JP2006029830A

JP2006029830A - 免疫クロマトグラフ用試験片および被検物質の検出方法

Info

Publication number: JP2006029830A
Application number: JP2004205225A
Authority: JP
Inventors: Takeo Matsumura; 健雄松村; Takeshi Saiga; 健雜賀; Koji Maruyama; 幸治丸山
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2004-07-12
Filing date: 2004-07-12
Publication date: 2006-02-02

Abstract

【課題】免疫クロマトグラフ法による検査において、被検試料に含まれる被検物質などの展開を阻害する物質が吸水性基材に沈着することを防ぎ、被検物質を安定に検出する試験片、および該試験片を用いた被検物質の検出方法を提供すること。
【解決手段】吸水性基材に被検試料受領部が配置された免疫クロマトグラフ用試験片において、該被検試料受領部が、被検試料および試薬液の両方が滴下される滴下パッドを備える、免疫クロマトグラフ用試験片、ならびに、該免疫クロマトグラフ用試験片の滴下パッドに被検試料および試薬液を滴下して、免疫クロマトを行うことを特徴とする被検物質の検出方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、免疫クロマトグラフ法に用いる試験片に関する。さらに詳しくは、被検試料に含まれる被検物質などの展開を阻害する物質の影響を抑え、より安定な被検物質の検出を可能とする免疫クロマトグラフ用試験片に関する。

食品に含まれる食中毒原因菌の検査、感染性病原体などの検査、または感染症を始めとする種々の疾患の診断分野において、免疫化学的検査が行なわれている。特に、被検試料を高感度かつ再現性よく測定するために、酵素免疫法（EIA法）、ラジオイムノアッセイ法（RIA法）などの免疫化学的検査が汎用されている。しかしながら、かかる方法は、特別な設備が必要である。さらに、前記測定法は、操作時間または検出時間が長く、洗浄工程も有するため、結果が出るまでに時間がかかるという欠点を有する。

近年、迅速かつ簡便に免疫化学的検査を行うことができる方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されている。当該方法は、例えば以下の工程を経る。被検試料中に被検物質が存在する場合、試験片上に被検物質と結合しうる特異的結合物質を固定化した固定相に、該被検物質に特異的に結合しうる特異的結合物質と標識物質とを含有した標識複合体と該被検物質との複合体が形成する。続いて固定相にて結合した標識物質を検出することにより、被検試料中に被検物質の存在を確認することができる。

現在使用されている免疫クロマトグラフ法としては、１ステップ法および２ステップ法が挙げられる。１ステップ法に用いられる試験片では、試験片の被検試料受領部に標識複合体が塗布乾燥されている。被検試料を被検試料受領部に滴下することにより標識複合体が被検試料によって分散されて、吸水性基材中を展開しながら被検物質と標識複合体とが反応し複合体を形成し、固定相に到達すると、固定相上の被検物質に特異的に結合し得る特異的結合物質と反応して固定相に結合する。２ステップ法では、試験片の被検試料受領部に被検試料が滴下されると、被検物質が吸水性基材中を展開し、固定相に到達し、固定相上の被検物質に特異的に結合し得る特異的結合物質と反応して固定相に結合する。その後、別に標識複合体を分散した溶液を標識複合体受領部に滴下して吸水性基材中を展開し固定相に到達すると固定相に結合した被検物質と該標識複合体が結合する。

免疫学的検査の対象となる被検物質は、食品や糞便などの固形物と共存することがある。例えば、食品中の有害微生物の検査においては、食品検体中に含まれる菌数は直接検出できるほど多くはないので、食品検体中の菌数を検出できるレベルになるまで増菌培養を行う。すなわち、増菌用培地と食品検体を混合し、ストマッカーなどを用いてホモジナイズしたものを静置または振盪培養を行い、得られた培養液を被検試料とするのが一般的である。

従って、被検試料に食品検体由来の種々の固形物や水に不溶性の成分が含まれる場合、これらの固形物が吸水性基材上に非特異的に沈着して被検物質の測定に困難をきたす場合がある。さらに、被検試料に食品検体由来の粘性の高い物質が含まれる場合、この粘性によって吸水性基材上での被検物質の展開が阻害され、被検物質の測定に困難をきたす場合がある。

例えば、食品検体中の大腸菌O157汚染の検査方法としては、食品検体を液体培地中で培養し、得られた培養液を直接免疫クロマトグラフ法または酵素免疫クロマトグラフ法に供する方法などが挙げられる。しかしながら、チーズ、卵などの粘性の高い食品検体の場合には被検試料の粘性が高くなり、吸水性基材上での被検物質の展開が阻害され、あるいは、食肉、糞便などの夾雑物を多く含む検体の場合には被検試料中に固形物や水に不溶性の成分が含まれ、吸水性基材上に沈着して、被検物質の測定に支障を与える可能性がある。

上記のような展開阻害を解決する方法としては、あらかじめ被検試料を滅菌水などにより希釈する方法などが挙げられる。しかし、このような方法では、別に希釈するための器具や希釈媒の調製が必要となり、被検試料の調製に手間と時間を要することになり免疫クロマトグラフ法のメリットである簡易性が損なわれる。また、被検試料に病原性を有する細菌が含まれている危険性もあり、被検試料の希釈操作や希釈に使用した器具の取り扱い時に病原性細菌に対する感染リスクが高まる。さらに、被検物質の検出感度が希釈率に応じて変化し、希釈しすぎた場合には被検物質の検出率が低下するなどの問題がある。

従って、本発明の目的は、免疫クロマトグラフ法による検査において、被検試料に含まれる被検物質などの展開を阻害する物質が吸水性基材に沈着することを防ぎ、被検物質を安定に検出する試験片、および該試験片を用いた被検物質の検出方法を提供することにある。

すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕吸水性基材に被検試料受領部が配置された免疫クロマトグラフ用試験片において、該被検試料受領部が、被検試料および試薬液の両方が滴下される滴下パッドを備える、免疫クロマトグラフ用試験片、
〔２〕前記〔１〕記載の免疫クロマトグラフ用試験片の滴下パッドに被検試料および試薬液を滴下して、免疫クロマトを行うことを特徴とする被検物質の検出方法、ならびに
〔３〕前記〔１〕記載の免疫クロマトグラフ用試験片の滴下パッドに被検試料10〜250μlを滴下し、次いで試薬液20〜500μlを滴下して、免疫クロマトを行うことを特徴とする請求項２記載の被検物質の検出方法
に関する。

本発明の試験片を用いることにより、免疫クロマトグラフ法による検査において、被検試料に含まれる被検物質などの展開を阻害する物質が吸水性基材に沈着することを防ぎ、被検物質を安定に検出することが可能となる。

本発明の免疫クロマトグラフ用試験片は、被検試料および試薬液の両方が滴下される滴下パッドを備える被検試料受領部が吸水性基材に配置されていることを１つの大きな特徴とする。かかる特徴を有することにより、被検物質などの展開を阻害する物質が被検試料に含まれる場合、滴下パッドにより該展開を阻害する物質が吸水性基材に沈着することを防ぐことができ、さらに同一の滴下パッドに被検試料と試薬液が滴下されるため、被検試料の粘度を低下させることができ、被検物質などの展開性を良好に保つことができる。また、同一の滴下パッドに被検試料と試薬液が滴下されるため、滴下パッド中に被検物質が停滞することなく、吸収性基材に展開され、被検物質の検出率の低下を防ぐことができる。したがって本発明の試験片を用いて免疫クロマトグラフ法を行うことにより、被検物質などの展開を阻害する物質が被検試料に含まれる場合であっても、または被検試料の粘度が高い場合であっても、固定相における〔被検物質−標識複合体〕からなる複合体の有無を好適な状態で検出することができる。

本明細書において、「被検物質などの展開を阻害する物質」とは、例えば、食品、糞便、環境ふきとり物に由来する塵埃、土砂、植物断片、細胞断片などの固形物、脂質などの水に不溶性の成分、Ｏ/Ｗエマルション、多糖類、糖蛋白質、蛋白質、水溶性ポリマーなどをいう。

本明細書において、「被検試料受領部」とは、本発明の免疫クロマトグラフ用試験片を用いて免疫クロマトグラフを行う際に、被検物質を含むと疑われる被検試料および試薬液を滴下する部分をいう。

被検試料および試薬液の両方が滴下される滴下パッドの材料としては、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン、セルロース、パルプなどからなる吸水性の不織布などが挙げられる。滴下パッドの大きさとしては、6mm×40mm程度の吸水性基材に対して、縦が4〜10mm、横が6〜20mm程度で、厚みは0.1〜5mm程度が好ましい。また、滴下パッドの密度（目付け）は、10g/m²〜500g/m²が好ましい。

滴下パッドは、被検試料および試薬液の両方が滴下される観点から、少なくとも被検試料を滴下した際に該被検試料が滴下パッドから溢れない程度の容量を有していることが好ましい。従って、被検試料および試薬液の滴下量に応じて滴下パッドを選定するのが好ましい。滴下パッドの容量は、具体的には、滴下する被検試料の容量の1〜10倍程度、かつ、滴下する被検試料と滴下する試薬液を合わせた容量の0.3〜3倍程度の容量が好ましい。例えば、被検試料50μl、試薬液100μlを滴下する時の滴下パッドの容量は200μl前後が好ましい。

本発明において、吸水性基材は、被検試料および試薬液を吸収できる基材であり、被検試料中の被検物質と後述するような標識複合体の第２の特異的結合物質または固定相の第１の特異的結合物質との十分な反応を行うための時間を確保できるような吸水性基材が用いられる。吸収性基材の材料としては、適度な吸水速度を有する観点から、好ましくは、不織布、濾紙、ガラス繊維紙、ガラスフィルター、ニトロセルロース、矩多孔質材料などが挙げられる。

吸水性基材の吸水性の程度は、5mm幅の短冊状に裁断した吸水性基材の片端部を水に浸漬し、1分間経過後の吸水距離が0.5〜5cm程度が好ましい。

吸水性基材の形状は、被検試料を展開できる形状であれば特に限定されるものではなく、例えば、矩形のシート状（片状）、ロッド状などが好ましい。

被検試料を滴下するための滴下パッドと吸水性基材との配置は、特に限定されるものではなく、吸水性基材と滴下パッドの重なりが上下どちらでもかまわない。また、配置の仕方としては、特に限定されるものではないが、滴下パッドの一部が吸水性基材に接触するように配置するのが好ましい。滴下パッドの吸水性基材への配置方法は、試薬液および被検物質の透過性を妨げないのであれば、滴下パッドの全面または一部に接着剤などを塗布してもよいし、吸水性基材と共に滴下パッドを収納したケースなどを用いて滴下パッドのズレを防止してもよい。

本発明において、被検試料中に被検物質が存在する場合、被検物質に特異的に結合しうる第２の特異的結合物質と標識物質とを担体に固定化した標識複合体と該被検物質とからなる複合体を捕捉できるような、被検物質と結合しうる第１の特異的結合物質を固定化した固定相を、試験片上の被検試料受領部と離れたところに有することが好ましい。

本明細書において、「特異的結合物質」とは、標識複合体に用いられる特異的結合物質（本明細書において、第２の特異的結合物質という場合がある）、および展開した被検物質を試験片上で捕捉するための固定相に用いられる特異的結合物質（本明細書において、第１の特異的結合物質という場合がある）のいずれも意味する。したがって、単に「特異的結合物質」と記載する場合、第１または第２のいずれか、あるいは第１および第２の特異的結合物質を総称することを意図する。

前記特異的結合物質としては、例えば、抗体が挙げられる。この場合、第１の特異的結合物質と、第２の特異的結合物質には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を使用することができ、一方の特異的結合物質がモノクローナル抗体である場合には、もう一方の特異的結合物質は、当該モノクローナル抗体とは異なる抗原決定基を認識するものが好ましい。

前記標識物質としては、免疫測定分野で用いられる公知の物質、例えば、着色粒子、酵素、蛍光物質などが挙げられる。なかでも目視判定が可能であり、測定装置を必要としないという観点から、着色粒子および酵素がより好ましい。

着色粒子としては、肉眼で色が検出可能なものであれば特に限定されないが、例えば、スダンブルー、スダンレッドIV、スダンIII、オイルオレンジ、キニザリングリーンなどに代表される染料、顔料などで着色した着色水分散型高分子粒子などが挙げられる。目視確認性の点からは、青色、赤色、緑色またはオレンジ色に着色した着色水分散型高分子粒子が好ましい。中でも、分散安定性や被検物質の検出感度を調整し易い点から青色または赤色などに着色した着色ラテックス粒子が望ましい。前記着色粒子の平均粒子径は、発色の良好性の観点から、約0.01μm以上、好ましくは0.05μm以上であり、着色粒子の僅かな凝集に起因する吸水性基材の目詰まりを防ぐ観点から、約3μm以下、好ましくは、約0.5μm以下であることが望ましい。具体的には、約0.01〜3μm、好ましくは、約0.05〜0.5μmの範囲であることが望ましい。

酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、β-D-グルクロニダーゼなどが挙げられる。より高感度で安定な検出を達成することが可能なペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼが好ましい。

また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどが挙げられる。

担体としては、その表面上に、前記特異的結合物質および前記標識物質を固定することができる担体であれば特に限定されず、金属コロイド粒子、水分散型高分子粒子、シリコーン、ガラスケイソウ土粒子などが挙げられる。なかでも、金属コロイド粒子および水分散型高分子粒子が好ましい。

金属コロイド粒子としては、金コロイド粒子、セレニウムコロイド粒子などが挙げられる。

水分散型高分子粒子としては、粒径コントロール、分散安定性および結合容易性の観点から、ラテックス粒子が好ましい。前記水分散型高分子粒子は、例えば、不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体の乳化重合によって調製される。かかる単量体としては、例えば、エチレン、プロピレンなどのオレフィン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビニルなどのビニル系単量体、スチレン、メチルスチレン、クロロスチレンなどのスチレン系単量体、メタクリル酸メチルなどのメタクリル酸エステル系単量体、ブタジエンなどのジエン系単量体などが挙げられる。

さらに、前記水分散型高分子粒子は、単量体の単独重合体または共重合体に改質用単量体を共重合して得られた重合体でもよい。改質用単量体としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、2,2,2-トリフルオロエチルメチルメタクリレートなどのフッ素化メタクリル酸エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、スルホプロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、N-ビニル-2-ピロリドン、2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジルメタクリレートなどが挙げられる。

さらにまた、水分散性高分子粒子は、市販されている種々の水分散性高分子粒子でもよい。市販されている水分散性高分子粒子としては、例えば、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリロニトリル−ブタジエン共重合体などの種々のスチレン共重合体からなるエマルジョンなどのスチレン含有物またはその誘導体を単量体成分とする単独重合体や共重合体のエマルジョン；（メタ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその誘導体を単量体成分とする単独重合体、該単量体成分と（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、グリシジル（メタ）アクリレートなどとの共重合体；前記したスチレンまたはその誘導体と（メタ）アクリレートエステルまたはその誘導体との共重合体；ゴム、ナイロン、ポリウレタン、微結晶質セルロースなどが挙げられる。

なお、水分散型高分子粒子の調製に使用される個々の単量体の種類は、標識複合体の使用時および保存時の融着および凝集を防止する観点から、得られる水分散型高分子粒子のガラス転移点が好ましくは10℃以上、より好ましくは室温以上であるように選択される。

また、水分散型高分子粒子を調製する際に使用される重合開始剤としては、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；これらの過硫酸塩と、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウムなどのチオ硫酸塩または亜硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウムなどの亜硫酸塩とのレドックス系重合開始剤などの公知の重合開始剤が挙げられる。

前記水分散型高分子粒子を調製する際に、粒子の膨潤および溶解を防ぐために、架橋剤を添加することが好ましい。架橋剤としては、内部架橋剤が挙げられ、例えば、トリエチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、1,3-ブチレングリコールジ（メタ）アクリレートなどの脂肪族多価アルコールのポリ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン、N,N'-メチレンビスアクリルアミドなどが挙げられる。上記架橋剤の添加時期は、水分散型高分子粒子を調製するための原料と共に添加することが好ましい。

前記水分散型高分子粒子のうち、粒子の安定性の点から、スチレン系単量体を主成分とする重合体が好ましく、また、抗体および標識物質を固定するために、アクリル酸やメタクリル酸などのカルボキシル基を有する単量体を共重合した高分子粒子が望ましい。

さらに、前記担体として、該担体表面への抗体および標識物質の固定、スペーサーの導入または水分散状態での安定性の向上の観点から、官能基を有している担体を使用してもよい。官能基としては、例えばカルボキシル基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、ホルミル基、カルバモイル基、イソチオシアナート基、アジドカルボニル基、ヒドラジド基、酸無水物基などを挙げることができ、カルボキシル基が好ましい。これらの官能基を有する担体の調製は、単量体成分として、例えば、アクリル酸、メタクリル酸などのカルボキシル基を有する単量体、例えば、ヒドロキシエチルアクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレートなどの水酸基を有する単量体、例えば、グリシジルメタクリレートなどのグリシジル基を有する単量体などを共重合させること、あるいは任意に他の共重合性単量体（例えば、アミノスチレンなど）と乳化共重合させることによって行うことができ、それぞれカルボキシル基、水酸基およびグリシジル基を有する担体を得ることができる。また、単量体成分を重合させた後、得られた担体に官能基を導入することもできる。具体的には、アクリル酸エステルを単量体成分として重合した粒子を加水分解することによって担体にカルボキシル基を導入したり、アミド基を有する単量体を共重合させた後、ホフマン分解により担体にアミノ基を導入したり、メチルエステル基を有する単量体を共重合させた後、ヒドラジンと反応させてヒドラジド基を担体に導入することができる。

担体の粒子径は、分散性、ならびに酵素、特異的結合物質などの固定化量の調整を良好にする観点から、好ましくは3μm以下、さらに好ましくは2μm以下であり、得られた標識複合体の精製の容易性の観点から、好ましくは0.01μm以上、さらに好ましくは0.1μm以上であることが望ましい。

担体に特異的結合物質および標識物質を固定させる方法としては、疎水結合法（物理的吸着法）、イオン結合法、共有結合法などが挙げられる。中でも、得られた標識複合体が特異的結合物質および酵素の離脱がなく安定である観点から、共有結合法が好ましい。さらに、共有結合法により担体に特異的結合物質および標識物質を結合させる際に、特異的結合物質の担体上での自由度を高めるために、スペーサー基を介在させることもできる。

スペーサー基としては、少なくとも二官能性の有機化合物が挙げられ、中でも、炭素数1〜12の炭素鎖基を有する二官能性の有機化合物が好ましい。このような化合物としては、特に限定されないが、例えば、へキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、キシリレンジアミンなどのジアミン類、グリシン、β−アミノプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、ε−アミノカプリル酸などのアミノアルキルカルボン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニン、アルギニン、グリシルグリシンなどのアミノ酸類などが挙げられる。

スペーサー基を使用して担体に特異的結合物質および標識物質を固定させる場合、予め担体に結合させた後、特異的結合物質および標識物質と結合させてもよく、予め特異的結合物質および標識物質に結合させた後、これを担体に結合させてもよい。更に、必要に応じて、担体、特異的結合物質および標識物質の全てに予めスペーサー基を結合させ、これらを相互に結合させることもできる。

担体に直接またはスペーサー基を介して特異的結合物質および標識物質を共有結合にて結合させるための方法としては、特に限定されず、慣用の方法が挙げられる。かかる方法としては、例えば、結合試薬として水溶性カルボジイミドを用いる方法が挙げられる。具体的には、例えば、アミノアルキルカルボン酸をスペーサー基として用いる場合、水溶性カルボジイミドを用いて、特異的結合物質および標識物質を共有結合にて担体に結合させることができる。

前記水溶性カルボジイミドとしては、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミド-メト-p-トルエンスルホネートなどが挙げられる。このような水溶性カルボジイミドを用いて、スペーサー基を介するまたは直接的な共有結合による、特異的結合物質および標識物質の担体への結合は、慣用の方法および条件により行なわれ得る。なお、本発明において、特異的結合物質および標識物質の担体への結合は、両者の結合を同時に行なってもよく、別々に行なってもよい。

得られた標識複合体中に含まれる特異的結合物質および標識物質の総固定量は、担体の乾燥重量1gあたり好ましくは5〜200mgであり、その量は上記の範囲内で、使用する特異的結合物質および標識物質の種類などによって適宜変更し得る。例えば、担体が水分散型高分子粒子の場合、当該粒子の表面積に鑑みると、前記総固定量は、水分散型高分子粒子の乾燥重量1gあたり好ましくは200mg以下であり、さらに好ましくは150mg以下であり、被検物質の検出の迅速性、感度および再現性の観点から好ましくは5mg以上であり、さらに好ましくは10mg以上であることが望ましい。

ここで、担体の「乾燥重量」とは、一定量の担体を120℃で2時間乾燥した後の重量をいう。

固定相は、公知の物理吸着法、共有結合法などにより作製されうる。また、固定相に使用する第１の特異的結合物質と親水性重合体とを含む溶液を吸水性基材に塗布した後、該親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬することで固定相を作製することもできる。親水性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロースなどが挙げられる。凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、メタノール、エーテルなどが挙げられる。第１の特異的結合物質と親水性重合体とを含む溶液を吸収性基材に塗布する場合、被検試料の吸液によって展開し移動してきた〔被検物質−標識複合体〕からなる複合体を効率よく捕捉する観点から、吸水性基材上の第１の特異的結合物質が0.001〜0.2mg/cm²となるように塗布することが望ましい。

固定相が作製された後の吸水性基材は、被検対象でないタンパク質の基材への非特異的吸着の防止、展開の容易性、固定した第１の特異的結合物質の保存安定性の観点から、ブロッキング剤、界面活性剤および糖を含有する溶液（処理液という）で処理されることが好ましい。ここで、使用されるブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルクなどが挙げられる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどが挙げられる。前記処理液中のブロッキング剤の含有量は、好ましくは0.1〜10重量％である。前記処理液中の界面活性剤の含有量は、好ましくは0.01〜5重量％である。前記処理液中の糖の含有量は0.1〜10重量％である。

本発明において、固定相より下流側の吸水性基材上に、標識複合体に含まれる第２の特異的結合物質に特異的に結合しうる物質が固定化されたリファレンス相をさらに有することが好ましい。リファレンス相では、展開してきた標識複合体そのものを捕捉することができる。リファレンス相を設けることにより、免疫クロマトグラフ法による試験の成否を直接的に判定することが可能となる。

なお、本明細書において、「下流」とは、被検試料受領部からみて固定相側を意味する。

リファレンス相に用いられる標識複合体に含まれる第２の特異的結合物質に特異的に結合しうる物質としては、例えば、該第２の特異的結合物質に対する抗体（抗IgG抗体、抗Fc抗体など）、抗体結合性のあるプロテインＡおよびプロテインＧなどが挙げられる。ここで捕捉される標識複合体には検出感度の高い標識複合体と低い標識複合体とがあり、両複合体に用いられる抗体が例えば同一動物由来のIgGである場合、その動物のIgGに対する抗IgG抗体を単独で前記物質として用いることができる。また異種動物である場合、それぞれの動物由来の抗体に対する抗IgG抗体を混合して前記物質として用いることができる。このようにすれば、いずれの標識複合体も捕捉できる。

リファレンス相は、固定相を作製する方法と同様の方法より作製されうる。また、リファレンス相は、被検試料などの吸液によって展開し移動してきた標識複合体を効率よく捕捉する観点から、吸水性基材上の前記物質が0.001〜0.2mg/cm²となるように塗布されていることが望ましい。

本発明において、前記標識複合体は、後述する試薬液に含まれていてもよいし、被検物質と被検試料および試薬液に含まれる液体成分の接触により展開できるように、試験片上に標識複合体相として脱離可能に保持されていてもよい。

本発明の試験片において、展開移動距離は、固定相での発色の均一性および発色感度の観点から、0.5cm以上、好ましくは1cm以上であり、固定相までの被検試料の到達性、発色感度および測定時間の観点から、8cm以下、好ましくは6cm以下となるように設定されていることが望ましい。

本発明においては、例えば、前記展開移動距離を得るように、被検試料受領部、固定相およびリファレンス相を配置した試験片を用いることができる。

本発明において、試験片を展開する液体成分を吸収させて展開を容易に進行させる観点から、固定相の下流側の吸収性基材の末端に吸水パッドをさらに有していてもよい。吸水パッドの材質としては、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン、セルロース、パルプなどからなる吸水性不織布、濾紙、ガラス繊維紙などが挙げられる。吸水パッドの大きさとしては、6mm×40mm程度の吸水性基材に対して、縦が4〜15mm、横が6〜20mm程度で、厚みは0.1〜5mm程度が好ましい。

本発明に使用される被検試料としては、被検物質を含有する疑いがある試料が挙げられる。具体的には、血液成分、尿、唾液、汗、便などの生体由来成分、食品、培養液などが挙げられる。また、前記被検試料は液体試料であってもよく、固体試料であってもよい。固体試料の場合、該固体試料を、例えば、緩衝液、生理的食塩水などの溶媒に、溶解または希釈して得られた溶液として用いてもよい。

被検物質としては、通常の免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反応）により検出可能な物質であれば特に限定されないが、細菌およびその構成成分、細菌が産生する毒素などが挙げられる。細菌としては、例えば、サルモネラ菌、大腸菌O157、黄色ブドウ球菌、カンピロバクター菌、リステリア菌、ウェルシュ菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、クラミジア・トラコマティス菌などが挙げられる。細菌が産生する毒素としては、例えば、ベロトキシン、ストレプトリシンOなどが挙げられる。

試薬液としては、前記標識複合体を含む緩衝液が好ましい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液などのpH5〜10付近の緩衝液が挙げられる。さらに、試薬液には、抗菌剤、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、サッカロース、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどを単独であるいは複数を組み合わせて適宜添加してもよい。試薬液における標識複合体の濃度は、好ましくは0.001重量％以上であり、より好ましくは0.005重量％以上であることが望ましく、特異的結合を得る観点から、好ましくは0.1重量％以下であり、より好ましくは0.05重量％以下であることが望ましい。

滴下パッドへの前記被検試料と前記試薬液の滴下は、被検試料の粘度を低下させることができ、また、被検物質の検出率の低下を防ぐことができる観点から、被検試料次いで試薬液の順序であれば、特に限定されず、試薬液、被検試料次いで試薬液の順序でもよい。被検試料の滴下と試薬液の滴下の間隔は、滴下後の被検試料が乾燥しない時間であれば特に限定されないが、好ましくは1〜300秒、より好ましくは3〜60秒である。また、滴下パッドへの被検試料および試薬液の滴下量は、滴下される滴下パッドの容量によって異なるので一概にはいえないが、被検試料の滴下量は、滴下精度、操作性および検出感度の観点から、10〜250μlが好ましく、20〜100μlがより好ましく、40〜60μlがさらに好ましく、試薬液の滴下量は、滴下精度、操作性および検出感度の観点から、20〜500μlが好ましく、50〜200μlがより好ましく、80〜120μlがさらに好ましい。さらに、滴下容量の比率（被検試料／試薬液）は、1:0.5〜1:20が好ましい。

本発明の試験片を用いた免疫クロマトグラフによる被検物質の検出方法について、図１を代表例として参照して説明する。

まず、ピペットなどを用いて被検試料受領部の滴下パッド５に被検試料を好ましくは10〜250μl、より好ましくは20〜100μl滴下し、次いで標識複合体を含む試薬液を好ましくは20〜500μl、より好ましくは50〜200μl滴下する。これらの溶液は、吸水パッド１の方向に試験片上に展開していき、固定相３を通過して、リファレンス相４へと移動する。この時、被検試料と共存する被検物質などの展開を阻害する物質は、被検試料受領部の滴下パッド５上にトラップされる。被検試料中に被検物質が存在する場合、形成された〔被検物質−標識複合体〕からなる複合体は、固定相３に固定化された第１の特異的結合物質と結合して固定相３上に捕捉される。すなわち、固定相３で標識物質が検出された場合、被検試料中に被検物質が存在することの指標となる。また、標識複合体の展開が正常である場合、固定相３で捕捉されなかった残りの標識複合体は、リファレンス相４に固定化された標識複合体に含まれる第２の特異的結合物質に特異的に結合しうる物質と結合して、リファレンス相４に捕捉される。すなわち、リファレンス相４で標識物質が検出された場合、免疫クロマトグラフ法による試験において正常なクロマト展開が行なわれたことの指標となる。

以下、本発明の実施例および比較例を挙げ、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

調製例１：標識複合体の作製
１）着色ラテックス粒子懸濁液の作製
スチレンモノマー50g、アクリル酸0.5g、トリエチレングリコールジメタクリレート0.2gおよび蒸留水440gからなる混合液を窒素ガス雰囲気下で75℃に維持し、攪拌しながら、重合開始剤としての過硫酸カリウム0.25gを蒸留水10gに溶解した水溶液を加え、10時間重合を行った。その結果、カルボキシル化された水分散型高分子粒子としてカルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子（平均粒子径：0.2μm）を得た。得られたカルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子を、0.01Mホウ酸緩衝液（pH8.2）に固形分濃度が10重量％になるように分散し、ラテックス粒子の分散液を得た。

スダンブルー0.2gをトルエン20mlに溶解し、これにドデシル硫酸ナトリウム0.2g、および蒸留水100mlを加え、超音波分散機でこの混合液を乳化した。この乳化液に上記ラテックス粒子の分散液30mlを加え、室温で24時間攪拌した。得られた液をエバポレータにてトルエンを除去した後、0.01Mホウ酸緩衝液（pH8.2）を用いて遠心分離洗浄を行い、固形分濃度が5重量％になるように分散し、着色ラテックス粒子懸濁液を得た。

２）抗体の固定
本実施例では、特異的結合物質としてヤギ抗大腸菌 O157：H7ポリクローナル抗体を、前記１）で作製した着色ラテックス粒子に以下のようにして固定した。

前記１）で得られた着色ラテックス粒子懸濁液3mLに、水溶性カルボジイミド〔同仁化学研究所社製、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩10mg/mL、0.01Mホウ酸緩衝液（pH8.2）〕0.5mLと、ヤギ抗大腸菌 O157：H7ポリクローナル抗体〔イムノプローブ社製、1mg/mL、0.01Mホウ酸緩衝液（pH8.2）〕2mLとを加えて、10℃で3時間反応させた。次いで、得られた反応物について、洗浄液として0.01Mホウ酸緩衝液（pH8.2）を用いて遠心分離洗浄を行い、前記0.01Mホウ酸緩衝液で固形分濃度5重量％に調整し、抗体固定化着色ラテックス粒子の懸濁液を作製した。

３）標識複合体を含有する試薬液の作製
前記２）で得られた抗体固定化着色ラテックス粒子の懸濁液を、緩衝液〔0.02Mリン酸緩衝液（pH7.4）に0.88重量％NaCl、0.1重量％アジ化ナトリウム、1重量％サッカロースおよび1％重量ウシ血清アルブミンを含有したもの〕で0.01重量％となるように希釈して、標識複合体を含有する試薬液を作製した。

実施例１：免疫クロマトグラフ用試験片の作製
図１に示されるような免疫クロマトグラフ用試験片を以下のように作製した。ニトロセルロースメンブレン（ワットマン社製、孔径8μm、200μm厚、6mm×40mm）の一端から22mmの箇所に、ヤギ抗大腸菌O157：H7ポリクローナル抗体〔1mg/mL、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）〕1.5μLを、ディスペンサーを用いてライン状（幅1mm）に塗布し、固定相３を形成した。さらに、固定相３の下流6mmの箇所にウサギ抗ヤギIgGポリクローナル抗体〔KPL社製、0.5mg/ml、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）〕1μLを、ディスペンサーを用いてライン状（幅1mm）に塗布し、リファレンス相４を配置したメンブレンを得た。

得られたメンブレンを、ウシ血清アルブミン（オリエンタル酵母社製、1重量％）、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製、0.1重量％）およびサッカロース（和光純薬工業社製、１重量％）を含む水溶液に10分間浸漬した。浸漬後のメンブレンを、40℃で2時間乾燥させた。次いで、得られたメンブレンの裏側（抗体塗布面の反対側）にポリエステルフィルム（100μm厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせた。

得られたメンブレンの上流端から3mmの部分が被さるように目付け100g/m²のポリエステル製不織布FC-1006（日本バイリーン社製、7×15mm、厚さ2mm）を貼り合せて、被検試料受領部の滴下パッド５を作製した。さらに、得られたメンブレンの下流端から5mmの部分が被さるように吸水パッド１としてガラス繊維製の吸水材（ワットマン社製、l5×20mm、厚さ5mm）を貼り合わせて、免疫クロマトグラフ用試験片を作製した。

比較例１：免疫クロマトグラフ用試験片の作製
図３に示されるような免疫クロマトグラフ用試験片を以下のように作製した。実施例１で作製したメンブレンの上流端から6〜12mmの部分が被さるように目付け100g/m²のポリエステル製不織布FC-1006（日本バイリーン社製、6×6mm、厚さ2mm）を貼り合せて、被検試料用滴下パッド６を作製した。また、ニトロセルロースメンブレンの上流端から3mmの部分が被さるように目付け100g/m²のポリエステル製不織布FC-1006（日本バイリーン社製、7×7mm、厚さ2mm）を貼り合せて、試薬液用滴下パッド７を作製した。さらに、得られたメンブレンの下流端から5mmの部分が被さるように吸水パッド１としてガラス繊維製の吸水材（ワットマン社製、l5×20mm、厚さ5mm）を貼り合わせて、免疫クロマトグラフ用試験片を作製した。

試験例１：食品検体を用いた被検試料の展開性および大腸菌O157加熱処理菌の検出
検体として、牛タン、豚ロースおよびクリームチーズを用い、ノボビオシン加mEC培地〔関東化学社製の粉末培地をもとに調製〕225mlに、検体をそれぞれ25g加え、ストマッカーで１分間ホモジナイズした後、42℃で18時間静置培養したものを被検試料として試験を行った。なお、ノボビオシン加mEC培地は、大腸菌O157分離用の選択培地に添加して培養を行うことにより、大腸菌O157を含まないことを確認している。

また、大腸菌O157（ATCC 35150）を加熱処理した菌の10倍段階希釈系列を生理食塩水にて調製し、上記被検試料に加えたものも被検試料として試験を行った。

上記で調製した被検試料および調製例３）で調製した試薬液を表１に示すような滴下量で、実施例１で作製した免疫クロマトグラフ用試験片または比較例１で作製した免疫クロマトグラフ用試験片に滴下して試験を行い、その結果を表１に示す。

なお、試験方法および判定基準は以下のとおりである。
（試験方法）
実施例１で作製した免疫クロマトグラフ用試験片を使用する場合、滴下パッドに被検試料を滴下し、5秒後に、標識複合体を含有する試薬液を同じ滴下パッドに滴下した。一方、比較例１で作製した免疫クロマトグラフ用試験片を使用する場合、被検試料用滴下パッドに被検試料を滴下し、5秒後に、標識複合体を含有する試薬液を試薬用滴下パッドに滴下した。該試薬液の滴下終了15分後に、固定相およびリファレンス相での発色度を観察した。青色の発色を陽性とした。
（判定基準）
発色度
＋：固定相またはリファレンス相に濃い青色の発色が見られる
±：固定相またはリファレンス相に青色の発色が見られる
−：固定相またはリファレンス相に発色が見られない

実施例１で作製した免疫クロマトグラフ用試験片を使用した場合では、全ての食品検体にわたってリファレンス相の発色が明瞭であり、正常に検査できたことを確認した。大腸菌O157を含む被検試料では、全ての食品検体にわたって固定相の発色が明瞭であり、正常に被検物質を検出可能であった。

比較例１で作製した免疫クロマトグラフ用試験片を使用した場合では、固定相の発色が認めらない検体があり、正常に被検物質を検出できなかった。

本発明の免疫クロマトグラフ用試験片は、食品に含まれる食中毒原因菌の検査、感染性病原体などの検査、または感染症を始めとする種々の疾患の診断分野に利用することができる。

図１は、本発明の免疫クロマトグラフ用試験片の１つの態様を示す模式図（平面図）である。図２は、本発明の免疫クロマトグラフ用試験片の１つの態様を示す模式図（断面図）である。図３は、比較例１で作製した免疫クロマトグラフ用試験片を示す模式図（平面図）である。図４は、比較例１で作製した免疫クロマトグラフ用試験片を示す模式図（断面図）である。

符号の説明

１吸水パッド
２吸水性基材
３固定相
４リファレンス相
５滴下パッド
６被検試料用滴下パッド
７試薬液用滴下パッド

Claims

吸水性基材に被検試料受領部が配置された免疫クロマトグラフ用試験片において、該被検試料受領部が、被検試料および試薬液の両方が滴下される滴下パッドを備える、免疫クロマトグラフ用試験片。
請求項１記載の免疫クロマトグラフ用試験片の滴下パッドに被検試料および試薬液を滴下して、免疫クロマトを行うことを特徴とする被検物質の検出方法。
請求項１記載の免疫クロマトグラフ用試験片の滴下パッドに被検試料10〜250μlを滴下し、次いで試薬液20〜500μlを滴下して、免疫クロマトを行うことを特徴とする請求項２記載の被検物質の検出方法。