JP2002372537A - 免疫クロマトグラフ用試験片および被検物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】免疫クロマトグラフ法による検査において、被
検試料に含まれる被検物質等の展開を阻害する物質が吸
水性基材に沈着することを防ぎ、被検物質を安定に検出
する試験片、および該試験片を用いた被検物質の検出方
法を提供すること。 【解決手段】吸水性基材上に被検試料受領部が配置され
た免疫クロマトグラフ用試験片において、被検試料を滴
下するための滴下パッドとフィルターとが積層されて吸
水性基材上に配設されてなる免疫クロマトグラフ用試験
片、ならびに該免疫クロマトグラフ用試験片を用いて免
疫クロマトを行うことを特徴とする被検物質の検出方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫クロマトグラ
フ法に用いる試験片に関する。さらに詳しくは、被検試
料に含まれる被検物質等の展開を阻害する物質の影響を
抑え、より安定な被検物質の検出を可能とする免疫クロ
マトグラフ用試験片に関する。

【０００２】

【従来の技術】食品に含まれる食中毒原因菌の検査、感
染性病原体等の検査、または感染症を始めとする種々の
疾患の診断分野において、免疫化学的検査が行なわれて
いる。特に、被検試料を高感度かつ再現性よく測定する
ために、酵素免疫法（ＥＩＡ法) 、ラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）法等の免疫化学的検査が汎用されている。
しかしながら、かかる方法は、特別な設備が必要であ
る。さらに、前記測定法は、操作時間または検出時間が
長く、洗浄工程も有するため、結果が出るまでに時間が
かかるという欠点を有する。

【０００３】近年、迅速かつ簡便に免疫化学的検査を行
なうことができる方法として、免疫クロマトグラフ法が
注目されている。当該方法は、例えば以下の工程を経
る。被検試料中に被検物質が存在する場合、試験片上に
被検物質と結合しうる特異的結合物質を固定化した固定
相に、該被検物質に特異的に結合しうる特異的結合物質
と標識物質とを含有した標識複合体と該被検物質との複
合体が形成する。続いて固定相にて結合した標識物質を
検出することにより、被検試料中に被検物質の存在を確
認することができる。

【０００４】免疫学的検査の対象となる被検物質は、食
品や糞便等の固形物と共存することがある。被検試料が
種々の固形物や水に不溶性の成分を含む場合、これらの
固形物が吸水性基材上に非特異的に沈着して被検試料の
測定に困難をきたす場合がある。例えば、養鶏場等にお
けるサルモネラ汚染の環境検査においては、採取した鶏
糞を液体培地中で培養し、得られた培養液を直接免疫ク
ロマトグラフ法および酵素免疫クロマトグラフ法に供す
る方法が挙げられる。しかしながら、この方法は、鶏糞
由来の固形物が吸水性基材上に沈着して測定に支障を与
える可能性がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、免疫
クロマトグラフ法による検査において、被検試料に含ま
れる被検物質等の展開を阻害する物質が吸水性基材に沈
着することを防ぎ、被検物質を安定に検出する試験片、
および該試験片を用いた被検物質の検出方法を提供する
ことにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、吸水性
基材上に被検試料受領部が配置された免疫クロマトグラ
フ用試験片において、被検試料を滴下するための滴下パ
ッドとフィルターとが積層されて吸水性基材上に配設さ
れてなる免疫クロマトグラフ用試験片、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の試験片は、被検試料を滴
下するための滴下パッドとフィルターとが積層されて吸
水性基材上に配設されてなることに１つの特徴を有す
る。被検物質等の展開を阻害する物質が被検試料に含ま
れる場合、フィルターにより該展開を阻害する物質が吸
水性基材に沈着することを防ぐことができるため、被検
物質等の展開性を良好に保つことができる。したがって
本発明の試験片を用いて免疫クロマトグラフ法を行なう
ことにより、被検物質等の展開を阻害する物質が被検試
料に含まれる場合であっても、固定相における〔被検物
質−標識複合体〕からなる複合体の有無を好適な状態で
検出することができる。

【０００８】被検試料を滴下するための滴下パッドとフ
ィルターとが積層されて吸水性基材上に配設されてなる
免疫クロマトグラフ用試験片において、積層の順序や、
滴下パッド、フィルターの数には、特に限定されない。
例えば、滴下パッドと吸水性基材の間にフィルターが
積層されてなる試験片、吸水性基材上に、滴下パッ
ド、フィルターの順に積層されてなる試験片、２枚の
滴下パッドの間にフィルターが積層されたものが吸水性
基材上に配設されてなる試験片等が挙げられる。

【０００９】被検物質等の展開を阻害する物質として
は、例えば、食品、糞便、環境ふきとり物に由来する塵
埃、土砂、植物断片、細胞断片等の固形物、脂質等の水
に不溶性の成分等が挙げられる。

【００１０】フィルターの材質としては、不織布、ガラ
ス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースおよび
多孔質材料等が挙げられ、なかでも、被検物質等の展開
を阻害する物質のトラップ能力に優れていることから、
不織布およびガラス繊維布が好ましい。前記不織布とし
ては、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレ
ン、セルロース、パルプ等からなる吸水性のものが挙げ
られる。

【００１１】フィルターは、被検物質等の展開を阻害す
る物質をトラップする観点から、被検試料を滴下するた
めの滴下パッドより孔径の小さいものが好ましい。フィ
ルターの孔径は、展開を阻害する物質のトラップ能力お
よび被検物質の透過性等の観点から０．５〜１０μｍが
好ましく、１．０〜９．０μｍがより好ましい。

【００１２】フィルターの大きさは、展開を阻害する物
質が吸水性基材に沈着することを防ぐ観点から、該滴下
パッドと同等が望ましい。

【００１３】フィルターの厚みは、試薬の浸透および被
検物質の透過を妨げない観点から０．０５〜２ｍｍが好
ましく、０．１〜１ｍｍがより好ましい。フィルターの
積層は、少なくとも１層あればよく、２層以上に積層し
てもよい。

【００１４】被検試料を滴下するための滴下パッドの材
質としては、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレ
ン、セルロース、パルプ等からなる吸水性の不織布等が
例示される。滴下パッドの大きさとしては、５ｍｍ×４
ｃｍ程度の試験片に対して、縦が４〜６ｍｍ、横が７〜
１２ｍｍ程度で、厚みは０．１〜５ｍｍ程度が好まし
い。

【００１５】本発明の試験片に用いられる吸水性基材
は、被検試料を吸収できる基材、後述の標識複合体溶液
または基質溶液を吸収できる基材であればよい。

【００１６】本発明においては、被検試料中の被検物質
と後述の標識複合体の第２の特異的結合物質や固定相の
第１の特異的結合物質との十分な反応を行うための時間
を確保できるような吸水性基材が用いられる。好ましい
具体例としては、適度な吸水速度を有する観点から、不
織布、ろ紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロ
セルロース、多孔質材料等が挙げられる。

【００１７】吸水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の
短冊状に裁断した吸水性基材の片端部を水に浸漬し、１
分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが好
ましい。

【００１８】吸水性基材の形状は、被検試料を展開でき
る形状であれば特に限定されるものではなく、例えば、
矩形のシート状（片状）やロッド状等が好ましい。

【００１９】被検試料を滴下するための滴下パッドとフ
ィルターとを積層させて吸水性基材上に配設する方法
は、試薬や被検物質の透過性を妨げないのであれば、フ
ィルターおよび滴下パッドの全面または一部に接着剤等
を塗布してもよいし、吸水性基材と共に滴下パッド、フ
ィルターを収納したケース等を用いてフィルターおよび
滴下パッドのズレを防止してもよい。

【００２０】本発明の試験片により検出される被検物質
は、通常の免疫反応により検出可能な物質であれば特に
限定されないが、細菌およびその構成成分、細菌が産生
する毒素等が挙げられる。細菌としては、例えば、サル
モネラ菌、大腸菌Ｏ１５７、黄色ブドウ球菌、カンピロ
バクター菌、リステリア菌、ウェルシュ菌、腸炎ビブリ
オ菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、クラミジア・トラコ
マティス菌が挙げられる。細菌が産生する毒素として
は、例えば、ベロトキシン、ストレプトリシンＯ等が挙
げられる。

【００２１】被検物質の存在が疑われる被検試料として
は、具体的には、食品、糞便、環境からの拭き取り物お
よび水等が挙げられる。前記被検試料は、さらにそれを
液体培地にて培養して得られた培養液であってもよい。
前記被検試料が液体の場合は、それをそのまま用いても
よい。

【００２２】本発明の試験片は、被検試料受領部と離れ
たところに、被検試料中に被検物質が存在する場合、担
体に被検物質に特異的に結合しうる第２の特異的結合物
質と標識物質とを固定化した標識複合体と該被検物質と
からなる複合体を捕捉できるような、被検物質と結合し
うる第１の特異的結合物質を固定化した固定相を試験片
上に有するものが好ましい。

【００２３】なお、本明細書において、「特異的結合物
質」には、標識複合体に用いられる特異的結合物質（以
下、第２の特異的結合物質という）、および展開した被
検物質を試験片上で捕捉するための固定相に用いられる
特異的結合物質（以下、第１の特異的結合物質という）
のいずれもが包含される。したがって、単に「特異的結
合物質」と記載する場合、第１または第２のいずれか、
あるいは第１および第２の特異的結合物質を総称するこ
とを意図する。

【００２４】前記特異的結合物質としては、具体例とし
ては、抗体が挙げられる。この場合、第１の特異的結合
物質と、第２の特異的結合物質には、ポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体を使用することができ、一
方の特異的結合物質がモノクローナル抗体である場合に
は、もう一方の特異的結合物質は、当該モノクローナル
抗体とは異なる抗原決定基を認識するものが好ましい。

【００２５】標識複合体に用いられる担体としては、そ
の表面上に、特異的結合物質および標識物質を固定する
ことができる担体であればよく、金属コロイド粒子、水
分散型高分子粒子、シリコーン、ガラスケイソウ土粒子
等が挙げられる。なかでも、金属コロイド粒子および水
分散型高分子粒子が好ましい。

【００２６】金属コロイド粒子としては、金コロイド粒
子やセレニウムコロイド粒子等が例示される。

【００２７】水分散型高分子粒子としては、粒径コント
ロール、分散安定性、結合容易性の観点から、ラテック
ス粒子が好ましい。前記水分散型高分子粒子は、例え
ば、不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体の
乳化重合によって調製される。かかる単量体としては、
例えば、エチレン、プロピレン等のオレフィン系単量
体、酢酸ビニル、塩化ビニル等のビニル系単量体、スチ
レン、メチルスチレン、クロロスチレン等のスチレン系
単量体、メタクリル酸メチル等のメタクリル酸エステル
系単量体、ブタジエン等のジエン系単量体等が挙げられ
る。

【００２８】担体の粒子径は、分散性、ならびに酵素、
特異的結合物質等の固定化量の調整を良好にする観点か
ら、好ましくは３μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以
下であり、得られた標識複合体の精製の容易性の観点か
ら、好ましくは０．０１μｍ以上、さらに好ましくは
０．１μｍ以上であることが望ましい。

【００２９】標識複合体に用いられる標識物質として
は、例えば、酵素、蛍光物質等が挙げられる。かかる標
識物質は、単独でまたは２種以上を混合して用いること
ができる。

【００３０】酵素免疫クロマトグラフ法を行なう場合、
公知の標識に用いられる酵素を用いることができる。前
記酵素としては、具体的には、ペルオキシダーゼまたは
アルカリホスファターゼが挙げられる。とりわけ安定性
および酵素反応性という観点からペルオキシダーゼが好
ましい。ペルオキシダーゼの由来としては、西洋ワサ
ビ、モミガラ、大豆等の植物に由来するものが挙げられ
る。酵素反応性の観点から、西洋ワサビペルオキシダー
ゼが好ましい。

【００３１】担体に、特異的結合物質および酵素を固定
させる方法としては、従来からよく知られている方法、
例えば共有結合法、物理吸着法、イオン結合法等を用い
ることができる。得られた標識複合体が特異的結合体お
よび酵素の脱離がなく安定である点から共有結合法を採
用することが好ましい。

【００３２】第２の特異的結合物質および酵素の固定量
は、固定後の遊離のタンパク質をブラッドフォード（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ）法等を用いて測定することにより算出
することができる。

【００３３】得られた標識複合体中に含まれる特異的結
合物質および酵素の総固定量は、担体の乾燥重量１ｇあ
たり好ましくは５〜２００ｍｇであり、その量は上記の
範囲内で、使用する特異的結合物質や酵素の種類、酵素
の活性の程度等によって適宜変更し得る。例えば、担体
が水分散型高分子粒子の場合、当該粒子の表面積に鑑み
ると、前記総固定量は、水分散型高分子粒子の乾燥重量
１ｇあたり好ましくは２００ｍｇ以下であり、さらに好
ましくは１５０ｍｇ以下であり、被検物質の検出の迅速
性、感度、再現性の観点から好ましくは５ｍｇ以上であ
り、さらに好ましくは１０ｍｇ以上であることが望まし
い。

【００３４】担体の「乾燥重量」とは、一定量の担体を
１２０℃で２時間乾燥した後の重量をいう。

【００３５】より迅速、且つ高感度な免疫クロマトグラ
フ法を行うためには、担体に固定される酵素の固定量
は、その種類により適宜変更し得るが、被検物質の検出
の迅速性、感度、再現性の観点から、通常水分散型高分
子粒子の乾燥重量１ｇあたり１．０ｍｇ以上が好まし
く、１００ｍｇ以下であることがさらに好ましい。

【００３６】また酵素の固定量は、特異的結合物質１モ
ル当たり０．６モル以上が好ましく、当該水分散型高分
子粒子の表面積との関係およびバックグラウンドを低く
するという観点から、６０モル以下が好ましい。

【００３７】標識複合体は、本発明の検査方法において
緩衝液に分散させて使用することができる。標識複合体
を含有する緩衝液を標識複合体溶液という。ここで使用
する緩衝液としては、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液等が挙げられ、抗原抗体反応および酵素反応を十
分に行ないうる緩衝液、ｐＨならびに塩濃度を適宜選択
する。標識複合体の使用量は、本発明の各種の態様にお
いて適宜設定することができる。例えば、標識複合体溶
液中の標識複合体濃度は、好ましくは０．００５重量％
以上であり、より好ましくは０．０１重量％以上である
ことが望ましく、特異的結合を得る観点から、好ましく
は５重量％以下であり、より好ましくは０．５重量％以
下であることが望ましい。

【００３８】例えば、酵素がアルカリホスファターゼの
場合、発色基質は、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、
５−ブロモ−４−クロロー３−ホスフェート／ニトロブ
ルーテトラゾリウム、ファーストレッド／ナフトール、
ＡＳ−ＴＲホスフェート等が挙げられる。また、酵素が
ペルオキシダーゼの場合、発色基質は、ペルオキシダー
ゼと過酸化水素との組み合わせにより反応して発色しう
る基質であればよく、例えば、２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、ｏ
−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメ
チルベンジジン（以下、ＴＭＢという) 、ｏ−ジアニジ
ジン、３，３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９
−エチルカルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール等
が挙げられ、発色性および無毒性という観点からＴＭＢ
が好ましい。発色基質は、後述の基質溶液に直接溶解さ
せて用いてもよいし、また吸水性基材上において、被検
試料受領部の上流部に、基質溶液との接触により溶解し
うるように発色基質を塗布して保持させた発色基質相を
設け、後述の水溶性有機溶剤を含んだ基質溶液により溶
出させてもよい。

【００３９】また本明細書において、「上流」とは基質
溶液を滴下するための基質受領部が配置される末端側を
意味する。

【００４０】酵素免疫クロマトグラフ法において、試験
片上に発色基質を基質溶液との接触により脱離可能に保
持させる場合、発色基質は、該発色基質を溶解可能で、
かつ、吸水性基材を腐食しないような適当な溶媒に発色
基質を溶解して塗布した後、乾燥させる。塗布領域は、
５ｍｍ幅で４ｃｍ長さの短冊状の吸水性基材の場合、固
定部の上流に０．５〜３ｍｍの幅が好ましい。発色基質
の塗布量としては、ＴＭＢを例に取ると、発色を明瞭に
するという観点から、塗布部１ｃｍ² 当たりｌ〜１００
μｇが好ましい。

【００４１】前記水溶性有機溶剤としては、発色基質を
溶解可能で、かつ、基質溶液と吸水性基材との接触時に
おける該水溶性有機溶剤の量において酵素反応が十分起
こり、吸水性基材の腐食が起こらないものであればよ
い。例えば、発色基質としてＴＭＢを用いる場合、水溶
性有機溶剤は、ＴＭＢを溶解可能な溶剤であればよく、
中でも基質溶液における水溶性有機溶剤の濃度が１０重
量％のとき、ＴＭＢを０．２ｇ／Ｌ以上溶解可能な溶剤
であることが好ましい。具体的には、ジオキサン、アセ
トン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）、２−メトキシエタノールまた
は２−エトキシエタノールが挙げられ、酵素活性を十分
維持できるという観点から、ＤＭＳＯまたはＤＭＦが好
ましい。ＤＭＳＯを用いる場合、基質溶液におけるＤＭ
ＳＯの含有量は０．０５〜１０重量％が好ましく、０．
５〜５重量％がより好ましい。また、ＤＭＦを用いる場
合、基質溶液におけるＤＭＦの含有量は０．５〜２０重
量％が好ましく、１〜１５重量％がより好ましい。

【００４２】ペルオキシダーゼを酵素として用いる場
合、基質溶液は、過酸化水素をさらに含有することが好
ましい。基質溶液における過酸化水素の含有量として
は、０．００１〜０．０５重量％が好ましく、０．００
５〜０．０１５重量％がより好ましい。

【００４３】本発明に用いられる基質溶液は、酵素反応
に適する条件を得、酵素反応により生じた発色を沈着さ
せる目的で、緩衝液、および硫酸デキストランナトリウ
ム等の化学物質を含有してもよい。緩衝液は、用いる酵
素に最適のｐＨその他の条件を満たすように適宜選択す
ることができる。

【００４４】洗浄液は、発色反応に適したｐＨを保つた
めに緩衝液を含有した溶液であり、被検試料と基質溶液
が試験片内で直接接触することを防ぐために用いてもよ
い。前記緩衝液としては、標識物質として用いる酵素の
至適反応ｐＨ、抗原抗体反応等に適したｐＨの緩衝能を
有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、ホウ
酸緩衝液、塩化アンモニウム緩衝液、酢酸緩衝液、トリ
ス−塩酸緩衝液等が挙げられる。なかでも、発色反応の
安定性および標識複合体の安定性の観点から、リン酸緩
衝液および塩化アンモニウム緩衝液が好ましい。洗浄液
はまた、酵素免疫クロマトグラフにおける抗原抗体反応
をより安定に進める目的から、種々の塩類やタンパク
質、保存料を含んでいてもよい。

【００４５】固定相は、公知の物理吸着法、共有結合法
等により作製されうる。また、固定相に使用する第１の
特異的結合物質と親水性重合体とを含む溶液を吸水性基
材に塗布した後、該親水性重合体を凝固させる凝固溶剤
に浸漬することで固定相を作製することもできる。親水
性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロー
ス等が挙げられる。凝固溶剤としては、アセトン、エタ
ノール、メタノール、エーテル等が挙げられる。

【００４６】固定相は、被検試料の吸液によって展開し
移動してきた複合体を補足するために、吸水性基材上に
特異的結合物質を、０．００１〜１０ｍｇ／ｃｍ² 塗布
することが好ましい。

【００４７】固定後の吸水性基材は、検出対象でないタ
ンパク質の基材への非特異的吸着の防止、展開の容易
性、固定した第１の特異的結合物質の保存安定性の観点
から、ブロッキング剤、界面活性剤および糖を含有する
溶液（処理液という）で処理されることが好ましい。こ
こで使用するブロッキング剤としては、ウシ血清アルブ
ミン、カゼイン、スキムミルク等のタンパク質、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニル
ピロリドン等の水溶性高分子が挙げられる。界面活性剤
としては、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ
ラウレート（Ｔｗｅｅｎ^TM２０) 、ポリオキシエチレン
（２０）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ^TM８
０) 、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエ
ーテル（Ｔｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００) 、ドデシルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。

【００４８】本発明に用いられる試験片には、吸水性基
材の一端から順に、基質溶液を滴下するための基質受領
部、洗浄液を滴下するための洗浄液受領部を設けてもよ
く、被検試料を滴下するための被検試料受領部はそれら
の下流に設けるのが好ましい。また、被検試料等に含ま
れる液体成分の接触により前記標識複合体を展開できる
ように、該標識複合体を試験片に固定させてもよい。

【００４９】基質受領部、洗浄液受領部に用いられる滴
下パッドとしては、前記被検試料受領部に用いられる滴
下パッドと同様のものが挙げられる。

【００５０】また、試験片において、良好な発色感度を
得、かつ適切な測定時間を得る観点から、被検試料受領
部と固定相との間の距離は、好ましくは２〜２０ｍｍ、
より好ましくは３〜１０ｍｍであることが望ましい。

【００５１】本発明においては、前記展開移動距離を得
るように、基質受領部、洗浄液受領部、被検試料受領
部、発色基質相および固定相を配置した試験片を用いる
ことができる。

【００５２】また、固定相の下流側に吸水パッドを設け
てもよく、これにより、試験片を展開する液体部分を吸
収するので展開が容易に進行する。

【００５３】本発明の試験片を用いた酵素免疫クロマト
グラフによる被検物質の検出方法について、図１および
図２を代表例として参照して説明する。まず、ピペット
等を用いて洗浄液受領部６に洗浄液を、被検試料受領部
の滴下パッド５に被検試料および標識複合体溶液を滴下
する。これらの溶液は、吸水パッド１の方向に試験片上
に展開していく。この時、被検試料と共存する被検物質
等の展開を阻害する物質は、被検試料受領部の滴下パッ
ド５と吸水性基材２の間に積層されたフィルター８上に
トラップされる。最後に、基質受領部７にピペット等を
用いて基質溶液を滴下する。被検試料、標識複合体溶
液、洗浄液および基質溶液が、発色基質相４を通過して
固定相３へと移動する。被検試料中に被検物質が存在す
る場合、形成された〔被検物質−標識複合体〕からなる
複合体は、固定相３に固定化された第１の特異的結合物
質と結合して固定相３上に捕捉される。基質溶液は、発
色基質相４を通過する際に塗布された発色基質を溶解し
て、固定相３に移動する。次いで、固定相３において、
〔被検物質−標識複合体〕からなる複合体中の酵素と発
色基質とが反応することにより生成する発色が検出され
る。すなわち、固定相３での発色が検出された場合、被
検試料中に被検物質が存在することの指標となる。

【００５４】

【実施例】以下、本発明の実施例および比較例を挙げ、
さらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に
何ら限定されるものではない。

【００５５】調製例１：標識複合体（酵素−サルモネラ
抗体固定化ラテックス粒子）の作製 １）ラテックス粒子懸濁液の作製 スチレン５０ｇと、アクリル酸０．５ｇと、トリエチレ
ングリコールメタクリレート０．２ｇと、蒸留水４４０
ｇとからなる混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維
持、攪拌しながら、重合開始剤としての過硫酸カリウム
０．２５ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１
０時間重合を行った。その結果、カルボキシル化された
水分散型高分子粒子としてカルボキシル化ポリスチレン
ラテックス粒子（平均粒子径は０．２μｍ）を得た。得
られたカルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子を、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）に固形分濃度
が５重量％になるように分散し、ラテックス粒子の懸濁
液を得た。

【００５６】２）固定化 ｉ）抗体の固定 本実施例では、特異的結合物質として抗サルモネラ抗体
を、前記１）で作製したラテックス粒子に以下のように
して固定した。

【００５７】前記１）で得られたラテックス粒子の懸濁
液３ｍＬに、水溶性カルボジイミド〔同仁化学研究所
製、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍＬ、０．０１Ｍ−
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕０．５ｍＬと、ウサギ抗
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓポリク
ローナル抗体〔Kirkegaard & Perry Laboratories 社
製、１ｍｇ／ｍＬ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．２）〕２ｍＬとを加えて、１０℃で３時間反応させ
た。次いで、得られた反応物について、洗浄液として
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を用いて遠心
分離洗浄を行い、前記０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液で固形
分濃度５重量％に調整し、抗体固定化ラテックス粒子の
懸濁液を作製した。なお、以下の記述ではＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓをＳＥと略す。

【００５８】ii）酵素の固定 次いで、前記ｉ）で作製した抗体固定化ラテックス粒子
懸濁液３ｍＬに、水溶性カルボジイミド〔同仁化学研究
所製、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍＬ、０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕１ｍＬと、西洋ワサ
ビ由来ペルオキシダーゼ〔以下、ＨＲＰと略す：和光純
薬製、１０ｍｇ／ｍＬ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．２）〕２ｍＬとを加えて、１０℃で３時間反応さ
せた。次いで、得られた反応物について、洗浄液として
0 ．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を用いて遠心
分離洗浄を行ない、前記０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液で固
形分濃度２重量％に調整し、ウサギ抗ＳＥポリクローナ
ル抗体とＨＲＰとを固定化したラテックス粒子（標識複
合体という）を作製した。

【００５９】ラテックス粒子乾燥重量１ｇあたりの抗体
（分子量約１．６×１０⁵ ）の固定量は１１．１ｍｇ、
酵素（分子量約４×１０⁴ ）の固定量は１．８ｍｇであ
った。また、上記結果より抗体１分子あたりの酵素数を
算出すると、０．６分子であった。

【００６０】固定されたＨＲＰの活性は、ラテックス粒
子の乾燥重量１ｇあたり１０，１６０Ｕであった。

【００６１】実施例１：フィルター（孔径：３μｍ）を
有する試験片を用いた鶏糞培養液からのサルモネラ検出 １）試験片の作製 図１に示される模式図のニトロセルロースメンブレン
（孔径８μｍ、２００μｍ厚、６ｍｍ×６０ｍｍ）の一
端から１６ｍｍの箇所に、ウサギ抗ＳＥポリクローナル
抗体〔１ｍｇ／ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）〕１．５μＬを、ディスペンサーを用いてライン状
（幅１．０ｍｍ）に塗布し、固定相３を配置したメンブ
レンを得た。

【００６２】得られたメンブレンを、ウシ血清アルブミ
ン（オリエンタル酵母製、１重量％）と、ポリオキシエ
チレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬
製、０．１重量％) と、サッカロース（和光純薬社製、
１重量％）とを含む水溶液中に１０分間浸漬させた。浸
漬後のメンブレンを、４０℃で２時間乾燥させた。次い
で、得られたメンブレンの裏側（抗体塗布面の反対側）
にポリエステルフィルム（１００μｍ厚）をスプレー糊
を用いて貼り合わせた。

【００６３】次に、ＴＭＢ（同仁化学研究所製）を終濃
度１重量％となるようにトルエンに溶解して得られた溶
液１．２μＬを、前記ニトロセルロースメンブレン上の
固定相３の上流４．５ｍｍの箇所に塗布し、次いで乾燥
させて発色基質相４を設けた。

【００６４】固定相３の下流端から２３ｍｍ、３７ｍ
ｍ、５７ｍｍの３箇所に、ポリエステル製不織布ハイボ
ン４８８０Ｃ（シンワ製、孔径：６０μｍ、厚さ２．４
ｍｍ、大きさはそれぞれ７×７ｍｍ、７×７ｍｍ、７×
１２ｍｍ）を貼り合わせて、３つの滴下パッドを設置し
た。これらは図１において、固定相側の端部から順に、
被検試料受領部の滴下パッド５、洗浄液受領部６、基質
受領部７に相当する。

【００６５】被検試料受領部の滴下パッド５と吸水性基
材２の間に、フィルター８として不織布ハイボン７９１
５−８（シンワ製、素材：ポリエステル・ナイロン、孔
径３μｍ，大きさ７×７ｍｍ、厚さ０．７０ｍｍ）を積
層した。

【００６６】さらに、固定相３の下流端５〜１０ｍｍの
箇所に吸水パッド１としてガラス繊維製の吸水性基材２
（１５ｍｍ×３０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）を貼り合わせて試
験片を作製した。当該試験片を１００個作製して、以下
の検出に用いた。

【００６７】２）試薬の調製 ｉ）被検試料 ハーナ・テトラチオン酸塩培地〔栄研化学（株）製の粉
末培地をもとに調製〕１００ｍＬに、大阪府下の養鶏場
にて採取した鶏糞１０ｇを接種し、４２℃、２４時間静
置で培養した。この鶏糞の培養液に、ホルマリン固定後
にＰＢＳ（ｌ３７ｍＭ ＮａＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄ 、２．６８ｍＭ ＫＣ１、１．４７ｍＭ ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ｐＨ７．４）で洗浄、懸濁して得られたＳＥ
菌体懸濁液を表１に示した濃度で分散させ、被検試料を
調製した。なお、実験に用いる鶏糞の培養液は、さらに
サルモネラ分離用の選択培地による培養を行い、サルモ
ネラを含まないことを確認している。

【００６８】ii）標識複合体溶液 調製例１で作製した標識複合体を、緩衝液（０．２Ｍ
ＮＨ₄ Ｃｌ、０．９重量％ＮａＣｌ、５重量％塩化コリ
ン、１重量％サッカロース、０．１５重量％クロロブタ
ノール、０．４５重量％オキシ安息香酸メチル塩、ｐＨ
８．０）で０．０２０重量％となるように希釈して、標
識複合体溶液を得た。

【００６９】iii ）洗浄液 洗浄液として、０．１Ｍ塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ
８．０）を調製した。

【００７０】iv）基質溶液 基質溶液として、溶液〔１重量％ＤＭＳＯ、０．００５
重量％Ｈ₂ Ｏ₂ 、０．１２重量％硫酸デキストラン、
０．１Ｍ塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）〕を用
いた。

【００７１】３）検出 図１の洗浄液受領部６に５０μＬの洗浄液を滴下し、次
いで２５μＬの被検試料および５０μＬの標識複合体溶
液を被検試料受領部の滴下パッド５に滴下した。さら
に、１００μＬの基質溶液を基質受領部７に滴下した。
各液の滴下は、すべて１０秒間の間隔をおいて行うこと
により、滴下するタイミングのずれによる測定誤差をな
くした。滴下終了２０分後に固定相３での発色度および
ラインの明瞭さを観察した。青紫色の発色を陽性とし
た。

【００７２】実施例２：フィルター（孔径：７μｍ）を
有する試験片を用いた鶏糞培養液からのサルモネラ検出 １）試験片の作製 フィルター８としてハイボン４２６０（シンワ製、素
材：レーヨン、孔径７μｍ、大きさ７×７ｍｍ、厚さ
０．２８ｍｍ）を積層した以外は、実施例１の１）と同
様にして試験片を作製した。 ２）試薬の調製 実施例１の２）と同一の試薬を用いた。 ３）検出 実施例１の３）に記載の方法と同様の手順で行った。

【００７３】実施例３：フィルター（孔径：５μｍ）を
有する試験片を用いた鶏糞培養液からのサルモネラ検出 １）試験片の作製 フィルター８としてハイボン４２７０（シンワ製、素
材：レーヨン、孔径５μｍ、大きさ７×７ｍｍ、厚さ
０．３７ｍｍ）を積層した以外は、実施例１の１）と同
様にして試験片を作製した。 ２）試薬の調製 実施例１の２）と同一の試薬を用いた。 ３）検出 実施例１の３）に記載の方法と同様の手順で行った。

【００７４】実施例４：フィルター（孔径：１．７μ
ｍ）を有する試験片を用いた鶏糞培養液からのサルモネ
ラ検出 １）試験片の作製 フィルター８としてＧＦ／Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ製、素
材：ガラス繊維、孔径１．７μｍ，大きさ７×７ｍｍ、
厚さ０．２６ｍｍ）を積層した以外は、実施例１の１）
と同様にして試験片を作製した。 ２）試薬の調製 実施例１の２）と同一の試薬を用いた。 ３）検出 実施例１の３）に記載の方法と同様の手順で行った。

【００７５】比較例１：フィルターがない試験片を用い
た鶏糞培養液からのサルモネラ検出ｌ）試験片の作製 フィルター８がない他は、実施例１の１）と同様にして
試験片を作製した。 ２）試薬の調製 実施例１の２）と同一の試薬を用いた。 ３）検出 実施例１の３）に記載の方法と同様の手順で行った。

【００７６】実施例１〜４および比較例１の結果を表１
に示す。なお、表中の判定基準は以下の通りである。

【００７７】発色度 ＋：固定相３に濃い青紫色の発色が見られる。 ±：固定相３に青紫色の発色が見られる。 −：固定相３に発色が見られない。

【００７８】明瞭さ ○：固定相３の発色が、ライン状（実線状）に見える。 ×：固定相３の発色が、一部欠けたライン状（点線状）
に見える。 判定不能：固定相３が発色しなかった。

【００７９】

【表１】

【００８０】実施例１では、菌数０の場合に固定相３に
発色は見られず、非特異発色は認められなかった。ま
た、ＳＥ菌数５×１０⁶ 細胞数／ｍＬの場合に陽性反応
が検出され、陽性反応の発色は固定相３における実線と
して観察されたため、目視判定が容易であった。さら
に、試験後に試験片を分解してフィルター８を観察した
ところ、鶏糞由来の固形物の沈着が見られたが、吸水性
基材２上には固形物が沈着していなかった。

【００８１】実施例２では、菌数０の場合に固定相３に
発色は見られず、非特異発色は認められなかった。ま
た、ＳＥ菌数５×１０⁶ 細胞数／ｍＬの場合に陽性反応
が検出され、陽性反応の発色は固定相３における実線と
して観察されたため、目視判定が容易であった。ＳＥ菌
数５×１０⁶ 細胞数／ｍＬにおける発色度は実施例１の
方が良好であった。

【００８２】実施例３では、菌数０の場合に固定相３に
発色は見られず、非特異発色は認められなかった。ま
た、ＳＥ菌数５×１０⁶ 細胞数／ｍＬの場合に陽性反応
が検出され、陽性反応の発色は固定相３における実線と
して観察されたため、目視判定が容易であった。ＳＥ菌
数５×１０⁶ 細胞数／ｍＬにおける発色度は実施例１の
方が良好であった。

【００８３】実施例４では、菌数０の場合に固定相３に
発色は見られず、非特異発色は認められなかった。ま
た、ＳＥ菌数５×１０⁶ 細胞数／ｍＬの場合に陽性反応
が検出され、陽性反応の発色は固定相３における実線と
して観察されたため、目視判定が容易であった。ＳＥ菌
数１０⁷ 細胞数／ｍＬにおける発色度は実施例１の方が
良好であった。

【００８４】比較例１のように、フィルター８がない試
験片を用いる場合は、固定相３における発色が明瞭な実
線を示さずに点線状となり、陽性および陰性の判定が困
難であった。また試験後に試験片を分解して吸水性基材
２を観察したところ、被検試料受領部の滴下パッド５を
設置した場所に鶏糞由来と思われる固形物の沈着が認め
られ、これが被検試料および標識複合体の展開を阻害し
たため、固定相３における発色にムラが生じたものと考
えられた。したがって、被検試料受領部の滴下パッド５
と吸水性基材２の間にフィルター８が積層された試験片
を用いることにより、検出性能が向上することが明らか
となった。

【００８５】実施例５：フィルターを有する試験片を用
いた食肉培養液からの大腸菌Ｏ１５７検出 １）試験片の作製 固定相３には、ウサギ抗大腸菌Ｏ１５７ポリクローナル
抗体〔イムノプローブ社製、１ｍｇ／ｍＬ、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕１．５μＬを、ディスペン
サーを用いてライン状（幅１ｍｍ）に塗布した。フィル
ター８としては、ＧＦ／Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ製、素材：
ガラス繊維、孔径１．７μｍ，大きさ７×７ｍｍ）を積
層した。また、洗浄液受領部６に相当する滴下パッドは
使用しなかった。それ以外は、実施例１の１）と同様に
して試験片を作製した。

【００８６】２）試薬の調製 ｉ）被検試料 ノボビオシン含有ｍＥＣ培地（日水製薬製の粉末培地を
用いて調製）２２５ｍＬに、牛挽肉２５ｇを添加し、４
２℃で１８時間、静置培養した。この牛挽肉の培養液
に、ホルマリン固定後にＰＢＳで洗浄、懸濁して得られ
た大腸菌Ｏ１５７菌体懸濁液を表２に示した濃度で分散
させ、被検試料を調製した。なお、実験に用いる牛挽肉
の培養液は、さらに、大腸菌Ｏ１５７分離用の選択培地
による培養を行い、大腸菌Ｏ１５７を含まないことを確
認している。

【００８７】ii）標識複合体溶液 特異的結合物質としてヤギ抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ポリ
クローナル抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories 社
製）を用いた以外は、調製例１と同様にして、標識複合
体を作製した。得られた標識複合体を用いた以外は、実
施例１の２）のii）と同様にして、標識複合体溶液を得
た。

【００８８】iii ）基質溶液 実施例１の２）のiv）と同一の基質溶液を用いた。

【００８９】３）検出 図１の被検試料受領部の滴下パッド５に５０μＬの被検
試料および２５μＬの標識複合体溶液を滴下した。さら
に、１００μＬの基質溶液を基質受領部７に滴下した。
各液の滴下は、すべて１０秒間の間隔をおいて行うこと
により、滴下するタイミングのずれによる測定誤差をな
くした。滴下終了１０分後に固定相３での発色の有無を
観察した。青紫色の発色を陽性とした。

【００９０】比較例２：フィルターがない試験片を用い
た牛挽肉培養液からの大腸菌Ｏ１５７検出 １）試験片の作製 フィルター８がない他は、実施例５の１）と同様にして
試験片を作製した。 ２）試薬の調製 実施例５の２）と同一の試薬を用いた。 ３）検出 実施例５の３）に記載の方法と同様の手順で行った。

【００９１】実施例５および比較例２の結果を表２に示
す。なお、表中の判定基準は以下の通りである。

【００９２】 ＋：固定相３にライン状の発色が見られる。 −：固定相３にライン状の発色が見られない。

【００９３】

【表２】

【００９４】表２より、実施例５では、菌数０の場合に
固定相３に発色は見られず、非特異発色は認められなか
った。大腸菌Ｏ１５７菌数１０⁶ 細胞数／ｍＬでは、陽
性反応が検出された。また試験後に試験片を分解して観
察したところ、フィルター８上に牛挽肉由来と思われる
固形物の沈着が認められたが、吸水性基材２上での固形
物の沈着は見られなかった。

【００９５】また、比較例２のように、フィルター８が
ない試験片を用いる場合は、大腸菌Ｏ１５７菌数１０⁶
細胞数／ｍＬの場合も固定相３における発色が見られな
かった。また試験後に、試験片を分解して吸水性基材２
を観察したところ、被検試料受領部の滴下パッド５を設
置した場所に牛挽肉由来と思われる固形物の沈着が認め
られ、これが被検物質および標識複合体の展開を阻害し
たため、固定相３における発色を妨げたと考えられる。
したがって、被検試料受領部の滴下パッド５と吸水性基
材２の間にフィルター８が積層された試験片を用いるこ
とにより、検出感度が向上することが明らかとなった。

【００９６】

【発明の効果】本発明の試験片を用いることにより、免
疫クロマトグラフ法による検査において、被検試料に含
まれる被検物質等の展開を阻害する物質が吸水性基材に
沈着することを防ぎ、被検物質を安定に検出することが
可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の酵素免疫クロマトグラフ用試
験片の１つの態様を示す模式図（平面図）である。

【図２】図２は、本発明の酵素免疫クロマトグラフ用試
験片の１つの態様を示す模式図（断面図）である。

【符号の説明】

１ 吸水パッド ２ 吸水性基材 ３ 固定相 ４ 発色基質相 ５ 被検試料受領部の滴下パッド ６ 洗浄液受領部 ７ 基質受領部 ８ フィルター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 千田 修治 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 吸水性基材上に被検試料受領部が配置さ
   れた免疫クロマトグラフ用試験片において、被検試料を
   滴下するための滴下パッドとフィルターとが積層されて
   吸水性基材上に配設されてなる免疫クロマトグラフ用試
   験片。
2. 【請求項２】 フィルターが、滴下パッドより孔径の小
   さい不織布またはガラス繊維布である請求項１記載の免
   疫クロマトグラフ用試験片。
3. 【請求項３】 フィルターの孔径が、０．５〜１０μｍ
   である請求項１又は２記載の免疫クロマトグラフ用試験
   片。
4. 【請求項４】 請求項１〜３いずれか記載の免疫クロマ
   トグラフ用試験片を用いて免疫クロマトを行うことを特
   徴とする被検物質の検出方法。