JP2014194407A - クロマトグラフ方法、クロマトグラフ用キット及びクロマトグラフ用不溶性担体の製造方法 - Google Patents
クロマトグラフ方法、クロマトグラフ用キット及びクロマトグラフ用不溶性担体の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 被検物質と、該被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質との複合体を、不溶性担体上に展開する工程と、前記不溶性担体上の反応部位において、前記被検物質と標識物質との複合体を捕捉する工程と、洗浄液を用いて、前記不溶性担体上の反応部位を洗浄する工程と、増幅液で、前記標識物質のシグナルを増幅した後に、前記反応部位において捕捉された前記被検物質を検出する工程と、を含むクロマトグラフ方法であって、前記不溶性担体上の反応部位が、(i)前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、(ii)分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールとを含む、クロマトグラフ方法。
【選択図】なし
Description
前記不溶性担体上の反応部位において、前記被検物質と標識物質との複合体を捕捉する工程と、
洗浄液を用いて、前記不溶性担体上の反応部位を洗浄する工程と、
増幅液で、前記標識物質のシグナルを増幅した後に、前記反応部位において捕捉された前記被検物質を検出する工程と、を含むクロマトグラフ方法であって、
前記不溶性担体上の反応部位が、(i)前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、(ii)分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールと、を含む、
クロマトグラフ方法が提供される。
好ましくは、前記ポリエチレングリコールと、前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質とのモル比は、6.3〜150である。
好ましくは、(i)前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、(ii)前記ポリエチレングリコールと、を含む混合液を前記不溶性担体上に塗布することによって、前記不溶性担体上の反応部位が設けられる。
好ましくは、前記洗浄液は、銀イオンを還元し得る還元剤を含む。
好ましくは、前記銀イオンを還元し得る還元剤は2価の鉄イオンを含む。
好ましくは、前記標識物質は、金属コロイドである。
(b)(i)前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、(ii)分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールとを含む反応部位を備えた不溶性担体、
(c)洗浄液、及び
(d)増幅液を含むクロマトグラフ用キットが提供される。
本発明は、被検物質と、該被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質との複合体を、不溶性担体上に展開する工程と、前記不溶性担体上の反応部位において、前記被検物質と標識物質との複合体を捕捉する工程と、洗浄液を用いて、前記不溶性担体上の反応部位を洗浄する工程と、増幅液で、前記標識物質のシグナルを増幅した後に、前記反応部位において捕捉された前記被検物質を検出する工程と、を含むクロマトグラフ方法であって、前記不溶性担体上の反応部位が、(i)前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、(ii)分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールとを含む、クロマトグラフ方法である。本発明の方法によれば、抗体などの結合物質を不溶性担体に固定化する際に、分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールを抗体と共に固定化することが好ましい態様である。これにより、非特異吸着を抑制できる。更に洗浄液を用いて非特異吸着物質を洗浄することにより、増幅反応を用いたクロマトグラフ方法において特に抑制することが期待されている偽陽性を特異的に抑制することができ、非常に高いノイズに対するシグナル比(S/N比)を実現することが可能となる。
本発明は、検出シグナルを増幅させるクロマトグラフ方法において、上記の課題を達成するものである。一般には、クロマトグラフ方法とは以下のような手法で被検物質を簡便かつ迅速に、また特異的に、判定したり測定する手法である。すなわち、被検物質と結合可能な結合物質(被検物質と結合し得る第二の結合物質、又は下記の第一の結合物質への結合性を有する物質に相当する。具体的には抗体、抗原等)を有する反応部位を少なくとも1つ含む標識物質捕捉領域を備えたクロマトグラフ担体(不溶性担体の一部)を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、被検物質と結合し得る第一の結合物質によって修飾された標識物質を含む液を移動層として、クロマトグラフ的に移動させる。これにより、被検物質と標識物質とが特異的に結合しながら、反応部位を有する標識物質捕捉領域まで到達する。標識物質捕捉領域の反応部位において、被検物質と標識物質の複合体が、固定化された結合物質(第二の結合物質又は第一の結合物質への結合性を有する物質)に特異的に結合することにより、被検試料中に被検物質が存在する場合にのみ、結合物質(第二の結合物質又は第一の結合物質への結合性を有する物質)に標識物質が濃縮される。標識物質を目視または適当な機器を用いて標識量を測定することにより、被検試料中に被検物質が存在することを定性及び定量的に分析する。
本発明のクロマトグラフ方法及びキットを用いて分析することのできる被検試料としては、被検物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(特にヒト)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体(スワブ)、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。被検物質としては、例えば、天然物、毒素、ホルモン、農薬等の生理活性物質、環境汚染物質、ウイルス、抗原、抗体などが挙げられる。
本発明のクロマトグラフ方法では、被検試料をそのままで、あるいは、被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形で、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。本発明で用いられる抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒(例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等)、あるいは、かかる溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
本発明のクロマトグラフ方法を行うためのクロマトグラフ用キットにおいては、クロマトグラフ用ストリップを組み込んで使用することができる。使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。
本発明において使用することができるクロマトグラフ用ストリップとしては、被検物質を含む被検試料の展開方向の上流方向から下流方向に向かって、標識物質保持領域、標識物質補足領域を有している。例えば、試料添加パッド、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド(例えば金コロイド抗体保持パッド)、不溶性担体である結合物質固定化メンブレン(例えば、標識物質捕捉領域を有するクロマトグラフ担体)、及び吸収パッドをこの順に、粘着シート上に配置する態様が好ましく用いられる。結合物質を固定化したクロマトグラフ担体(不溶性担体)としては、被検物質と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した反応部位(テストライン)を少なくとも1つ有する領域である標識物質捕捉領域を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化したコントロールラインを少なくとも1つ有する領域であるコントロール領域を更に有していてもよい。
本発明で用いる標識物質(被検物質(抗原)と特異的に結合する第一の結合物質を標識するのに用いる標識)として、金属を含む標識物質を用いるのが好ましい。本発明で用いることができる金属の種類としては、好ましくは、金、銀、白金の貴金属や、鉄、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀を用いることができ、更に好ましくは金、銀、白金の貴金属を用いることができる。本発明において使用できる金属を含む標識物質の好ましい形態としては、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いることができる。金属コロイド標識としては、好ましくは、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、又は水酸化アルミニウムコロイドなどを用いることができ、金属硫化物標識としては、好ましくは、鉄、銀、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を用いることができる。本発明においては更に好ましくは、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、最も好ましくは金コロイドを用いることができる。金属コロイド標識として金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法(Nature Physical Science,241(1973)20等)により金コロイド粒子を調製することができる。
本発明では、標識物質は、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば被検物質(抗原)に対する抗体、被検物質(抗体)に対する抗原、被検物質(たんぱく質、低分子化合物等)に対するアプタマーなど、被検物質に対して親和性を持つ化合物であれば特に制限はない。
より好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、第二の結合物質が第一の結合物質と結合する抗体である。
本発明で用いることができる不溶性担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
本発明の不溶性担体(クロマトグラフ用不溶性担体)は、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドを組み込んで使用することが好ましい。標識物質保持パッドとしては、金コロイド保持パッドが挙げられる。標識物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等を好ましく使用することができる。標識物質保持パッドは、前記素材に、前述のように調製した標識物質を一定量含浸させ、次いで乾燥させて作製できる。
本発明の不溶性担体(クロマトグラフ用不溶性担体)は更に、試料添加パッドを組み込み使用することが好ましい。試料添加パッドは、添加された被検物質を含む試料(被検試料)を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる態様が好ましい。試料添加パッドの材質としては、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられる。また、分析の際、試料中の被検物質が試料添加パッドの材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもできる。本発明においては、試料添加パッドは、4−4で述べた標識物質保持領域を有する標識物質保持パットを兼ねていてもよい。
本発明においては、吸収パッドを不溶性担体(クロマトグラフ用ストリップ)に好ましく組み込んで用いることができる。吸収パッドは、クロマト移動した、添加された被検試料を物理的に吸収すると共に、クロマトグラフ担体の反応部位に捕捉されない標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロース濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された被検試料がクロマト移動して吸収パッドに届いてからのクロマト移動の速度は、吸収パッドの材質、大きさなどにより異なるので、その選定により被検物質の測定に合った速度を設定することができる。
本発明では、洗浄液は、特異的な結合反応以外で不溶性担体中に残存している(つまり非特異的に残存している)標識物質を洗浄する機能を有する液であれば特に制限はなく、洗浄効果を上げるためにそのpHを調整したり、界面活性剤成分やBSAなどのタンパク質などの高分子化合物を加えた洗浄液を用いてもよい。本発明においては、洗浄液として、以下に説明する銀イオンを還元し得る還元剤を含有する液を用いることが好ましい。その場合、使用される2種類の増幅液(後述する)のうちの一方の増幅液は、洗浄液としての役割をも担うことになる。
吸収用不溶性担体は、吸水することが可能な物質であれば特に制限はなく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法について説明する。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質の分析を実施することができる。まず、被検物質(抗原)に対して特異性を有する第一の結合物質(例えば、第1抗体)及び第二の結合物質(例えば、第2抗体)を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第一の結合物質で、予め標識物質を修飾しておく。第二の結合物質を、適当なクロマトグラフ用担体(不溶性担体)(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定して標識物質捕捉領域とし、被検物質(抗原)を含む可能性のある被検試料(又はその抽出液)と接触させると、その被検試料中に被検物質が存在する場合には、第二の結合物質との結合(例えば、第二抗体との抗原抗体反応)が起こる。被検物質と第二の結合物質との結合と同時又は結合後に、更に第一の結合物質で修飾した標識物質を過剰量接触させると、被検試料中に被検物質が存在する場合には、固定化された第二の結合物質と被検物質(抗原)と第一の結合物質で修飾した標識物質とからなる複合体が形成される。
本発明で使用する増幅液は、増幅試薬を含有する液である。増幅試薬は、標識物質や被検物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる試薬であり、試薬を含有する溶液の状態、即ち増幅液として使用することができる。例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。
以下、第1の増幅液に含まれる銀イオンを還元し得る還元剤と第2の増幅液に含まれる銀を含む化合物等について説明する。
銀を含む化合物としては、銀イオン含有化合物、例えば、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
銀イオンを還元し得る還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe2+を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤(例えば酸化防止剤または有機安定剤)、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、又はトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅液に最適なpHに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはC9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50Hである。
2種の増幅試薬をクロマトグラフ用キットに内蔵する方法としては、各増幅試薬を含む溶液を含むポットを、各増幅試薬を点着する部位の上部に配置する方法が挙げられる。還元剤溶液(第1の増幅液)を、還元剤溶液を送液するためのパッドの上部に置き、銀イオン溶液(第2の増幅液)を含むポットを銀イオン溶液充填孔のすぐ上部に設置することが好ましい。このように配置することにより、それぞれのポットを押すことで液が流れ、所定の部位に点着することができる。
本発明のクロマトグラフ方法は、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質と、被検物質と結合し得る第二の結合物質、又は被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質を含んだ不溶性担体とを具えたクロマトグラフ用キットを用いて実施することができる。その場合、クロマトグラフ用キットは、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質を予め不溶性担体上に具えているものでもよい。あるいは、被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質を不溶性担体とは別に具えているものでもよい。この場合、不溶性担体とは別に具えられた標識物質を被検試料と混合した後に不溶性担体上を展開するなどの方法で測定を行うことができる。本発明のクロマトグラフ用キットは、洗浄液、および増幅液を備えるものであり、好ましくは、銀を含む化合物と銀イオンを還元し得る還元剤とを含む増幅液を具えることができる。クロマトグラフ用キットを構成する各素材の例、好ましい範囲は、クロマトグラフ方法等で記載した例、範囲を好ましく用いることができる。
(a)被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質と、
(b)(i)被検物質と結合し得る第二の結合物質、または被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、(ii)分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールとを含む反応部位を備えた不溶性担体、
(c)洗浄液、及び
(d)増幅液を含むクロマトグラフ用キットが提供される。
被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した金属を含む標識物質は、標識物質保持パッドの上に配置されていてもよいし、標識物質保持パッドとは別に具えていてもよい。
(1−1)抗インフルエンザA型抗体修飾金コロイドの作成
(1−1−1)F(ab’)2断片化抗インフルエンザA型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザA型ウイルス抗体(品番7307、メディックスバイオケミカ社製)を使用し、ImmunoPureIgG1 Fab and F(ab')2 Preparation Kit(品番 44880、ピアース社製)を用いて、160μg/mLのF(ab’)2断片化抗インフルエンザA型ウイルス抗体溶液を作製した。
直径50nm金コロイド溶液(EM.GC50、BBInternational社製)9mLに50mM KH2PO4バッファー(pH7.5)1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、(1−1−1)で作製したF(ab’)2断片化抗インフルエンザA型ウイルス抗体溶液1mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1質量%ポリエチレングリコール(PEG 分子量20000、品番168−11285、和光純薬社製)水溶液を550μL加え攪拌し、続いて10質量%牛血清アルブミン(BSA FractionV、品番A−7906、SIGMA社製)水溶液を1.1mL加え攪拌した。この溶液を8000×g、4 ℃下、30分遠心(himacCF16RX、日立社製)した後、1mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20mLの金コロイド保存液(20mM Tris−HClバッファー(pH8.2)、0.05質量%PEG(分子量20000)、150mM NaCl、1質量%BSA)に分散し、再び8000×g、4℃、30分間遠心した後、1mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド(50nm)溶液を得た。
(1−2−1) F(ab’)2断片化抗インフルエンザB型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザB型ウイルス抗体(品番M2110171、Fitzgerald社製)を使用し、V8−プロテアーゼ(品番164−13982、和光純薬社製)を用いて、60μg/mLのF(ab’)2断片化抗インフルエンザB型抗体溶液を作製した。
直径50nm金コロイド溶液(EM.GC50、BBInternational社製)9mLに20mM Boraxバッファー(pH9.0)1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、(1−2−1)で作製したF(ab’)2断片化抗インフルエンザB型抗体溶液1mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1質量%ポリエチレングリコール(PEG 分子量20000、品番168−11285、和光純薬社製)水溶液を550μL加え攪拌し、続いて10質量%牛血清アルブミン(BSA FractionV、品番A−7906、SIGMA社製)水溶液を1.1mL加え攪拌した。この溶液を8000×g、4 ℃下、30分遠心(himacCF16RX、日立社製)した後、1mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20mLの金コロイド保存液(20mM Tris−HClバッファー(pH8.2), 0.05質量%PEG(分子量20000), 150mM NaCl、1質量%BSA)に分散し、再び8000×g、4℃下、30分間遠心した後、1mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド(50nm)溶液を得た。
(1−1−2)で作成した抗インフルエンザA型断片化抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液(20mM Tris−HClバッファー(pH8.2)、0.05質量%PEG(分子量20000)、 5質量%スクロース)及び水を用いて、520nmのAbsorbanceが1.5となるように希釈した。この溶液を、8mm×200mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製)1枚あたり1.1mLずつ均一に塗布し、12時間減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。金コロイド抗体を保持する部分が、標識物質保持領域に相当する。
(1−2−2)で作成した抗インフルエンザB型断片化抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液(20mMTris−HClバッファー(pH8.2)、0.05質量%PEG(分子量20000)、5質量%スクロース)及び水を用いて、520nmのAbsorbanceが1.5となるように希釈した。この溶液を、8mm×200mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製)1枚あたり1.1mLずつ均一に塗布し、12時間減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。金コロイド抗体を保持する部分が、標識物質保持領域に相当する。
(1−5−1)実施例1
25mm×200mmに切断したニトロセルロースメンブレン(プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社製)に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下側(手前側)にし、下側から7mmの位置に、1.5mg/mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社製)溶液に分子量2000のポリエチレングリコールを0.1質量%となるように混合した溶液をインクジェット方式の塗布機(BioDot社製)を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。このラインをテストラインと呼ぶ。同様に、下側から13mmの位置に、0.5mg/mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体(抗マウスIgG(H+L)、ウサギF(ab')2、 品番566−70621、和光純薬社製)溶液をライン状に塗布した。このラインをコントロールラインと呼ぶ。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液(0.5質量%カゼイン(乳由来、品番030−01505、和光純薬社製)含有50mMホウ酸バッファー(pH8.5))500mLをバットに入れ、その中に、乾燥したメンブレンを浸漬し、そのまま30分間静置した。その後、別のバットに入れた洗浄・安定化液(0.5質量%スクロースおよび0.05質量%コール酸ナトリウムを含む50mM Tris−HCl(pH7.5)バッファー)500mL中に、ブロッキング液中から取り出したメンブレンを浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で12時間乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
分子量2000のポリエチレングリコールに代えて、分子量6000のポリエチレングリコール(0.1質量%)を用いた以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−5−3) 実施例3
分子量2000のポリエチレングリコールに代えて、分子量8000のポリエチレングリコール(0.1質量%)を用いた以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
固定化用抗インフルエンザA型モノクローナル抗体を、分子量2000のポリエチレングリコールと混合することなく塗布する以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−5−5) 比較例2
分子量2000のポリエチレングリコールに代えて、分子量1000のポリエチレングリコール(0.1質量%)を用いた以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−5−6) 比較例3
分子量2000のポリエチレングリコールに代えて、分子量20000のポリエチレングリコール(0.1質量%)を用いた以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−5−7) 比較例4
分子量2000のポリエチレングリコールに代えて、分子量72500のポリビニルアルコール(PVA)(0.1質量%)を用いた以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−5−8) 比較例5
分子量2000のポリエチレングリコールに代えて、分子量66000のBSA(0.1質量%)を用いた以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−5−9) 比較例6
分子量2000のポリエチレングリコールに代えて、分子量40000のデキストラン(0.1質量%)を用いた以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−5−10) 比較例7
分子量2000のポリエチレングリコールに代えて、分子量5000のデキストラン硫酸(0.1質量%)を用いた以外は(1−5−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−6−1)実施例4
25mm×200mmに切断したニトロセルロースメンブレン(プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社製)に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下側(手前側)にし、下側から10mmの位置に、1.5mg/mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザB型モノクローナル抗体(Anti-Influenza B M2110171、Fitzgerald社製)溶液に分子量8000のポリエチレングリコールを0.17質量%となるように混合した溶液をインクジェット方式の塗布機(BioDot社製)を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。このラインをテストラインと呼ぶ。同様に、下側から13mmの位置に、0.5mg/mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体(抗マウスIgG(H+L)、ウサギF(ab')2、 品番566−70261、和光純薬社製)溶液をライン状に塗布した。このラインをコントロールラインと呼ぶ。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液(0.5質量%カゼイン(乳由来、品番030−01505、和光純薬社製)含有50mMホウ酸バッファー(pH8.5))500mLをバットに入れ、その中に、乾燥したメンブレンを浸漬し、そのまま30分間静置した。その後、別のバットに入れた洗浄・安定化液(0.5質量%スクロースおよび0.05質量%コール酸ナトリウムを含む50mM Tris−HCl(pH7.5)バッファー)500mL中に、ブロッキング液中から取り出したメンブレンを浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で12時間乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
固定化用抗インフルエンザB型モノクローナル抗体を、分子量8000のポリエチレングリコールと混合することなく塗布する以外は(1−6−1)と同じ方法で行った。
(1−6−3) 比較例9
分子量8000のポリエチレングリコールに代えて、分子量1000のポリエチレングリコール(0.17質量%)を用いた以外は(1−6−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−6−4) 比較例10
分子量8000のポリエチレングリコールに代えて、分子量20000のポリエチレングリコール(0.17質量%)を用いた以外は(1−6−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
(1−6−5) 比較例11
分子量8000のポリエチレングリコールに代えて、分子量66000の牛血清アルブミン(BSA、0.17質量%)を用いた以外は(1−6−1)と同じ方法で、抗体固定化メンブレンを作製した。
バック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社製)に、(1−5)あるいは(1−6)で作成した抗体固定化メンブレンをそれぞれ貼り付けた。このバック粘着シート付着抗体固定化メンブレンを、テストライン側が下側(手前側)となるようメンブレンを横長に設定し、抗体固定化メンブレンの下側に約2mm重なるように(1−3)及び(1−4)で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付けた。更に、金コロイド抗体保持パッド下側に約4mm重なるようにして試料添加パッド(18mm×200mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製))を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5mm重なるように吸収パッド(80mm×200mmに切ったセルロース・グラス膜(CF6、ワットマン社製))を重ねて貼り付けた。このように作製したクロマトグラフ用シートを、幅7mmずつに裁断し、クロマトグラフ用不溶性担体を作製した。
水290gに、硝酸鉄(III)九水和物(品番095−00995、和光純薬社製)を水に溶解して作製した1mol/Lの硝酸鉄水溶液23.6mL及びクエン酸(品番038−06925、和光純薬社製)13.1gを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸(10重量%)を36mL加え、さらに硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物(品番091−00855、和光純薬社製)を60.8g加えこれを洗浄液とした。なお、この洗浄液は、銀イオンの還元剤を含む液であり、増幅液の一部の役割をも担うものである。
水66gに、硝酸銀溶液8mL(10gの硝酸銀を含む)と1mol/Lの硝酸鉄水溶液24mLを加えた。さらに、この溶液と、硝酸(10重量%)5.9mL、ドデシルアミン(品番123−00246、和光純薬社製)0.1g、界面活性剤C12H25-C6H4-O-(CH2CH2O)50H 0.1gをあらかじめ47.6gの水に溶解した溶液とを混合し、これを増幅液とした。
図1に示す第1のデバイス部品(射出成形によるポリプロピレン製)11に、(1−7)で作製したクロマトグラフ用不溶性担体を装填した。次に、図2に示すように送液用不溶性担体2および吸収用不溶性担体3として、グラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製)を装填した。
(2−1−1)検体(被検試料)液の点着・展開
A型模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B-(ベクトン・ディッキンソン社製))又はB型模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA-B+(ベクトン・ディッキンソン社製))を、1質量%BSA−PBS(Phosphate Buffered Saline)で希釈し、(1−7)で作成したクロマトグラフ用不溶性担体の試料添加パットに、各抽出液で希釈した検体液を検体注入孔から140μL点着し、10分間静置して検体液を拡散、展開させた。
検体液を10分間展開した後、図1に示した第1のデバイス部品11の液体貯蔵ポッド13に(1−8)で作製した洗浄液200μLを入れた。第1のデバイス部品11を第2のデバイス部品12に向かい合わせて閉じた。こうして洗浄液をクロマトグラフ用不溶性担体に展開させ2分間送液した。この工程によりクロマトグラフ用不溶性担体が洗浄液に浸され、さらに特異的に吸着していない材料が洗浄された。
第2のデバイス部品12に設けられた点着孔15から(1−9)で作製した増幅液を滴下し、銀増幅反応を1分間行った。増幅後、クロマトグラフ用不溶性担体を取り出し、3分間水洗した。
水洗したクロマトグラフ用不溶性担体をLAS4000(富士フイルム社製)で撮影し、テストラインΔOD (テストラインの光学濃度(OD)−非テストライン部の光学濃度(OD))を算出した。抗原(被検物質)を含む場合のテストラインのΔODをシグナル(S)、抗原を含まない場合のテストラインのΔODをシグナル(N)と定義した。表1及び表2において、各実施例及び各比較例の欄の上段に抗原を含まない場合のテストラインのΔODであるシグナル(N)を示し、各実施例及び各比較例の欄の下段に抗原を含む場合のテストラインのΔODであるシグナル(S)を示した。また、表1及び表2においては、各実施例及び各比較例についてのS/N比を算出して記載した。
Claims (10)
- 被検物質と、該被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質との複合体を、不溶性担体上に展開する工程と、
前記不溶性担体上の反応部位において、前記被検物質と標識物質との複合体を捕捉する工程と、
洗浄液を用いて、前記不溶性担体上の反応部位を洗浄する工程と、
増幅液で、前記標識物質のシグナルを増幅した後に、前記反応部位において捕捉された前記被検物質を検出する工程と、
を含むクロマトグラフ方法であって、
前記不溶性担体上の反応部位が、
(i)前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、
(ii)分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールと、
を含む、クロマトグラフ方法。 - 前記ポリエチレングリコールの分子量が7000以上9000以下である、請求項1に記載のクロマトグラフ方法。
- 前記ポリエチレングリコールと、前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質とのモル比が、6.3〜150である、請求項1又は2に記載のクロマトグラフ方法。
- (i)前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、
(ii)前記ポリエチレングリコールと、
を含む混合液を前記不溶性担体上に塗布することによって、前記不溶性担体上の反応部位が設けられる、請求項1から3の何れか1項に記載のクロマトグラフ方法。 - 前記増幅液が、銀を含む化合物を含む、請求項1から4の何れか1項に記載のクロマトグラフ方法。
- 前記洗浄液が、銀イオンを還元し得る還元剤を含む、請求項1から5の何れか1項に記載のクロマトグラフ方法。
- 前記銀イオンを還元し得る還元剤が2価の鉄イオンを含む、請求項1から6の何れか1項に記載のクロマトグラフ方法。
- 前記標識物質が、金属コロイドである、請求項1から7の何れか1項に記載のクロマトグラフ方法。
- (a)被検物質と結合し得る第一の結合物質で修飾した標識物質、
(b)(i)前記被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、(ii)分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールとを含む反応部位を備えた不溶性担体、
(c)洗浄液、及び
(d)増幅液を含むクロマトグラフ用キット。 - (i)被検物質と結合し得る第二の結合物質、または前記被検物質と結合し得る第一の結合物質への結合性を有する物質と、
(ii)分子量1500以上10000以下のポリエチレングリコールと
を含む混合液を不溶性担体上に塗布する工程、
を含むクロマトグラフ用不溶性担体の製造方法。
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