JP2003107090A

JP2003107090A - 免疫クロマトグラフ用標識複合体組成物

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Publication number: JP2003107090A
Application number: JP2001302276A
Authority: JP
Inventors: Koji Maruyama; 幸治丸山; Takeshi Saiga; 健雜賀; Shuji Senda; 修治千田
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2003-04-09

Abstract

(57)【要約】【課題】広い範囲の被検物質量での被検物質の検出が確
実性を有する免疫クロマトグラフ用標識複合体組成物お
よびそれを用いた免疫クロマトグラフ法を提供するこ
と。【解決手段】標識物質と被検物質に対する抗体とを有す
る標識複合体を２種以上含む標識複合体組成物であっ
て、各標識複合体における抗体の該被検物質に対する検
出感度が互いに異なることを特徴とする免疫クロマトグ
ラフ用標識複合体組成物、ならびに吸水性基材上に、被
検物質に対する抗体が固定化された固定相を有する試験
片を用いて、被検試料中における被検物質の有無を、下
記（ａ）と（ｂ）：（ａ）被検物質、（ｂ）請求項１〜
４いずれかに記載の標識複合体組成物中の標識複合体、
との複合体の有無により検出することを特徴とする、免
疫クロマトグラフ法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、広範囲の量の被検
物質の検出において、高い確実性を有する免疫クロマト
グラフ用標識複合体組成物およびそれを用いた免疫クロ
マトグラフ法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、迅速かつ簡便に免疫化学的検査が
行なうことができる方法として、免疫クロマトグラフ法
が注目されている。当該方法は、例えば以下の工程を経
る。被検試料中に被検物質が存在する場合、試験片上に
被検物質と結合しうる特異的結合物質を固定化した固定
相に、該被検物質に特異的に結合しうる特異的結合物質
と標識物質とを有する標識複合体と該被検物質との複合
体が形成する。続いて固定相にて結合した標識物質を検
出することにより、被検試料中に被検物質の存在を確認
することができる。

【０００３】しかしながら、被検物質が過剰に存在する
場合、標識複合体と該被検物質との複合体が形成された
後、得られた複合体同士が凝集塊となり、クロマト展開
が正常に行われない場合がある。通常、免疫クロマトグ
ラフ法にはリファレンスラインが設けられており、未反
応の標識複合体を捕捉することで試験が正常に行われた
ことを確認している。ところが、多くのクロマトキット
は未感作動物のイムノグロブリン標識体を用いテストの
成否を判定している。これは、実際の被検物質に対する
標識複合体が正常に展開していることの直接的な証拠と
はなりえないという問題を含んでいる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、広い範囲の
被検物質量での被検物質の検出が確実性を有する免疫ク
ロマトグラフ用標識複合体組成物およびそれを用いた免
疫クロマトグラフ法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、〔１〕標識物質と被検物質に対する抗体とを有する
標識複合体を２種以上含む標識複合体組成物であって、
各標識複合体における抗体の該被検物質に対する検出感
度が互いに異なることを特徴とする免疫クロマトグラフ
用標識複合体組成物、ならびに〔２〕吸水性基材上に、
被検物質に対する抗体が固定化された固定相を有する試
験片を用いて、被検試料中における被検物質の有無を、
下記（ａ）と（ｂ）：（ａ）被検物質、（ｂ）前記〔１〕記載の標識複合体組
成物中の標識複合体、との複合体の有無により検出する
ことを特徴とする、免疫クロマトグラフ法、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の免疫クロマトグラフ用標
識複合体組成物は、標識物質と被検物質に対する抗体と
を有する標識複合体を２種以上含む標識複合体組成物で
あって、各標識複合体における抗体の該被検物質に対す
る検出感度が互いに異なることに１つの特徴を有する。
本発明の標識複合体組成物を用いて免疫クロマトグラフ
法を行なうことにより、被検物質量が少なくても被検物
質の検出が可能であり、逆に被検物質量が多くても標識
複合体の展開が良好となるため、広い範囲の被検物質量
で高い確実性をもって被検物質の検出を行なうことがで
きる。

【０００７】被検物質に対する抗体の最大の検出感度と
最小の検出感度の差は、免疫クロマト法による測定で、
好ましくは５〜５×１０⁴倍の差であり、さらに好まし
くは５０〜１×１０³倍の差である。被検物質に対する
検出感度が異なる抗体は、例えば、以下のような方法に
て選択する。被検物質に対する抗体としてポリクローナ
ル抗体、または、モノクローナル抗体を通常行なわれて
いる方法によって数種類得る。それぞれの抗体を標識物
質と結合させ感度を測定しようとする抗体の標識複合体
を作製する。クロマト試験紙はニトロセルロース膜を用
いて常法に従い作製する。測定はサンドイッチ法を用い
試験紙側に被検物質に対する抗体（基準となる抗体）を
一定量塗布し検出ラインとする。このクロマト試験紙を
用いてサンプル滴下部及び吸水材などを配置した免疫ク
ロマトキットを作製する。このようにして作製した免疫
クロマトキットと標識複合体を用いて、被検物質の段階
希釈溶液（例えば１０倍希釈系列）、すなわち標準溶液
を測定し、その結果としてそれぞれの抗体について被検
物質を検出可能な最小濃度を検出感度として求める。こ
のようにして検出感度の異なる抗体を選択できる。例え
ば、被検物質が大腸菌Ｏ１５７である場合、大腸菌Ｏ１
５７を検出できる最小濃度の検体として、例えば１０⁴
個／ｍＬ含む検体から検出できる抗体の感度は１０⁴個
／ｍＬで、最小濃度が１０⁶個／ｍＬ含む検体から検出
できる抗体の感度は１０⁶個／ｍＬと表示する。したが
って、この場合、２つの抗体の検出感度の差は１００倍
の差があることになる。

【０００８】被検物質に対する検出感度が異なる２種以
上の抗体は、異種動物由来であってもよく、同種動物由
来であってもよい。また、モノクローナル抗体およびポ
リクローナル抗体のいずれであってもよい。

【０００９】被検物質に対する最大の検出感度を有する
抗体を含む標識複合体の含有率は、低濃度の被検物質を
高感度に検出することおよび結合しなかった標識複合体
がリファレンス相に達することができる観点から、標識
複合体組成物の３０〜９５重量％が好ましく、５０〜８
０重量％がより好ましい。

【００１０】被検物質に対する最小の検出感度を有する
抗体を含む標識複合体の含有率は、大過剰の被検物質が
存在した場合、凝集塊にとり込まれず、クロマト展開で
きる観点から、標識複合体組成物の５〜７０重量％が好
ましく、２０〜５０重量％がより好ましい。

【００１１】被検物質に対する検出感度の高い抗体を含
む標識複合体を用いることにより、低濃度の被検物質を
より高感度に検出できる。

【００１２】また、被検物質に対する検出感度の低い抗
体を含む標識複合体を用いることにより、被検物質が大
過剰に存在する場合においても、検出感度の低い抗体を
含む標識複合体は凝集塊を形成することなく、クロマト
展開可能である。

【００１３】本発明の免疫クロマトグラフ法により検出
されうる被検物質としては、免疫化学的反応（すなわち
抗原抗体反応）によりサンドイッチ免疫複合体を形成し
得るものであれば特に制限されない。例えば、大腸菌等
の細菌およびその構成成分、細菌が産生する毒素、タン
パク質、ウイルス抗原および抗体ならびにマイコプラズ
マ等の生物由来成分、および内分泌攪乱物質、農薬、医
薬品等の化学物質が挙げられる。

【００１４】標識物質と抗体とを有する標識複合体にお
いて、前記標識物質としては、免疫測定分野で用いられ
る公知の物質、例えば、着色粒子、酵素、蛍光物質等が
挙げられる。なかでも目視判定が可能であり、測定装置
を必要としないという観点から、着色粒子および酵素が
より好ましい。

【００１５】着色粒子としては、肉眼で色が検出可能な
ものであればよく、例えば、スダンブルー、スダンレッ
ドIV、スダンIII 、オイルオレンジ、キニザリングリー
ン等に代表される染料、顔料等で着色した着色水分散型
高分子粒子等が挙げられる。目視確認性の点からは、青
色、赤色、緑色またはオレンジ色に着色した着色水分散
型高分子粒子が好ましい。分散安定性や被検物質の検出
感度を調整し易い点から青色または赤色等に着色した着
色ラテックス粒子が望ましい。前記着色粒子の平均粒子
径は、発色の良好性の観点から、約０．０１μｍ以上、
好ましくは０．０５μｍ以上であり、着色粒子の僅かな
凝集に起因する吸水性基材の目詰まりを防ぐ観点から、
約３μｍ以下、好ましくは、約０．５μｍ以下であるこ
とが望ましい。具体的には、約０．０１〜３μｍ、好ま
しくは、約０．０５〜０．５μｍの範囲であることが望
ましい。

【００１６】酵素としては、例えば、ペルオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステ
ラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。よ
り高感度で安定な検出を達成することが可能なペルオキ
シダーゼまたはアルカリホスファターゼが好ましい。

【００１７】また、蛍光物質としては、例えば、フルオ
レセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン
イソチオシアネート等が挙げられる。

【００１８】さらに、本発明においては、前記標識複合
体は、金属コロイド粒子または水分散型高分子粒子等を
担体とし、該担体に、標識物質（前記酵素または蛍光物
質）と抗体とが固定された複合体であってもよい。

【００１９】標識複合体に用いられる担体としては、そ
の表面上に、抗体および標識物質を固定することができ
るものであればよく、金属コロイド粒子、水分散型高分
子粒子、シリコーン、シリカ、ガラスケイソウ土粒子等
が挙げられる。

【００２０】金属コロイド粒子としては、金コロイド粒
子およびセレニウムコロイド粒子等が例示される。

【００２１】水分散型高分子粒子としては、粒径コント
ロール、分散安定性、結合容易性の観点から、ラテック
ス粒子が好ましい。水分散型高分子粒子は、例えば、不
飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体の乳化重
合によって調製される。かかる単量体としては、例え
ば、エチレン、プロピレン等のオレフィン系単量体、酢
酸ビニル、塩化ビニル等のビニル系単量体、スチレン、
メチルスチレン、クロロスチレン等のスチレン系単量
体、メタアクリル酸メチル等のメタクリル酸エステル系
単量体、ブタジエン等のジエン系単量体等が挙げられ
る。

【００２２】水分散型高分子粒子は、単量体の単独重合
体または共重合体に改質用単量体を共重合して得られた
重合体でもよい。このような改質用単量体としては、例
えば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフ
ルオロエチルメチルメタクリレート等のフッ素化メタク
リル酸エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリ
ル、アクリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、
スルホプロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ
−ビニル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチルアク
リレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリ
シジルメタクリレート等が挙げられる。

【００２３】また本発明においては、担体は、市販され
ている種々の水分散性高分子粒子でもよい。市販されて
いる水分散性高分子粒子としては、例えば、スチレン−
ブタジエン共重合体、スチレン−アクリロニトリル−ブ
タジエン共重合体等の種々のスチレン共重合体からなる
エマルジョン等のスチレン含有物またはその誘導体を単
量体成分とする単独重合体や共重合体のエマルジョン；
（メタ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその
誘導体を単量体成分とする単独重合体、該単量体成分と
（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチ
ル、グリシジル（メタ）アクリレート等との共重合体；
前記したスチレンまたはその誘導体と、（メタ）アクリ
レートエステルやその誘導体との共重合体；ゴム、ナイ
ロン、ポリウレタン、微結晶質セルロース等が挙げられ
る。

【００２４】個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子粒子を担体として使用した抗体が、その
使用時や保存時に融着、凝集を起こさないように、前記
水分散型高分子粒子が所要のガラス転移点を有するよう
に選ばれる。水分散型高分子粒子のガラス転移点は、好
ましくは１０℃以上、特に室温以上であることが望まし
い。

【００２５】前記水分散型高分子粒子のうち、粒子の安
定性の点から、スチレン系単量体を主成分とする重合体
が好ましく、また、抗体および標識物質を固定するため
に、アクリル酸やメタクリル酸等のカルボキシル基を有
する単量体を共重合した高分子粒子が望ましい。

【００２６】前記担体は、該担体表面への抗体および標
識物質の固定、スペーサーの導入または水分散状態での
安定性の向上の観点から、官能基を有していてもよい。
このような官能基としては、例えばカルボキシル基、水
酸基、グリシジル基、アミノ基、ホルミル基、カルバモ
イル基、イソチオシアナート基、アジドカルボニル基、
ヒドラジド基、酸無水物基等を挙げることができ、好ま
しくはカルボキシル基が導入される。これらの官能基を
有する担体を調製するには、単量体成分として、例え
ば、アクリル酸、メタクリル酸のようなカルボキシル基
を有する単量体、例えばヒドロキシエチルアクリレー
ト、２−ヒドロキシエチルメタクリレートのような水酸
基を有する単量体、例えば、グリシジルメタクリレート
のようなグリシジル基を有する単量体を共重合させるこ
と、あるいは必要に応じて他の共重合性単量体と乳化共
重合させることによって、それぞれカルボキシル基、水
酸基およびグリシジル基を有する担体を得ることができ
る。また、所要の単量体成分を重合させた後、得られた
担体に官能基を導入することもできる。

【００２７】担体の粒子径は、分散性、ならびに酵素、
抗体等の固定化量の調製を良好にする観点から、好まし
くは３μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以下であり、
得られた標識複合体の精製の容易性の観点から、好まし
くは０．０１μｍ以上、さらに好ましくは０．１μｍ以
上であることが望ましい。

【００２８】担体に、抗体および標識物質を固定させる
方法としては、疎水結合（物理的吸着) 、イオン結合、
共有結合等が利用できる。安定性の観点から、共有結合
を介して結合させる際に、必要に応じて、抗体等の当該
水分散型高分子粒子上での自由度を高めるために、スペ
ーサー基を介在させることができる。

【００２９】前記スペーサー基は、予め水分散型高分子
粒子に結合させた後、抗体および標識物質と結合させて
もよく、予め抗体および標識物質に結合させた後、これ
を水分散型高分子粒子に結合させてもよい。更に、必要
に応じて、水分散型高分子粒子、抗体および標識物質の
全てに予めスペーサー基を結合させ、これらを相互に結
合させることもできる。

【００３０】スペーサー基として用い得る化合物は、少
なくとも二官能性の有機化合物であり、特に炭素数１〜
１２の炭素鎖基を有する二官能性の有機化合物が好まし
い。このようなスペーサー基として機能する化合物とし
ては、特に限定されないが、例えば、へキサメチレンジ
アミン、ドデカメチレンジアミン、キシリレンジアミン
等のジアミン類、グリシン、β−アミノプロピオン酸、
γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、ε−アミノカ
プリル酸等のアミノアルキルカルボン酸、リジン、グル
タミン酸、β−アラニン、アルギニン、グリシルグリシ
ン等のアミノ酸類等が好ましい。

【００３１】水分散型高分子粒子に直接またはスペーサ
ー基を介して抗体および標識物質を共有結合にて結合さ
せるための方法は、特に限定されず、慣用の方法が挙げ
られる。かかる方法としては、例えば、結合試薬として
水溶性カルボジイミドを用いる方法が挙げられる。具体
的には、例えば、アミノアルキルカルボン酸をスペーサ
ー基として用いる場合であれば、水溶性カルボジイミド
を用いて、抗体および標識物質を共有結合にて水分散型
高分子粒子に結合させることができる。

【００３２】前記水溶性カルボジイミドとしては、例え
ば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２
−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トル
エンスルホネート等が挙げられる。このような水溶性カ
ルボジイミドを用いて、スペーサー基を介するまたは直
接的な共有結合による、抗体および標識物質の水分散型
高分子粒子への結合は、慣用の方法および条件により行
なわれ得る。本発明において、抗体および標識物質の水
分散型高分子粒子への結合は、両者の結合を同時に行な
ってもよく、別々に行なってもよい。

【００３３】このようにして得られた標識複合体に含ま
れる抗体および標識物質の総固定量は、担体の乾燥重量
１ｇあたり好ましくは５〜２００ｍｇであり、その量は
上記の範囲内で、使用する抗体、標識物質の種類等によ
って適宜変更し得る。例えば、担体が水分散型高分子粒
子の場合、当該粒子の表面積に鑑みると、前記総固定量
は、水分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり、好まし
くは２００ｍｇ以下であり、さらに好ましくは１５０ｍ
ｇ以下であり、被検物質の検出の迅速性、感度、再現性
の観点から、好ましくは５ｍｇ以上であり、さらに好ま
しくは１０ｍｇ以上であることが望ましい。

【００３４】ここで、担体の「乾燥重量」とは、一定量
の担体を１２０℃で２時間乾燥した後の重量をいう。

【００３５】免疫クロマトグラフ法とは、例えば、以下
のような工程を含む方法が挙げられる。すなわち、吸水
性基材上に、被検物質に対する抗体が固定化された固定
相を有する試験片の一端より、標識複合体組成物を含有
する溶液と、被検試料とを、別々にあるいはそれらを予
め混合して、試験片に滴下して展開する。被検試料中に
被検物質が存在する場合、形成された〔被検物質−標識
複合体〕からなる複合体は、固定相に固定化された抗体
と結合して固定相上に捕捉される。したがって、該固定
相に補足された〔被検物質−標識複合体〕からなる複合
体中の標識物質を測定することにより被検試料中の被検
物質を測定することができる。

【００３６】被検試料としては、被検物質を含有する疑
いがある試料が挙げられる。具体的には、血液成分、
尿、唾液、汗、便等の生体由来成分、食品および培養液
等が挙げられる。また、前記被検試料は液体試料であっ
てもよく、固体試料であってもよい。固体試料の場合、
該固体試料を、例えば、緩衝液、生理的食塩水等の溶媒
に、溶解または希釈して得られた溶液として用いてもよ
い。

【００３７】試験片に用いられる吸水性基材は、被検試
料を吸収できる基材、またはこれらを緩衝液によって希
釈した希釈液を吸収する基材であればよい。本発明にお
いては、被検試料中の被検物質と標識複合体中の抗体や
固定相の抗体との充分な反応を行なうための時間を確保
できるような吸水性基材が用いられる。好ましい具体例
としては、適度な吸水速度を有する観点から、例えば、
不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニト
ロセルロース、多孔質材料等が挙げられる。

【００３８】吸水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の
短冊状に裁断した吸水性基材の片端部に水を浸漬し、１
分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍのものが好まし
い。親水性重合体を使用して吸水性基材の吸水性を調整
することもできる。

【００３９】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検試料を展開できる形状であれば特に限定されるもので
はなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等
が好ましい。

【００４０】前記試験片の固定相に用いられる、被検物
質に対する抗体は、前記標識複合体に用いられる抗体と
同じ抗体または同一抗原の別のエピトープを認識する抗
体を使用することができる。

【００４１】固定相は、公知の物理吸着法、共有結合法
等により作製されうる。また、固定相に使用する抗体と
親水性重合体とを含む溶液を吸水性基材に塗布した後、
該親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬することで
固定相を作製することもできる。親水性重合体として
は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニル
アルコール、ヒドロキシエチルセルロース等が挙げられ
る。凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、メタノ
ール、エーテル等が挙げられる。

【００４２】固定相は、被検試料の吸液によって展開し
移動してきた〔被検物質−標識複合体〕からなる複合体
を捕捉するために、吸水性基材上に抗体を０．００５〜
５ｍｇ／ｃｍ²塗布することが望ましい。

【００４３】固定後の吸水性基材は、被検対象でないタ
ンパク質の基材への非特異的吸着の防止、展開の容易
性、固定した抗体の保存安定性の観点から、ブロッキン
グ剤、界面活性剤および糖を含有する溶液（処理液とい
う）で処理されることが好ましい。ここで、使用するブ
ロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、カゼイ
ン、ゼラチン、スキムミルク等が挙げられる。界面活性
剤としては、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェ
ニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウ
レート、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルリ
ン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリ
ン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル等が挙げられる。前記処理液中のタンパク質の含
有量は、好ましくは０．１〜１０重量％である。前記処
理液中の界面活性剤の含有量は、好ましくは０．０１〜
１重量％である。前記処理液中の糖の含有量は０．１〜
１０重量％である。

【００４４】試験片には、固定相より下流側の吸水性基
材上に、標識複合体に含まれる抗体に特異的に結合しう
る物質が固定化されたリファレンス相を設けてもよい。
リファレンス相では、展開してきた標識複合体そのもの
を捕捉することができる。リファレンス相を設けること
により、免疫クロマトグラフ法による試験の成否を直接
的に判定することが可能となる。

【００４５】なお、本明細書において、「下流」とは、
後述の被検試料受領部からみて固定相側を意味する。

【００４６】リファレンス相に用いられる標識複合体に
含まれる抗体に特異的に結合しうる物質としては、例え
ば、標識複合体に含まれる抗体に対する抗体（抗ＩｇＧ
抗体、抗Ｆｃ抗体等）、抗体結合性のあるプロテインＡ
およびプロテインＧ等が挙げられる。ここで、捕捉する
標識複合体は、検出感度の高い標識複合体と低い標識複
合体に用いられる抗体種が例えば同一動物由来のＩｇＧ
である場合、その動物のＩｇＧに対する抗ＩｇＧ抗体を
単独で用いることができる。また異種動物であれば、そ
れぞれの動物由来の抗体に対する抗ＩｇＧ抗体を混合し
て用いることができる。このようにすれば、いずれの標
識複合体も捕捉できる。

【００４７】リファレンス相は、固定相を作製する方法
と同様の方法より作製されうる。また、リファレンス相
は、被検試料等の吸液によって展開し移動してきた標識
複合体を捕捉するために、吸水性基材上に、標識複合体
に含まれる抗体に特異的に結合しうる物質を０．０５〜
１０μｇ／ｃｍ²塗布することが望ましい。

【００４８】本発明に用いられる吸水性基材には、被検
試料受領部（被検試料を供給するための部分) および標
識複合体受領部（標識複合体組成物を含有する溶液を供
給するための部分) を設けてもよい。標識物質に酵素を
用いる場合は、さらに発色基質溶液受領部（発色基質溶
液を供給するための部分）を設けてもよい。前記標識複
合体組成物を含有する溶液は、例えば、緩衝液等に標識
複合体組成物を溶解させることにより得ることができ
る。また、被検試料等に含まれる液体成分の接触により
前記標識複合体を展開できるように、該標識複合体を脱
離可能に試験片に保持させて、標識複合体相を設けても
よい。

【００４９】また本発明に用いられる試験片において、
展開移動距離は、固定相での発色の均一性および発色感
度の観点から、０．５ｃｍ以上、好ましくは１ｃｍ以上
であり、固定相までの被検試料の到達性、発色感度およ
び測定時間の観点から、８ｃｍ以下、好ましくは６ｃｍ
以下となるように設定されていることが望ましい。

【００５０】本発明の免疫クロマトグラフ法において
は、例えば、前記展開移動距離を得るように、標識複合
体受領部、被検試料受領部、固定相およびリファレンス
相を配置した試験片を用いることができる。

【００５１】展開方法としては、例えば、吸水性基材の
一端側から、標識複合体組成物を含有する溶液および被
検試料等のそれぞれの溶液を加え、毛細管現象によって
自然展開させる方法が挙げられる。また、吸水性基材に
は固定相の下流側の末端に吸水パッドを設けてもよく、
これにより試験片を展開する液体成分を吸収するので展
開が容易に進行する。

【００５２】本発明の被検物質の検出方法について、図
１を代表例として参照して説明する。被検試料受領部２
にピペット等を用いて被検試料を滴下し、標識複合体組
成物を含有する溶液を標識複合体受領部１に滴下する。
被検試料および標識複合体組成物を含有する溶液は、吸
水パッド５の方向に試験片上に展開していき、固定相３
を通過して、リファレンス相４へと移動する。被検試料
中に被検物質が存在する場合、形成された〔被検物質−
標識複合体〕からなる複合体は、固定相３に固定化され
た被検物質に対する抗体と結合して固定相３上に捕捉さ
れる。すなわち、固定相３で標識物質が検出された場
合、被検試料中に被検物質が存在することの指標とな
る。また、標識複合体の展開が正常である場合、固定相
３で捕捉されなかった残りの標識複合体は、リファレン
ス相４に固定化された標識複合体に含まれる抗体に特異
的に結合しうる物質と結合して、リファレンス相４に捕
捉される。すなわち、リファレンス相４で標識物質が検
出された場合、免疫クロマトグラフ法による試験におい
て正常なクロマト展開が行なわれたことの指標となる。

【００５３】

【実施例】調製例１：標識複合体組成物の作製１）着色ラテックス粒子懸濁液の作製スチレンモノマー５０ｇと、アクリル酸０．５ｇと、ト
リエチレングリコールメタクリレート０．２ｇと、蒸留
水４４０ｇとからなる混合液を、窒素ガス雰囲気下で７
５℃に維持し、攪拌しながら、重合開始剤としての過硫
酸カリウム０．２５ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液
を加え、１０時間重合を行い、ポリスチレンラテックス
粒子（平均粒子径：０．２μｍ）を得た。得られたラテ
ックス粒子を緩衝液（０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
８．２）に固形分濃度が１０重量％になるように分散
し、ラテックス粒子分散液を得た。スダンブルー０．２
ｇをトルエン２０ｍl に溶解し、これにドデシル硫酸ナ
トリウム０．２ｇ、および蒸留水１００ｍｌを加え、超
音波分散機でこの混合液を乳化した。この乳化液に上記
ラテックス粒子分散液３０ｍｌを加え、室温で２４時間
攪拌した。得られた液をエバポレータにてトルエンを除
去した後、緩衝液（０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
８．２）にて遠心洗浄を行い、固形分濃度が５重量％に
なるように分散し、着色ラテックス粒子懸濁液を得た。

【００５４】２）抗体の固定化本実施例では、抗体としてヤギ抗E.coliＯ１５７：Ｈ７
ポリクローナル抗体を、前記１）で得られた着色ラテッ
クス粒子に以下のようにして固定した。抗体は、被検物
質である大腸菌Ｏ１５７に対する検出感度が互いに異な
る２種を使用して、抗体結合着色ラテックス粒子を２種
類作製した。

【００５５】高感度抗体結合着色ラテックス粒子前記１）で得られた着色ラテックス粒子懸濁液３ｍｌ
に、水溶性カルボジイミド〔同仁化学研究所製、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．２）〕０．５ｍｌと、ヤギ抗E.coliＯ１５
７：Ｈ７ポリクローナル抗体〔大腸菌Ｏ１５７に対する
免疫クロマト感度：10⁴cells/ml、Kirkegaard＆ Perry
Laboratories Inc. (KPL) 製、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕２ｍｌとを加えて、
１０℃で３時間反応させた。次いで、得られた反応物に
ついて、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．２）を用いて遠心分離洗浄を行い、前記０．０１Ｍ
−ホウ酸緩衝液で固形分濃度５重量％に調製し、高感度
抗体結合着色ラテックス粒子懸濁液を得た。

【００５６】低感度抗体結合着色ラテックス粒子前記１）で得られた着色ラテックス粒子懸濁液３ｍｌ
に、水溶性カルボジイミド〔同仁化学研究所製、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍ１、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．２）〕０．５ｍｌと、ヤギ抗E.coliＯ１５
７：Ｈ７ポリクローナル抗体〔大腸菌Ｏ１５７に対する
免疫クロマト感度：10⁶cells/ml、イムノプローブ製、
１ｍｇ/ ｍ１、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
２）〕２ｍｌとを加えて、１０℃で３時間反応させた。
次いで、得られた反応物について、洗浄液として０．０
１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を用いて遠心分離洗
浄を行い、前記０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液で固形分濃度
５重量％に調製し、低感度抗体結合着色ラテックス粒子
懸濁液を得た。

【００５７】なお、上記抗体の大腸菌Ｏ１５７に対する
検出感度の差は、免疫クロマト法による測定で求めた。
高感度抗体と低感度抗体の大腸菌Ｏ１５７に対する検出
感度の差は、１００倍の差であった。

【００５８】３）標識複合体を含有する溶液前記２）で得られた２種類の抗体結合着色ラテックス粒
子の懸濁液を、下記のように組み合わせて、それぞれ緩
衝液〔０．２ＭＮＨ₄Ｃｌ、０．９重量％ＮａＣｌ、
５重量％塩化コリン、１重量％サッカロース（ｐＨ８．
０）〕で０．０１重量％となるように希釈して、標識複
合体Ａ〜Ｃを含有する溶液を得た。

【００５９】標識複合体Ａ：高感度抗体結合着色ラテッ
クス粒子と低感度抗体結合着色ラテックス粒子を重量比
２：１で混合標識複合体Ｂ：高感度抗体結合着色ラテックス粒子のみ標識複合体Ｃ：低感度抗体結合着色ラテックス粒子のみ

【００６０】調製例２：免疫クロマトグラフ用試験片の
作製図１に示される模式図のニトロセルロースメンブレン
（ワットマン社製、孔径８μｍ、２００μｍ厚、６×４
０ｍｍ）の一端から２０ｍｍの箇所にヤギ抗E.coliＯ１
５７：Ｈ７ポリクローナル抗体〔１ｍｇ／ｍｌ、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕を１．５μＬ、ディス
ペンサーを用いてライン状（幅１ｍｍ）に塗布し、固定
相３を配置したメンブレンを得た。さらに、固定相３の
下流１０ｍｍの箇所にウサギ抗ヤギIgG ポリクローナル
抗体〔ＫＰＬ製、１ｍｇ／ｍ１、０．１Ｍ−リン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）〕を１．５μＬ、ディスペンサーを用
いてライン状（幅１ｍｍ）に塗布し、リファレンス相４
を配置したメンブレンを得た。

【００６１】得られたメンブレンをウシ血清アルブミン
（オリエンタル酵母社製、１重量％）と、ポリオキシエ
チレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工
業社製、０．１重量％) と、サッカロース（和光純薬工
業社製、０．１重量％）とを含む水溶液中に１０分間浸
漬し、４０℃で２時間乾燥させた。次いで、得られたメ
ンブレンの裏側（抗体塗布面の反対側）にポリエステル
フィルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り合
せた。

【００６２】ニトロセルロースメンブレンの上流端から
０〜７ｍｍと９〜１６ｍｍの２箇所にポリエステル不織
布ハイボン4880Ｃ（富士繊維資材工業（株）製、６×７
ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り合せて、それぞれ標識複
合体受領部１および被検試料受領部２を作製した。さら
に、吸水パッド５としてガラス繊維製の吸水材（ｌ０×
１０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）を、ニトロセルロースメンブレ
ンの下流端から５〜１０ｍｍの箇所から下流方向に貼り
合わせて試験片を作製した。得られた試験片を以下の検
出に用いた。

【００６３】試験方法図１の被検試料受領部２に被検試料５０μＬを滴下し、
次いで、標識複合体を含有する溶液１００μＬを標識複
合体受領部１に滴下した。１５分後に、固定相３および
リファレンス相４での発色の有無を観察した。青色の発
色を陽性とした。

【００６４】なお、判定基準は以下の通りである。＋＋：非常に強い発色＋：強い発色 ±：弱い発色 −：発色なし

【００６５】試験例１：大腸菌Ｏ１５７加熱処理菌の検
出被検試料として、大腸菌Ｏ１５７（ATCC strain 35150
）加熱処理菌の１０倍段階希釈系列を生理食塩水にて
調製したものを用いた。標識複合体を含有する溶液は、
調製例１の３）で得られたもののうち、それぞれ標識複
合体Ａ（実施例１）、標識複合体Ｂ（比較例１）または
標識複合体Ｃ（比較例２）を使用した。上記試験方法に
より、固定相３およびリファレンス相４での発色の有無
を観察した。その結果を、表１に示す。

【００６６】

【表１】

【００６７】実施例１では、１０⁴〜１０⁹ cells/ｍＬ
の広範囲で大腸菌Ｏ１５７が検出可能であり、全ての測
定範囲にわたってリファレンス相４の発色が明瞭であっ
た。比較例１では、１０⁴ cells/ ｍＬから大腸菌Ｏ１
５７が検出できた。しかし、１０⁸ cells/ ｍＬでは固
定相３で発色が認められたが、リファレンス相４の発色
が認められず判定不能であった。さらに、１０⁹ cells/
ｍＬでは固定相３、リファレンス相４ともに発色が認め
られず、判定不能であった。比較例２では、１０⁶cell
s/ｍＬになるまで大腸菌の測定はできなかった。このよ
うに、大腸菌Ｏ１５７に対する検出感度が異なる抗体を
有する２種類の標識複合体を使用すると、低濃度〜高濃
度の大腸菌Ｏ１５７検出が可能となる。また、リファレ
ンス相４の発色が全ての測定範囲にわたって明瞭になる
ため、被検試料が高濃度の大腸菌Ｏ１５７であっても、
被検物質である大腸菌Ｏ１５７に対する標識複合体の展
開性が直接的に確認でき、検査が正常に行なわれたとい
う確認ができる。

【００６８】試験例２：大腸菌Ｏ１５７培養液からの大
腸菌Ｏ１５７の検出被検試料として、大腸菌Ｏ１５７（ATCC strain 35150
、700375、700376、700377）をＴＳＢ培地にて培養し
て、得られた培養液を用いた。菌数は、得られた培養液
の希釈系列を作製し、ペトリフィルム（３Ｍ製）にて３
７℃、１８時間培養し、コロニーを計数して求めた。標
識複合体を含有する溶液は、調製例１の３）で得られた
もののうち、標識複合体Ａ（実施例２）または標識複合
体Ｂ（比較例３）を使用した。上記試験方法により、固
定相３およびリファレンス相４での発色の有無を観察し
た。その結果を、表２に示す。

【００６９】

【表２】

【００７０】実施例２では、全てのstrainにおいてリフ
ァレンス相４が強く発色し、検査が正常に行なわれたこ
とが確認された。一方、比較例３では、大腸菌Ｏ１５７
ATCC strain 35150、700376、700377においてリファレ
ンス相４の発色が認められず、検査が正常に行なわれた
という確認ができなかった。したがって、大腸菌Ｏ１５
７に対する検出感度が異なる抗体を有する２種類の標識
複合体を使用することにより、リファレンス相４が強く
発色するようになり、検査が正常に行なわれたという確
認ができるようになることがわかる。

【００７１】試験例３：食品培養液からの大腸菌Ｏ１５
７の検出大腸菌Ｏ１５７（ATCC strain 35150 、700375、70037
6、700377）をＴＳＢ培地で培養した。また、対照とし
て、大腸菌非接種のものを同条件でＴＳＢ培地で培養し
た。得られた培養液を生理食塩水にて希釈し、１０⁷倍
希釈液０．４ｍＬを牛挽肉１０ｇに添加して、ノボビオ
シン（２０ｍｇ／Ｌ）含有ｍＥＣ（日水製薬製）９０ｍ
Ｌを加えた。これをストマッカーでホモジナイズし、４
２℃、２４時間静置培養したものを、被検試料として用
いた。標識複合体を含有する溶液は、調製例１の３）で
得られたもののうち、標識複合体Ａ（実施例３）または
標識複合体Ｂ（比較例４）を使用した。上記試験方法に
より、固定相３およびリファレンス相４での発色の有無
を観察した。その結果を、表３に示す。

【００７２】

【表３】

【００７３】実施例３では、いずれのstrainを接種した
牛挽肉培養液においても固定相３が強く発色し、大腸菌
Ｏ１５７が存在することが示された。さらにリファレン
ス相４も発色し、検査が正常に行なわれたことが確認さ
れた。比較例４では、大腸菌Ｏ１５７ ATCC strain 351
50、700376、700377において、固定相３ではいずれも発
色が認められＯ１５７が検出されたが、リファレンス相
４の発色が認められず、検査が正常に行なわれたという
確認ができなかった。したがって、大腸菌Ｏ１５７に対
する検出感度が異なる抗体を有する２種類の標識複合体
を使用することにより、リファレンス相４の発色が確実
となり、検査が正常に行なわれたという確認ができるた
め、高濃度の大腸菌が存在した場合も不具合なく測定が
可能であることがわかる。

【００７４】

【発明の効果】本発明の免疫クロマトグラフ用標識複合
体組成物を使用することにより、広い範囲の被検物質量
での確実性の高い免疫クロマトグラフ測定を行なうこと
が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の免疫クロマトグラフ用試験片
の１つの態様を示す模式図（平面図）である。

【符号の説明】

１標識複合体受領部２被検試料受領部３固定相４リファレンス相５吸水パッド６吸水性基材

フロントページの続き (72)発明者千田修治大阪府茨木市下穂積１−１−２日東電工株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標識物質と被検物質に対する抗体とを有
する標識複合体を２種以上含む標識複合体組成物であっ
て、各標識複合体における抗体の該被検物質に対する検
出感度が互いに異なることを特徴とする免疫クロマトグ
ラフ用標識複合体組成物。
【請求項２】最大の検出感度と最小の検出感度の差
が、免疫クロマト法による測定で５〜５×１０⁴倍の差
である請求項１記載の標識複合体組成物。
【請求項３】標識物質が、着色粒子または酵素である
請求項１または２記載の標識複合体組成物。
【請求項４】標識複合体が、金属コロイド粒子または
水分散型高分子粒子に標識物質と抗体とを固定させたも
のである請求項１〜３いずれかに記載の標識複合体組成
物。
【請求項５】吸水性基材上に、被検物質に対する抗体
が固定化された固定相を有する試験片を用いて、被検試
料中における被検物質の有無を、下記（ａ）と（ｂ）：（ａ）被検物質、（ｂ）請求項１〜４いずれかに記載の
標識複合体組成物中の標識複合体、との複合体の有無に
より検出することを特徴とする、免疫クロマトグラフ
法。
【請求項６】試験片が、固定相より下流側の吸水性基
材上に、標識複合体に含まれる抗体に特異的に結合しう
る物質が固定化されたリファレンス相を有してなる、請
求項５記載の免疫クロマトグラフ法。
【請求項７】標識複合体組成物を含有する溶液を、試
験片上に滴下して、被検試料に接触させるステップ、を
含む請求項５または６記載の免疫クロマトグラフ法。
【請求項８】試験片が、請求項１〜４いずれかに記載
の２種以上の標識複合体を被検試料との接触により脱離
可能に保持した標識複合体相を有するものである、請求
項５または６記載の免疫クロマトグラフ法。