JP2001305139A - 特異的結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】より効率よく被検物質を捕捉しうる特異的結合
体及びより迅速、簡便で、高精度、かつ高感度な免疫測
定法並びにそれに用いる免疫測定用キットを提供するこ
と。 【解決手段】担体と、被検物質に対する第１の特異的結
合物質と、ポリアミノ酸とを有した特異的結合体であ
り、該担体と該特異的結合物質とがポリアミノ酸を介し
て固定化された特異的結合体；担体とポリアミノ酸と
が、さらに標識物質を介して固定化された特異的結合
体；（ａ）吸水性基材上で、被検物質と結合する第２の
特異的結合物質を固定化した固定相と、前記特異的結合
体と被検物質とをサンドイッチ反応させるステップ、及
び（ｂ）ステップ（ａ）のサンドイッチ反応を検出する
ステップ、を含む免疫測定法、並びに前記特異的結合体
を含有した免疫測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、効率よく被検物質
を捕捉しうる特異的結合体、迅速、簡便で、高精度に、
かつ高感度で測定できる免疫測定法並びにそれに用いる
免疫測定用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】被検物質を高感度で、かつ再現性よく測
定しうる免疫測定法として、エンザイムイムノアッセイ
(EIA) 、ラジオイムノアッセイ(RIA) 等が用いられる。
EIA を用いた場合、標識物質として用いられる酵素標識
抗体等の安定性が悪く、また、RIA を用いた場合、放射
性物質を使用するため、特別な設備を必要とするという
欠点がある。また、かかる方法によると、操作及び反応
に時間を要し、測定結果を得るまでに時間がかかる場合
がある。

【０００３】一方、近年、免疫クロマトグラフ法によ
り、前記EIA またはRIA により測定した場合よりも測定
が簡便かつ迅速に行なえるようになっている。しかしな
がら、かかる免疫クロマトグラフ法においては、被検液
中の被検物質が少量であるとき、その測定が困難である
場合があり、実用に十分な感度を得るには至っていない
ため、さらに高感度な免疫測定法が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、より効率よ
く被検物質を捕捉しうる特異的結合体、より迅速、簡便
で、高精度、かつ高感度な免疫測定法並びにそれに用い
る免疫測定用キットを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、〔１〕
担体と、被検物質に対する第１の特異的結合物質と、
ポリアミノ酸とを有してなる特異的結合体であって、該
担体と該特異的結合物質とがポリアミノ酸を介して固定
化されてなる特異的結合体、〔２〕 前記〔１〕記載の
特異的結合体において、担体とポリアミノ酸とが、さら
に標識物質を介して固定化されてなる特異的結合体、
〔３〕 （Ａ）ポリアミノ酸と担体とを結合させて、複
合体を得る工程、及び（Ｂ）工程（Ａ）で得られた複合
体と第１の特異的結合物質とを結合させる工程、を含む
工程により得られる特異的結合体、〔４〕 （Ａ’）標
識物質と担体とを結合させて、複合体を得る工程、
（Ｂ’）工程（Ａ’）で得られた複合体とポリアミノ酸
とを結合させて、複合体を得る工程、及び（Ｃ’）工程
（Ｂ’）で得られた複合体と第１の特異的結合物質とを
結合させる工程、を含む工程により得られる特異的結合
体、〔５〕 （ａ）吸水性基材上で、被検物質と結合す
る第２の特異的結合物質を固定化した固定相と、前記
〔１〕〜〔４〕いずれか記載の特異的結合体と被検物質
とをサンドイッチ反応させるステップ、及び（ｂ）ステ
ップ（ａ）におけるサンドイッチ反応を検出するステッ
プ、を含む免疫測定法、並びに〔６〕 前記〔１〕〜
〔４〕いずれか記載の特異的結合体を含有してなる免疫
測定用キット、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の特異的結合体は、担体
と、被検物質に対する第１の特異的結合物質と、ポリア
ミノ酸とを有してなる特異的結合体であって、該担体と
該特異的結合物質とがポリアミノ酸を介して固定化され
ていることを１つの大きな特徴とする。本発明の特異的
結合体は、免疫測定法、特に免疫クロマトグラフ法に好
適である。

【０００７】従来、免疫測定法には、公知の方法により
担体に直接免疫化学成分などの特異的結合物質を固定化
した標識複合体が使用されている。かかる標識複合体を
用いた場合、多量の被検物質を必要とする場合がある。
しかしながら、本発明の特異的結合体によれば、担体に
ポリアミノ酸を固定してスペーサ化し、さらに免疫化学
成分などの特異的結合物質が固定化されているため、該
特異的結合物質の自由度が向上し、驚くべく効率よく、
被検物質を捕捉できるという優れた効果を発揮する。し
たがって、被検液中の被検物質が少量である場合でも、
高感度な測定を可能にする。

【０００８】なお、本明細書において、「被検物質」
は、第１の特異的結合物質及び第２の特異的結合物質と
結合して免疫化学的反応によりサンドイッチ免疫複合体
を形成し得るものであればよい。具体的には、微生物
（例えば、細菌、放線菌、酵母、かび、ウイルスな
ど）；表面抗原などの該微生物の構成タンパク質；細菌
などが産生する毒素；腫瘍マーカー抗原などの生体試料
中の抗原性ペプチド；それらに対する抗体などが挙げら
れる。また、「被検液」とは、前記被検物質を含有した
液体試料をいう。かかる被検液としては、例えば、食品
から抽出された溶液またはその培養上清、血清または血
漿、血液、尿、便、汗、唾液など、あるいはそれらを適
切な希釈溶媒 (例えば、緩衝液など) によって希釈した
希釈液が挙げられる。

【０００９】本発明の特異的結合体に用いられるポリア
ミノ酸としては、同一のアミノ酸がポリマー化されたポ
リアミノ酸、複数のアミノ酸がブロック化してポリマー
化されたポリアミノ酸、複数のアミノ酸がランダムにポ
リマー化されたポリアミノ酸が挙げられ、かかるポリア
ミノ酸を適宣選択して使用することができる。

【００１０】ポリアミノ酸の重量平均分子量は、特に限
定されないが、検出感度の向上の観点から、好ましくは
４，０００以上であり、より好ましくは９，０００以上
であり、非特異的発色の抑制の観点から、好ましくは
１，０００，０００以下であり、より好ましくは５０
０，０００以下であることが望ましい。具体的には、好
ましくは、分子量４，０００〜１，０００，０００、よ
り好ましくは、９，０００〜５００，０００であること
が望ましい。

【００１１】前記ポリアミノ酸におけるモノマー単位の
アミノ酸の種類としては、特に限定されるものではな
く、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン
酸、グルタミン、グルタミン酸などが好ましく、かかる
アミノ酸において、側鎖に、アミノ基またはカルボキシ
ル基を少なくとも１つ有するアミノ酸化合物がより好ま
しい。

【００１２】担体１ｇに対するポリアミノ酸の固定量
は、１〜３００ｍｇであることが望ましく、高感度化の
観点から１ｍｇ以上であることが望ましく、担体同士の
凝集の抑制の観点から、３００ｍｇ以下であることが望
ましい。

【００１３】本発明において、特異的結合体に固定化さ
れる「第１の特異的結合物質」と、後述の吸水性基材の
固定相に固定化される「第２の特異的結合物質」とは、
いずれも抗原抗体反応により被検物質と特異的に結合し
得る免疫学的成分であればよい。例えば、被検物質が抗
原（例えば、タンパク質、ペプチド、ハプテンなど）で
あれば、第１の特異的結合物質及び第２の特異的結合物
質は、いずれも該抗原と特異的に結合し得る抗体であ
る。前記抗体は、モノクローナル抗体であってもポリク
ローナル抗体であってもよい。また、本発明における
「抗体」とは、被検物質との特異的親和性を保持する抗
体の断片、例えば、H 鎖、L 鎖、Fab 、F(ab')₂ 、
Ｖ_H 、Ｖ_L などを包含する。一方、被検物質が抗体であ
る場合には、第１の特異的結合物質及び第２の特異的結
合物質は、該抗体と特異的に結合し得る抗原もしくは該
抗体を抗原として特異的に結合し得る２次抗体である。

【００１４】第１の特異的結合物質及び第２の特異的結
合物質は、被検物質に応じてサンドイッチ法などで用い
られる公知の物質を適宣選択すればよい。また、該特異
的結合物質が抗体であれば、単離された被検物質を感作
抗原として、公知の抗体作製技術を用いて調整すること
もできる。

【００１５】第１の特異的結合物質及び第２の特異的結
合物質がいずれも抗体の場合、第１の抗体及び第２の抗
体は、同一であってもよく、異なっていてもよい。異な
る抗体としては、同一の抗原決定基を認識する２種の抗
体又は異なる抗原決定基を認識する２種の抗体が挙げら
れる。

【００１６】担体１ｇに対する第１の特異的結合物質の
固定量は、１〜５００ｍｇであり、より好ましくは、担
体１ｇ当たり１０〜１００ｍｇであることが望ましい。

【００１７】本発明の特異的結合体に用いられる担体と
しては、水分散型高分子粒子；スダンブルー、スダンレ
ッドIV、スダンIII 、オイルオレンジ、キニザリーング
リーン等に代表される顔料、染料などで着色した水分散
型高分子粒子、例えば、着色ラテックス粒子などが挙げ
られる。着色した水分散型高分子粒子は、着色している
点が検出手段ともなるので、標識物質を介さない特異的
結合体の場合は、特に、着色した水分散型高分子粒子を
用いるのが望ましい。また、金、銀又は銅の金属からな
るコロイド粒子を用いることもできる。この場合、初め
に、前記コロイド粒子に標識物質を公知の物理吸着法に
より固定化すればよい。

【００１８】分散安定性、検出感度の調節の容易性など
の観点から、水分散型高分子粒子からなるラテックス粒
子、着色ラテックス粒子を担体として使用することが望
ましい。

【００１９】前記担体の平均粒子径は、吸水性基材の吸
水性を低下させない程度の該基材中での移動性を有する
ものであれば特に制限はないが、特異的結合体の保存安
定性、検出感度の調節の容易性などの観点から、好まし
くは、約０．０１〜５μｍ、より好ましくは、約０．０
５〜３μｍの範囲であることが望ましい。

【００２０】本発明の特異的結合体においては、担体と
ポリアミノ酸とが、直接に又はさらに標識物質を介して
固定化されていてもよい。

【００２１】本発明の特異的結合体としては、具体的に
は、（Ａ）ポリアミノ酸と担体とを結合させて、複合体
を得る工程、及び（Ｂ）工程（Ａ）で得られた複合体と
第１の特異的結合物質とを結合させる工程、を含む工程
により得られる特異的結合体；並びに（Ａ’）標識物質
と担体とを結合させて、複合体を得る工程、（Ｂ’）工
程（Ａ’）で得られた複合体とポリアミノ酸とを結合さ
せて、複合体を得る工程、及び（Ｃ’）工程（Ｂ’）で
得られた複合体と第１の特異的結合物質とを結合させる
工程、を含む工程により得られる特異的結合体が挙げら
れる。

【００２２】ポリアミノ酸を介した第１の特異的結合物
質と担体との結合（第１の特異的結合物質−ポリアミノ
酸−担体）、並びにさらに標識物質を介した第１の特異
的結合物質とポリアミノ酸と担体との結合（第１の特異
的結合物質−ポリアミノ酸−標識物質−担体）は、従来
公知の方法、例えば、共有結合法、物理吸着法、イオン
結合法などにより行なうことができる。担体と第１の特
異的結合物質−ポリアミノ酸との間、または担体と第１
の特異的結合物質−ポリアミノ酸−標識物質との間の結
合の安定性の観点から、共有結合法がより好ましい。

【００２３】さらに、本発明の特異的結合体は、第１の
特異的結合物質とポリアミノ酸との結合（第１の特異的
結合物質−ポリアミノ酸）または第１の特異的結合物質
とポリアミノ酸と標識物質との結合（第１の特異的結合
物質−ポリアミノ酸−標識物質）を行なって、複合体を
得、ついで得られた複合体と担体とを結合させることに
より得ることもできる。

【００２４】前記した方法により結合を行ない、本発明
の特異的結合体を製造する際、反応条件により、担体の
表面に、第１の特異的結合物質−ポリアミノ酸−担体及
び第１の特異的結合物質−ポリアミノ酸−標識物質−担
体以外の結合の態様（例えば、第１の特異的結合物質−
担体、ポリアミノ酸−担体、第１の特異的結合物質−標
識物質−担体、ポリアミノ酸−標識物質−担体など）が
一部生じる場合があるが、得られた特異的結合体が、前
記第１の特異的結合物質−ポリアミノ酸−担体又は第１
の特異的結合物質−ポリアミノ酸−標識物質−担体の結
合様式を担体表面に有するものであれば、かかる特異的
結合体も本発明の範囲に含まれるものとする。

【００２５】ここで用いられる標識物質としては、酵
素、蛍光物質などが挙げられる。

【００２６】本発明に用いられる酵素としては、従来公
知の固相イムノアッセイ等に用いられる任意の酵素を用
いることができる。具体的には、アルカリホスファター
ゼ、ペルオキシダーゼ、β−D −ガラクトシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−D −グル
コニダーゼなどが挙げられる。なかでも、より高感度で
安定な検出が可能なアルカリホスファターゼ、ペルオキ
シダーゼが好ましい。

【００２７】標識物質として前記酵素を用いる場合、該
酵素の検出のために、固定した酵素の種類に応じて、公
知の発色基質と検出方法とが選択され、発色の程度や活
性の変化等により被検物質が検出及び／又は定量されう
る。用いられる基質としては、例えば、アルカリホスフ
ァターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５
−ブルモ−４−クロロ−３−ホスフェート／ニトロブル
ーテトラゾリウム、ファーストレッド／ナフトール、AS
／TRホスフェート等が挙げら、ペルオキシダーゼの場
合、過酸化水素と、２，２’−アジノ−ビス（3 −エチ
ルベンズチアゾリン−６−スルホン酸、ｏ−フェニレン
ジアミン，３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジ
ン、ｏ−ジアニシジン、３−アミノ−９−エチルカルバ
ゾール、４−クロロ−１−ナフトール等の化合物との組
み合わせが挙げられる。

【００２８】標識物質が蛍光物質である場合には、固定
相における標識物質の検出のために、EIA 及び蛍光抗体
法(FIA) で従来使用されている検出方法が適宣選択され
る。蛍光物質としては、FITC、ローダミンなどが挙げら
れる。

【００２９】担体１ｇに対する標識物質の固定量は、１
〜５００ｍｇであり、より好ましくは、担体１ｇ当たり
１０〜１００ｍｇであることが望ましい。

【００３０】本発明の特異的結合体は、具体的には、例
えば、ラテックス粒子などの水分散型高分子粒子を担体
として用い、共有結合法により、酵素、ポリ−Ｌ−リジ
ン塩酸塩 (例えば、平均分子量約２８，０００の化合物
など) 、抗ＨＢｓモノクローナル抗体を順次固定化し
て、ＨＢｓ検出用の特異的結合体を作製することができ
る。この場合、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩を介して抗体を
固定化することにより、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩がスペ
ーサーの役割を果たし、抗体の自由度が未固定のものよ
り向上させうる。

【００３１】本発明の特異的結合体は、適宜保存に適し
た緩衝液などに懸濁して保存することができる。

【００３２】本発明の特異的結合体により、被検物質の
免疫測定法が提供される。かかる免疫測定法も本発明に
含まれる。

【００３３】本発明の免疫測定法は、（ａ）吸水性基材
上で、被検物質と結合する第２の特異的結合物質を固定
化した固定相と、本発明の特異的結合体と被検物質とを
サンドイッチ反応させるステップ、及び（ｂ）ステップ
（ａ）におけるサンドイッチ反応を検出するステップ、
を含む。

【００３４】本発明の免疫測定法によれば、本発明の特
異的結合体を用いるため、従来の免疫測定法に比べ、よ
り迅速に、簡便に測定することができ、特に、被検液中
の被検物質が少量である場合でも、高精度でかつ高感度
に測定することができるという優れた効果を発揮する。

【００３５】本発明の免疫測定法は、具体的には、以下
のような工程を含むが、その検出方法は特に限定されな
い。すなわち、被検物質に対する第２の特異的結合物質
を固定化した固定相を有する吸水性基材からなる試験片
の一端より、該被検物質に対する第１の特異的結合物質
を有する特異的結合体と被検液との混合物を吸収させて
展開すると、該混合物中で形成された特異的結合体−被
検物質複合体は固定相上に固定化された第２の特異的結
合物質と結合して捕捉される。したがって、該固定相に
結合した特異的結合体−被検物質複合体を測定すること
により被検液中の被検物質を測定することができる。こ
の場合、検出用の標識物質として酵素を用いた場合、固
定相で捕捉され形成される複合体が酵素標識複合体とな
り、酵素反応により生じる産物を測定することにより検
出を行なうことができる。また、標識物質として蛍光標
識体を用いた場合、該蛍光標識体から生じる蛍光を測定
することにより行なうことができる。

【００３６】例えば、本発明の免疫測定法により、ヒト
ＨＢｓ抗原を含有した被検液を測定する場合、該被検液
と本発明の特異的結合体（酵素標識）との混合物を滴下
し展開した後、洗浄用緩衝液、酵素発色基質を順々に吸
水性基材上を展開させ、上記特異的結合体中の酵素によ
り発色基質が発色し、この標識を肉眼観察又は、光学的
に測定することで、ヒトＨＢｓ抗原の測定ができる。

【００３７】本発明に用いられる試験片において、吸水
性基材は、被検物質を含有した被検液、特異的結合体の
含有溶液を吸収できる基材であればよい。本発明におい
ては、被検液中の被検物質と、特異的結合体または固定
相に固定化された第２の特異的結合物質との免疫化学的
反応を行なう時間を確保できるような吸水性を有する基
材が好ましい。

【００３８】本発明における吸水性基材の好ましい吸水
性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した吸水性基材の
片端部を水に浸し、1 分間経過後の吸水距離が０．５〜
５ｃｍ程度である。

【００３９】本発明の吸水性基材の好ましい具体例とし
ては、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルタ
ー、ニトロセルロースフィルター、多孔質材料などが挙
げられる。これらの基材は、適度な吸水速度を有すると
ともに、標識物質を使用せず、着色ラテッス粒子を使用
した場合、着色ラテックス粒子が結合して発色した際の
目視確認性に優れるなどの利点を有する。

【００４０】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、基材の表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆す
ることもでき、基材に親水性重合体や界面活性剤を含浸
させることもできる。

【００４１】本発明においては、吸水性基材の形状は、
被検液を展開できる形状であればよく、例えば、矩形の
シート状（片状）やロッド状などが好ましい。

【００４２】本発明において、固定相とは、吸水性基材
上に第２の特異的結合物質が固定化された領域をいう。
前記第２の特異的結合物質の基材への固定量は、検出方
法などにより適宜選択することができる。

【００４３】かかる固定相の作製方法は、従来から知ら
れている物理吸着法や共有結合法が好ましく、該特異的
結合物質が基材から脱離しにくいという観点から、共有
結合法が好ましい。吸水性基材が共有結合に用いられう
る官能基を有さない場合、例えば、適当な官能基を有す
る重合体を用いて基材を作製し、吸水性基材の吸水性を
阻害しない範囲で、共有結合に用いられうる官能基を付
着させることができる。

【００４４】また、前記固定相は、第２の特異的結合物
質と親水性重合体とを含む溶液を吸水性基材に塗布した
後、該親水性重合体を凝固させうる凝固溶剤に浸漬する
ことにより固定相を作製することもできる。前記親水性
重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロー
スなどが挙げられる。また、前記凝固剤としては、アセ
トン、エタノール、メタノール、エーテルなどが挙げら
れる。

【００４５】本発明において、前記固定相と、被検液、
特異的結合体、展開用試薬等の展開が開始される部位
（本明細書においては、「吸液部」ともいう）との間の
距離は、特に限定されないが、固定相に特異的結合体−
被検物質複合体を均一に捕捉させ、検出シグナル感度を
向上させる観点から、好ましくは１ｃｍ以上、より好ま
しくは３ｃｍ以上であり、適切な検出シグナル感度を
得、測定に要する時間を短縮させる観点から、好ましく
は、６ｃｍ以下、より好ましくは、４ｃｍ以下であるこ
とが望ましい。具体的には、好ましくは、１〜６ｃｍで
あり、より好ましくは、３〜４ｃｍであることが望まし
い。

【００４６】前記吸液部としては、被検液を滴下するた
めの試料受領部及び特異的結合体、展開用試薬などを滴
下するための試薬受領部が挙げられる。なお、試料受領
部と試薬受領部とは、同一箇所に位置していてもよく、
異なる場所に位置していてもよい。

【００４７】前記吸液部は、被検液または特異的結合体
を含有した溶液の吸水性基材への移動が可能であるもの
であればよく、該吸水性基材と兼用したものであっても
よく、不織布、織布などを該吸水性基材に接着させたも
のであってもよい。

【００４８】吸水性基材上に被検液を吸液部に滴下後、
同吸液部またはその後方から前記特異的結合体を含有し
た緩衝液を直ちに展開させる。このとき、予め被検液と
特異的結合体を含有した緩衝液とを混合した後、滴下し
てもよい。検体中のヒトＨＢｓ抗原（被検物質）と特異
的結合体中の第１の特異的結合物質とが結合し、被検物
質−第１の特異的結合物質−ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩−
酵素−水分散型高分子粒子の複合体を形成する。前記複
合体が吸水性基材上を移動し、第２の特異的結合物質が
固定化された固定相に到達し、吸水性基材−第２の特異
的結合物質−被検物質−第１の特異的結合物質−ポリ−
Ｌ−リジン塩酸塩−酵素−水分散型高分子粒子の複合体
を形成する。その後、洗浄用緩衝液、酵素発色基質を順
々に吸水性基材上を展開させる。これにより、前記複合
体中の酵素により酵素発色基質が発色する。かかる発色
を肉眼観察または吸光度などを光学的に測定することに
より、ヒトＨＢｓ抗原を測定することができる。

【００４９】本発明の免疫測定用キットは、前記免疫測
定法に好適であり、前記特異的結合体を含有することを
１つの特徴とする。本発明のキットは、本発明の特異的
結合体を含有するため、かかるキットを用いることによ
り、精度の高い、被検物質の検出を可能にする。前記キ
ットには、さらに、緩衝液、発色基質溶液などの展開用
もしくは検出用試薬、被検物質と特異的に結合し得る抗
体などの第２の特異的結合物質を固定化した固定相を有
する吸水性基材からなる試験片などを適宜含有してもよ
い。

【００５０】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定する
ものではない。

【００５１】実施例１ 免疫測定用キット構成物の作製 (1) 水分散型高分子粒子からなる着色ラテックス粒子の
作製 スチレンモノマー５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエ
チレングリコールジメタクリレート０．２ｇ及び蒸留水
４４０ｇを混合した。得られた混合物を窒素気流下、温
度７５℃で攪拌しながら、該混合物に過硫酸カリウム水
溶液 (過硫酸カリウム０．２５ｇを水１０ｇに溶解) を
添加し、１０時間重合させた。これにより、平均粒子径
約０．２２μｍのカルボキシル化ポリスチレン粒子の水
分散液 (重合体粒子分散液) が得られた。０．０１Ｍ水
酸化ナトリウム（アルカリ）、０．０１Ｍ塩酸（酸）及
び蒸留水を順に用いて、前記重合体粒子分散液を遠心洗
浄した後、固形分濃度１０重量％に調整し、担体粒子分
散液を得た。

【００５２】次に、スダンブルー０．２ｇをトルエン２
０ｍｌに溶解し、ついでドデシル硫酸ナトリウム０．２
ｇ及び蒸留水１００ｍｌを添加して混合物を得、得られ
た混合物を超音波分散機で乳化した。得られた乳化液に
前記担体粒子分散液（固形分濃度１０重量％）３０ｍｌ
を添加し、室温で２４時間攪拌した。ついで、得られた
溶液から、エバポレータを用いてトルエンを除去し、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で遠心洗浄
し、その後、固形分濃度５重量％になるように調整し
た。これにより、スダンブルー染色化粒子分散液を得
た。

【００５３】(2) 特異的結合体含有溶液の作製 a.酵素固定化 前記(1) で作製したスダンブルー染色化粒子分散液１０
ｍｌに水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１０ｍ
ｇ／ｍｌ、同仁化学研究所社製〕水溶液１ｍｌを加え、
室温で２時間反応させた。得られた反応物を、前記と同
じ緩衝液で洗浄し、その後、固形分濃度１重量％になる
ように調整して分散液を得た。得られた分散液１０ｍｌ
に標識物質であるアルカリホスファターゼ（１０ｍｇ／
ｍｌ）を１ｍｌ添加し、１０℃で２４時間攪拌した。得
られた溶液を前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、同緩衝液
で固形分濃度１重量％に調整し、スダンブルー染色化粒
子−酵素固定化粒子分散液を得た。

【００５４】b.ポリアミノ酸固定化 前記a.で作製した酵素固定化粒子分散液１０ｍｌに水溶
性カルボジイミド〔１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）同仁化学研究所社製〕水溶液１ｍｌを添加し、室温
にて2 時間反応させた。得られた反応物を、前記と同じ
緩衝液で洗浄し、その後、固形分濃度１重量％に調整し
て分散液を得た。得られた分散液１０ｍｌにポリアミノ
酸 (ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩、平均分子量約９，８０
０、ＳＩＧＭＡ社製、１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ添加
し、１０℃で２４時間攪拌した。得られた溶液を、前記
と同じ緩衝液で遠心洗浄し、同緩衝液で固形分濃度１重
量％になるように調整し、スダンブルー染色化粒子−酵
素−ポリアミノ酸固定化粒子分散液を得た。

【００５５】c.抗体固定化 上記b.で作製した酵素−ポリアミノ酸固定化粒子分散液
１０ｍｌに水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（１０ｍｇ／ｍｌ）、同仁化学研究所社製社製〕水溶液
１ｍｌを添加し、室温で２時間反応させた。得られた反
応物を、前記と同じ緩衝液にて洗浄し、固形分濃度１重
量％になるように調整し、分散液を得た。得られた分散
液１０ｍｌに抗ヒトＨＢｓモノクローナル抗体（５ｍｇ
／ｍｌ）を１ｍｌ添加し、１０℃にて２４時間攪拌し
た。得られた溶液を、前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、
同緩衝液で固形分濃度１重量％になるように調整し、ス
ダンブルー染色化粒子−酵素−ポリアミノ酸−抗ヒトＨ
Ｂｓモノクローナル抗体固定化粒子含有溶液 (特異的結
合体含有溶液) を得た。

【００５６】(3) 免疫測定用試験片の作製 第２の特異的結合物質として抗ヒトＨＢｓモノクローナ
ル抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈
し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌに調整し、抗体水溶液を得
た。前記水溶液をニトロセルロースメンブランフィルタ
ー（５×１００ｍｍ）の一端から５０ｍｍ部位に３μl
塗布した後、直ちに３７℃で１時間静置した。その後、
ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、つ
いで該フィルターを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０と０．１
％スキムミルクとの混合水溶液に１時間浸漬させた。そ
の後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出
し、該フィルターを室温で3 時間静置し、ＰＥＴフィル
ムを貼り合わせて、ニトロセルロースメンブランフィル
ター／ＰＥＴフィルムを形成させ、抗ヒトＨＢｓ抗体固
定化ニトロセルロースメンブランフィルター／ＰＥＴフ
ィルムを得た。

【００５７】次に、前記抗ヒトＨＢｓ抗体固定化ニトロ
セルロースメンブランフィルター／ＰＥＴフィルムの一
端から２０ｍｍの所に不織布（５×５ｍｍ）を設け、試
料受領部とした。また、試料受領部と同じ試験片端に不
織布（５×１０ｍｍ）を設け、試薬受領部とした。これ
により、ニトロセルロースメンブランフィルター／ＰＥ
Ｔフィルムからなる試験片を得た。

【００５８】実施例２ 免疫測定用キット構成物の作製 (1) 特異的結合体含有溶液の作製 ポリアミノ酸として、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（平均分
子量約１１１，０００、ＳＩＧＭＡ社製、１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を用いる以外は、実施例１と同様にして、スダンブ
ルー染色化粒子−酵素−ポリアミノ酸−抗ヒトＨＢｓモ
ノクローナル抗体固定化粒子含有溶液 (特異的結合体含
有溶液) を得た。

【００５９】(2) 免疫測定用試験片の作製 実施例１と同様にして、第２の特異的結合物質として抗
ヒトＨＢｓモノクローナル抗体を用いたニトロセルロー
スメンブランフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験
片を得た。

【００６０】実施例３ 免疫測定用キット構成物の作製 (1) 特異的結合体含有溶液の作製 ポリアミノ酸として、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（平均分
子量約２０５，０００、ＳＩＧＭＡ社製、１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を用いる以外は実施例１と同様にして、スダンブル
ー染色化粒子−酵素−ポリアミノ酸−抗ヒトＨＢｓモノ
クローナル抗体固定化粒子含有溶液 (特異的結合体含有
溶液) を得た。

【００６１】(2) 免疫測定用試験片の作製 実施例１と同様にして、第２の特異的結合物質として抗
ヒトＨＢｓモノクローナル抗体を用いたニトロセルロー
スメンブランフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験
片を得た。

【００６２】実施例４ 免疫測定用キット構成物の作製 (1) 特異的結合体含有溶液の作製 ポリアミノ酸として、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（平均分
子量約４５９，０００、ＳＩＧＭＡ社製、１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を用いる以外は、実施例１と同様にして、スダンブ
ルー染色化粒子−酵素−ポリアミノ酸−抗ヒトＨＢｓモ
ノクローナル抗体固定化粒子含有溶液 (特異的結合体含
有溶液) を得た。

【００６３】(2) 免疫測定用試験片の作製 実施例１と同様にして、第２の特異的結合物質として抗
ヒトＨＢｓモノクローナル抗体を用いたニトロセルロー
スメンブランフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験
片を得た。

【００６４】実施例５ 免疫測定用キット構成物の作製 (1) 特異的結合体含有溶液の作製 ポリアミノ酸として、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（平均分
子量約５４，４００、ＳＩＧＭＡ社製、１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を用いる以外は、実施例１と同様にして、スダンブ
ルー染色化粒子−酵素−ポリアミノ酸−抗ヒトＨＢｓモ
ノクローナル抗体固定化粒子含有溶液 (特異的結合体含
有溶液) を得た。

【００６５】(2) 免疫測定用試験片の作製 実施例１と同様にして、第２の特異的結合物質として抗
ヒトＨＢｓモノクローナル抗体を用いたニトロセルロー
スメンブランフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験
片を得た。

【００６６】比較例１ (1) 特異的結合体含有溶液の作製 ポリアミノ酸の固定化工程を行なわずに、スダンブルー
染色化粒子−酵素固定化粒子分散液に直接、抗体を固定
化すること以外は、実施例１と同様にして、スダンブル
ー染色化粒子−酵素−抗ヒトＨＢｓモノクローナル抗体
固定化粒子含有溶液 (特異的結合体含有溶液) を得た。

【００６７】(2) 免疫測定用試験片の作製 実施例１と同様にして、第２の特異的結合物質として抗
ヒトＨＢｓモノクローナル抗体を用いたニトロセルロー
スメンブランフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験
片を得た。

【００６８】比較例２ (1) 特異的結合体含有溶液の作製 ポリアミノ酸の代わりに６−アミノ−n −カプロン酸
（１０ｍｇ／ｍｌ 分子量：１３１．１８、和光純薬)
を用いる以外は、実施例１と同様にして、スダンブルー
染色化粒子−酵素−６−アミノ−n −カプロン酸−抗ヒ
トＨＢｓモノクローナル抗体固定化粒子含有溶液 (特異
的結合体含有溶液) を得た。

【００６９】(2) 免疫測定用試験片の作製 実施例１と同様にして、第２の特異的結合物質として抗
ヒトＨＢｓモノクローナル抗体を用いたニトロセルロー
スメンブランフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験
片を得た。

【００７０】試験例１ ヒトＨＢｓ抗原を生理食塩水水溶液に溶解させた被検液
１０μｌを、前記実施例１〜５、比較例１及び２のそれ
ぞれで作製した試験片の試料受領部に滴下した。その
後、直ちに前記実施例１〜５、比較例１及び２のそれぞ
れで作製した特異的結合体含有溶液（固形分濃度０．０
０２重量％）５０μｌを試薬受領部に滴下し展開した。
１０分後、トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）５０μｌ
を試薬受領部に滴下し展開した。

【００７１】さらにその１０分後、発色基質（BCIP／NB
TPHOSPHATASE SUBSTRATE l-COMPONENTSYSTEM KPL 社
製）１００μｌを試薬受領部に滴下し展開させ、１０分
後の固定相上での発色を目視観察した。その結果を表１
に示す。

【００７２】表１における判定基準を以下に示す： 判定基準 − ：発色が見られない ＋Ｗ：わずかな発色が見られる ＋ ：発色が見られる

【００７３】

【表１】

【００７４】表１の結果より、ポリアミノ酸をスペーサ
ーとして用いた実施例１〜５の特異的結合体（本発明）
を用いた場合、０．１〜１ｎｇ／ｍｌのＨＢｓ抗原濃度
でも良好な発色が見られたが、ポリアミノ酸をスペーサ
ーとして用いていない比較例１及び２の特異的結合体を
用いた場合、０．１〜１ｎｇ／ｍｌの抗原濃度の試料の
検出が困難であることが示される。したがって、本発明
の特異的結合体は、被検液中の被検物質が少量である場
合でも、該被検物質を良好に検出し得ることが示され
る。

【００７５】実施例６ (1) 水分散型高分子粒子からなる着色ラテックス粒子の
作製 実施例１の(1) と同様にして、スダンブルー染色化粒子
分散液を得た。

【００７６】(2) 特異的結合体含有溶液の作製 a.ポリアミノ酸固定化 前記(1) で作製したスダンブルー染色化粒子分散液１０
ｍｌに水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１０ｍ
ｇ／ｍｌ 同仁化学研究所社製〕水溶液１ｍｌを加え、
室温にて２時間反応させた。得られた反応物を、０．０
１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、その後、
固形分濃度１重量％に調整して、分散液を得た。得られ
た分散液１０ｍｌにポリアミノ酸（ポリ−Ｌ−リジン塩
酸塩、平均分子量約９，８００、ＳＩＧＭＡ社製、１０
ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ添加し、１０℃で２４時間攪拌し
た。得られた溶液を、前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、
同緩衝液で固形分濃度１重量％に調整し、スダンブルー
染色化粒子−ポリアミノ酸固定化粒子分散液を得た。

【００７７】b.抗体固定化 前記a.で作製した、スダンブルー染色化粒子−ポリアミ
ノ酸固定化粒子分散液１０ｍｌに水溶性カルボジイミド
〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩１０ｍｇ／ｍｌ同仁化学研究所社
製〕水溶液１ｍｌを加え、室温にて２時間反応させた。
得られた反応物を、前記と同じ緩衝液で洗浄し、その
後、固形分濃度１重量％に調整し、分散液を得た。得ら
れた分散液１０ｍｌに抗ヒトＨＢｓモノクローナル抗体
（５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、１０℃にて２４時間攪
拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、同緩衝
液で固形分濃度１重量％に調整したスダンブルー染色化
粒子−ポリアミノ酸−抗ヒトＨＢｓモノクローナル抗体
固定化粒子分散液を得た。

【００７８】c.酵素固定化 上記ｂで作製したスダンブルー染色化粒子−ポリアミノ
酸−抗ヒトＨＢｓモノクローナル抗体固定化粒子分散液
１０ｍｌに水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
１０ｍｇ／ｍｌ；同仁化学研究所社製〕水溶液１ｍｌを
添加し、室温にて２時間反応させた。得られた反応物
を、前記と同じ緩衝液にて洗浄し、その後、固形分濃度
１重量％になるように調整して分散液を得た。得られた
分散液１０ｍｌに、標識物質であるアルカリホスファタ
ーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、１０℃にて２４
時間攪拌した。得られた溶液を前記と同じ緩衝液で遠心
洗浄し、同緩衝液で固形分濃度１重量％に調整し、スダ
ンブルー染色化粒子−ポリアミノ酸−抗ヒトＨＢｓモノ
クローナル抗体−酵素固定化粒子含有液（特異的結合体
含有溶液）を得た。

【００７９】(3) 免疫測定用試験片の作製 第２の特異的結合物質として抗ヒトＨＢｓモノクローナ
ル抗体を０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈
し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌに調整した抗体水溶液を得
た。前記水溶液をニトロセルロースメンブランフィルタ
ー（５×１００ｍｍ）の一端から５０ｍｍ部位に３μｌ
塗布した後、直ちに３７℃で１時間静置した。その後、
ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、つ
いで、該フィルターを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と０．１
％スキムミルクとの混合水溶液に１時間浸漬させた。そ
の後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出
し、該フィルターを室温で３時間静置し、ＰＥＴフィル
ムを貼り合わせて、ニトロセルロースメンブランフィル
ター／ＰＥＴフィルムを形成させ、抗ヒトＨＢｓ抗体固
定化ニトロセルロースメンブランフィルター／ＰＥＴフ
ィルムを得た。

【００８０】次に、前記抗ヒトＨＢｓ抗体固定化ニトロ
セルロースメンブランフィルター／ＰＥＴフィルムの一
端に、不織布（５×１０ｍｍ）を設け、試料・試薬混合
液受領部とした。これにより、ニトロセルロースメンブ
ランフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験片を得
た。

【００８１】実施例７ (1) 水分散型高分子粒子からなる着色ラテックス粒子の
作製 実施例１の(1) と同様にして、スダンブルー染色化粒子
分散液を得た。

【００８２】(2) 標識複合体含有液の作製 実施例６の(2) におけるa.およびb.と同様にして、スダ
ンブルー染色化粒子−ポリアミノ酸−抗ヒトＨＢｓモノ
クローナル抗体固定化粒子分散液を得た。

【００８３】(3) 免疫測定用試験片の作製 実施例６の(3) と同様にしてニトロセルロースメンブラ
ンフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験片を得た。

【００８４】比較例３ (1) 水分散型高分子粒子からなる着色ラテックス粒子の
作製 実施例１の(1) と同様にして、スダンブルー染色化粒子
分散液を得た。

【００８５】(2) 特異的結合体含有溶液の作製 前記(1) で作製したスダンブルー染色化粒子分散液１０
ｍｌに水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１０ｍ
ｇ／ｍｌ 同仁化学研究所社製〕水溶液１ｍｌを加え、
室温にて２時間反応させた。得られた反応物を、０．０
１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、その後、
固形分濃度１重量％に調整して、分散液を得た。得られ
た分散液１０ｍｌに抗ヒトＨＢｓモノクローナル抗体
（５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、１０℃にて２４時間攪
拌した。得られた溶液を、前記と同じ緩衝液で遠心洗浄
し、同緩衝液で固形分濃度１重量％に調整し、スダンブ
ルー染色化粒子−抗ヒトＨＢｓモノクローナル抗体固定
化粒子含有溶液（特異的結合体含有溶液）を得た。

【００８６】(3) 免疫学的検査片の作製 実施例６の(3) と同様にしてニトロセルロースメンブラ
ンフィルター／ＰＥＴフィルムからなる試験片を得た。

【００８７】試験例２ ヒトＨＢｓ抗原を生理食塩水水溶液に溶解させた被検液
１００μｌを、前記実施例６、実施例７および比較例３
のそれぞれで作製した特異的結合体含有溶液（固形分濃
度２．５重量％）１μｌを混合攪拌し、この液６０μｌ
を上記実施例６、実施例７および比較例３のそれぞれで
作製した試験片の試料・試薬混合液受領部に滴下し、展
開した。１０分後、固定相上での発色を目視観察した。
なお、実施例６については、前記試験例１と同様に行な
い、発色基質を用いた発色を行なった。結果を表２に示
す。なお、表２における判定基準は、前記表１における
判定基準と同様である。

【００８８】

【表２】

【００８９】表２の結果より、ポリアミノ酸をスペーサ
ーとして用い、ポリアミノ酸、抗体および標識物質の固
定化の順番を実施例１〜５とは変えた実施例６において
も、実施例１〜５と同様に良好な発色が見られることが
わかる。

【００９０】また、標識物質を用いない場合であって
も、ポリアミノ酸をスペーサーとして用いた実施例７の
特異的結合体（本発明）を用いた場合、１０００ｎｇ未
満であっても発色が見られたが、ポリアミノ酸をスペー
サーとして用いていない比較例３の特異的結合体を用い
た場合、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの抗原濃度の試料の
検出が困難であることが示される。したがって、本発明
の特異的結合体は、被検液中の被検物質が少量である場
合でも、該被検物質を良好に検出し得ることが示され
る。

【００９１】

【発明の効果】本発明の特異的結合体は、免疫測定法、
特に免疫クロマトグラフ法に用いた場合、被検液中の被
検物質が少量である場合でも、高感度な測定が可能にな
るという優れた効果を奏する。従って、本発明の免疫測
定法によれば、より迅速に、簡便に測定することがで
き、被検液中の被検物質が少量である場合でも、高精度
でかつ高感度に測定することができるという優れた効果
を奏する。さらに、本発明の免疫測定用キットは、前記
免疫測定法に好適である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 担体と、被検物質に対する第１の特異的
   結合物質と、ポリアミノ酸とを有してなる特異的結合体
   であって、該担体と該特異的結合物質とがポリアミノ酸
   を介して固定化されてなる特異的結合体。
2. 【請求項２】 請求項１記載の特異的結合体において、
   担体とポリアミノ酸とが、さらに標識物質を介して固定
   化されてなる特異的結合体。
3. 【請求項３】 （Ａ）ポリアミノ酸と担体とを結合させ
   て、複合体を得る工程、及び（Ｂ）工程（Ａ）で得られ
   た複合体と第１の特異的結合物質とを結合させる工程、
   を含む工程により得られる特異的結合体。
4. 【請求項４】 （Ａ’）標識物質と担体とを結合させ
   て、複合体を得る工程、（Ｂ’）工程（Ａ’）で得られ
   た複合体とポリアミノ酸とを結合させて、複合体を得る
   工程、及び（Ｃ’）工程（Ｂ’）で得られた複合体と第
   １の特異的結合物質とを結合させる工程、を含む工程に
   より得られる特異的結合体。
5. 【請求項５】 （ａ）吸水性基材上で、被検物質と結合
   する第２の特異的結合物質を固定化した固定相と、請求
   項１〜４いずれか記載の特異的結合体と被検物質とをサ
   ンドイッチ反応させるステップ、及び（ｂ）ステップ
   （ａ）におけるサンドイッチ反応を検出するステップ、
   を含む免疫測定法。
6. 【請求項６】 請求項１〜４いずれか記載の特異的結合
   体を含有してなる免疫測定用キット。