JP4932765B2 - 免疫クロマトグラフィー用展開溶媒 - Google Patents

Description

本発明は免疫クロマトグラフィー用展開溶媒および免疫学的測定方法に関する。

ラテックス粒子や金コロイド粒子等の不溶性担体で標識した抗体または抗原を用いた免疫クロマトグラフ法は、エンザイムイムノアッセイ法等と比較して感度が低いという問題がある。
この問題を解決するために、特許文献１は、展開用溶媒中にアルギニンを存在させる方法が開示されている。この方法において得られる高感度も未だ改善される余地がある。
一方、ラテックス凝集法等の免疫学的凝集反応においては、特許文献２記載のように、抗原抗体反応時に熱変性アルブミンを存在させることで非特異的反応を抑制できることは知られていた。しかし、免疫クロマトグラフ法において抗体または抗原が担持された不溶性担体が膜担体上を展開しているときに熱変性アルブミンを存在させることで高感度化できることは知られていなかった。
特開２００７−１１４０４９号公報 特開平１１−２３５７３号公報

本発明の目的は、免疫クロマトグラフィーにおいて、非特異的反応を起さずに、高い感度を得ることができる展開溶媒およびそれを用いた免疫学的測定方法を提供することにある。

本発明の他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。

本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、熱変性アルブミンを含有することを特徴とする免疫クロマトグラフィー用展開溶媒によって達成される。

本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体と、該被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体とを備えた免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて該被検出物質を免疫学的に測定する方法において、該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を、熱変性アルブミンを含有する展開溶媒で展開せしめることを特徴とする免疫学的測定方法によって達成される
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、熱変性アルブミンを含有する水溶液の免疫クロマトグラフィー用展開溶媒としての使用によって達成される。
本発明に用いる熱変性アルブミンの作用機序は必ずしも明確ではないが、高分子化されたアルブミンと不溶性担体との間で何らかの相互作用により、凝集を促進し、感度増強に作用しているものと思われる。

本発明の展開溶媒を用いる免疫クロマトグラフィーによって、非特異的反応を起こすことなく、高い感度で、被検出物質を検出することができる。

本発明の展開溶媒は熱変性アルブミンを含有する水溶液からなる。熱変性アルブミンとは、アルブミンを熱処理することによって得られる高分子量化あるいは会合した変性アルブミンである。原料アルブミンとしては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウマ血清アルブミンあるいはヒト血清アルブミンを挙げることができる。ＢＳＡは入手し易く、好ましく用いられる。
原料アルブミンは、好ましくは５０〜１００℃、より好ましくは６０〜８０℃の温度で熱処理され、上記熱変性アルブミンを与える。５０℃未満では熱処理の効果が弱く長時間の処理を要し、１００℃より高い場合ではアルブミンの凝集が著しく析出してしまう。温度以外の熱処理の諸条件および変性アルブミンの精製法はそれ自体公知であり、例えば特開平１１−２３５７３号公報に開示されている。
免疫クロマトグラフィーの手法は公知であるが、その原理を模式的に図１に示す。
図１の試料添加部位（１）に、検査対象となる被検出物質についての検体の試料が滴下される。

本発明で対象とする検体としては、例えば咽頭あるいは鼻腔拭い液、血漿、血清、尿、唾液等の生体試料が挙げられる。
また、検体から検出する被検出物質としては、例えばインフルエンザウイルス抗原、アデノウイルス抗原、ＲＳウイルス抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス抗原、溶連菌抗原、百日咳菌抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、レプトスピラ抗原、トレポネーマ・パリダム抗原、トキソプラズマ・ゴンディ抗原、ボレリア抗原、炭疽菌抗原、ＭＲＳＡ抗原等の細菌抗原、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＡＦＰ等の腫瘍マーカー、抗ＨＩＶ抗体、抗ＨＢＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ダニアレルゲン抗体、抗スギ花粉アレルゲン抗体等の免疫グロブリン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの検体は、それ自体公知の方法により採取することができる。あるいは、採取した検体を公知の検体処理試薬組成物により処理して試料しても良い。

また、試料添加部位（１）は、多孔性分離マトリックスが好適に用いられる。多孔性分離マトリックスとしては、例えば多孔質ポリエチレン、多孔質ポリプロピレンのような多孔質合成樹脂シートまたはフィルム、ならびに濾紙、綿布のようなセルロース製の紙、織布あるいは不織布などが用いられる。
検体はそれ自体公知の検体処理試薬組成物により処理して試料とすることができる。
試料添加部位（１）に滴下された試料は、被検出物質と特異的に結合する抗体または抗原（それぞれ第２抗体、第２抗原という）が固定された不溶性担体が保持された標識物質保持部位（２）を経てクロマトグラフィー媒体（３）を介して吸収部位（５）の方向に試料が展開される。検出部位（４）には被検出物質と特異的に結合する抗体または抗原（それぞれ、第１抗体、第１抗原という）が固定されている。被検出物質をクロマトグラフィー媒体（３）で展開するための、そして検出部位（４）を有する担体は膜担体からなる。

本発明では、上記クロマトグラフィー用展開溶媒として、熱変性アルブミンを含有する展開溶媒が用いられる。熱変性アルブミンは好ましくは展開溶媒中に０．１〜１０重量％の割合で含有される。かかる熱変性アルブミン濃度の展開溶媒を用いることにより、非特異的反応を抑制して高感度で被検出物質を検出することができる。熱変性アルブミンを含む水溶液を免疫クロマトグラフィー用展開溶媒として使用することは知られていない。
検体中に対象とする被検出物質が混入している場合には、被検出物質と第２抗体あるいは第２抗原が反応し、これらの複合体が検出部位（４）で第１抗原または第１抗体によって補足され、着色のバンドが現れる。（４）に現れたバンドの色調等により、検体中に含まれる被検出物質の量を概略的に把握することができる。
標識物質保持部位（２）に使用する第２抗原または第２抗体、及び検出部位（４）に使用する第１抗原または第１抗体は、被検出物質の異なる部位と結合するものであれば良い。

抗体としては、被検出物質と特異的に結合する抗体が用いられる。抗体は、その産生動物種としてヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等があり、それぞれに所定範囲の免疫グロブリンがある。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでも良く、また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びこれらの断片（抗原と結合能を有するもの；例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２等のいずれでも良い。）が挙げられる。
具体的には、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体等、及びこれらの断片（抗原と結合能を有するもの；例えばＦ（ａｂ）’２又はＦａｂ’等のいずれでも良い。）が挙げられる。
また、抗原としても、被検出物質と特異的に結合する抗原が用いられる。例えばアデノウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス等のウイルス由来蛋白質、ヒトアルブミン、リウマチ因子等の血液由来たん白質、ダニアレルゲン、スギ花粉アレルゲン等が挙げられる。

さらに、抗原や抗体を標識する不溶性担体としては、例えば金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、セレニウムコロイド粒子等の非金属コロイド粒子、ラッテックス粒子等の着色樹脂粒子、染料コロイド粒子及び着色リポソーム等の不溶性粒状物質等が挙げられる。抗原や抗体を標識する酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。
また、クロマトグラフィー媒体のための膜担体としては、毛細管現象により試料検体を吸収し流動させることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる人工ポリマーからなる群から選択される。

以下、実施例により本発明をさらに詳述する。本発明は実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１
（１）クロマトグラフィー媒体上への判定部の作製
膜担体としてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０，３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。５重量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにマウス由来抗前立腺癌特異抗原（ＰＳＡ）モノクローナル抗体（第１抗体）を希釈した。この溶液１５０μＬを膜担体上に１ｍｍの幅で塗布し、５０℃で３０分間乾燥させた。乾燥後、０．５重量％のカゼイン（和光純薬工業社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍｌに室温で３０分間浸漬し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフィー媒体を作製した。

（２）標識物質溶液の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業（株）製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈したマウス由来抗ＰＳＡモノクローナル抗体（第２抗体）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。次いで、１０重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８，０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１重量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で第２抗体が固定された不溶性担体の溶液、つまり標識物質溶液を作製した。

（３）免疫クロマトグラフィー用試験片の作製
上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０重量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１５ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識保持部材を作製した。
次に、バッキングシートから成る基材に、上記作製したクロマトグラフィー媒体、標識物質保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマトグラフィー用試験片とした。

（４）展開用溶媒の作製
１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬに１０重量％となるように牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を入れ、７０℃で１時間、インキュベーションした。この熱変性ＢＳＡの分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認したところ、２０ｋＤａ以上であった。この熱変性ＢＳＡを１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に１．５重量％となるように加え、展開用溶媒とした。

（５）測定
上記作製した免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて、以下の方法で血液中のＰＳＡの存在の有無を測定した。
即ち、血清中のＰＳＡ濃度が０．１ｎｇ／ｍＬ未満のものを陰性検体、ＰＳＡ濃度が０．５ｎｇ／ｍＬのものを陽性検体１、ＰＳＡ濃度が５ｎｇ／ｍＬのものを陽性検体２として、６０μＬの展開用溶媒をサンプルパッド上に載せた後、陰性検体または陽性検体８０μＬを免疫クロマトグラフィー用試験片のサンプルパッド上に載せて展開させ、１５分後に目視判定をした。テストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、赤い線は確認できるが、非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「−」とした。その結果を表１に示す。

実施例２
実施例１で用いた熱変性ＢＳＡに代えて、ＢＳＡを５０℃で５時間、インキュベーションした熱変性ＢＳＡを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。尚、この熱変性ＢＳＡの分子量は２０ｋＤａ以上であった。結果を表１に示す。

実施例３
実施例１で用いた熱変性ＢＳＡに代えて、ＢＳＡを１００℃で１５分間、インキュベーションした熱変性ＢＳＡを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。尚、この熱変性ＢＳＡの分子量は２０ｋＤａ以上であった。結果を表１に示す。

比較例１
実施例１で用いた熱変性ＢＳＡに代えて、熱変性処理していないＢＳＡを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表１に示す。

実施例４
実施例１で膜担体に塗布した抗体を、マウス由来抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体（第１抗体）に変更し、金コロイドに固定した抗体をマウス由来抗ＣＥＡモノクローナル抗体（第２抗体）に変更し、さらに測定に用いた被検体を、陰性検体がＣＥＡ濃度０．５ｎｇ／ｍＬ未満の血液、陽性検体１がＣＥＡ濃度２ｎｇ／ｍＬの血液および陽性検体２がＣＥＡ濃度１０ｎｇ／ｍＬの血液に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表２に示す。

比較例２
実施例４で用いた熱変性ＢＳＡの代わりに、熱変性処理していないＢＳＡを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表２に示す。

免疫クロマトグラフィー用試験片の概略図。

符号の説明

１ 試料添加部位
２ 標識物質保持部位
３ クロマトグラフィー媒体
４ 検出部位
５ 吸収部位

Claims (5)

1. 熱変性アルブミンを含有することを特徴とする免疫クロマトグラフィー用展開溶媒。
2. 熱変性アルブミンが５０〜１００℃の間の温度で変性されたアルブミンである請求項１に記載の展開溶媒。
3. 被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体と、該被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体とを備えた免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて該被検出物質を免疫学的に測定する方法において、該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を、熱変性アルブミンを含有する展開溶媒で展開せしめることを特徴とする免疫学的測定方法。
4. 熱変性アルブミンが５０〜１００℃の間の温度で変性されたアルブミンである請求項３に記載の免疫学的測定方法。
5. 熱変性アルブミンを含有する水溶液の免疫クロマトグラフィー用展開溶媒としての使用。

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