JP4030438B2 - 免疫学的測定方法および免疫クロマトグラフィー法測定キット。 - Google Patents
免疫学的測定方法および免疫クロマトグラフィー法測定キット。 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4030438B2 JP4030438B2 JP2003019952A JP2003019952A JP4030438B2 JP 4030438 B2 JP4030438 B2 JP 4030438B2 JP 2003019952 A JP2003019952 A JP 2003019952A JP 2003019952 A JP2003019952 A JP 2003019952A JP 4030438 B2 JP4030438 B2 JP 4030438B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- test
- solution
- antibody
- test liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的測定方法および免疫クロマトグラフィー法測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、免疫学的測定方法において、測定操作の簡便化と短時間化が可能な免疫クロマトグラフィー法が注目されており、各種の免疫クロマトグラフィー法測定キットが開発されている。ここで、免疫クロマトグラフィー法とは、免疫クロマトグラフィーテストストリップ（以下、単に「テストストリップ」とも称する）の展開メンブレン上を被検液を展開させ、該展開メンブレン上に設けた、検出用抗原または検出用抗体が固定化された検出部位上で、被検液に含まれる抗原又は抗体を捕捉し、これを検出する方法である。
【０００３】
その検出手法としては、サンドイッチ法、すなわち、上記展開メンブレン上を、被検液に随伴させて、被検液中の抗原または抗体に対応する標識抗体または標識抗原（以下、これらを単に「標識体」とも総称する）も展開させ、該標識体と結合した被検液中の抗原または抗体を検出用抗体または検出用抗原にて捕捉し、この補足された抗原または抗体に結合する標識体を検出する手法を採用するのが、迅速かつ簡便に測定を行うことができる等の理由から有利である。この場合、使用するテストストリップとしては、
i) 被検液を一時的に吸収し保持するための被検液保持部、
ii) 標識抗体または標識抗原が一時的に保持された標識体保持部、並びに
iii) 検出用抗体または検出用抗原が固定化され、前記被検液保持部に一時的に吸収し保持された被検液および該被検液に随伴して前記標識体保持部より流出した標識抗体または標識抗原が展開される展開メンブレン部
が、この順序で配置された構造をしたものを用いるのが一般的であり、且つ効率的である（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、このようなテストストリップを用いてサンドイッチ法により免疫学的測定を行おうとした場合、簡便且つ迅速に測定を行える反面、その迅速性ゆえに反応時間が短くなり、結合型と遊離型の分離も不十分になり、検出感度が不足する問題が生じていた。また、免疫クロマトグラフィー法では被検液を毛管現象により展開するので、被検液や標識体の展開性を、測定（各テストストリップ）毎に一定に制御することが難しく、検出結果の再現性にも問題があった。
【０００５】
このため、こうした免疫クロマトグラフィー法において検出感度を高めるための種々の検討がなされており、その施策の一つとして、抗原抗体反応を促進することや、展開中における標識体の分散性を高めることが行われている。例えば、一般に、抗原抗体反応は、水溶性高分子の存在下では、反応性が高まることが知られており、ラテックス凝集法等の免疫学的測定方法では、これを反応促進剤（増感剤ともいう）として測定系に存在させることが行われているため（例えば、非特許文献１、特許文献２参照）、この技術を免疫クロマトグラフィー法にも応用することが試みられている（例えば、特許文献３，４参照）。また、同水溶性高分子は、標識体の凝集を抑制するため、これを分散剤として、免疫クロマトグラフィー法の測定系に存在させることも試みられている（例えば、特許文献５参照）。
【０００６】
【特許文献１】
特開平０１−６３８６５号公報
【非特許文献１】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：１０７１−６，１９７４．
【特許文献２】
特開昭５８−４７２５６号公報
【特許文献３】
特開２００２−１４８２６６号公報
【特許文献４】
特開２００２−３１６３９号公報
【特許文献５】
特開平０５−１３３９５６号公報
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来、これらの方法において、使用される水溶性高分子は、重量平均分子量が１万〜１００万程度の大きいものが一般的であり、１万未満の重量平均分子量のものを、その実施例等において具体的に使用した例は知られていない。そうして、このように高分子量の水溶性高分子を用いた場合、測定感度は、ある程度には増感されるものの今一歩十分ではなく、また、検出可能になるまでの測定時間の短速化も十分ではなく、測定結果の再現性も依然として十分に満足できるものではないことが多かった。
【０００７】
特に、これらの公知技術において、実施例等で具体的に使用されている水溶性高分子の多くは、テストストリップ上において標識体保持部等に乾燥・保持させておき、被検液の展開中に溶解させる形態のものであり（例えば、前記特許文献５）、この場合においては、テストストリップに乾固された該水溶性高分子を、毛管現象により展開する被検液に溶解させる際の溶解力が弱く、該水溶性高分子を十分、且つ高度な再現性で溶解させることが困難であり、上記問題がより顕著に発生していた。
【０００８】
以上の背景にあって、本発明は、前記一般的な構成にあるテストストリップを用いてサンドイッチ法により免疫学的測定方法を実施するに際して、高感度で、短時間に再現性良く測定が行える方法を開発することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を続けてきた。その結果、特定の範囲の比較的低分子量の水溶性高分子を用い、且つこれを、テストストリップ上において乾燥・保持させるのではなく、予め被検液に溶解させて使用する手法と組合わせて使用することにより、上記の課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記の部位
i) 被検液を一時的に吸収し保持するための被検液保持部、
ii) 標識抗体または標識抗原が一時的に保持された標識体保持部、並びに
iii) 検出用抗体または検出用抗原が固定化され、前記被検液保持部に一時的に吸収し保持された被検液および該被検液に随伴して前記標識体保持部より流出した標識抗体または標識抗原が展開される展開メンブレン部
を有し、これらの部位が上記順序で配置された免疫クロマトグラフィーテストストリップを用いて、被検液中の抗原または抗体を検出する免疫学的測定方法において、予め被検液に、重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子を溶解させることを特徴とする免疫学的測定方法である。
【００１１】
また、本発明は、（ａ）前記構成のテストストリップ、および
（ｂ）１種または２種以上の被検液の調製用試薬からなり、該（ｂ）被検液の調製用試薬の少なくとも１種に、重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子が含まれてなる免疫クロマトグラフィー法測定キットも提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫学的測定方法では、テストストリップとして、i) 被検液を一時的に吸収し保持するための被検液保持部、ii) 標識抗体または標識抗原が一時的に保持された標識体保持部、並びにiii) 検出用抗体または検出用抗原が固定化され、前記被検液保持部に一時的に吸収し保持された被検液および該被検液に随伴して前記標識体保持部より流出した標識抗体または標識抗原が展開される展開メンブレン部が、この順序で配置された構成のものを使用する。
【００１３】
こうしたテストストリップは、上記構成のものであれば公知のものが制限なく使用可能であるが、一般には、図１および図２の概略図に示されるものが使用される。すなわち、このテストストリップは、１が被検液保持部であり、その端部に被検液が供給される。また、２は標識体保持部（コンジュゲートパッド）であり、標識抗体または標識抗原が保持された部位が設けられている。さらに、３は展開メンブレンであり、被検液の展開方向の下流に検出用抗体または検出用抗原が固定化された部位（検出部位５）を有している。そして、これらの各部は多孔性支持体により形成されており、これらは順に毛管流により連絡可能な状態で 配置されている。
【００１４】
したがって、上記テストストリップでは、被検液保持部１に被検液を供給すると、被検液が毛管流により標識体保持部２へ流れ、ここで該被検液の流れに標識体が随伴して展開メンブレン部３へ流れていく。そして、この流れの過程で反応した、被検液中の抗原または抗体と標識体の複合体を、展開メンブレン３の検出部位５に固定されている検出用抗体または検出用抗原で捕捉し、捕捉された標識体を検出することにより、被検液中の抗原または抗体の有無またはその多賓を測定することができる。このときに標識体が被検液と共に正常に展開されていることは、上記検出部位５の下流のコントロール判定部位６に標識体と反応する抗原または抗体を固定化しておき、この位置で標識体が検出されることにより確認することができる。
【００１５】
上記テストストリップにおいて、被検液保持部１は、供給した被検液を適量保持する目的で、ある程度大きな保持容量を有する部材で形成することもできる（このような目的で使用する被検液保持部１をサンプルパッドと呼ぶこともある）。また、被検液の展開性を向上する目的で、展開終了後の被検液を保持するために、展開メンブレン部３の下流に吸収部４を設けることもできる。更に、外界からの汚染を防止する目的で、上記テストストリップを適当な容器（ハウジングと呼ぶことがある）に収納し使用することもできる。
【００１６】
なお、図１および図２中に示される各寸法（長さ）は、単に大きさの目安を示すものであり、本発明の免疫クロマトグラフィー法で使用するテストストリップの大きさは、これら図に示される値に限定されるものではない。
【００１７】
標識体保持部２に保持させる標識体を構成する抗体および抗原は、被検液に含まれる抗原または抗体に免疫学的に反応するものが適宜に使用される。その保持量は、標識物質の種類や、抗体の反応性を勘案して、通常、０．００１〜１００μｇ／テストストリップの範囲から適宜に採択すればよい。
【００１８】
これらの抗体および抗原は、化学的、物理学的、生化学的に検出可能とするべく従来公知の標識処理が施される。該標識処理に使用する標識物質としては、放射性物質として放射性ヨード、放射性炭素等が、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等が、各種色素類として、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光色素類が、コロイドとして金コロイド、炭素コロイド等が、各種粒子としては着色ラテックス粒子等が使用出来る。
【００１９】
標識体保持部２への上記標識体の保持は、特に制限されるものではなく、該部位に標識体を添加して乾燥させればよいが、この部位から脱離し易くするためには、サッカロース等の糖類や水溶性分子を予め塗布、乾燥した後で該標識体を添加してから乾燥させる、或いは標識体を該糖類や水溶性分子と混合してから塗布し乾燥させるのが好適である。このような目的で糖類や水溶性分子を使用する場合には、重量平均分子量が２０００以下の糖類や水溶性分子を使用することが好ましい。重量平均分子量が２０００以下の糖類や水溶性分子を使用した場合は、脱離性を高める目的で使用する限りにおいては、一般に被検液中の該糖類や水溶性分子の濃度は抗原抗体反応の促進効果にほとんど影響を及ぼさないため、測定の再現性をより高度に保つことができる。
【００２０】
展開メンブレン部３に保持させる検出用抗体および検出用抗原は、被検液に含まれる抗原または抗体に免疫学的に反応するものが適宜に使用される。その保持量は、抗体の反応性や検出部位５の形態を勘案して、通常、０．０１〜１０００μｇ／テストストリップの範囲から適宜に採択すればよい。
【００２１】
これらの検出用抗体または検出用抗原の展開メンブレン部３への固定化方法は特に限定されず、従来公知の物理的吸着法や共有結合法が何ら制限無く使用できるし、他のタンパク質等と混合して固定化することもできる。また、展開メンブレン部３への他の成分の非特異的吸着を抑制するため、検出用抗体または検出用抗原を固定化後の展開メンブレン部３を公知の方法によりタンパク質、脂質、高分子化合物等によりブロッキング処理することもできる。このブロッキング処理に用いるタンパク質等は特に限定されるものではないが、一般的な免疫学的測定方法において、非特異的反応を抑制する目的で使用されている牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略すこともある）、スキムミルク等が好適である。また、被検液が展開メンブレン部３を均一に展開するように、被検液の展開メンブレン部３への 浸透性を調整するために、展開メンブレン部３の表面に親水性重合体や界面活性剤等を被覆または含浸させることもできる。
【００２２】
なお、展開メンブレン部３において、検出用抗体および検出用抗原を固定化する部位は、図１および図２に示される如くに必ずしもライン状である必要はなく、スポット状等任意の形状をとることができる。更に、検出部位５を支持体上に複数設置することで、複数の分析対象物質を同時に検出する、或いは同一の分析対象物質を複数の検出部位で検出することもできる。
【００２３】
同様に、展開メンブレン部３に前記コントロール判定部位６を設ける場合においても、その位置、順、形状、数等は適宜に設定できる。
【００２４】
図１および図２のテストストリップにおいて、前記各部材を構成する多孔性支持体の素材は特に限定されず、各部材の目的に応じて吸湿性材料、多孔質材料、繊維質材料等から適宜選択される。例えば、被検液保持部１としては、濾紙、吸取紙、ガラスフィルター等を用いるのが好適であり、標識体保持部２としてはガラス繊維布、ポリプロピレン不織布、ガラスフィルター等を用いるのが好適である。また、展開メンブレン部３としてはニトロセルロース、或いは酢酸セルロースを含むニトロセルロース等を用いるのが好適であり、吸収部４としては濾紙、吸取紙等を用いるのが好適である。
【００２５】
本発明の最大の特徴は、以上の構成のようなサンドイッチ法によるテストストリップを用いて、被検液中の抗原または抗体を検出するに際して、予め被検液に、重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子（以下、単に「特定非イオン性水溶性高分子」とも略する）を溶解させることにある。このように比較的低分子量の非イオン性水溶性高分子を用い、且つこれを、テストストリップ上において乾燥・保持させるのではなく、予め被検液に溶解させて使用する手法と組合わせて使用することにより、被検液中の抗原または抗体を、極めて高感度で迅速に測定することが可能になる。また、その測定の再現性も極めて良好になる。
【００２６】
ここで、使用する水溶性高分子は、非イオン性であることが必要であり、イオン性水溶性高分子を使用した場合には、安定的な検出が行えなくなるおそれがある。例えば、カチオン性水溶性高分子を使用した場合には、標識体として、金コロイド標識抗体や抗原、或いは抗体または抗原感作ラテックス粒子等を使用した際には、これらの粒子が通常帯びている負の表面ゼータ電位が打ち消され、粒子同士の凝集が生じ易くなる。また、アニオン性水溶性高分子を使用した場合には、被検液の展開性が悪くなる場合がある。
【００２７】
また、上記非イオン性水溶性高分子の重量平均分子量が２０００〜９０００、特に３０００〜８５００であることも極めて重要である。重量平均分子量が２０００未満の場合は、抗原抗体反応の十分な反応促進効果を得ることが困難になる。また、重量平均分子量が９０００より大きい場合は、十分な反応促進効果が得られるまでに被検液中の非イオン性水溶性高分子濃度を高めた場合に、被検液の展開性が悪くなり検出部位の発色が一定となるまでに長時間を要するようになったり、或いはテストストリップ間で標識体の検出強度にバラツキが生じたりするようになる。
【００２８】
被検液に溶解させる水溶性高分子の濃度は、十分な反応促進効果が得られ、且つ水溶性高分子を溶解した被検液の展開性を良好に保つ観点から、０．０１〜２０質量％、より好適には０．５〜１０質量％であるのが好ましい。
【００２９】
上記非イオン性水溶性高分子の種類としては、公知のものが特に制限なく使用できるが、具体的にはポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと略すこともある）、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール類；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（以下ＨＰＣと略すこともある）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース類；デンプン、デキストラン等の多糖類；ポリビニルアルコール（以下ＰＶＡと略すこともある）、ポリビニルピロリドン（以下ＰＶＰと略すこともある）、ポリビニルメチルエーテル等のビニル系高分子などを例示できる。これらの水溶性高分子は、一定の分子量のものを単独で使用してもよいし、所望の展開性や反応促進効果が得られるように、分子量分布や分子構造等の異なる複数のものを適宜混合して使用することもできる。
【００３０】
上記非イオン性水溶性高分子のうち、ポリアルキレングリコール類および／またはセルロース類を使用した場合は、特に高い反応促進効果が得られ好適である。中でも、ポリエチレングリコールを使用した場合は、重量平均分子量や分子量分布の異なるものを容易に入手でき、これらを適宜混合することで被検液の粘性、展開性、反応促進効果を容易に所望の程度に調整することができるため最も好ましい。
【００３１】
本発明において、上記２０００〜９０００の重量平均分子量を有する非イオン性水溶性高分子は、予め、被検液に溶解させて使用する。すなわち、このように比較的低分子量の非イオン性水溶性高分子を使用したとしても、これをテストストリップに乾燥・保持する方法では、毛管流として展開される被検液への溶解性や混合の均一性が十分ではなく、その効果を十分且つ安定的に発揮させることが困難である。これに対して、本発明では、上記の如く水溶性高分子を予め、被検液に溶解させておくことにより、この問題を解消し、前記したような優れた効果を達成することが可能になる。
【００３２】
被検液に特定非イオン性水溶性高分子を溶解する方法は、特に限定されず、該水溶性高分子の固体、或いは所定濃度の溶液（以下、「水溶性高分子原液」と表記することもある）を必要量添加する方法を適宜に採択すればよい。水溶性高分子原液は、精製水；生理食塩水等の各種塩溶液；トリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下「トリス」と略すこともある）緩衝液、リン酸緩衝液等の各種緩衝液等の水性液体に、特定非イオン性水溶性高分子の必要量を溶解することにより調製される。
【００３３】
次に、本発明の免疫学的測定方法が測定対象とする抗原または抗体を説明する。本発明において、上記抗原または抗体は、公知のものが制限無く対象になる。例えば、抗原としては、アルブミン、ヘモグロビン、プロテインA等のタンパク質や糖タンパク質；高比重リポタンパク質、低比重リポタンパク質等の脂質タンパク質；アルカリ性ホスファターゼ、リパーゼ、アミラーゼ等の酵素タンパク質；各種糖類；核酸；レセプター；各種微生物抗原等が例示される。また、抗体としてはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の免疫グロブリンが例示される。
【００３４】
本発明では、これらの抗原または抗体が、前記テストストリップを毛管現象により展開可能な状態で溶解、分散、または懸濁されている水性液体が被検液とされる。これらの抗原または抗体を含む採取対象物としては、例えば、微生物の培養液、微生物の懸濁液、食品およびその懸濁液、咽頭ぬぐい液、唾液、血漿、血清、尿等の体液、或いは歯垢の懸濁液等が挙げられる。
【００３５】
これらの採取対象物からの被検液の調製は、測定対象とする抗原または抗体の性状や分析の目的に応じて適宜に行えばよい。例えば、採取対象物が、血液、尿、唾液等の体液、或いは環境水等の水性液体の場合、これらを採取し、そのまま被検液として使用することも可能である。通常は、前記採取対象物を、適宜に、希釈、溶解、懸濁等の処理を施して使用するのが一般的である。被検液中に、抗原抗体反応を阻害する物質が共存している場合等には、阻害物質の分解処理、検出対象の抗原または抗体の抽出処理や精製処理等を施して、被検液を調製すればよい。
【００３６】
微生物（細菌、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、及び単細胞真核生物を指す）を免疫クロマトグラフィー法で分析する場合は、一般に採取した試料中に含まれる微生物濃度が小さい為に、免疫クロマトグラフィー法の感度が不足する場合がある。このような場合には、その測定感度を向上させるために、微生物菌体に結合または付着した、或いは該菌体内に含まれる特定の抗原を抽出処理したものを被検液として使用するのが好ましいが、これを本発明の免疫学的測定方法により測定することにより、さらに高感度で測定が行えるため好適である。
【００３７】
本発明の方法を適用するのに最も好適な被検液としては、糖鎖抗原を有する微生物から該糖鎖抗原を亜硝酸抽出法により抽出した液（以下、単に「亜硝酸抽出溶液」とも言う）が例示できる。すなわち、亜硝酸抽出法は、短時間に且つ高い効率で、微生物から血清型多糖抗原等の特異性の高い糖鎖抗原を抽出できるので（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）、微生物を免疫クロマトグラフィー法にて分析する場合には有利である。しかしながら、亜硝酸抽出法においては高濃度の亜硝酸塩水溶液を酸性条件下で使用することから、亜硝酸抽出溶液には亜硝酸に由来する塩や中和により生じた塩が高濃度に含まれる。その為、該亜硝酸抽出溶液は、免疫クロマトグラフィー法における展開性が十分でない。このような被検液に、本発明の方法を適用することにより、前記効果を特に顕著に発揮させ、希釈等により被検液の塩濃度を下げることなく、良好に被検液を展開させて、高感度に上記糖鎖抗原を検出することできる。
【００３８】
この場合、糖鎖抗原を有する微生物としては、齲蝕関連菌であるのが好ましい。すなわち、近年、歯牙の齲蝕のリスクを診断するために、口腔内より採取した唾液や歯垢中に存在する齲蝕関連菌濃度を測定することが試みられている。これらの齲蝕関連菌の多くは、糖鎖抗原を有する微生物であるが、唾液や歯垢中に１０４〜１０７個／ｍｌ程度に微量にしか含まれておらず、さらに通常は、不溶性グルカンに覆われた凝集状態で存在しているため、免疫クロマトグラフィー法における展開性が著しく悪い。したがって、唾液や歯垢の懸濁液をそのまま被検液として使用しても、該齲蝕関連菌の測定感度は極めて低くなるので、上記の如くに糖鎖抗原を亜硝酸抽出法により抽出して、得られた亜硝酸抽出溶液を被検液として本発明の測定方法に適用する方法が最も適している。
【００３９】
なお、唾液や歯垢の懸濁液は、遠心分離法や濾過法により処理し、その不溶性画分を分離し、被検液の調製に供するのが高感度な測定を行う観点から好ましい。
【００４０】
ここで、上記齲蝕関連菌としては、具体的には、ミュータンスレンサ球菌に属する細菌（ストレプトコッカス・ミュータンスやストレプトコッカス・ソブリヌスを例示できる）、ラクトバチルス属に属する細菌、アクチノミセス属に属する細菌を挙げることができる。
【００４１】
亜硝酸抽出法は、微生物に亜硝酸水溶液を作用させる従来公知の方法を制限無く採用することができる。この亜硝酸水溶液は、一般的には亜硝酸塩水溶液と酸水溶液とを混合することで調製できる。このような亜硝酸塩水溶液としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の水溶液が、酸水溶液としては酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸水溶液や硝酸、塩酸等の無機酸水溶液を使用することができる。
【００４２】
得られた亜硝酸抽出溶液は、残留する酸により酸性を呈しているため、中和してから被検液とするのが好ましい。この中和に使用する塩基性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、トリス水溶液等の各種塩基を含む水溶液、或いはトリス−塩酸緩衝液、ホウ砂−ホウ酸緩衝液、グリシンアミド−水酸化ナトリウム緩衝液等の各種緩衝液を使用することができる。中和処理後の被検液のｐＨは、免疫クロマトグラフィー法において抗原抗体反応を十分に行わせる観点からｐＨ６．０〜１０．０になるよう調整するのが良い。
【００４３】
糖鎖抗原を有する微生物に亜硝酸を作用させる方法は特に限定されず、例えば、該微生物を含む液体試料を採取し、該液体試料の所定量に対し所定量の亜硝酸水溶液を添加し、所定の温度下（通常は１０〜６０℃）にて所定時間（通常は０．５〜３０分）反応させた後、中和する方法が採用できる。また、液体試料に遠心分離や濾過処理等を施して不溶性画分（菌体を含む画分）を採取し、該不溶性画分に対し亜硝酸水溶液と塩基性水溶液を順に作用させる方法を採用することも可能である。
【００４４】
本発明において、上記説明したような被検液の調製は、（ａ）前記構成のテストストリップと（ｂ）抗原または抗体の採取対象物から被検液を調製する際に使用する種々の調製用試薬からなる免疫クロマトグラフィー法測定キットを用いて実施するのが好ましい。その場合において、特定非イオン性水溶性高分子は、（ｂ）被検液の調製用試薬の構成試薬の一つとして、錠剤等の固形物として設けても良いが、操作を効率的に行うには、（ｂ）１種または２種以上からなる被検液の調製用試薬において、その少なくとも１種に含有させるのが好ましい。この場合、調製用試薬に含有させる特定非イオン性水溶性高分子の濃度は、最終的に得られる被検液中において該水溶性高分子が所望濃度になるように調整しておくことが必要である。特定非イオン性水溶性高分子を含有させておく調製用試薬としては、抗原または抗体を含む採取対象物に対して使用する調製用試薬の如何なるものであっても良い。
【００４５】
前記したように被検液に含有される抗原が、糖鎖抗原を有する微生物の該糖鎖抗原であり、被検液が、上記糖鎖抗原を有する微生物から該糖鎖抗原を亜硝酸抽出法により抽出することにより調製する場合においては、特定非イオン性水溶性高分子は亜硝酸水溶液からなる抽出液および／または中和用塩基性水溶液に含有させておくのが好適である。
【００４６】
上記特定非イオン性水溶性高分子を含有させた調製用試薬には、必要に応じて抗菌剤や酸化防止剤等の公知の添加剤を、本発明の効果を損なわない範囲で少量含有させても良い。
【００４７】
本発明において、前記構成のテストストリップを用いて、上記の予め特定非イオン性水溶性高分子を溶解させた被検液を免疫クロマトグラフィー法により測定する具体的手順は、例えば以下のような手順が、迅速簡便に測定を行えることから好ましい。即ち、まず、予め特定非イオン性水溶性高分子を溶解させた被検液（例えば１００〜２００μｌ）を分取し、前記テストストリップの被検液保持部１に添加し、所定時間（例えば１〜３０分）静置した後、該ストリップの検出部位５およびコントロール判定部位６の着色の有無あるいはその状態により判定することにより、被検液中に検出対象とする抗原または抗体が存在するか否か、或いはその量を知る方法である。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００４９】
製造例１〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の作製〕
（１）［菌体試料懸濁液の調製］
ブレインハートインフュージョン（以下「ＢＨＩ」と略すこともある）（ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの超純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地２ｍｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｃ）を３７℃、５時間、嫌気条件下（Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０）で培養した後、培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。
【００５０】
次いで、沈殿物を５ｍｌのリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略すこともある）に懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。その後得られた菌体沈殿をＰＢＳに懸濁し、Ａ６００＝１．０に調整しＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液とした。なお、該菌体試料懸濁液を超音波処理後、適宜希釈した後にＢＨＩ培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体試料懸濁液の希釈倍率を乗じることで該菌体試料懸濁液の菌体濃度を求めたところ、約１×１０９個／ｍｌであった。
【００５１】
（２）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清の作製〕
免疫は以下のように実施した。
【００５２】
第１週は０．５ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第２週は１．０ｍｌの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第３週は２．０ｍｌの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第４週は第３週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より１週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
【００５３】
（３）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の精製〕
オートクレーブ処理したＢＨＩ液体培地１Ｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔを３７℃、１２時間、嫌気条件下で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍｌのＰＢＳに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。
【００５４】
Ｉｎｇｂｒｉｔｔ菌体を洗浄した後、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁しＡ６００＝１５に調整した。ここにプロナーゼ（和光純薬社）を５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。反応終了後、遠心分離し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。次いで２０ｍｌの０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で３回洗浄し、更に２０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ６００＝１２．５）を調製した。
【００５５】
次いで、該プロテアーゼ処理菌体懸濁液と（２）で調製した抗血清０．５ｍｌとを混合し、４℃、６０分反応させた。混合液を４０００ｇ、５分遠心分離し、菌体を回収した。この菌体を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い洗浄した。
【００５６】
次いで、０．５ｍｌの０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）に菌体を懸濁し、吸着した抗体を溶出し、遠心分離により上清を回収し、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。同様の溶出操作を４回行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【００５７】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記溶出液を添加し、５ｍｌ洗浄後、５ｍｌの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ２８０を測定することで確認した。
【００５８】
以上により、抗血清（０．５ｍｌ）をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体を１ｍｇ得た。
【００５９】
実施例１〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原を含む被検液の調製と免疫クロマトグラフィー法による分析（１）〕
（１）〔遠心分離法を使用した亜硝酸抽出法による被検液の調製〕
製造例１（１）で調製した１×１０９個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液をＰＢＳで１０００倍希釈し、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液を調製した。この、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液１ｍｌをサンプリングチューブに分取し、１００００ｇ、１０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿に、１２５μｌの２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と１２５μｌの０．５Ｍ酢酸水溶液を添加し、良く混合後室温で１０分間放置した。次いで、７５０μｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、良く混合し反応を停止した。次いで、１００００ｇ、１０分間遠心分離し、上清（亜硝酸抽出溶液）を回収した。該亜硝酸抽出溶液を、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液とした。
【００６０】
１２．５ｍｌの２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と１２．５ｍｌの０．５Ｍ酢酸水溶液を混合し、室温で１０分間放置した。次いで、７５ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、良く混合し反応を停止した。このようにして調製した亜硝酸抽出溶液を、検体希釈液とした。
【００６１】
２ｇのポリエチレングリコール６０００（数字は重量平均分子量を示す）を全量１０ｍｌとなるよう検体希釈液に溶解し、２０％ＰＥＧ６０００を含む検体希釈液を調製した。１００μｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液と７８０μｌの検体希釈液及び１２０μｌの２０％ＰＥＧ６０００を含む検体希釈液を混合することで、終濃度２．４％のＰＥＧ６０００を含む１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００６２】
同様の方法にて、ＰＥＧ３０００、及びＰＥＧ８０００を含む検体希釈液とＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液、及び検体希釈液を適宜混合し、所定の重量平均分子量のＰＥＧを所定の濃度で、且つ１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００６３】
同様に、陰性コントロールとして各種ＰＥＧを含む検体希釈液と検体希釈液を適宜混合し、所定の重量平均分子量のＰＥＧを所定の濃度で含み、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含まない被検液を得た。
【００６４】
（２）〔金コロイド標識されたストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の調製〕
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）１０ｍｌに１００ｍＭＫ２ＣＯ３を２μｌ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝１．０であった。
【００６５】
次いで、１ｍｇ／ｍｌに調整した製造例１（３）で調製したポリクローナル抗体の２ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）６４μｌを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍｌ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍｌの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。該再懸濁した画分の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝４．９であった。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識抗体」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【００６６】
（３）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップの作製〕
ニトロセルロースメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ１８０、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン部３上の検出部位５及びコントロール判定部位６上に、それぞれ１ｍｇ／ｍｌの製造例１（３）で調製したポリクローナル抗体及び抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（ＩＣＮファーマシューティカルズ社）１μｌをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥し抗体を固定化した。該抗体固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００６７】
また、標識体保持部２であるコンジュゲートパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッド２に（２）で調製した金コロイド標識抗体をＡ５２０＝１．０に調整したものを２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、被検液保持部１であるサンプルパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、展開終了後の被検液を保持するための吸収部４である吸収パッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
【００６８】
このように調製した、図１に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。
【００６９】
（４）〔免疫クロマトグラフィー法における被検液の分析〕
免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド２上に、（１）で得られた各種被検液１００μｌを添加し、５分、１０分、２０分、３０分後にスポット発色の有無と強度を判定した。測定は、各被検液ごとに５回行った。判定は、固定化抗体スポット上に捕捉された金コロイドの程度を４段階（＋＋＋：発色強度が強い、＋＋：発色強度が中程度、＋：発色強度が弱い、−：発色しない）に目視で識別した。また、（１）にて調製したＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液を検体希釈液にて１０倍希釈することで、１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含みＰＥＧを含まない被検液を得、該被検液並びに検体希釈液だけを上記と同様の操作により分析した。結果を表１、表２に示した。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
表１、表２より、重量平均分子量が３０００、６０００、８０００のポリエチレングリコールを使用した場合は、それぞれ５回の測定の全てにおいて測定開始後５分以降発色強度は変化せず、短時間に、且つ再現性よく判定することができた。Ｉｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含まない被検液並びに検体希釈液では非特異的発色は検出されなかった。
【００７３】
比較例１〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原を含む被検液の調製と免疫クロマトグラフィー法による分析〕
実施例１（１）にてＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１２０００、及びＰＥＧ２００００を使用すること以外は、実施例１（１）〜（４）と同様の操作を行った。結果を表３、表４に示した。
【００７４】
【表３】
【００７５】
【表４】
【００７６】
表３から、重量平均分子量が１０００のポリエチレングリコールを使用した場合は、ポリエチレングリコール濃度を実用上十分高くした場合も十分な増感効果が得られなかった。また、重量平均分子量が１２０００のポリエチレングリコールを使用した場合は２回の測定において、更に重量平均分子量が２００００のポリエチレングリコールを使用した場合は５回の測定において測定開始後５分以降発色強度が経時的に強くなり、発色強度の再現性が悪かった。
【００７７】
比較例２〔ポリエチレングリコールを乾固した免疫クロマトグラフィーテストストリップを使用したストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原を含む被検液の分析〕
（１）〔遠心分離法を使用した亜硝酸抽出法によるポリエチレングリコールを含まない被検液の調製〕
実施例１（１）で調製した、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液を、検体希釈液で１０倍希釈することで、１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００７８】
（２）〔ポリエチレングリコールを乾固した免疫クロマトグラフィーテストストリップの作製〕
金コロイド標識抗体を実施例１（２）と同様に作製した。ニトロセルロースメンブレン、サンプルパッド、及び吸収パッドは実施例１（３）と同様の処理を施した。
【００７９】
標識体保持部２であるコンジュゲートパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。実施例１（２）で調製した金コロイド標識抗体に、Ａ５２０＝１．０、終濃度９．６％となるようＰＥＧ６０００を添加した。コンジュゲートパッド２に、該金コロイド標識抗体を２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。同様に、２０．０％のＰＥＧ３０００或いは８．８％のＰＥＧ８０００を含む、Ａ５２０＝１．０の金コロイド標識抗体２５μｌを添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００８０】
このように調製した、図１に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。
【００８１】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法における被検液の分析〕
免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド２上に、上記比較例２（１）で得られた被検液１００μｌを添加し、５分、１０分、２０分、３０分後にスポット発色の有無と強度を判定した。測定は、各被検液ごとに５回行った。判定は、実施例１（４）と同様に行った。結果を表５に示した。同様に、検体希釈液を分析した結果を表６に示した。
【００８２】
【表５】
【００８３】
【表６】
【００８４】
表５、表６より、重量平均分子量が３０００、６０００、８０００のポリエチレングリコールを乾固した免疫クロマトグラフィーテストストリップを使用した場合は、測定開始後５分以降発色強度が経時的に強くなり発色が安定せず、短時間に、且つ再現性よく判定することができなかった。
【００８５】
実施例２〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原を含む被検液の調製と免疫クロマトグラフィー法による分析（２）〕
（１）〔遠心分離法を使用した亜硝酸抽出法による被検液の調製〕
実施例１（１）と同様に、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液及び検体希釈液を調製した。
【００８６】
２ｇのデキストラン（重量平均分子量６０００）を全量１０ｍｌとなるよう検体希釈液に溶解し、２０％デキストランを含む検体希釈液を調製した。１００μｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液と７８０μｌの検体希釈液及び１２０μｌの２０％デキストランを含む検体希釈液を混合することで、終濃度２．４％のデキストランを含む１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００８７】
同様の方法にて、それぞれ重量平均分子量６０００のＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含む検体希釈液とＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液、及び検体希釈液を混合し、終濃度２．４％の上記水溶性高分子を含み、且つ１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００８８】
（２）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップの作製〕
実施例１（２）、（３）の方法に従い、免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。
【００８９】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法における被検液の分析〕
免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド２上に、上記（１）で得られた各種被検液１００μｌを添加し、５分、１０分、２０分、３０分後にスポット発色の有無と強度を判定した。測定は、各被検液ごとに５回行った。判定は、実施例１（４）と同様に行った。結果を表７に示した。同様に、終濃度２．４％の（１）の各種水溶性高分子を含む検体希釈液調製し、同様に分析した。結果を表８に示した。
【００９０】
【表７】
【００９１】
【表８】
【００９２】
表７、表８より、ポリエチレングリコール又はヒドロキシプロピルセルロースを使用した場合は、特に高い発色強度が得られ、且つ、短時間に再現性よく判定することができた。
【００９３】
実施例３〔免疫クロマトグラフィー法測定キットを使用した唾液からのストレプトコッカス・ミュータンスの検出〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
被験者にパラフィンペレットを５分間噛ませ、分泌された唾液を滅菌容器に吐き出させることで回収した。
【００９４】
得られた唾液を４０Ｗ、１０秒間超音波処理した後、適宜希釈して、１００μｌをミチス・サリバリウス・バシトラシン（以下、「ＭＳＢ」と表記することもある。）固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、４８時間培養した。ＭＳＢ固体培地上に生じるコロニー数を計数し、唾液の希釈率から、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を個／ｍｌとして算出した。ＭＳＢ固体培地上には主としてストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスが、また、一部の口腔内細菌が生育する。コロニーの形態学的分類、及び形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法及び、糖発酵試験等の生化学的方法により、ストレプトコッカス・ミュータンスをストレプトコッカス・ソブリヌス及び他の口腔内細菌と識別し、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を測定した。
【００９５】
（２）〔濾過装置を使用した亜硝酸抽出法による被検液の調製〕
ＳＣカートリッジ８（マルエム社）に直径１２ｍｍの円形に切り取ったガラス繊維濾紙９（アドバンテック東洋社、ＧＡ−１００）をセットし、図３の構造の濾過装置７を作製した。
【００９６】
（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過装置７に添加し、シリンジをセットした蓋１０を閉めてシリンジにより加圧濾過した。蓋１０を開け、濾過装置７に５００μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を添加し同様に濾過した。次いで、２００μｌの１Ｍ酢酸水溶液と２００μｌの４．８％ＰＥＧ６０００を含む２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液を混合し、０．５Ｍ酢酸−１Ｍ亜硝酸ナトリウム−２．４％ＰＥＧ６０００水溶液を調製した。２５０μｌの０．５Ｍ酢酸−１Ｍ亜硝酸ナトリウム−２．４％ＰＥＧ６０００水溶液を濾過装置７に添加し、直ちにシリンジで加圧し濾過した。室温で２分間放置した後、２．４％のＰＥＧ６０００を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１５０μｌを添加し、加圧濾過することで約１５０μｌの濾液を回収した。このようにして得られた濾液を、終濃度２．４％のＰＥＧ６０００を含む被検液とした。
【００９７】
同様に、１０％ＰＥＧ３０００を含む２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と５％のＰＥＧ３０００を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、４．４％ＰＥＧ８０００を含む２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と２．２％のＰＥＧ８０００を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）をそれぞれ使用し、上記ＰＥＧ６０００の場合と同様の操作に従い所定の重量平均分子量のＰＥＧを所定の濃度で含 む被検液を得た。
【００９８】
（３）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップによる被検液のストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
実施例１（２）、（３）の方法に従い、免疫クロマトグラフィーテストストリップを作製した。該免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド１上に、（１）で得られた各種被検液１００μｌを添加し、５、１０、３０分後のスポット発色の有無と強度を判定した。判定は、実施例１（４）と同様に行った。
【００９９】
免疫クロマトグラフィーテストストリップの判定結果と、（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表９に示す。
【０１００】
【表９】
【０１０１】
表９より、重量平均分子量が３０００、６０００、８０００のＰＥＧを添加した場合は、発色が短時間に（５分以内に）飽和し、以降で判定は変わらなかった。被検液中に含まれる糖鎖抗原濃度は、唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度に相関することから、迅速、簡便に、且つ再現性良く糖鎖抗原濃度、言い換えれば、唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度を測定できた。
【０１０２】
比較例３〔ＰＥＧを使用しない免疫クロマトグラフィー法による唾液からのストレプトコッカス・ミュータンスの検出〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
実施例３（１）の方法に従った。
【０１０３】
（２）〔濾過装置を使用した亜硝酸抽出法によるＰＥＧを含まない被検液の調製〕
ＳＣカートリッジ８（マルエム社）に直径１２ｍｍの円形に切り取ったガラス繊維濾紙９（アドバンテック東洋社、ＧＡ−１００）をセットし、図３の構造の濾過装置７を作製した。
【０１０４】
（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過装置７に添加し、シリンジをセットした蓋１０を閉めてシリンジにより加圧濾過した。蓋１０を開け、濾過装置７に５００μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を添加し同様に濾過した。次いで、２５０μｌの０．５Ｍ酢酸−１Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液を濾過装置７に添加し、直ちにシリンジで加圧し濾過した。室温で２分間放置した後、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１５０μｌを添加し、加圧濾過することで約１５０μｌの濾液を回収した。このようにして得られた濾液を、ＰＥＧを含まない被検液とした。
（３）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップによるＰＥＧを含まない被検液のストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
実施例１（２）、（３）の方法に従い、免疫クロマトグラフィーテストストリップを作製した。該免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド１上に、（２）で得られた被検液１００μｌを添加し、５、１０、３０分後のスポット発色の有無と強度を判定した。判定は、実施例１（４）と同様に行った。
【０１０５】
免疫クロマトグラフィーテストストリップの判定結果と、上記比較例３（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表１０に示す。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
表１０より、ＰＥＧを添加しない被検液を分析した場合は、発色強度が不足しており、陽性の判定が得られるまでに長時間（１０〜３０分）を要した。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫クロマトグラフィー法において、極めて高感度に測定を行うことができる。加えて、検出部位の発色のテストストリップ間差を無くすことができるので、被検液中の分析対象物質の濃度を、短時間に、再現性良く測定することが可能な免疫クロマトグラフィー法に基づく免疫学的測定方法を提供できる。本発明によれば、従来その測定を再現性良く実施することが困難であった亜硝酸抽出溶液のような、展開性の悪い被検液中に含まれる分析対象物質を短時間に、再現性良く、高感度に測定できる。
【０１０９】
また、本発明によれば、免疫クロマトグラフィーテストストリップ及び被検液の調製用試薬からなる、迅速、且つ簡便に実施可能で、短時間に且つ再現性良く被検液中に含まれる分析対象物質を測定可能な免疫クロマトグラフィー法測定キットが提供される。このようなキットを使用し、例えば唾液中のミュータンスレンサ球菌等の齲蝕関連菌濃度などを、再現性良く短時間に、高感度に測定することができる。
【０１１０】
このように、本発明により、免疫クロマトグラフィー法に基づく迅速且つ正確な免疫学的測定方法、並びに免疫学的測定キットを提供できるので、環境分析や臨床検査の分野に与える影響は計り知れない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、本発明の免疫クロマトグラフィー法で使用するテストストリップの各部材の概略図である。
【図２】本図は、本発明の免疫クロマトグラフィー法で使用するテストストリップの側面図である。
【図３】本図は、本発明の免疫クロマトグラフィー法キットで使用する唾液処理用の濾過装置の側面図である。
【符号の説明】
１・・・被検液保持部
２・・・標識体保持部
３・・・展開メンブレン部
４・・・吸収部
５・・・検出用抗体または検出用抗原が固定化された部位（検出部位）
６・・・コントロール判定部位
７・・・濾過装置
８・・・ＳＣカートリッジ
９・・・ガラス繊維濾紙
１０・・蓋
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的測定方法および免疫クロマトグラフィー法測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、免疫学的測定方法において、測定操作の簡便化と短時間化が可能な免疫クロマトグラフィー法が注目されており、各種の免疫クロマトグラフィー法測定キットが開発されている。ここで、免疫クロマトグラフィー法とは、免疫クロマトグラフィーテストストリップ（以下、単に「テストストリップ」とも称する）の展開メンブレン上を被検液を展開させ、該展開メンブレン上に設けた、検出用抗原または検出用抗体が固定化された検出部位上で、被検液に含まれる抗原又は抗体を捕捉し、これを検出する方法である。
【０００３】
その検出手法としては、サンドイッチ法、すなわち、上記展開メンブレン上を、被検液に随伴させて、被検液中の抗原または抗体に対応する標識抗体または標識抗原（以下、これらを単に「標識体」とも総称する）も展開させ、該標識体と結合した被検液中の抗原または抗体を検出用抗体または検出用抗原にて捕捉し、この補足された抗原または抗体に結合する標識体を検出する手法を採用するのが、迅速かつ簡便に測定を行うことができる等の理由から有利である。この場合、使用するテストストリップとしては、
i) 被検液を一時的に吸収し保持するための被検液保持部、
ii) 標識抗体または標識抗原が一時的に保持された標識体保持部、並びに
iii) 検出用抗体または検出用抗原が固定化され、前記被検液保持部に一時的に吸収し保持された被検液および該被検液に随伴して前記標識体保持部より流出した標識抗体または標識抗原が展開される展開メンブレン部
が、この順序で配置された構造をしたものを用いるのが一般的であり、且つ効率的である（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、このようなテストストリップを用いてサンドイッチ法により免疫学的測定を行おうとした場合、簡便且つ迅速に測定を行える反面、その迅速性ゆえに反応時間が短くなり、結合型と遊離型の分離も不十分になり、検出感度が不足する問題が生じていた。また、免疫クロマトグラフィー法では被検液を毛管現象により展開するので、被検液や標識体の展開性を、測定（各テストストリップ）毎に一定に制御することが難しく、検出結果の再現性にも問題があった。
【０００５】
このため、こうした免疫クロマトグラフィー法において検出感度を高めるための種々の検討がなされており、その施策の一つとして、抗原抗体反応を促進することや、展開中における標識体の分散性を高めることが行われている。例えば、一般に、抗原抗体反応は、水溶性高分子の存在下では、反応性が高まることが知られており、ラテックス凝集法等の免疫学的測定方法では、これを反応促進剤（増感剤ともいう）として測定系に存在させることが行われているため（例えば、非特許文献１、特許文献２参照）、この技術を免疫クロマトグラフィー法にも応用することが試みられている（例えば、特許文献３，４参照）。また、同水溶性高分子は、標識体の凝集を抑制するため、これを分散剤として、免疫クロマトグラフィー法の測定系に存在させることも試みられている（例えば、特許文献５参照）。
【０００６】
【特許文献１】
特開平０１−６３８６５号公報
【非特許文献１】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：１０７１−６，１９７４．
【特許文献２】
特開昭５８−４７２５６号公報
【特許文献３】
特開２００２−１４８２６６号公報
【特許文献４】
特開２００２−３１６３９号公報
【特許文献５】
特開平０５−１３３９５６号公報
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来、これらの方法において、使用される水溶性高分子は、重量平均分子量が１万〜１００万程度の大きいものが一般的であり、１万未満の重量平均分子量のものを、その実施例等において具体的に使用した例は知られていない。そうして、このように高分子量の水溶性高分子を用いた場合、測定感度は、ある程度には増感されるものの今一歩十分ではなく、また、検出可能になるまでの測定時間の短速化も十分ではなく、測定結果の再現性も依然として十分に満足できるものではないことが多かった。
【０００７】
特に、これらの公知技術において、実施例等で具体的に使用されている水溶性高分子の多くは、テストストリップ上において標識体保持部等に乾燥・保持させておき、被検液の展開中に溶解させる形態のものであり（例えば、前記特許文献５）、この場合においては、テストストリップに乾固された該水溶性高分子を、毛管現象により展開する被検液に溶解させる際の溶解力が弱く、該水溶性高分子を十分、且つ高度な再現性で溶解させることが困難であり、上記問題がより顕著に発生していた。
【０００８】
以上の背景にあって、本発明は、前記一般的な構成にあるテストストリップを用いてサンドイッチ法により免疫学的測定方法を実施するに際して、高感度で、短時間に再現性良く測定が行える方法を開発することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を続けてきた。その結果、特定の範囲の比較的低分子量の水溶性高分子を用い、且つこれを、テストストリップ上において乾燥・保持させるのではなく、予め被検液に溶解させて使用する手法と組合わせて使用することにより、上記の課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記の部位
i) 被検液を一時的に吸収し保持するための被検液保持部、
ii) 標識抗体または標識抗原が一時的に保持された標識体保持部、並びに
iii) 検出用抗体または検出用抗原が固定化され、前記被検液保持部に一時的に吸収し保持された被検液および該被検液に随伴して前記標識体保持部より流出した標識抗体または標識抗原が展開される展開メンブレン部
を有し、これらの部位が上記順序で配置された免疫クロマトグラフィーテストストリップを用いて、被検液中の抗原または抗体を検出する免疫学的測定方法において、予め被検液に、重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子を溶解させることを特徴とする免疫学的測定方法である。
【００１１】
また、本発明は、（ａ）前記構成のテストストリップ、および
（ｂ）１種または２種以上の被検液の調製用試薬からなり、該（ｂ）被検液の調製用試薬の少なくとも１種に、重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子が含まれてなる免疫クロマトグラフィー法測定キットも提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫学的測定方法では、テストストリップとして、i) 被検液を一時的に吸収し保持するための被検液保持部、ii) 標識抗体または標識抗原が一時的に保持された標識体保持部、並びにiii) 検出用抗体または検出用抗原が固定化され、前記被検液保持部に一時的に吸収し保持された被検液および該被検液に随伴して前記標識体保持部より流出した標識抗体または標識抗原が展開される展開メンブレン部が、この順序で配置された構成のものを使用する。
【００１３】
こうしたテストストリップは、上記構成のものであれば公知のものが制限なく使用可能であるが、一般には、図１および図２の概略図に示されるものが使用される。すなわち、このテストストリップは、１が被検液保持部であり、その端部に被検液が供給される。また、２は標識体保持部（コンジュゲートパッド）であり、標識抗体または標識抗原が保持された部位が設けられている。さらに、３は展開メンブレンであり、被検液の展開方向の下流に検出用抗体または検出用抗原が固定化された部位（検出部位５）を有している。そして、これらの各部は多孔性支持体により形成されており、これらは順に毛管流により連絡可能な状態で 配置されている。
【００１４】
したがって、上記テストストリップでは、被検液保持部１に被検液を供給すると、被検液が毛管流により標識体保持部２へ流れ、ここで該被検液の流れに標識体が随伴して展開メンブレン部３へ流れていく。そして、この流れの過程で反応した、被検液中の抗原または抗体と標識体の複合体を、展開メンブレン３の検出部位５に固定されている検出用抗体または検出用抗原で捕捉し、捕捉された標識体を検出することにより、被検液中の抗原または抗体の有無またはその多賓を測定することができる。このときに標識体が被検液と共に正常に展開されていることは、上記検出部位５の下流のコントロール判定部位６に標識体と反応する抗原または抗体を固定化しておき、この位置で標識体が検出されることにより確認することができる。
【００１５】
上記テストストリップにおいて、被検液保持部１は、供給した被検液を適量保持する目的で、ある程度大きな保持容量を有する部材で形成することもできる（このような目的で使用する被検液保持部１をサンプルパッドと呼ぶこともある）。また、被検液の展開性を向上する目的で、展開終了後の被検液を保持するために、展開メンブレン部３の下流に吸収部４を設けることもできる。更に、外界からの汚染を防止する目的で、上記テストストリップを適当な容器（ハウジングと呼ぶことがある）に収納し使用することもできる。
【００１６】
なお、図１および図２中に示される各寸法（長さ）は、単に大きさの目安を示すものであり、本発明の免疫クロマトグラフィー法で使用するテストストリップの大きさは、これら図に示される値に限定されるものではない。
【００１７】
標識体保持部２に保持させる標識体を構成する抗体および抗原は、被検液に含まれる抗原または抗体に免疫学的に反応するものが適宜に使用される。その保持量は、標識物質の種類や、抗体の反応性を勘案して、通常、０．００１〜１００μｇ／テストストリップの範囲から適宜に採択すればよい。
【００１８】
これらの抗体および抗原は、化学的、物理学的、生化学的に検出可能とするべく従来公知の標識処理が施される。該標識処理に使用する標識物質としては、放射性物質として放射性ヨード、放射性炭素等が、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等が、各種色素類として、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光色素類が、コロイドとして金コロイド、炭素コロイド等が、各種粒子としては着色ラテックス粒子等が使用出来る。
【００１９】
標識体保持部２への上記標識体の保持は、特に制限されるものではなく、該部位に標識体を添加して乾燥させればよいが、この部位から脱離し易くするためには、サッカロース等の糖類や水溶性分子を予め塗布、乾燥した後で該標識体を添加してから乾燥させる、或いは標識体を該糖類や水溶性分子と混合してから塗布し乾燥させるのが好適である。このような目的で糖類や水溶性分子を使用する場合には、重量平均分子量が２０００以下の糖類や水溶性分子を使用することが好ましい。重量平均分子量が２０００以下の糖類や水溶性分子を使用した場合は、脱離性を高める目的で使用する限りにおいては、一般に被検液中の該糖類や水溶性分子の濃度は抗原抗体反応の促進効果にほとんど影響を及ぼさないため、測定の再現性をより高度に保つことができる。
【００２０】
展開メンブレン部３に保持させる検出用抗体および検出用抗原は、被検液に含まれる抗原または抗体に免疫学的に反応するものが適宜に使用される。その保持量は、抗体の反応性や検出部位５の形態を勘案して、通常、０．０１〜１０００μｇ／テストストリップの範囲から適宜に採択すればよい。
【００２１】
これらの検出用抗体または検出用抗原の展開メンブレン部３への固定化方法は特に限定されず、従来公知の物理的吸着法や共有結合法が何ら制限無く使用できるし、他のタンパク質等と混合して固定化することもできる。また、展開メンブレン部３への他の成分の非特異的吸着を抑制するため、検出用抗体または検出用抗原を固定化後の展開メンブレン部３を公知の方法によりタンパク質、脂質、高分子化合物等によりブロッキング処理することもできる。このブロッキング処理に用いるタンパク質等は特に限定されるものではないが、一般的な免疫学的測定方法において、非特異的反応を抑制する目的で使用されている牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略すこともある）、スキムミルク等が好適である。また、被検液が展開メンブレン部３を均一に展開するように、被検液の展開メンブレン部３への 浸透性を調整するために、展開メンブレン部３の表面に親水性重合体や界面活性剤等を被覆または含浸させることもできる。
【００２２】
なお、展開メンブレン部３において、検出用抗体および検出用抗原を固定化する部位は、図１および図２に示される如くに必ずしもライン状である必要はなく、スポット状等任意の形状をとることができる。更に、検出部位５を支持体上に複数設置することで、複数の分析対象物質を同時に検出する、或いは同一の分析対象物質を複数の検出部位で検出することもできる。
【００２３】
同様に、展開メンブレン部３に前記コントロール判定部位６を設ける場合においても、その位置、順、形状、数等は適宜に設定できる。
【００２４】
図１および図２のテストストリップにおいて、前記各部材を構成する多孔性支持体の素材は特に限定されず、各部材の目的に応じて吸湿性材料、多孔質材料、繊維質材料等から適宜選択される。例えば、被検液保持部１としては、濾紙、吸取紙、ガラスフィルター等を用いるのが好適であり、標識体保持部２としてはガラス繊維布、ポリプロピレン不織布、ガラスフィルター等を用いるのが好適である。また、展開メンブレン部３としてはニトロセルロース、或いは酢酸セルロースを含むニトロセルロース等を用いるのが好適であり、吸収部４としては濾紙、吸取紙等を用いるのが好適である。
【００２５】
本発明の最大の特徴は、以上の構成のようなサンドイッチ法によるテストストリップを用いて、被検液中の抗原または抗体を検出するに際して、予め被検液に、重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子（以下、単に「特定非イオン性水溶性高分子」とも略する）を溶解させることにある。このように比較的低分子量の非イオン性水溶性高分子を用い、且つこれを、テストストリップ上において乾燥・保持させるのではなく、予め被検液に溶解させて使用する手法と組合わせて使用することにより、被検液中の抗原または抗体を、極めて高感度で迅速に測定することが可能になる。また、その測定の再現性も極めて良好になる。
【００２６】
ここで、使用する水溶性高分子は、非イオン性であることが必要であり、イオン性水溶性高分子を使用した場合には、安定的な検出が行えなくなるおそれがある。例えば、カチオン性水溶性高分子を使用した場合には、標識体として、金コロイド標識抗体や抗原、或いは抗体または抗原感作ラテックス粒子等を使用した際には、これらの粒子が通常帯びている負の表面ゼータ電位が打ち消され、粒子同士の凝集が生じ易くなる。また、アニオン性水溶性高分子を使用した場合には、被検液の展開性が悪くなる場合がある。
【００２７】
また、上記非イオン性水溶性高分子の重量平均分子量が２０００〜９０００、特に３０００〜８５００であることも極めて重要である。重量平均分子量が２０００未満の場合は、抗原抗体反応の十分な反応促進効果を得ることが困難になる。また、重量平均分子量が９０００より大きい場合は、十分な反応促進効果が得られるまでに被検液中の非イオン性水溶性高分子濃度を高めた場合に、被検液の展開性が悪くなり検出部位の発色が一定となるまでに長時間を要するようになったり、或いはテストストリップ間で標識体の検出強度にバラツキが生じたりするようになる。
【００２８】
被検液に溶解させる水溶性高分子の濃度は、十分な反応促進効果が得られ、且つ水溶性高分子を溶解した被検液の展開性を良好に保つ観点から、０．０１〜２０質量％、より好適には０．５〜１０質量％であるのが好ましい。
【００２９】
上記非イオン性水溶性高分子の種類としては、公知のものが特に制限なく使用できるが、具体的にはポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと略すこともある）、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール類；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（以下ＨＰＣと略すこともある）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース類；デンプン、デキストラン等の多糖類；ポリビニルアルコール（以下ＰＶＡと略すこともある）、ポリビニルピロリドン（以下ＰＶＰと略すこともある）、ポリビニルメチルエーテル等のビニル系高分子などを例示できる。これらの水溶性高分子は、一定の分子量のものを単独で使用してもよいし、所望の展開性や反応促進効果が得られるように、分子量分布や分子構造等の異なる複数のものを適宜混合して使用することもできる。
【００３０】
上記非イオン性水溶性高分子のうち、ポリアルキレングリコール類および／またはセルロース類を使用した場合は、特に高い反応促進効果が得られ好適である。中でも、ポリエチレングリコールを使用した場合は、重量平均分子量や分子量分布の異なるものを容易に入手でき、これらを適宜混合することで被検液の粘性、展開性、反応促進効果を容易に所望の程度に調整することができるため最も好ましい。
【００３１】
本発明において、上記２０００〜９０００の重量平均分子量を有する非イオン性水溶性高分子は、予め、被検液に溶解させて使用する。すなわち、このように比較的低分子量の非イオン性水溶性高分子を使用したとしても、これをテストストリップに乾燥・保持する方法では、毛管流として展開される被検液への溶解性や混合の均一性が十分ではなく、その効果を十分且つ安定的に発揮させることが困難である。これに対して、本発明では、上記の如く水溶性高分子を予め、被検液に溶解させておくことにより、この問題を解消し、前記したような優れた効果を達成することが可能になる。
【００３２】
被検液に特定非イオン性水溶性高分子を溶解する方法は、特に限定されず、該水溶性高分子の固体、或いは所定濃度の溶液（以下、「水溶性高分子原液」と表記することもある）を必要量添加する方法を適宜に採択すればよい。水溶性高分子原液は、精製水；生理食塩水等の各種塩溶液；トリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下「トリス」と略すこともある）緩衝液、リン酸緩衝液等の各種緩衝液等の水性液体に、特定非イオン性水溶性高分子の必要量を溶解することにより調製される。
【００３３】
次に、本発明の免疫学的測定方法が測定対象とする抗原または抗体を説明する。本発明において、上記抗原または抗体は、公知のものが制限無く対象になる。例えば、抗原としては、アルブミン、ヘモグロビン、プロテインA等のタンパク質や糖タンパク質；高比重リポタンパク質、低比重リポタンパク質等の脂質タンパク質；アルカリ性ホスファターゼ、リパーゼ、アミラーゼ等の酵素タンパク質；各種糖類；核酸；レセプター；各種微生物抗原等が例示される。また、抗体としてはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の免疫グロブリンが例示される。
【００３４】
本発明では、これらの抗原または抗体が、前記テストストリップを毛管現象により展開可能な状態で溶解、分散、または懸濁されている水性液体が被検液とされる。これらの抗原または抗体を含む採取対象物としては、例えば、微生物の培養液、微生物の懸濁液、食品およびその懸濁液、咽頭ぬぐい液、唾液、血漿、血清、尿等の体液、或いは歯垢の懸濁液等が挙げられる。
【００３５】
これらの採取対象物からの被検液の調製は、測定対象とする抗原または抗体の性状や分析の目的に応じて適宜に行えばよい。例えば、採取対象物が、血液、尿、唾液等の体液、或いは環境水等の水性液体の場合、これらを採取し、そのまま被検液として使用することも可能である。通常は、前記採取対象物を、適宜に、希釈、溶解、懸濁等の処理を施して使用するのが一般的である。被検液中に、抗原抗体反応を阻害する物質が共存している場合等には、阻害物質の分解処理、検出対象の抗原または抗体の抽出処理や精製処理等を施して、被検液を調製すればよい。
【００３６】
微生物（細菌、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、及び単細胞真核生物を指す）を免疫クロマトグラフィー法で分析する場合は、一般に採取した試料中に含まれる微生物濃度が小さい為に、免疫クロマトグラフィー法の感度が不足する場合がある。このような場合には、その測定感度を向上させるために、微生物菌体に結合または付着した、或いは該菌体内に含まれる特定の抗原を抽出処理したものを被検液として使用するのが好ましいが、これを本発明の免疫学的測定方法により測定することにより、さらに高感度で測定が行えるため好適である。
【００３７】
本発明の方法を適用するのに最も好適な被検液としては、糖鎖抗原を有する微生物から該糖鎖抗原を亜硝酸抽出法により抽出した液（以下、単に「亜硝酸抽出溶液」とも言う）が例示できる。すなわち、亜硝酸抽出法は、短時間に且つ高い効率で、微生物から血清型多糖抗原等の特異性の高い糖鎖抗原を抽出できるので（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）、微生物を免疫クロマトグラフィー法にて分析する場合には有利である。しかしながら、亜硝酸抽出法においては高濃度の亜硝酸塩水溶液を酸性条件下で使用することから、亜硝酸抽出溶液には亜硝酸に由来する塩や中和により生じた塩が高濃度に含まれる。その為、該亜硝酸抽出溶液は、免疫クロマトグラフィー法における展開性が十分でない。このような被検液に、本発明の方法を適用することにより、前記効果を特に顕著に発揮させ、希釈等により被検液の塩濃度を下げることなく、良好に被検液を展開させて、高感度に上記糖鎖抗原を検出することできる。
【００３８】
この場合、糖鎖抗原を有する微生物としては、齲蝕関連菌であるのが好ましい。すなわち、近年、歯牙の齲蝕のリスクを診断するために、口腔内より採取した唾液や歯垢中に存在する齲蝕関連菌濃度を測定することが試みられている。これらの齲蝕関連菌の多くは、糖鎖抗原を有する微生物であるが、唾液や歯垢中に１０４〜１０７個／ｍｌ程度に微量にしか含まれておらず、さらに通常は、不溶性グルカンに覆われた凝集状態で存在しているため、免疫クロマトグラフィー法における展開性が著しく悪い。したがって、唾液や歯垢の懸濁液をそのまま被検液として使用しても、該齲蝕関連菌の測定感度は極めて低くなるので、上記の如くに糖鎖抗原を亜硝酸抽出法により抽出して、得られた亜硝酸抽出溶液を被検液として本発明の測定方法に適用する方法が最も適している。
【００３９】
なお、唾液や歯垢の懸濁液は、遠心分離法や濾過法により処理し、その不溶性画分を分離し、被検液の調製に供するのが高感度な測定を行う観点から好ましい。
【００４０】
ここで、上記齲蝕関連菌としては、具体的には、ミュータンスレンサ球菌に属する細菌（ストレプトコッカス・ミュータンスやストレプトコッカス・ソブリヌスを例示できる）、ラクトバチルス属に属する細菌、アクチノミセス属に属する細菌を挙げることができる。
【００４１】
亜硝酸抽出法は、微生物に亜硝酸水溶液を作用させる従来公知の方法を制限無く採用することができる。この亜硝酸水溶液は、一般的には亜硝酸塩水溶液と酸水溶液とを混合することで調製できる。このような亜硝酸塩水溶液としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の水溶液が、酸水溶液としては酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸水溶液や硝酸、塩酸等の無機酸水溶液を使用することができる。
【００４２】
得られた亜硝酸抽出溶液は、残留する酸により酸性を呈しているため、中和してから被検液とするのが好ましい。この中和に使用する塩基性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、トリス水溶液等の各種塩基を含む水溶液、或いはトリス−塩酸緩衝液、ホウ砂−ホウ酸緩衝液、グリシンアミド−水酸化ナトリウム緩衝液等の各種緩衝液を使用することができる。中和処理後の被検液のｐＨは、免疫クロマトグラフィー法において抗原抗体反応を十分に行わせる観点からｐＨ６．０〜１０．０になるよう調整するのが良い。
【００４３】
糖鎖抗原を有する微生物に亜硝酸を作用させる方法は特に限定されず、例えば、該微生物を含む液体試料を採取し、該液体試料の所定量に対し所定量の亜硝酸水溶液を添加し、所定の温度下（通常は１０〜６０℃）にて所定時間（通常は０．５〜３０分）反応させた後、中和する方法が採用できる。また、液体試料に遠心分離や濾過処理等を施して不溶性画分（菌体を含む画分）を採取し、該不溶性画分に対し亜硝酸水溶液と塩基性水溶液を順に作用させる方法を採用することも可能である。
【００４４】
本発明において、上記説明したような被検液の調製は、（ａ）前記構成のテストストリップと（ｂ）抗原または抗体の採取対象物から被検液を調製する際に使用する種々の調製用試薬からなる免疫クロマトグラフィー法測定キットを用いて実施するのが好ましい。その場合において、特定非イオン性水溶性高分子は、（ｂ）被検液の調製用試薬の構成試薬の一つとして、錠剤等の固形物として設けても良いが、操作を効率的に行うには、（ｂ）１種または２種以上からなる被検液の調製用試薬において、その少なくとも１種に含有させるのが好ましい。この場合、調製用試薬に含有させる特定非イオン性水溶性高分子の濃度は、最終的に得られる被検液中において該水溶性高分子が所望濃度になるように調整しておくことが必要である。特定非イオン性水溶性高分子を含有させておく調製用試薬としては、抗原または抗体を含む採取対象物に対して使用する調製用試薬の如何なるものであっても良い。
【００４５】
前記したように被検液に含有される抗原が、糖鎖抗原を有する微生物の該糖鎖抗原であり、被検液が、上記糖鎖抗原を有する微生物から該糖鎖抗原を亜硝酸抽出法により抽出することにより調製する場合においては、特定非イオン性水溶性高分子は亜硝酸水溶液からなる抽出液および／または中和用塩基性水溶液に含有させておくのが好適である。
【００４６】
上記特定非イオン性水溶性高分子を含有させた調製用試薬には、必要に応じて抗菌剤や酸化防止剤等の公知の添加剤を、本発明の効果を損なわない範囲で少量含有させても良い。
【００４７】
本発明において、前記構成のテストストリップを用いて、上記の予め特定非イオン性水溶性高分子を溶解させた被検液を免疫クロマトグラフィー法により測定する具体的手順は、例えば以下のような手順が、迅速簡便に測定を行えることから好ましい。即ち、まず、予め特定非イオン性水溶性高分子を溶解させた被検液（例えば１００〜２００μｌ）を分取し、前記テストストリップの被検液保持部１に添加し、所定時間（例えば１〜３０分）静置した後、該ストリップの検出部位５およびコントロール判定部位６の着色の有無あるいはその状態により判定することにより、被検液中に検出対象とする抗原または抗体が存在するか否か、或いはその量を知る方法である。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００４９】
製造例１〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の作製〕
（１）［菌体試料懸濁液の調製］
ブレインハートインフュージョン（以下「ＢＨＩ」と略すこともある）（ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの超純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地２ｍｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｃ）を３７℃、５時間、嫌気条件下（Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０）で培養した後、培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。
【００５０】
次いで、沈殿物を５ｍｌのリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略すこともある）に懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。その後得られた菌体沈殿をＰＢＳに懸濁し、Ａ６００＝１．０に調整しＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液とした。なお、該菌体試料懸濁液を超音波処理後、適宜希釈した後にＢＨＩ培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体試料懸濁液の希釈倍率を乗じることで該菌体試料懸濁液の菌体濃度を求めたところ、約１×１０９個／ｍｌであった。
【００５１】
（２）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清の作製〕
免疫は以下のように実施した。
【００５２】
第１週は０．５ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第２週は１．０ｍｌの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第３週は２．０ｍｌの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第４週は第３週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より１週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
【００５３】
（３）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の精製〕
オートクレーブ処理したＢＨＩ液体培地１Ｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔを３７℃、１２時間、嫌気条件下で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍｌのＰＢＳに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。
【００５４】
Ｉｎｇｂｒｉｔｔ菌体を洗浄した後、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁しＡ６００＝１５に調整した。ここにプロナーゼ（和光純薬社）を５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。反応終了後、遠心分離し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。次いで２０ｍｌの０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で３回洗浄し、更に２０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ６００＝１２．５）を調製した。
【００５５】
次いで、該プロテアーゼ処理菌体懸濁液と（２）で調製した抗血清０．５ｍｌとを混合し、４℃、６０分反応させた。混合液を４０００ｇ、５分遠心分離し、菌体を回収した。この菌体を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い洗浄した。
【００５６】
次いで、０．５ｍｌの０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）に菌体を懸濁し、吸着した抗体を溶出し、遠心分離により上清を回収し、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。同様の溶出操作を４回行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【００５７】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記溶出液を添加し、５ｍｌ洗浄後、５ｍｌの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ２８０を測定することで確認した。
【００５８】
以上により、抗血清（０．５ｍｌ）をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体を１ｍｇ得た。
【００５９】
実施例１〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原を含む被検液の調製と免疫クロマトグラフィー法による分析（１）〕
（１）〔遠心分離法を使用した亜硝酸抽出法による被検液の調製〕
製造例１（１）で調製した１×１０９個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液をＰＢＳで１０００倍希釈し、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液を調製した。この、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液１ｍｌをサンプリングチューブに分取し、１００００ｇ、１０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿に、１２５μｌの２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と１２５μｌの０．５Ｍ酢酸水溶液を添加し、良く混合後室温で１０分間放置した。次いで、７５０μｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、良く混合し反応を停止した。次いで、１００００ｇ、１０分間遠心分離し、上清（亜硝酸抽出溶液）を回収した。該亜硝酸抽出溶液を、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液とした。
【００６０】
１２．５ｍｌの２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と１２．５ｍｌの０．５Ｍ酢酸水溶液を混合し、室温で１０分間放置した。次いで、７５ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、良く混合し反応を停止した。このようにして調製した亜硝酸抽出溶液を、検体希釈液とした。
【００６１】
２ｇのポリエチレングリコール６０００（数字は重量平均分子量を示す）を全量１０ｍｌとなるよう検体希釈液に溶解し、２０％ＰＥＧ６０００を含む検体希釈液を調製した。１００μｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液と７８０μｌの検体希釈液及び１２０μｌの２０％ＰＥＧ６０００を含む検体希釈液を混合することで、終濃度２．４％のＰＥＧ６０００を含む１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００６２】
同様の方法にて、ＰＥＧ３０００、及びＰＥＧ８０００を含む検体希釈液とＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液、及び検体希釈液を適宜混合し、所定の重量平均分子量のＰＥＧを所定の濃度で、且つ１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００６３】
同様に、陰性コントロールとして各種ＰＥＧを含む検体希釈液と検体希釈液を適宜混合し、所定の重量平均分子量のＰＥＧを所定の濃度で含み、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含まない被検液を得た。
【００６４】
（２）〔金コロイド標識されたストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の調製〕
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）１０ｍｌに１００ｍＭＫ２ＣＯ３を２μｌ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝１．０であった。
【００６５】
次いで、１ｍｇ／ｍｌに調整した製造例１（３）で調製したポリクローナル抗体の２ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）６４μｌを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍｌ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍｌの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。該再懸濁した画分の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝４．９であった。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識抗体」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【００６６】
（３）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップの作製〕
ニトロセルロースメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ１８０、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン部３上の検出部位５及びコントロール判定部位６上に、それぞれ１ｍｇ／ｍｌの製造例１（３）で調製したポリクローナル抗体及び抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（ＩＣＮファーマシューティカルズ社）１μｌをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥し抗体を固定化した。該抗体固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００６７】
また、標識体保持部２であるコンジュゲートパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッド２に（２）で調製した金コロイド標識抗体をＡ５２０＝１．０に調整したものを２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、被検液保持部１であるサンプルパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、展開終了後の被検液を保持するための吸収部４である吸収パッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
【００６８】
このように調製した、図１に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。
【００６９】
（４）〔免疫クロマトグラフィー法における被検液の分析〕
免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド２上に、（１）で得られた各種被検液１００μｌを添加し、５分、１０分、２０分、３０分後にスポット発色の有無と強度を判定した。測定は、各被検液ごとに５回行った。判定は、固定化抗体スポット上に捕捉された金コロイドの程度を４段階（＋＋＋：発色強度が強い、＋＋：発色強度が中程度、＋：発色強度が弱い、−：発色しない）に目視で識別した。また、（１）にて調製したＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液を検体希釈液にて１０倍希釈することで、１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含みＰＥＧを含まない被検液を得、該被検液並びに検体希釈液だけを上記と同様の操作により分析した。結果を表１、表２に示した。
【００７０】
【表１】
【表２】
表１、表２より、重量平均分子量が３０００、６０００、８０００のポリエチレングリコールを使用した場合は、それぞれ５回の測定の全てにおいて測定開始後５分以降発色強度は変化せず、短時間に、且つ再現性よく判定することができた。Ｉｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含まない被検液並びに検体希釈液では非特異的発色は検出されなかった。
【００７３】
比較例１〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原を含む被検液の調製と免疫クロマトグラフィー法による分析〕
実施例１（１）にてＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１２０００、及びＰＥＧ２００００を使用すること以外は、実施例１（１）〜（４）と同様の操作を行った。結果を表３、表４に示した。
【００７４】
【表３】
【表４】
表３から、重量平均分子量が１０００のポリエチレングリコールを使用した場合は、ポリエチレングリコール濃度を実用上十分高くした場合も十分な増感効果が得られなかった。また、重量平均分子量が１２０００のポリエチレングリコールを使用した場合は２回の測定において、更に重量平均分子量が２００００のポリエチレングリコールを使用した場合は５回の測定において測定開始後５分以降発色強度が経時的に強くなり、発色強度の再現性が悪かった。
【００７７】
比較例２〔ポリエチレングリコールを乾固した免疫クロマトグラフィーテストストリップを使用したストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原を含む被検液の分析〕
（１）〔遠心分離法を使用した亜硝酸抽出法によるポリエチレングリコールを含まない被検液の調製〕
実施例１（１）で調製した、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液を、検体希釈液で１０倍希釈することで、１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００７８】
（２）〔ポリエチレングリコールを乾固した免疫クロマトグラフィーテストストリップの作製〕
金コロイド標識抗体を実施例１（２）と同様に作製した。ニトロセルロースメンブレン、サンプルパッド、及び吸収パッドは実施例１（３）と同様の処理を施した。
【００７９】
標識体保持部２であるコンジュゲートパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。実施例１（２）で調製した金コロイド標識抗体に、Ａ５２０＝１．０、終濃度９．６％となるようＰＥＧ６０００を添加した。コンジュゲートパッド２に、該金コロイド標識抗体を２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。同様に、２０．０％のＰＥＧ３０００或いは８．８％のＰＥＧ８０００を含む、Ａ５２０＝１．０の金コロイド標識抗体２５μｌを添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００８０】
このように調製した、図１に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。
【００８１】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法における被検液の分析〕
免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド２上に、上記比較例２（１）で得られた被検液１００μｌを添加し、５分、１０分、２０分、３０分後にスポット発色の有無と強度を判定した。測定は、各被検液ごとに５回行った。判定は、実施例１（４）と同様に行った。結果を表５に示した。同様に、検体希釈液を分析した結果を表６に示した。
【００８２】
【表５】
【表６】
表５、表６より、重量平均分子量が３０００、６０００、８０００のポリエチレングリコールを乾固した免疫クロマトグラフィーテストストリップを使用した場合は、測定開始後５分以降発色強度が経時的に強くなり発色が安定せず、短時間に、且つ再現性よく判定することができなかった。
【００８５】
実施例２〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原を含む被検液の調製と免疫クロマトグラフィー法による分析（２）〕
（１）〔遠心分離法を使用した亜硝酸抽出法による被検液の調製〕
実施例１（１）と同様に、１×１０６個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液及び検体希釈液を調製した。
【００８６】
２ｇのデキストラン（重量平均分子量６０００）を全量１０ｍｌとなるよう検体希釈液に溶解し、２０％デキストランを含む検体希釈液を調製した。１００μｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液と７８０μｌの検体希釈液及び１２０μｌの２０％デキストランを含む検体希釈液を混合することで、終濃度２．４％のデキストランを含む１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００８７】
同様の方法にて、それぞれ重量平均分子量６０００のＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含む検体希釈液とＩｎｇｂｒｉｔｔ抗原抽出原液、及び検体希釈液を混合し、終濃度２．４％の上記水溶性高分子を含み、且つ１×１０５個／ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ抽出抗原を含む被検液を得た。
【００８８】
（２）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップの作製〕
実施例１（２）、（３）の方法に従い、免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。
【００８９】
（３）〔免疫クロマトグラフィー法における被検液の分析〕
免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド２上に、上記（１）で得られた各種被検液１００μｌを添加し、５分、１０分、２０分、３０分後にスポット発色の有無と強度を判定した。測定は、各被検液ごとに５回行った。判定は、実施例１（４）と同様に行った。結果を表７に示した。同様に、終濃度２．４％の（１）の各種水溶性高分子を含む検体希釈液調製し、同様に分析した。結果を表８に示した。
【００９０】
【表７】
【表８】
表７、表８より、ポリエチレングリコール又はヒドロキシプロピルセルロースを使用した場合は、特に高い発色強度が得られ、且つ、短時間に再現性よく判定することができた。
【００９３】
実施例３〔免疫クロマトグラフィー法測定キットを使用した唾液からのストレプトコッカス・ミュータンスの検出〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
被験者にパラフィンペレットを５分間噛ませ、分泌された唾液を滅菌容器に吐き出させることで回収した。
【００９４】
得られた唾液を４０Ｗ、１０秒間超音波処理した後、適宜希釈して、１００μｌをミチス・サリバリウス・バシトラシン（以下、「ＭＳＢ」と表記することもある。）固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、４８時間培養した。ＭＳＢ固体培地上に生じるコロニー数を計数し、唾液の希釈率から、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を個／ｍｌとして算出した。ＭＳＢ固体培地上には主としてストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスが、また、一部の口腔内細菌が生育する。コロニーの形態学的分類、及び形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法及び、糖発酵試験等の生化学的方法により、ストレプトコッカス・ミュータンスをストレプトコッカス・ソブリヌス及び他の口腔内細菌と識別し、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を測定した。
【００９５】
（２）〔濾過装置を使用した亜硝酸抽出法による被検液の調製〕
ＳＣカートリッジ８（マルエム社）に直径１２ｍｍの円形に切り取ったガラス繊維濾紙９（アドバンテック東洋社、ＧＡ−１００）をセットし、図３の構造の濾過装置７を作製した。
【００９６】
（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過装置７に添加し、シリンジをセットした蓋１０を閉めてシリンジにより加圧濾過した。蓋１０を開け、濾過装置７に５００μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を添加し同様に濾過した。次いで、２００μｌの１Ｍ酢酸水溶液と２００μｌの４．８％ＰＥＧ６０００を含む２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液を混合し、０．５Ｍ酢酸−１Ｍ亜硝酸ナトリウム−２．４％ＰＥＧ６０００水溶液を調製した。２５０μｌの０．５Ｍ酢酸−１Ｍ亜硝酸ナトリウム−２．４％ＰＥＧ６０００水溶液を濾過装置７に添加し、直ちにシリンジで加圧し濾過した。室温で２分間放置した後、２．４％のＰＥＧ６０００を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１５０μｌを添加し、加圧濾過することで約１５０μｌの濾液を回収した。このようにして得られた濾液を、終濃度２．４％のＰＥＧ６０００を含む被検液とした。
【００９７】
同様に、１０％ＰＥＧ３０００を含む２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と５％のＰＥＧ３０００を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、４．４％ＰＥＧ８０００を含む２Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と２．２％のＰＥＧ８０００を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）をそれぞれ使用し、上記ＰＥＧ６０００の場合と同様の操作に従い所定の重量平均分子量のＰＥＧを所定の濃度で含 む被検液を得た。
【００９８】
（３）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップによる被検液のストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
実施例１（２）、（３）の方法に従い、免疫クロマトグラフィーテストストリップを作製した。該免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド１上に、（１）で得られた各種被検液１００μｌを添加し、５、１０、３０分後のスポット発色の有無と強度を判定した。判定は、実施例１（４）と同様に行った。
【００９９】
免疫クロマトグラフィーテストストリップの判定結果と、（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表９に示す。
【０１００】
【表９】
表９より、重量平均分子量が３０００、６０００、８０００のＰＥＧを添加した場合は、発色が短時間に（５分以内に）飽和し、以降で判定は変わらなかった。被検液中に含まれる糖鎖抗原濃度は、唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度に相関することから、迅速、簡便に、且つ再現性良く糖鎖抗原濃度、言い換えれば、唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度を測定できた。
【０１０２】
比較例３〔ＰＥＧを使用しない免疫クロマトグラフィー法による唾液からのストレプトコッカス・ミュータンスの検出〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
実施例３（１）の方法に従った。
【０１０３】
（２）〔濾過装置を使用した亜硝酸抽出法によるＰＥＧを含まない被検液の調製〕
ＳＣカートリッジ８（マルエム社）に直径１２ｍｍの円形に切り取ったガラス繊維濾紙９（アドバンテック東洋社、ＧＡ−１００）をセットし、図３の構造の濾過装置７を作製した。
【０１０４】
（１）で採取した唾液０．５ｍｌを濾過装置７に添加し、シリンジをセットした蓋１０を閉めてシリンジにより加圧濾過した。蓋１０を開け、濾過装置７に５００μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を添加し同様に濾過した。次いで、２５０μｌの０．５Ｍ酢酸−１Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液を濾過装置７に添加し、直ちにシリンジで加圧し濾過した。室温で２分間放置した後、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１５０μｌを添加し、加圧濾過することで約１５０μｌの濾液を回収した。このようにして得られた濾液を、ＰＥＧを含まない被検液とした。
（３）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップによるＰＥＧを含まない被検液のストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
実施例１（２）、（３）の方法に従い、免疫クロマトグラフィーテストストリップを作製した。該免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド１上に、（２）で得られた被検液１００μｌを添加し、５、１０、３０分後のスポット発色の有無と強度を判定した。判定は、実施例１（４）と同様に行った。
【０１０５】
免疫クロマトグラフィーテストストリップの判定結果と、上記比較例３（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表１０に示す。
【０１０６】
【表１０】
表１０より、ＰＥＧを添加しない被検液を分析した場合は、発色強度が不足しており、陽性の判定が得られるまでに長時間（１０〜３０分）を要した。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫クロマトグラフィー法において、極めて高感度に測定を行うことができる。加えて、検出部位の発色のテストストリップ間差を無くすことができるので、被検液中の分析対象物質の濃度を、短時間に、再現性良く測定することが可能な免疫クロマトグラフィー法に基づく免疫学的測定方法を提供できる。本発明によれば、従来その測定を再現性良く実施することが困難であった亜硝酸抽出溶液のような、展開性の悪い被検液中に含まれる分析対象物質を短時間に、再現性良く、高感度に測定できる。
【０１０９】
また、本発明によれば、免疫クロマトグラフィーテストストリップ及び被検液の調製用試薬からなる、迅速、且つ簡便に実施可能で、短時間に且つ再現性良く被検液中に含まれる分析対象物質を測定可能な免疫クロマトグラフィー法測定キットが提供される。このようなキットを使用し、例えば唾液中のミュータンスレンサ球菌等の齲蝕関連菌濃度などを、再現性良く短時間に、高感度に測定することができる。
【０１１０】
このように、本発明により、免疫クロマトグラフィー法に基づく迅速且つ正確な免疫学的測定方法、並びに免疫学的測定キットを提供できるので、環境分析や臨床検査の分野に与える影響は計り知れない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、本発明の免疫クロマトグラフィー法で使用するテストストリップの各部材の概略図である。
【図２】本図は、本発明の免疫クロマトグラフィー法で使用するテストストリップの側面図である。
【図３】本図は、本発明の免疫クロマトグラフィー法キットで使用する唾液処理用の濾過装置の側面図である。
【符号の説明】
１・・・被検液保持部
２・・・標識体保持部
３・・・展開メンブレン部
４・・・吸収部
５・・・検出用抗体または検出用抗原が固定化された部位（検出部位）
６・・・コントロール判定部位
７・・・濾過装置
８・・・ＳＣカートリッジ
９・・・ガラス繊維濾紙
１０・・蓋
Claims (6)
- 下記の部位
i) 被検液を一時的に吸収し保持するための被検液保持部、
ii) 標識抗体または標識抗原が一時的に保持された標識体保持部、並びに
iii) 検出用抗体または検出用抗原が固定化され、前記被検液保持部に一時的に吸収し保持された被検液および該被検液に随伴して前記標識体保持部より流出した標識抗体または標識抗原が展開される展開メンブレン部
を有し、これらの部位が上記順序で配置された免疫クロマトグラフィーテストストリップを用いて、被検液中の抗原または抗体を検出する免疫学的測定方法において、予め被検液に、重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子を溶解させることを特徴とする免疫学的測定方法。 - 重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子が、ポリアルキレングリコール類および／またはセルロース類である請求項１に記載の免疫学的測定方法。
- 被検液が、糖鎖抗原を有する微生物から該糖鎖抗原を亜硝酸抽出法により抽出した液である請求項１または請求項２に記載の免疫学的測定方法。
- 糖鎖抗原を有する微生物が、齲蝕関連菌である請求項１〜３に記載の免疫学的測定方法。
- （ａ）下記の部位
i) 被検液を一時的に吸収し保持するための被検液保持部、
ii) 標識抗体または標識抗原が一時的に保持された標識体保持部、並びに
iii) 検出用抗体または検出用抗原が固定化され、前記被検液保持部に一時的に吸収し保持された被検液および該被検液に随伴して前記標識体保持部より流出した標識抗体または標識抗原が展開される展開メンブレン部
を有し、これらの部位が上記順序で配置された免疫クロマトグラフィーテストストリップ、および
（ｂ）１種または２種以上の被検液の調製用試薬からなり、
該（ｂ）被検液の調製用試薬の少なくとも１種に、重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子が含まれてなる免疫クロマトグラフィー法測定キット。 - 被検液に含有される抗原が、糖鎖抗原を有する微生物の該糖鎖抗原であり、該被検液が、上記糖鎖抗原を有する微生物から該糖鎖抗原を亜硝酸抽出法により抽出することにより調製されるものであり、且つ重量平均分子量が２０００〜９０００である非イオン性水溶性高分子が含まれてなる被検液の調製用試薬が、亜硝酸水溶液からなる抽出液および／または中和用塩基性水溶液である請求項５記載の免疫クロマトグラフィー法測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003019952A JP4030438B2 (ja) | 2003-01-29 | 2003-01-29 | 免疫学的測定方法および免疫クロマトグラフィー法測定キット。 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003019952A JP4030438B2 (ja) | 2003-01-29 | 2003-01-29 | 免疫学的測定方法および免疫クロマトグラフィー法測定キット。 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004233127A JP2004233127A (ja) | 2004-08-19 |
| JP4030438B2 true JP4030438B2 (ja) | 2008-01-09 |
Family
ID=32949710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003019952A Expired - Fee Related JP4030438B2 (ja) | 2003-01-29 | 2003-01-29 | 免疫学的測定方法および免疫クロマトグラフィー法測定キット。 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4030438B2 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006194785A (ja) * | 2005-01-14 | 2006-07-27 | Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine | ウマバベシア感染用診断キット |
| JP4578401B2 (ja) * | 2005-12-27 | 2010-11-10 | 株式会社トクヤマ | 固定化抗体の製造方法 |
| JP4980945B2 (ja) | 2008-02-12 | 2012-07-18 | 富士フイルム株式会社 | 金属粒子及びそれを用いた検査方法 |
| JP4932765B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2012-05-16 | 田中貴金属工業株式会社 | 免疫クロマトグラフィー用展開溶媒 |
| US9903864B2 (en) | 2009-04-09 | 2018-02-27 | Arkray, Inc. | Sample analysis tool, method for producing sample analysis tool, and method for inhibiting decrease in liquid permeability of development member |
| FR2951542B1 (fr) * | 2009-10-16 | 2011-12-02 | Commissariat Energie Atomique | Procede de detection optique d'objets micrometriques en solution |
| JP4638555B1 (ja) * | 2010-09-08 | 2011-02-23 | 田中貴金属工業株式会社 | 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット |
| EP2902783B1 (en) | 2012-09-28 | 2017-08-30 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Additive for measuring diluted sample in non-dilution-type immunochromatographic method reagent |
| JP2017166831A (ja) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | 株式会社アイシーエレクトロニクス | 歯周病検査キット、及び検査方法 |
| JP6841679B2 (ja) * | 2017-02-09 | 2021-03-10 | 積水メディカル株式会社 | イムノクロマトグラフ法 |
| JP2022046827A (ja) * | 2018-11-19 | 2022-03-24 | 積水メディカル株式会社 | イムノクロマト用試験片及びイムノクロマト検出キット |
| TW202314244A (zh) * | 2021-06-07 | 2023-04-01 | 日商電化股份有限公司 | 糞便檢體之檢查方法及其免疫層析試驗片 |
| CN116449023B (zh) * | 2023-04-10 | 2024-07-12 | 浙江伊利康生物技术有限公司 | 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5039607A (en) * | 1988-05-17 | 1991-08-13 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for immunochromatographic analysis |
| JP3182819B2 (ja) * | 1991-11-14 | 2001-07-03 | ジェイエスアール株式会社 | イムノクロマトグラフ法 |
| JPH0933526A (ja) * | 1995-07-19 | 1997-02-07 | Nitto Denko Corp | 免疫学的検査キット |
| JP2001302697A (ja) * | 2000-04-25 | 2001-10-31 | Tokuyama Corp | ポリクローナル抗体及びその製造方法 |
-
2003
- 2003-01-29 JP JP2003019952A patent/JP4030438B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004233127A (ja) | 2004-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6226624B2 (ja) | 溶血性レンサ球菌診断イムノクロマト試薬、キット及び検出方法 | |
| US6057166A (en) | Fecal test method | |
| JP6564860B2 (ja) | 免疫測定法、免疫クロマトキット | |
| US4853335A (en) | Colloidal gold particle concentration immunoassay | |
| JP6150559B2 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニアの検出方法 | |
| JP4030438B2 (ja) | 免疫学的測定方法および免疫クロマトグラフィー法測定キット。 | |
| JP3757171B2 (ja) | 微生物抗原の抽出方法 | |
| DK174032B1 (da) | Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler | |
| CN109342740A (zh) | 一种检测人幽门螺旋杆菌抗体的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法 | |
| CA2076592A1 (en) | Method, test device and kit for assay of specific binding ligand using controlled flow through filtration membrane | |
| JP4268358B2 (ja) | 抗体および免疫学的測定方法 | |
| EP0868665A1 (en) | Fecal test method and device | |
| JPH09511058A (ja) | 被検体の検出 | |
| JP3841559B2 (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット | |
| JP2008224543A (ja) | 唾液緩衝能の測定方法 | |
| JP4022005B2 (ja) | 簡易抗体検査方法及び検査用キット | |
| NL2016301B1 (en) | Method for detecting a marker for active tuberculosis. | |
| JP3781768B2 (ja) | 微生物の抽出方法および該方法に用いる濾過装置 | |
| JPH09511057A (ja) | 被検体の検出 | |
| JP4616575B2 (ja) | タンパク質の膜固定化方法 | |
| JP2000028612A (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット | |
| JP3841558B2 (ja) | 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット | |
| JP2005337795A (ja) | 抗原又は抗体の抽出液の製造方法 | |
| JP3544968B2 (ja) | ヒトヘモグロビン検出装置 | |
| JP4217516B2 (ja) | ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050531 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070207 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071015 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071016 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4030438 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101026 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131026 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131026 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131026 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131026 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20161026 Year of fee payment: 9 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |