選択される。 糞便サンプルからコレラを検出するために使用する場合、本発明の方法は、1 ）コレラ菌抗原を含むことが疑われる糞便サンプルを少くとも一種の界面活性剤 と少くとも一種のバッファーを含む抽出試薬と接触させて混合物を形成し；2） 免疫クロマトグラフィーアッセイに近接しているかあるいは接触している吸収性 フィルターに混合物を適用してサンプル中に存在するコレラ菌抗原を免疫クロマ トグラフィーアッセイに移し；3）免疫クロマトグラフィーアッセイによりコレ ラ菌抗原の存在を、例えばアッセイ中における発色により検出する段階を含む。 免疫クロマトグラフィーアッセイ及び吸収性フィルターのその他の組み合わせ も可能で、当業者によって容易に認識されるであろう。 抽出試薬は、分析対象物を糞便サンプルから抽出することができる任意の試薬 である。許容できる抽出試薬は、少くとも一種のバッファーと少くとも一種の界 面活性剤を含む水性の流体を含む。許容できるバッファーは、１mＭ〜１Ｍ、よ り好ましくは５mＭ〜250mＭの間の濃度にあり、3〜13、より好ましくは6〜9の間 の pH を有し得る。バッファー組成物は当業者に知られた一種以上の化学化合物 とすることができる。使用する抽出試薬の容量は少なくとも糞便サンプルと同じ 容量とすることが有利である。 界面活性剤は一般に両性化合物であり、多くのそのような界面活性剤が当業者 に知られている。界面活性剤の例としては、デオキシコール酸、Tween-20、Trit on Ｘ-100 及びドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。界面活性剤が中性に近い pHで解離する（pH 5〜9の間のpKa）少くとも一種の化学基を含む場合、バッファ ーと界面活性剤は同じ物質であってもよい。 好ましい態様においては、Tweed-20 が界面活性剤であり、1.5 パーセント重 量/容量を越える高い濃度で使用される。1.6 パーセント〜2.0 パーセントの濃 度で Tween-20 を使用することが最も好ましい。試験物質の移動を最も容易化す るためには、好ましい抽出組成物は 1.8 パーセントの Tween-20、0.05％のアジ 化ナトリウム及び９mM トリス-Cl、pH 8.2 である。先行技術で使用される1％未 満の Tween-20 の濃度及び2.5％を越える濃度は好ましくない。 本発明に適した免疫クロマトグラフィーアッセイは、それが接触する水性サン プルから分析対象物を検出するものである。都合のよいことに、検出はアッセイ の少くとも１の部分からの色の形成あるいは消滅によって行うことができる。 しかし、多くのその他の可能性も当業者によって容易に認識されるであろう。 好ましい免疫クロマトグラフィーアッセイは、抽出された糞便のサンプルを濾 過する吸収性フィルターと好適に組み合わせることができるストリップアッセイ である。好ましい態様においては、免疫クロマトグラフィーストリップアッセイ は、a）分析対象物に対する抗体で被覆された金粒子；及びb）ストリップの領域 内で固定された分析対象物に対する抗体を含む。抗体標識された金粒子は、その 製造時にクロマトグラフィーストリップ上またはその範囲内で乾燥することが 好ましい。 本発明による一つの方法の態様の実施の間、糞便の標本は抽出試薬と反応し、 分析対象物を水不浸透性の容器内の少量の流体（好ましくは 100μl〜500μl容 量）中に放出する（分析対象物が存在する場合）。吸収性フィルターとストリッ プ検出手段を含むストリップは、容器中に入れるか、そこに既に存在するものと する。そして抗原を含む（抗原が存在する場合）流体をストリップに毛管現象に より吸収させる。吸収性フィルターにより破片と固形物が閉じ込められ、一方抽 出された抗原は液体とともにストリップ中に拡散し続ける。抽出された抗原を含 む濾過された抽出流体は、ストリップ検出手段中に存在する抗体標識粒子を再懸 濁させる。抗体標識粒子と抗原との間に免疫複合体が形成される。この免疫複合 体は、分析対象物に対する固定された抗体を含む領域を含むストリップ検出手段 の間を通って拡散する。固定された抗体のいくらかは粒子に結合した分析対象物 を捕捉し、粒子の捕捉は視覚的に検出することができる。 免疫クロマトグラフィーアッセイにおいて金粒子を使用することは、本発明の 免疫クロマトグラフィーアッセイにおいて使用することができる、例えば色素産 生酵素反応を必要とせずに、粒子を直接見ることができるので、好ましい態様で ある。金粒子の場合、糞便のサンプル中の分析対象物の存在は、固定された抗体 を含むストリップの領域内での赤から紫の領域の形成によって検出される。分析 対象物が存在しない場合は色は検出されない。 粒子を使用するアッセイ及び糞便サンプルのアッセイを行うための有利な用具 と方法が、いずれも1995年12月22日に出願された係属中の米国特許出願第08/577 ,108 号及び第 08/577,128 号（Foley ＆ Lardner 名簿番号 73294/103″Partic le Assisted Immunoassay″及び73294/108″Device for Collecting andTesting Samples″）に記載されている。これらはいずれも引用によりその全体を本明細 書の一部とすることを明記する。優先権書類であるいずれも1995年12月22日に出 願されたアメリカ特許出願第 08/577,623 号及び第 08/577,127 号も引用により その全体を本明細書の一部とすることを明記する。 ここで図面を参照すると、本発明による５種の形態的な態様が示されている。 図１は、本発明の用具 102 の一つの態様を示す。この態様においては、吸収 性のフィルターと免疫クロマトグラフィーアッセイは、上部ストリップ 104 と 非多孔性裏装 101 からなる単一のユニットとして存在する。この態様において は、部分 106 が抽出流体と糞便のサンプルの混合物を濾過するように働く。免 疫クロマトグラフィーアッセイ部分 108 は、分析対象物を検出するための試薬 を含む。分析対象物に結合する抗体は、領域 110 に直接及び／または間接的に 固定される。マウス IgG を結合する対照抗体は、領域 112 に固定される。上部 ストリップ 104 は、その下部の表面全体が非多孔性裏装 101 に接合される。 操作の際に、用具 102 は、抽出流体及び糞便のサンプルの混合物を含む試験 管のような容器中に入れるか、あるいは既にそこに存在するものとする。用具10 2 は、ユニット 104 の部分 106 が混合物と接触するように置かれる。混合物は 部分 106 に入り、濾過された物質はこの部分を通過し部分 108 に入る。対照線 は、マウス抗体試薬を使用する、コレラについてのような試験のために領域112 に形成する。分析対象物の検出は、分析対象物の存在に応答して領域 110におい て色が形成されることにより完了する。 図２は、吸収性のパッド 202 が、非多孔性裏装ストリップ 204 と、分析対象 物に特異的な抗体を固定した領域 208 を含む免疫クロマトグラフィーアッセイ 部分 206 との間に挿入されている図１の用具の変形を示す。マウス IgG に結合 する対照抗体は、領域 210 に固定される。この態様においては、免疫クロマト グラフィーアッセイ部分 206 は、吸収性のパッド 202 の上に重なる部分を除い て、その下部の表面に沿って非多孔性の裏装 204 に接合される。吸収性のパッ ド 202 は、その下部表面全体にわたって非多孔性裏装 204 に接合される。 図２の用具は、吸収性のパッド 202 がストリップ、及び固定された抗体を含 む領域全体（最上部表面から底表面まで）に水性の流体を引き上げることを除い て、図１の用具と同様に機能する。 図３は、図１の用具の別の変形を示し、ここでは吸収性のパッド 302 が、分 析対象物に特異的な抗体を固定した領域 306 を含む別のクロマトグラフィー免 疫クロマトグラフィーアッセイストリップ 304 の上部にその近傍またはそれと 接触して存在する。マウス IgG に結合する対照抗体は領域 307 に固定される。 この態様においては、吸収性のパッド 302 は、免疫クロマトグラフィーアッセ イストリップ 304 の上に重ねられる部分を除いて、非多孔性裏装 308 に接合さ れる。免疫クロマトグラフィーアッセイストリップ 304 は、その全長にわたっ て非多孔性裏装 308 に接合される。 図３の用具は、吸収性のパッド 302 がストリップ、及び固定された抗体を含 む領域全体に（膜表面の軸に沿って）水性流体を引き上げることを除いて、図１ の用具と同様に機能する。 図４は、免疫クロマトグラフィーアッセイストリップ 406 と物理的に接触す る吸収性フィルター 404 を含む別の用具 402 を示す。免疫クロマトグラフィー アッセイストリップ 406 は分析対象物を検出するための試薬を含む。分析対象 物に特異的な固定された抗体試薬は領域 408 に存在する。マウス IgG に結合す る対照抗体は領域 409 に固定される。ストリップ 406 は、その下面全体にわた って非多孔性裏装 410 に接合される。吸収性フィルター 404 は、ストリップ40 6 に重なり接触する部分を除いてその下部表面に沿って非多孔性裏装 410 に接 合される。 操作の際に、用具 402 は、抽出流体と糞便のサンプルとの混合物を含む試験 管中に存在するか、入れられる。混合物は吸収性フィルター 404 に入り、そし て濾過された流体はストリップ 406 に入る。分析対象物の検出は、分析対象物 の存在に応答して領域 408 において色が形成されることにより完了する。 図５は、非多孔性裏装 510 に接合される、吸収性フィルター 504、免疫クロ マトグラフィーアッセイストリップ 506 及び吸収性パッド 508 を含む用具 502 を示す。用具の中央の方へ突き出る吸収性フィルター 504 及び吸収性パッド508 の末端は、ストリップ 506 の上部に重なっていてもよく、あるいはストリップ 506 の末端に接していてもよい。吸収性フィルター 504、ストリップ 506及び吸 収性パッド 508 は、非多孔性裏装 510 に接合される。 この好ましい態様においては、吸収性フィルター 504 は、抽出流体と糞便の サンプルの混合物を濾過する。ストリップ 506 は分析対象物を検出するための 試薬を含む。サンプル抗原と反応する固定された抗体試薬は領域 512 に存在し 、マウス IgG に結合する対照抗体は領域 514 に固定される。 操作の間に、用具 502 は、抽出流体と糞便のサンプルの混合物を含む試験管 中に存在するか、その中に入れ、部分 504 が混合物と接触するようにする。混 合物は部分 504 に入り、濾過された物質はこの部分を通過してストリップ 506 に入る。吸収性パッド 508 は、水性の流体をストリップ、及び固定された抗体 を含む領域全体に（膜表面の軸に沿って）引き上げる。分析対象物の検出は、分 析対象物の存在に応答して領域 512 において色が形成されることにより完了す る。コレラについての試験及びマウス抗体を使用するその他の試験については、 試験の完了は領域 514 内での色の形成により示される。 以下の実施例は、例示のために示すものであり、限定のためのものではない。 実施例１ この実施例は、試験試薬粒子の形成とコレラの試験におけるこれらの粒子の使 用を例示する。 粒子の製造 0.03％w/v二酸化セレン溶液の100 mlを加熱して沸騰させた。その後、2％アス コルビン酸の新たに調製した溶液の2.25 mlを0.03％ SeO₂溶液に加えた。混合物 をその容量が50 mlに蒸発するまで沸騰させ、室温に冷却した。冷却した溶液の5 20 nmと580 nmにおける吸光度は、それぞれ1.457及び1.167であった。この処理 により調製されたコロイド状のセレンを10000ｘｇで15分間遠心分離した。上清 は捨て、ペレットを100 mlの蒸留水中に再懸濁した。 360 mgの塩化金（四塩化金酸三水和物）を９ mlの脱イオン水に溶解して塩化 金の4％溶液を製造した。100 mlの脱イオン水に1.0ｇのクエン酸ナトリウムを溶 解することによりクエン酸ナトリウムの 1％溶液を調製した。３リットルの脱イ オン水を４リットルビーカーに入れ、ホットプレート上で沸騰させた。そして４ ％塩化金溶液の7.5 mlをその沸騰水に加えた。1％クエン酸ナトリウム溶液の72 mlをビーカーに加え、その容量が2.2リットルに減少するまで溶液を沸騰させた 。コロイド状金溶液をホットプレートから除去し、室温に冷却した。冷却したコ ロイド状金溶液を、0.2 ミクロン酢酸セルロースフィルターユニットを通して清 浄な褐色瓶中に濾過した。得られた濾液の520 nm及び580 nmでの吸光度はそれぞ れ1.54及び0.455であった。 コロイド状のセレンの１mlのアリコートを等容量のコロイド状金と混合した。 この混合物のpHは5.0であった。合わせたセレン-金混合物を10000ｘｇで１分間 遠心分離して凝集物質を全て除去した。0.2Ｍ炭酸カリウムを慎重に添加して上 清のpHを8.0に調整した。 マウスモノクローナルコレラ菌抗体の調製 精製コレラ菌抗体は、Intelligent Monitoring Systems（Gainesville,Fl）か ら市販されているものを購入した。抗体を0.002Ｍホウ砂バッファーpH 8.2に対 して透析し、0.2 ミクロン酢酸セルロースフィルターを通して濾過し、同じバッ ファー中に100μg/mlの終濃度に希釈した。 抗体によるセレン-金混合物の標識化 コロイド状セレン及びコロイド状金溶液を、体積比 50/50 で混合した。混合 物のpHを、0.2Ｍ炭酸カリウムで8.0に調整した。抗コレラ菌モノクローナル抗体 （100g/ml）の200μlを、コロイド状セレン-コロイド状金混合物の2.0 mlのアリ コートに加えた。その後、20％ウシ血清アルブミンの200μlを各アリコートに加 えた。各混合物を５分間室温でインキュベートした。抗体処理した混合物を16,0 00ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、各ペレットを1％ウシ血清アルブ ミンを含む0.02ＭトリスバッファーpH 8.2に再懸濁した。各調製物を二回洗浄し た。最後の洗浄の後、ペレットを 1％ウシ血清アルブミンを含む0.02Ｍトリスバ ッファーpH 8.2の100μlに再懸濁した。 ニトロセルロースストリップへの抗体の適用 非積層５ミクロンニトロセルロース(Millipore Inc.,New Bedford,Mass.)を、 22 mm×４mmのストリップに切断した。ウサギ抗コレラ菌アフィニティ精製抗体( Louisiana State University,BatonRouge)を、0.05 Ｍホウ酸ナトリウムバッフ ァーpH 8.2で1.6 mg/mlの濃度に希釈した。1.5μlの抗体をニトロセルロースス トリップの中央近くにスポットした。ストリップは真空乾燥器中で乾燥させた。 アクリル接着剤を付したビニールストリップを４ mm×70 mmの部分に切断した 。調製したニトロセルロースストリップをこの切断ビニールストリップの上へ接 合した。４mm×30 mmに切断した１つの吸収紙（Type III,Gelman Seiences）を各ニトロセルロースストリップの上部に重なるように接合させ、そ して１つのガラス線維パッド（Gelman Sciences）を各ニトロセルロースストリ ップの下面に重なるように接合させた。セレン-金抗体混合物の 10μlを各ガラ ス線維パッド上にピペットで取り、乾燥器中で室温で一晩乾燥させた。 抽出試薬の調製 抽出試薬は、1％ Triton Ｘ-100（容量/容量）及び1％ウシ血清アルブミン（ 重量/容量）を0.02Ｍトリス緩衝化食塩水pH 8.0に加えることによって調製した 。 セレン-金抗体抱合体の試験 コレラ菌 01（ATCC♯11628株）、及びコレラ菌non01（ATCC♯14547株）をアル カリ性のペプトン水において一晩35℃で増殖させた。各サンプルのアリコートを 5000ｘｇで10分間遠心分離した。上清を除去し、各ペレットを650nm の吸光度0. 040（１mlあたり約10⁸生物）になるように食塩水中に再懸濁した。 各サンプルの50μlを、10 mm×75 mm試験管中ヘピペットで移した。抽出試薬 の 100μl を各管に加えた。試験ストリップを各試験管中に置き、液体が各ニト ロセルロースストリップ全体に拡散して上昇するようにした。10分後、各ストリ ップを抗体が固定された領域における色の存在について調べた。結果は以下の通 りである。 糞便標本は、Ministerio de Salud Pubica y Asistencia Social，DireccionG eneral de Services de Salud Guatamala City，Guatamala CA.により、Hospita l San Juan de Dios から得た。各サンプルは以下のように培養した。10μlを10 mlのアルカリ性のペプトンブロースに加え、30℃で一晩培養した。その後各ブ ロースのサンプルをTCBS（チオ硫酸塩、クエン酸塩、胆汁酸塩及びスクロース） 寒天選択培地上で二次培養し、37℃で18時間インキュベートした。 糞便サンプルを、調製した試験ストリップを使用して試験した。各サンプルの 50μlをピペットで10 mm×75 mm試験管中に取った。100μlの抽出試薬を各試験 管に加えた。試験ストリップを各試験管中に入れ、液体が拡散して上昇し、各ニ トロセルロースストリップに行き渡るようにした。10分後に各ストリップを抗体 が固定された領域における色の存在について調べた。 対照試験は、市販のコレラ試験 SMART ロット 120（New HorizonsDiagnostics Corp.，Columbia，MD）を使用し、製造業者の説明書に従って同じ糞便サンプル について行った。 試験結果は、以下の通りであった。 各試験において、ストリップアッセイ結果は培養アッセイ結果と一致した。 実施例２ この実施例は簡略化された手順を示すものであり、ここでは抽出試薬がストリ ップ自体の中に乾燥形態で提供され、別の抽出液体は必要ない。代替的な界面活 性剤について、種々の濃度で、当分野において行われているコレラ試験に対する その効果に関して比較した。 試薬及びストリップは、水中にl.8％ Tween-20、0.05％アジ化ナトリウム、及 び９mMトリスをpH 8.2で含む抽出試薬（120μl）を各ストリップのサンプリング 部分末端上に乾燥させた以外は、実施例１と同様に調製した。これらのストリッ プを上記のように使用して Guatamala でコレラと疑われたサンプルを試験した 。200を越える湿潤糞便サンプルを、抽出試薬を加えることなく直接試験し、40 を越える固体試料を7:10希釈抽出試薬の約５倍容量と混合して分散させた後に試 験した。 各標本は本発明の用具を使用して試験し、また標準の培養法を使用して試験し た。培養法によってコレラについて陽性と判定された全てのサンプルは、本発明 の用具を使用して同様に陽性と判定された。培養法によってコレラについて陰性 と判定された全てのサンプルは、本発明の用具を使用してやはり陰性と判定され た。 以下の界面活性剤を抽出試薬中で別々に試験した。 Tween-20 Triton X-100 Igepal Zwittergent Brij セチルトリアンモニウムブロマイド ポリエチレングリコール 高い Tween-20 濃度でのアッセイ性能の改良は、1％又はそれ未満あるいは2％ を越える Tween-20 濃度を使用すると見られなかった。さらに、Tween-20のこの 効果は、実験室においてブロース培養物から調製された生物について行われた試 験では見られなかった。 実施例３ この実施例では、実施例２の本発明の方法と用具を、ウンステップ大腸菌 Ｏ157 ストリップ試験に使用した。アフィニティ精製されたヤギ抗大腸菌血清型 Ｏ157 抗体を得、この実施例でコレラ菌抗体の代わりに使用した。この抗体調製 物の他の大腸菌株に対する交差反応性は、大腸菌の非 Ｏ157:Ｈ7 血清型を使用 して十分に吸着することにより最小にした。 大腸菌 Ｏ157:Ｈ7 細胞の純培養をＬＢブロースにおいて37℃で18時間増殖さ せた。細胞を、滅菌新鮮ＬＢブロース中に10倍連続希釈し、その後直接試験した 。各試験について、試験管中の希釈培養物の５滴（約 200μl）を試験ストリッ プに適用し、５分後に結果を調べた。2000細菌（コロニー形成単位）を含むサン プルから陽性の試験結果が得られた。 本発明の組成物と方法について種々の改変や変形が可能であることは当業者に 明らかであろう。従って、そのような改変及び変形は、添付の請求の範囲及びそ れらの等価物の範囲内にあるものである限り、本発明に包含されることが意図さ れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 チョウダリー，モハンメド，エー. アメリカ合衆国 20770 メリーランド州, グリーンベルト，スプリングヒル ドライ ブ ナンバー203 6203 (72)発明者 チャン，クレイグ アメリカ合衆国 20879 メリーランド州, ゲイザーズバーグ，サイプレス ヒル ド ライブ 7115 (72)発明者 カーター，ダイアン アメリカ合衆国 20755 メリーランド州, フォート ミード，ユニット ディー，フ ァウニアー ストリート 7303 (72)発明者 プラカッシュ，アンジャナ アメリカ合衆国 21136 メリーランド州, リースターズタウン，ゴアーズ ミル ロ ード 12827 (72)発明者 バーンスタイン，デイビッド アメリカ合衆国 21784 メリーランド州, エルダーバーグ，メルビル ロード 5814

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 糞便のサンプル中の分析対象物の存在または量を測定するための方法であっ て、以下の工程： Ａ.糞便のサンプルを、免疫クロマトグラフィーアッセイストリップに近接し ているかあるいは接触している吸収性フィルターに適用し、該サンプル中に存在 する分析対象物を免疫クロマトグラフィーアッセイストリップに移す工程、及び Ｂ.該免疫クロマトグラフィーアッセイストリップにより分析対象物の存在を 検出する工程、を包含する方法。 2．前記吸収性フィルターが、乾燥された界面活性剤を含み、該界面活性剤は再 湿潤されたときに、前記糞便のサンプルから前記分析対象物を抽出することがで きるものである請求項１に記載の方法。 3．前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン-脂肪酸である請求項２に記 載の方法。 4．前記ポリオキシエチレンソルビタン-脂肪酸が Tween-20 であり、そして吸収 剤重量の少なくとも0.5％で含まれる請求項３に記載の方法。 5．前記ポリオキシエチレンソルビタン-脂肪酸が、吸収剤重量の少なくとも1％ で含まれる請求項３に記載の方法。 6．前記免疫クロマトグラフィーアッセイストリップが多孔性のストリップを含 み、前記検出工程が該ストリップ内で生成された色を検出する工程を包含する請 求項１に記載の方法。 7．前記の色が金粒子により生成されたものである請求項６に記載の方法。 8．前記吸収性フィルター及び前記多孔性ストリップが同じ素材の部分である請 求項６に記載の方法。 9．前記吸収性フィルター及び前記多孔性ストリップが互いに近接しているか、 接触している別々の素材である請求項６に記載の方法。 10．前記糞便のサンプルを前記吸収性フィルターに適用する前に少くとも等容量 の抽出試薬と接触させる請求項１に記載の方法。 11．前記分析対象物が腸内生物から得られた表面抗原である請求項１に記載の方 法。 12．前記表面抗原が、コレラ菌抗原、大腸菌血清型 Ｏ157 リポ多糖及びサルモ ネラリポ多糖からなる群から選択される請求項11に記載の方法。 13．前記免疫クロマトグラフィーアッセイストリップが、以下： Ａ．前記分析対象物を特異的に認識することができる結合成分を結合して有す る第一群の粒子、及び Ｂ．該分析対象物を特異的に認識することができる結合成分を結合して有する 第二群の粒子を含み、ここで第一群の粒子の平均粒径が第二群の粒子の平均粒径 よりも大きいものである請求項１に記載の方法。 14．前記のより大きい粒子がセレンを含み、そしてより小さい粒子が金を含む請 求項13に記載の方法。 15．より小さい粒子の全容量がより大きい粒子の全容量を上回る請求項13に記載 の方法。 16．前記のより小さい粒子の平均粒径が50 nm未満であり、そして前記のより 大きい粒子の平均粒径が50 nmを越えるものである請求項15に記載の方法。 17．前記のより小さい粒子が金粒子である請求項16に記載の方法。 18．工程Ｂを、免疫クロマトグラフィーアッセイストリップ中のクロマトグラフ ィー移動によるサンプル中の分析対象物の量の測定として、分析対象物-粒子複 合体の存在または量を測定することにより行う請求項13に記載の方法。 19．前記ストリップの少なくとも一部分が抗体で被覆されている請求項18に記載 の方法。 20．分析対象物の検出用試験キットであって、以下： Ａ.少なくとも一種の界面活性剤を含む抽出試薬、及び Ｂ.該分析対象物を検出するための免疫試薬を含む免疫クロマトグラフィーア ッセイストリップに近接しているかあるいは接触している吸収性フィルター、 を含む試験キット。 21．前記クロマトグラフィーストリップが、以下： Ａ.前記分析対象物に対する抗体で被覆された金粒子、及び Ｂ.抗体がストリップの領域内に固定される、分析対象物に対する抗体、 を含む請求項20に記載の試験キット。 22．糞便サンプル中の分析対象物の存在または量を測定するための方法であって 、以下の工程: Ａ.糞便サンプルと少くとも一種の界面活性剤を含む抽出試薬とを接触させて 混合物を形成する工程、 Ｂ.免疫クロマトグラフィーアッセイストリップに近接しているかあるいは接 触している吸収性フィルターに該混合物を適用して、該サンプル中に存在する分 析対象物を免疫クロマトグラフィーアッセイストリップに移す工程、及び Ｃ.該免疫クロマトグラフィーアッセイストリップにより分析対象物の存在を 検出する工程、を包含する方法。 23．前記免疫クロマトグラフィーアッセイストリップが、多孔性のストリップを 含み、前記検出工程が該ストリップ内で生成された色を検出する工程を含む、請 求項22に記載の方法。 24．前記吸収性フィルター及び前記多孔性ストリップが同じ素材の部分である請 求項23に記載の方法。 25．前記吸収性フィルター及び前記多孔性ストリップが互いに近接しているか、 又は接触している別々の素材である請求項23に記載の方法。 26．前記糞便のサンプルを少くとも等容量の抽出試薬と接触させる請求項１に記 載の方法。 27．前記抽出試薬が、その臨界ミセル濃度以上の濃度で存在する界面活性剤の水 溶液を含む請求項１に記載の方法。 28．前記界面活性剤が Tween-20 であり、濃度が１パーセントを越える請求項27 に記載の方法。 29．糞便のサンプル中の分析対象物の存在または量を測定するための方法であっ て、以下の工程： Ａ.該サンプルを少くとも一種の界面活性剤を含む少なくとも等容量の抽出試 薬と接触させて混合物を形成する工程、 Ｂ.該混合物を、多孔性免疫クロマトグラフィーアッセイストリップに接触し ている吸収性フィルターに適用して、該サンプル中に存在する分析対象物を、免 疫クロマトグラフィーアッセイストリップに移す工程、ここで該免疫クロマトグ ラフィーアッセイストリップが以下： (i)分析対象物を特異的に認識することができる結合成分を結合して有する 第一群の粒子、及び (ii)該分析対象物を特異的に認識することができる結合成分を結合して有す る第二群の粒子を含み、第一群の粒子の平均粒径が第二の群の粒子の平均粒径よ りも大きいものであり、そして Ｃ．サンプル中の分析対象物の量を検出するために、分析対象物-粒子複合体 の存在または量を測定する工程、を包含する方法。