JP2002202309A

JP2002202309A - 免疫学的検査方法

Info

Publication number: JP2002202309A
Application number: JP2000401662A
Authority: JP
Inventors: Chieko Kitaura; 千枝子北浦; Koji Maruyama; 幸治丸山; Takeshi Saiga; 健雜賀
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2000-12-28
Publication date: 2002-07-19

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】異なる被検物質を、同時に、高感度かつ特異的
に、迅速かつ簡便に検出することができる免疫学的検出
方法を提供する。【解決手段】免疫クロマトグラフ法において、（Ａ）吸
水性基材上に、１種の被検物質に対する第１特異的結合
物質の固定相が、被検物質数ｎに対してｎ種（ｎは、１
以上の整数）配置された試験片の一端から、被検液を展
開すること、（Ｂ）該試験片上に、被検物質に対する第
２特異的結合物質を展開すること、及び（Ｃ）該試験片
上に、第２特異的結合物質に対する第３特異的結合物質
を着色水分散型高分子粒子に固定化した標識複合体を展
開すること、を含み、被検液中に被検物質が存在する場
合、該固定相上で複合体が形成され、該固定相における
呈色が、該被検物質の存在の指標となる、被検物質の免
疫学的検査方法および免疫学的検査用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検物質の免疫学
的検査方法に関する。さらに詳しくは、異なる被検物質
を同時に検出することができる免疫学的検査方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、大腸菌Ｏ１５７やサルモネラ菌等
の病原性細菌による集団感染、あるいはダイオキシン等
の微量有害物質やホルモン等による環境汚染が問題とな
っている。これらの予知、予防を行なうため、高感度で
迅速かつ簡易である検出方法が求められている。かかる
目的のために様々な簡易検査キットや検査機器が開発さ
れている。なかでも、免疫化学的手法を用いた検出方法
（イムノアッセイ）では、比較的簡易な操作で被検物質
の迅速・高感度検出を行なうことが可能であり、特に免
疫クロマトグラフ法においては操作の簡易性という点に
おいては極めて優れている。

【０００３】前記免疫クロマトグラフ法は、２種類の抗
体により被検物質をサンドイッチする手法を応用したも
のである。具体的には、まず、被検物質に特異的に結合
する第１特異的結合物質（例えば、抗体等）を固定化し
た固定相を有する吸水性基材上に被検液を展開する。被
検液中に被検物質が存在する場合、該被検物質が固定相
上の特異的結合物質によりトラップされ、複合体〔被検
物質−特異的結合物質〕が形成される。さらに、前記複
合体〔被検物質−特異的結合物質〕と、被検物質に特異
的に結合しうる第２特異的結合物質を有する標識複合体
とを反応させることにより、吸水性基材上で複合体〔固
定相上の特異的結合物質−被検物質−標識複合体〕を形
成させる。標識複合体における標識としては、例えば、
着色水分散型高分子粒子（例えば、着色ラテックス粒子
等）、金コロイド粒子、酵素等が使用され、前記着色水
分散型高分子粒子や金コロイド粒子の色、または酵素に
よって生成される色素の色が検出の指標となる。

【０００４】前記免疫クロマトグラフ法においては、被
検物質の検出の際の操作としては、被検液および試薬を
吸水性基材上に展開させる操作のみである。したがっ
て、複数回の洗浄を必要とする酵素イムノアッセイ（Ｅ
ＩＡ）等に比べ、格段に簡便な方法である。

【０００５】かかる免疫クロマトグラフ法によれば、高
感度・迅速性の特徴を生かし、それぞれの被検物質に対
する特異的結合物質（抗体等）とそれぞれの被検物質に
特異的な標識複合体とを用いて、複数の被検物質を同時
に検出することもできる。かかる手法により、例えば、
ビスフェノールＡ、ダイオキシン、ＤＤＴ等の環境ホル
モンを下水や雨水等から、簡便な方法で同時検出でき
る。

【０００６】さらに、刑務所等での薬物検査、病院にお
ける疾患マーカーの検出等、単一の検査システムで複数
の被検物質を検出する用途は今後もますます必要となる
のが現状である。

【０００７】しかしながら、従来の免疫クロマトグラフ
法においては、被検物質により、それぞれ対応する特異
的結合物質（例えば、抗体等）を要するため、それに伴
い、吸水性基材や標識化条件に関して、それぞれ検討を
行なう必要があるという欠点を有する。また、これによ
り、同時に時間やコストを費やすことにもなるという欠
点を有する。

【０００８】また、かかる標識について、特異的結合物
質に対し、様々な方法で標識化が行なわれる。特異的結
合物質の標識化の方法によっては、特異的結合物質（例
えば、抗体等）と被検物質との結合に影響を及ぼすこと
がある。例えば、着色ラテックス粒子と特異的結合物質
（例えば、抗体等）とを含有した標識複合体の場合、個
々の特異的結合物質（例えば、抗体等）の物理的性質お
よび化学的性質の違いが影響し、該標識複合体は、凝集
を起こす場合がある。かかる凝集が起こると、免疫クロ
マトグラフ法における標識複合体としての機能を果たす
ことができなくなるという欠点を有する。また、特異的
結合物質（例えば、抗体等）を酵素等により直接標識す
る場合、標識方法によっては、標識された特異的結合物
質（例えば、抗体等）の収量が極めて少なかったり、被
検物質に対する特異的結合能が低下する場合がある。

【０００９】さらに、洗浄工程を省略したサンドイッチ
型免疫クロマトグラフ法の場合、標識複合体が被検物質
に特異的に結合するか否かが試験の信頼性を左右するた
め、標識複合体の適切な特異的結合能が重要である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、異なる被検
物質を、同時に、高感度かつ特異的に、迅速かつ簡便に
検出することができる免疫学的検出方法を提供すること
を目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、〔１〕免疫クロマトグラフ法において、（Ａ）吸水性
基材上に、１種の被検物質に特異的に結合しうる第１特
異的結合物質を固定化した固定相が、被検物質数ｎに対
してｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）配置された試験
片の一端から、被検液を展開するステップ、（Ｂ）該試
験片上に、被検物質に特異的に結合しうる第２特異的結
合物質を展開するステップ、および（Ｃ）該試験片上
に、第２特異的結合物質に特異的に結合しうる第３特異
的結合物質を着色水分散型高分子粒子に固定化した標識
複合体を展開するステップ、を含み、被検液中に被検物
質が存在する場合、該固定相上で複合体〔第１特異的結
合物質−被検物質−第２特異的結合物質−標識複合体〕
が形成され、該固定相における呈色が、該被検物質の存
在の指標となる、被検物質の免疫学的検査方法、ならび
に〔２〕下記（ａ）〜（ｃ）：（ａ）吸水性基材上に、１種の被検物質に特異的に結合
しうる第１特異的結合物質を固定化した固定相が、被検
物質数ｎに対してｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）配
置されてなる試験片、（ｂ）被検物質に特異的に結合し
うる特異的結合物質であって、第１特異的結合物質とは
異なる動物種由来の第２特異的結合物質、および（ｃ）
第２特異的結合物質中の動物種特異的部分に特異的に結
合しうる第３特異的結合物質を固定化した着色水分散型
高分子粒子からなる標識複合体を含有してなる免疫学的
検査用キット、に関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の免疫学的検出方法におい
ては、免疫クロマトグラフ法において、下記（ａ）〜
（ｃ）：（ａ）吸水性基材上に、１種の被検物質に特異的に結合
しうる第１特異的結合物質を固定化した固定相が、被検
物質数ｎに対してｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）配
置されてなる試験片、（ｂ）被検物質に特異的に結合し
うる特異的結合物質であって、第１特異的結合物質とは
異なる動物種由来の第２特異的結合物質、および（ｃ）
第２特異的結合物質中の動物種特異的部分に特異的に結
合しうる第３特異的結合物質を固定化した着色水分散型
高分子粒子からなる標識複合体を用いることに１つの大
きな特徴がある。本発明の被検物質の免疫学的検査方法
においては、被検液等の被検試料中に被検物質が存在す
る場合、該被検物質を、〔第１特異的結合物質−被検物
質−第２特異的結合物質−標識複合体中の第３特異的結
合物質〕の複合体の形で検出する。

【００１３】なお、前記ｎは、１以上の整数、好ましく
は、２以上の整数である。

【００１４】本発明の免疫学的検出方法としては、具体
的には、免疫クロマトグラフ法において、（Ａ）吸水性
基材上に、１種の被検物質に特異的に結合しうる第１特
異的結合物質を固定化した固定相が、被検物質数ｎに対
してｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）配置された試験
片の一端から、被検液を展開するステップ、（Ｂ）該試
験片上に、被検物質に特異的に結合しうる第２特異的結
合物質を展開するステップ、および（Ｃ）該試験片上
に、第２特異的結合物質に特異的に結合しうる第３特異
的結合物質を着色水分散型高分子粒子に固定化した標識
複合体を展開するステップ、を含み、被検液中に被検物
質が存在する場合、該固定相上で複合体〔第１特異的結
合物質−被検物質−第２特異的結合物質−標識複合体〕
が形成され、該固定相における呈色が、該被検物質の存
在の指標となる方法が挙げられる。

【００１５】本発明の被検物質の免疫学的検査方法によ
れば、固定相の第１特異的結合物質により、該固定相上
にトラップされた被検物質に対し、未標識の第２特異的
結合物質を反応させて、結合させる。したがって、第２
特異的結合物質の被検物質に対する特異的結合能を維持
させたまま、標識複合体を反応させ、結合させることが
できるという優れた効果を発揮する。

【００１６】また、同一の吸水性基材上に、ｎ種の被検
物質の検出に対して、ｎ種の固定相を設け、各固定相に
は、お互い別の被検物質に対して結合する第１特異的結
合物質を用いた場合にも、ｎ種の被検物質を１種の標識
複合体のみにより検出することができるという優れた効
果を発揮する。

【００１７】本発明の免疫学的検出方法においては、ま
ず、（Ａ）吸水性基材上に、１種の被検物質に特異的に
結合しうる第１特異的結合物質を固定化した固定相が、
被検物質数ｎに対してｎ種（ｎは、１以上の整数を示
す）配置された試験片の一端から、被検液を展開する
〔以下、ステップ（Ａ）という〕。

【００１８】本発明において、第１特異的結合物質、第
２特異的結合物質および第３特異的結合物質として用い
られる物質は、前記第１特異的結合物質と第２特異的結
合物質とが、互いに異なる動物種由来の特異的結合物質
であり、かつ第３特異的結合物質が、第２特異的結合物
質に特異的に結合しうる特異的結合物質であればよい。
かかる特異的結合物質としては、例えば、抗原、ハプテ
ン、抗体、エフェクター、レセプター、酵素、酵素補助
因子、酵素阻害剤等が挙げられる。

【００１９】具体的には、ｎ種（ｎは、１以上の整数を
示す）の固定相が配置されている場合、ｎ種の被検物質
にそれぞれ特異的に結合しうるｎ種の第２特異的結合物
質を用い、ここで、ｎ種の第２特異的結合物質は、互い
に同一動物種由来の抗体であることが好ましい。

【００２０】より具体的には、第１特異的結合物質と第
２特異的結合物質とが被検物質に対する抗体であり、か
つ第３特異的結合物質により特異的に結合される第２特
異的結合物質中の動物種特異的部分が、抗体の定常領域
であることが望ましい。例えば、被検物質に特異的に結
合する第１特異的結合物質としては、イムノグロブリン
Ｇ（ＩｇＧ）が挙げられ、マウス以外の動物種を由来と
するポリクローナル抗体であることが望ましい。ポリク
ローナル抗体は、被検物質上の種々の構造と反応するた
め、被検物質との結合確率は高いと考えられる。この場
合、第２特異的結合物質として、被検物質に対する選択
的結合能の高いマウス細胞由来のモノクローナル抗体を
使用することが望ましく、これにより、被検物質を効率
的に検出することが可能となる。さらに、第２特異的結
合物質として、マウス由来モノクローナル抗体を使用す
る場合、標識複合体に用いられる第３特異的結合物質
は、それにより特異的に結合される第２特異的結合物質
中の部分が、動物種特異的部分（この場合、マウス特異
的部分）とすることにより、同一の吸水性基材上にｎ種
の固定相を有する場合でも、１種の標識複合体（抗マウ
スＩｇＧ抗体を標識したもの）のみにより複数の被検物
質を検出することが可能となる。

【００２１】本明細書において、「被検物質」は、通常
の免疫化学的反応により検出可能な物質であればよく、
タンパク質、ウイルス抗原、細菌、微量有害物質、環境
ホルモン等が挙げられる。タンパク質としては、例え
ば、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ＣＲＰ
（Ｃ反応性タンパク質）等が挙げられる。ウイルス抗原
としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原、ロ
タウイルス抗原、アデノウイルス抗原等が挙げられる。
細菌としては、例えば、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ
菌、黄色ブドウ球菌等が挙げられる。微量有害物質とし
ては、例えば、水銀、砒素、カドミウム等が挙げられ
る。環境ホルモンとしては、ダイオキシン、ＤＤＴ、ヘ
キサクロロベンゼン、ビスフェノールＡ等が挙げられ
る。かかる被検物質は、液体試料（被検液という）とし
て、本発明の免疫測定法に供することができる。かかる
被検液としては、前記被検物質を適当な溶媒（例えば、
緩衝液、生理的食塩水等）に溶解または希釈して得られ
た溶液あるいは該被検物質が含有する可能性のある溶液
が挙げられる。かかる被検液としては、例えば、食品か
ら抽出された溶液又はその培養上清、血清、血漿、血
液、尿、便、汗、唾液等、あるいはそれらを適当な希釈
溶媒 (例えば、緩衝液等) によって希釈した希釈液が挙
げられる。なお、希釈液に使用される緩衝液としては特
に限定されないが、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が挙げられる。かかる緩衝液のｐ
Ｈおよび濃度は、被検物質の性質等に応じて適宜選択さ
れうる。

【００２２】試験片としては、前述のように、吸水性基
材上に、１種の被検物質に特異的に結合しうる第１特異
的結合物質を固定化した固定相が、被検物質数ｎに対し
てｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）配置された試験片
が挙げられる。

【００２３】前記吸水性性基材としては、被検液又は該
被検液を緩衝液によって希釈した希釈液を吸収できるも
のであればよい。

【００２４】本発明においては、前記吸水性基材は、迅
速な測定が行なえ、かつ固定相での捕捉を十分に行なう
ことができる程度の吸水性を呈する吸水性基材であれば
よく、吸水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状
に裁断した吸水性基材の片端部に水を浸漬し、１分間経
過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが望まし
い。

【００２５】好ましい具体例としては、適度な吸水速度
を有する観点から、例えば、ニトロセルロースフィルタ
ー、ガラス繊維濾紙、不織布、濾紙等が挙げられる。さ
らに本発明においては、吸水性基材として同一材料から
なる基材を用いてもよいし、あるいは異種の材料からな
る基材を任意の接着手段によって接合して得られた連続
した基材を用いることもできる。

【００２６】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、吸水性基材の表面に親水性重合体、タンパク質
（例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン等）、界面活
性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等）を被覆することも
でき、基材に親水性重合体、タンパク質、界面活性剤を
含浸させることもできる。

【００２７】親水性重合体としては、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキ
シエチルセルロース等が挙げられる。

【００２８】吸水性基材の形状は、前記被検液等の液体
を展開できる形状であればよく、例えば、矩形のシート
状やロッド状等が好ましい。

【００２９】固定相の大きさは、〔第１特異的結合物質
−被検物質−第２特異的結合物質−標識複合体（第３特
異的結合物質）〕を捕捉できるものであればよく、通常
０．５〜５０ｍｍ幅、好ましくは１〜２０ｍｍ幅である
ことが望ましい。

【００３０】前記吸水性基材は、被検液受領部、標識複
合体等の試薬を供するための試薬受領部、吸水用パッド
（例えば、吸水性不織布レーヨン等）等をさらに含有し
てもよい。

【００３１】ステップ（Ａ）において、吸水性基材上に
被検物質を展開するが、ステップ（Ｂ）と同時に行なう
ことも可能である。すなわち予め被検液と第２特異的結
合物質とを混合して得られた混合物を該吸水性基材に供
してもよい。

【００３２】ついで、試験片上に、被検物質に特異的に
結合しうる第２特異的結合物質を展開する〔以下、ステ
ップ（Ｂ）という〕。

【００３３】第２特異的結合物質の使用量は、被検物質
により、適宜設定されうる。

【００３４】ついで、試験片上に、第２特異的結合物質
に特異的に結合しうる第３特異的結合物質を着色水分散
型高分子粒子に固定化した標識複合体を展開する〔以
下、ステップ（Ｃ）という〕。

【００３５】前記標識複合体は、第３特異的結合物質を
着色水分散型高分子粒子（例えば、着色ラテックス粒子
等）に共有結合で結合させ標識したものであるが、かか
る標識複合体は、適切な緩衝液等に懸濁した懸濁液とし
て用いることができる。

【００３６】この場合、着色水分散型高分子粒子（例え
ば、着色ラテックス粒子）の色をそのまま検出の指標と
して利用することができる。また、前記水分散型高分子
粒子を担体として、別の標識物質を結合させることも可
能である。かかる標識物質としては、例えば、ペルオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、
エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられ
る。可視的な判別が容易である観点から、ペルオキシダ
ーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群より選ば
れた少なくとも一種であることが好ましい。

【００３７】標識複合体の使用量は、被検物質の検出に
必要とされる検出感度により適宜設定されうる。

【００３８】標識複合体において、着色水分散型高分子
粒子を用いる場合または標識物質として蛍光を発する粒
子を用いる場合、固定相における呈色や蛍光自体を検出
することができる。標識物質として酵素を使用する場
合、その活性により生成される色素等が指標となる。し
たがって、ステップ（Ｃ）において固定相上に基質とな
るものを存在させる必要がある。例えば、酵素がペルオ
キシダーゼの場合、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テト
ラメチルベンジジン）と過酸化水素０．０１重量％とを
含む０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）が挙げら
れる。

【００３９】本発明の被検物質の免疫学的検査方法にお
いては、被検液中に被検物質が存在する場合、該固定相
上で複合体〔第１特異的結合物質−被検物質−第２特異
的結合物質−標識複合体〕が形成され、該固定相におけ
る呈色が、該被検物質の存在の指標となる。

【００４０】本発明の免疫学的検査方法は、下記（ａ）
〜（ｃ）：（ａ）吸水性基材上に、１種の被検物質に特異的に結合
しうる第１特異的結合物質を固定化した固定相が、被検
物質数ｎに対してｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）配
置されてなる試験片、（ｂ）被検物質に特異的に結合し
うる特異的結合物質であって、第１特異的結合物質とは
異なる動物種由来の第２特異的結合物質、および（ｃ）
第２特異的結合物質中の動物種特異的部分に特異的に結
合しうる第３特異的結合物質を固定化した着色水分散型
高分子粒子からなる標識複合体を含有した免疫学的検査
用キットを用いることにより、より簡便に実施されう
る。かかるキットとしては、具体的には、第１特異的結
合物質と第２特異的結合物質とが被検物質に対する抗体
であり、かつ第３特異的結合物質により特異的に結合さ
れる第２特異的結合物質中の動物種特異的部分が、抗体
の定常領域である、免疫学的検査用キット等が挙げられ
る。

【００４１】本発明の免疫学的検査方法は、単一の検査
システムで複数の被検物質を同時に検出することができ
るため、例えば、設備の大きさに限界のある場所におけ
る、下水や雨水等に含まれるビスフェノールＡ、ダイオ
キシン、ＤＤＴ等の環境ホルモンの検出、疾患マーカー
の検出等に応用できる。

【００４２】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げ、さらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定され
るものではない。

【００４３】製造例（１）標識複合体の作製１）水分散型高分子粒子懸濁液の作製スチレン５０ｇとアクリル酸０．５ｇとトリエチレング
リコールジメタクリレート０．２ｇと蒸留水４４０ｇと
からなる混合物を、窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持、
攪拌しながら、過硫酸カリウム０．２５ｇを蒸留水１０
ｇに溶解した水溶液を重合開始剤として前記混合物に加
えた。１０時間重合を行なった結果、カルボキシル化さ
れた水分散型高分子粒子としてカルボキシル化ポリスチ
レンラテックス粒子（平均粒子径：約０．２μｍ）を得
た。得られたカルボキシル化ポリスチレンラテックス粒
子を０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）に固形分
濃度が５重量％になるよう分散し、水分散型高分子粒子
懸濁液を得た。

【００４４】２）標識複合体の作成第３特異的結合物質として抗マウスＩｇＧ−ヤギ由来ポ
リクローナル抗体を、カルボキシル化ポリスチレンラテ
ックス粒子に固定した。以下にその手順を示す。

【００４５】前記１）で得た水分散型高分子粒子懸濁液
３ｍｌに、水溶性カルボジイミド〔DOJIN 社製、1 −エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．２）〕０．５ｍｌ、抗マウスＩｇＧ−ヤギ
由来ポリクローナル抗体〔Kirkegaard ＆ Perry Labor
atories Inc.社製、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸
緩衝液（ｐＨ８．２）〕２ｍｌを加えて１０℃で３時間
反応させた。その後、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸
緩衝液（ｐＨ８．２）を用いて、反応物について遠心分
離洗浄を行なった。０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．２）で固形分濃度２重量％に調整し、抗マウスＩｇ
Ｇ−ヤギ由来ポリクローナル抗体を固定化したラテック
ス粒子を得た。

【００４６】（２）吸水性基材への第１特異的結合物質
の固定化第１特異的結合物質として、抗サルモネラエンテリテ
ィディス−ウサギ由来ポリクローナル抗体と抗大腸菌Ｏ
１５７−ヤギ由来ポリクローナル抗体とを用いた。各抗
体を、０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し
て、それぞれ４ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。

【００４７】吸水性基材として、ニトロセルロース膜
（孔径１２μｍ、外形６ｍｍ×６０ｍｍ）を用いた。前
記吸水性基材の一端から２０ｍｍの部位に、抗サルモネ
ラエンテリティディス−ウサギ由来ポリクローナル抗
体を含む抗体溶液を0 ．5 μｌを塗布したのち、４０℃
で２時間乾燥し、固定相を配置させた。本製造例および
実施例においては、かかる固定相をＳＥ固相部と称す。
また、前記吸水性基材の一端から３０ｍｍの位置に抗大
腸菌Ｏ１５７−ヤギ由来ポリクローナル抗体を含む抗体
溶液を0 ．5 μｌを塗布したのち、４０℃で２時間乾燥
し、それにより固定相を配置した。本製造例および実施
例においては、かかる固定相をＯ１５７：Ｈ７固相部と
称す。これにより、固定相を有する吸水性基材を得た。

【００４８】次に、得られた固定相を有する基材を、１
重量％ウシ血清アルブミン水溶液に１時間浸漬した後、
室温で一夜乾燥した。

【００４９】固定相から４〜８ｍｍの箇所にポリエステ
ル製不繊布（６×６ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合わせ、
試薬受領部を作製した。また、試薬受領部を中心とし
て、抗体塗布箇所とは反対側の端から４〜１７ｍｍの個
所にポリエステル製不繊布（６ｍｍ×６ｍｍ、厚さ１ｍ
ｍ）を貼り合わせ、被検液受領部を作製した。

【００５０】さらに、固定相側の端１０ｍｍの箇所に吸
水剤としてガラス繊維製不繊布（ワットマン社製）GF/B
（１５ｍｍ×３０ｍｍ×厚さ１ｍｍ）を貼り合せ、試験
編を得た。

【００５１】実施例１被検試料中のサルモネラ菌の検
出第２特異的結合物質として、抗サルモネラ−マウス由来
モノクローナル抗体を用い、塩化アンモニウム緩衝液
（組成：０．１Ｍ−ＮＨ₄Ｃｌ、０．９重量％ＮａＣ
ｌ、ｐＨ８．０）で１μｇ／ｍｌの濃度に調整した。被
検物質であるサルモネラ菌を１０⁸細胞／mlの濃度に調
整した試料液１００μｌに対して第１免疫学的成分（抗
体）を含む抗体溶液１μｌを添加し、５分間静置し、被
検液とした。

【００５２】製造例の（１）で調製した標識複合体を
０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ＮａＣｌ：０．９重量％、ア
ジ化ナトリウム：０．１重量％含有、ｐＨ７．４）にて
希釈し、０．０１重量％の展開液を調製した。

【００５３】調製した試薬６０μｌをそれぞれ吸水性基
材上の試薬受領部から添加し、１０分後上記の標識複合
体溶液６０μｌを添加した。展開後、それぞれの試験片
の固定相における１５分後の発色の有無を目視観察し
た。結果を表１に示す。

【００５４】実施例２試料中の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７
の検出第２特異的結合物質として抗Ｏ１５７：Ｈ７−マウス由
来モノクローナル抗体を用い、塩化アンモニウム緩衝液
（組成：０．１Ｍ−ＮＨ₄Ｃｌ、０．９重量％ＮａＣ
ｌ、ｐＨ８．０）で１μｇ／ｍｌの濃度に調整した。被
検物質であるＯ１５７：Ｈ７を１０⁶細胞／ｍｌの濃度
に調整した試料液１００μｌに対して第２の抗体を含む
上記溶液１μｌを添加し、５分間静置し、被検液とし
た。この被検液の組成以外は、実施例１と同様の方法で
実施し、結果を表１に示す。

【００５５】実施例３試料中のサルモネラエンテリ
ティディスおよびＯ１５７：Ｈ７の検出被検物質であるサルモネラエンテリティディスは１０
⁸細胞／ｍｌの濃度に、Ｏ１５７：Ｈ７は１０⁶細胞／
ｍｌの濃度になるように混合した。得られた被検液１０
０μｌに対して第２の抗体を含む実施例１記載の溶液お
よび実施例２記載の溶液各１μｌを添加し、５分間静置
したのち被検液とした。この被検液の組成以外は実施例
１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。

【００５６】なお、判定基準は、下記のとおりである。＋：固定相にライン状の発色が見られる −：固定相にライン状の発色が見られない

【００５７】

【表１】

【００５８】表１に示すように、ＳＥ固相部およびＯ１
５７固相部の各固定相において、それぞれに対応する被
検物質を特異的に検出できることがわかる。

【００５９】比較例１サルモネラエンテリティディ
スに結合する第２特異的結合物質の標識化サルモネラエンテリティディスに結合する第２特異的
結合物質を、製造例の（１）のとおりに着色ラテックス
粒子で標識化を行なったが、凝集が起こり、免疫クロマ
トグラフ法による検出に使用できなかった。

【００６０】

【発明の効果】本発明の被検物質の免疫学的検出方法に
よれば、複数種の被検物質についても同一の試験片にお
いて同じ標識複合体により検出することが可能であるた
め、異なる被検物質を、同時に、高感度かつ特異的に、
迅速かつ簡便に検出することができるという優れた効果
を奏する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫クロマトグラフ法において、（Ａ）
吸水性基材上に、１種の被検物質に特異的に結合しうる
第１特異的結合物質を固定化した固定相が、被検物質数
ｎに対してｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）配置され
た試験片の一端から、被検液を展開するステップ、
（Ｂ）該試験片上に、被検物質に特異的に結合しうる第
２特異的結合物質を展開するステップ、および（Ｃ）該
試験片上に、第２特異的結合物質に特異的に結合しうる
第３特異的結合物質を着色水分散型高分子粒子に固定化
した標識複合体を展開するステップ、を含み、被検液中
に被検物質が存在する場合、該固定相上で複合体〔第１
特異的結合物質−被検物質−第２特異的結合物質−標識
複合体〕が形成され、該固定相における呈色が、該被検
物質の存在の指標となる、被検物質の免疫学的検査方
法。
【請求項２】第１特異的結合物質と第２特異的結合物
質とが、互いに異なる動物種由来の特異的結合物質であ
る、請求項１記載の免疫学的検査方法。
【請求項３】ｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）の固
定相が配置されている場合、ｎ種の被検物質にそれぞれ
特異的に結合しうるｎ種の第２特異的結合物質を用いる
方法であり、ここで、ｎ種の第２特異的結合物質は、互
いに同一動物種由来の抗体である、請求項１または２記
載の免疫学的検査方法。
【請求項４】下記（ａ）〜（ｃ）：（ａ）吸水性基材上に、１種の被検物質に特異的に結合
しうる第１特異的結合物質を固定化した固定相が、被検
物質数ｎに対してｎ種（ｎは、１以上の整数を示す）配
置されてなる試験片、（ｂ）被検物質に特異的に結合し
うる特異的結合物質であって、第１特異的結合物質とは
異なる動物種由来の第２特異的結合物質、および（ｃ）
第２特異的結合物質中の動物種特異的部分に特異的に結
合しうる第３特異的結合物質を固定化した着色水分散型
高分子粒子からなる標識複合体を含有してなる免疫学的
検査用キット。
【請求項５】第１特異的結合物質と第２特異的結合物
質とが被検物質に対する抗体であり、かつ第３特異的結
合物質により特異的に結合される第２特異的結合物質中
の動物種特異的部分が、抗体の定常領域である、請求項
４記載の免疫学的検査用キット。