KR20100109938A

KR20100109938A - 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자를 특이적으로 검출하기 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20100109938A
Application number: KR1020107016679A
Authority: KR
Inventors: 피터 투레켓; 위르겐 시에크만; 알프레드 웨버; 헐바트 그리트쉬; 카탈린 바라디; 수잔느 바이다
Original assignee: 백스터 인터내셔널 인코포레이티드; 박스터 헬쓰케어 에스.에이.
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2010-10-11
Also published as: CA2710518A1; US20090220993A1; EP2416157A2; EP2245456B1; KR20160012252A; AU2008345183A1; EP2416157A3; JP2011508884A; NZ586317A; EP2245456A2; AU2008345183B2; ES2515365T3; JP5806816B2; DK2245456T3; EP2416157B1; CA2710518C; US8557534B2; US9547016B2; US20170227557A1; WO2009086356A3

Abstract

본 발명은 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하는 방법, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 기타 조성물, 및 상기 항체 또는 조성물을 함유하는 키트에 관한다.

Description

생리학적으로 수용가능한 중합체 분자를 특이적으로 검출하기 위한 방법 및 조성물{METHOD AND COMPOSITIONS FOR SPECIFICALLY DETECTING PHYSIOLOGICALLY ACCEPTABLE POLYMER MOLECULES}

본 출원은 본원에 참고문헌으로 도입된 2007.12.27에 출원된 미국 가특허 출원 제61/009,327호에 기초하여 우선권을 주장한다.

본 발명은 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하는 방법, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 및 상기 항체를 함유하는 키트에 관한다.

단백질의 생체 내 기능은 이를 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합시킴으로서 개선된다. 특히, 생리학적 활성 단백질을 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합시키는 것은 이의 생체 내 반감기를 실질적으로 연장시키는 것으로 밝혀졌다. 예컨대, 미국 특허 제4,970,300호는 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 인자 VIII에의 접합이 인자 VIII 단백질로 하여금 트롬빈에 의해 활성 가능해지고, 포유동물의 혈류 내에서 실질적으로 감소된 항원성 및 면역반응성, 및 실질적으로 증가된 생체 내 소멸 시간을 가지게 한다고 설명한다.

미국 특허 제4,970,300호는 중합체 분자(덱스트란)의 인자 VIII(FVIII)에의 접합이 FVIII 단백질로 하여금 트롬빈에 의해 활성 가능해지고, 포유동물의 혈류 내에서 실질적으로 감소된 항원성 및 면역반응성, 및 실질적으로 증가된 생체 내 체류 시간을 가지게 한다고 설명한다. 국제 특허 출원 WO 94/15625는 인자 VIII을 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 접합시키는 것이 (i) 이의 생체 내 가수분해에 대한 저항성을 증가시키고 그럼으로써 그의 투여 후의 활성을 연장시킴으로써, (ii) 변형되지 않은 단백질보다 그의 생체 내 순환기(circulating life)를 상당히 증가시킴으로써, 그리고 (iii) 혈류 내로의 그의 흡수 시간을 증가시킴으로서 인자 VIII의 생체 내 기능을 개선시킨다고 설명한다. 미국 특허 제6,037,452호는 단백질이 폴리(알킬렌 옥사이드)에 단백질 내의 카르보닐-기를 통해서 공유적으로 결합되는 FVIII 및 인자 IX (FIX) 접합체를 설명한다. 추가적으로, 인자 IX을 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자, 구체적으로 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG")에 결합시킴으로써 이의 생체 내 기능을 개선시키는 것은 국제 특허 공보 WO 94/29370에 설명되었다. 특이적 활성을 보유하는 페길화된(PEGylated) FVIII이 국제 특허 출원 WO/2007/126808에 개시된다. 생리학적으로 수용가능한 중합체의 활성제, 예컨대 단백질에 대한 접합이 안정한 중합체-단백질 접합체 또는 생리학적으로 수용가능한 중합체가 분리가능한 공유 결합(프로-드럭(pro-drug) 개념), 즉, 가수분해성 또는 분리가능한 연결자(linker)를 통해 단백질에 부착되는 중합체-단백질 접합체를 제조함으로써 수행된다. 예컨대, 분리가능한 PEG 부분이 2 개의 PEG 쇄를 함유하는 9-플로우렌메톡시카르보닐 (FMOC) 접합 시스템을 사용하여 개발되었다(넥타 인크.(Nektar Inc.), 알라바마주, 헌츠빌). 추가적으로, 단백질의 리신 잔기의 화학적 변형에 유용한 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS)기가 메톡시카르보닐기를 통해 플루오렌 환 시스템에 연결되어서 분리가능한 PEG 부분을 생성할 수 있다. 국제 특허 공보 WO 2008/082669 (본원에 참고문헌으로 도입)이 분리가능한 PEG 개념상에 기초한 일련의 페길화된 재조합 FVIII 변형물들을 설명한다.

그러나, 현재는 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 함량 추정치만을 제공하는 비감성 비색(insensitive colorimetric) 방법(문헌[Nag et al. 1997, Anal Biochem 250:35-43])을 제외하고, 단백질 또는 나노입자에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 정량 측정을 위한 신뢰가능한 방법이 없다. 게다가, PEG 농도의 결정을 위한 단일클론 항체가 개시되었으나(미국 특허 제6,617,118호), 현재까지는 단백질에 결합한 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하는 신뢰가능한 시스템이 존재하지 않는다.

따라서, 단백질에, 구체적으로 생리학적 활성 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자, 특히 PEG의 양을 결정하는 새로운 시스템에 대한 필요가 존재한다.

본 발명은 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하는 방법에 관한다. 추가적으로, 예컨대, 중합체 분자가 단백질에 결합한 채로 존재하는, 생리학적으로 수용가능한 상기 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 본 발명에 따라 제공된다. 추가적으로, 본 발명은 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하기 위한 상기 항체의 용도에 관한다.

일 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합된 하나 이상의 단백질을 제공하는 단계; (b) 상기 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 제공하는 단계; (c) 상기 항체를 상기 단백질에 결합된 하나 이상의 중합체 분자에 결합시키기에 적합한 조건 하에서 (b)단계의 항체를 (a)단계의 단백질과 접촉시키는 단계; 및 (d) 항체와 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하는 방법을 제공한다.

일 실시태양에서, 단계(a)에서 하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합된 단백질은 기질 또는 운반자 매트릭스 위에 고정된다.

추가적인 실시태양에서, 항체는 다중클론성 항체 및 단일클론성 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시태양에서, 단백질은 폰 빌레브란트 인자(VWF) 또는 그의 유도체이다. 추가적인 실시태양에서, 단백질은 인자 VIII 또는 그의 유도체이다.

일부 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레피닉 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파스파젠, 폴리옥사졸린 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 관련 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 또는 그의 유도체이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 고려한다. 일 실시태양에서, 항체는 다중클론성 항체이다.

관련 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자는 단백질에 결합된다. 추가적인 실시태양에서, 단백질은 폰 빌레브란트 인자(VWF) 또는 그의 유도체이다. 또다른 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레피닉 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(□-히드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파스파젠, 폴리옥사졸린 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 관련 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 또는 그의 유도체이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 본원에 설명된 항체를 포함하는, 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하기 위한 키트를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 단백질에 결합된 하나 이상의 중합체를 가지는 중합체:단백질 접합체와 (ii) 상기 중합체:단백질 접합체에 결합된 경우 검출가능한, 상기 중합체에 특이적으로 결합하는 항체 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함하고, 중합체:단백질 접합체 내의 중합체의 수가 공지된 대조군과 비교하는 경우 중합체:단백질 접합체에 결합된 검출되는 항체의 수준에 연관되는, 단백질 또는 중합체-단백질 접합체 내의 단백질 복합체에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 수를 결정하는 방법을 제공한다.

일 실시태양에서, 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 관련 실시태양에서, 검출가능한 표지는 효소, 방사성 표지, 형광단, 전자 밀집 시약, 비오틴, 디곡시제닌, 헵탄 및 이들 임의의 표지의 추가에 의해 검출가능하도록 된 단백질로 구성되는 군으로부터 선택된다.

추가적인 실시태양에서, 중합체:단백질 접합체는 항체와 결합하기에 앞서 운반자 매트릭스에 결합된다. 특정 실시태양에서, 운반자 매트릭스는 마이크로운반자, 입자, 막, 스트립, 종이, 필름, 비드 또는 플레이트로 구성되는 군으로부터 선택된다. 관련 실시태양에서, 중합체:단백질 접합체는 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용해서 단리되고 검출에 앞서 막으로 이송된다. 추가적인 실시태양에서, 중합체-단백질 복합체의 분자량은 중합체 분자를 포함하는 단백질 서브유닛에 연관된다.

또 다른 실시태양에서, 검출된 항체의 수준은 검출가능한 표지의 흡광도로 측정된다. 관련 실시태양에서, 중합체:단백질 접합체 내의 중합체의 수는 공지된 대조군에 비교한 단백질-중합체 접합체의 분자량에 기초하여 계산된다. 공지된 대조군의 중합체 분자를 측정하는 예시적인 방법은 크기 배재 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량 분광법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시태양에서, 단백질 또는 단백질 복합체는 혈액 응고 인자 또는 혈액 응고 인자 복합체이다. 관련 실시태양에서, 혈액 응고 인자 또는 혈액 응고 인자 복합체는 인간이다. 또한 추가적인 실시태양에서, 혈액 응고 인자는 인자 II, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX , 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자, 단백질 C, 안티트롬빈 III 및 이의 활성화 형태로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 혈액 응고 인자 복합체는 인자VIII:VWF이다.

특정 실시태양에서, 중합체는 분리가능하다. 관련 실시태양에서, 중합체는 가수분해성이다. 일 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 분자는 연결자를 통해 단백질 또는 단백질 복합체에 부착된다.

일 실시태양에서, 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레피닉 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(히드록시 산), 예컨대, 폴리(α-히드록시 산) 및 폴리(β-히드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파스파젠, 폴리옥사졸린 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

관련 실시태양에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 그의 유도체이다. 또 다른 실시태양에서, PEG는 약 3 내지 약 200 kDa이다. 추가적인 실시태양에서, PEG는 약 5 kDa 내지 약 60 kDa 범위의 분자량을 가진다. 또 다른 실시태양에서, PEG는 약 5 kDa 내지 약 40 kDa 범위의 분자량을 가진다. 또 다른 실시태양에서, PEG는 약 5 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 가진다. 그리고 또 추가적인 실시태양에서, PEG는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위의 분자량을 가진다. 본원에 사용하기 위한 추가적인 PEG 조성물들로 고려되는 것들에는 약 5 내지 약 150 kDa, 약 5 내지 약 120 kDa, 약 10 내지 약 100 kDa, 약 20 내지 약 50 kDa 범위, 약 5 내지 약 25 kDa 범위의 PEG와 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa인, 약 35 kDa, 약 40 kDa, 약 45 kDa, 약 50 kDa, 약 55 kDa, 약 60 kDa, 약 65 kDa, 약 70 kDa, 약 75 kDa, 약 80 kDa, 약 85 kDa, 약 90 kDa, 약 95 kDa, 약 100 kDa, 약 110 kDa, 약 120 kDa, 약 130 kDa, 약 140 kDa, 약 150 kDa, 약 160 kDa, 약 170 kDa, 약 180 kDa, 약 190 kDa, 또는 약 200 kDa의 분자량을 가지는 PEG를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 중합체를 상기 중합체에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 항체가 상기 중합체에 결합된 경우 검출가능하며, 여기에서 항체에 의해 결합된 중합체의 수가 공지된 대조군과 비교하는 경우 결합된 검출된 항체의 수준과 연관되는, 단백질 또는 단백질 복합체에 결합된 또는 용액 내에서 자유로운 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 수를 결정하는 방법을 제공한다.

관련 측면에서, 본 발명은 단백질 또는 단백질 복합체를 상기 단백질 또는 단백질 복합체와 특이적으로 결합하는 항체와 접촉하는 것을 포함하고, 상기 항체가 상기 단백질 또는 단백질 복합체와 결합된 경우 검출가능하고, 여기에서 항체에 의해 결합된 중합체의 수는 공지된 대조군과 비교하는 경우 결합된 검출된 항체의 수준에 연관되는, 상기 단백질 또는 단백질 복합체에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 수를 결정하는 방법을 고려한다.

관련 실시태양에서, 본 발명의 방법은 ELISA 기술을 사용하여 수행된다. ELISA 시약이 하기와 같이 사용되고, 여기에서 나열된 첫번째 항체가 기질에 결합된 항체이고 항체 내에 결합된 두번째 항체가 검출가능한 것이 고려된다. 단백질 또는 단백질 복합체에 결합된 중합체의 수를 검출하는 유용한 예시적인 분석법은 안티-중합체-안티-단백질 검출 방법, 안티-단백질-안티-중합체 검출 방법, 또는 안티-중합체-안티-중합체 검출 방법을 포함하며, 여기에서 안티-중합체 항체는 각각의 결합 단계에 대해 동일한 항체이거나, 각각의 단계에 대해 상이한 중합체-특이적 항체이다. 관련 실시태양에서, 분석법은 안티-중합체 특이적 항체 또는 안티-단백질-특이적 항체만을 사용하여 수행된다.

도 1은 항원 HSAP-2-SS (페길화된 인간 혈청 알부민(hSA)) 상의 직접적인 효소 연결 면역흡수 분석(ELISA)을 나타낸다. 토끼에 약 380 ㎍/ml 단백질 및 PEG 농도 250 ㎍/ml를 가지는 항원 HSAP-2-h-SS 제제를 접종하였다. 모든 동물들의 혈청 샘플들을 시작 전과 3 및 4 주 후에 취하고 후속적으로 항원 HSAP-2-h-SS에 대항한 검출 가능한 항체 형성을 시험하였다. 항원 HSAP-2-h-SS이 표면 위에 pH 9.6에서 1 ㎍/ml에서 0.1 M 카보네이트로 코팅되었다. 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액에서 희석하고 단일 배양 다층 면역 기술(SlMIT:Single Incubation Multilayer Immune Technique)을 사용하여 웰들 및 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다. 광학 밀도(OD) (수직 축)이 각각의 샘플들의 로그 희석(log dilution)(수평 축)에 대해 나타났다. Δ, SPF (정상 토끼 혈청); ◇, 풀 0(4 동물 이전); □, 풀 3 주(4 동물); ●, 풀 4 주(4 동물)
도 2는 PEG에 의한 항원 HSAP-2-SS 상의 직접적인 ELISA의 억제를 나타낸다. 토끼들을 항원 HSAP-2-SS에 대해 면역화시키고 혈청 샘플을 도 1에 설명된 바와 같이 제조하였다. 항원 HSAP-2-h-SS의 표면 위를 pH 9.6에서 1 ㎍/ml에서 0.1 M 카보네이트로 코팅하였다. 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액 또는 PBS-겔라틴-1 % PEG 5000 완충액(+1 % PEG)에서 희석하고 웰들 및 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다(SlMIT). 광학 밀도(OD) (수직 축)이 각각의 샘플의 로그 희석(수평 축)에 대해 나타났다. □, 3 주 + 1 %PEG; ■, 3 주; ○, 4 주 + 1 %PEG; ●, 4 주.
도 3은 PEG-변형 플레이트 상의 직접적인 ELISA를 나타낸다. 토끼들을 항원 HSAP-2-SS에 대해 면역화시키고 혈청 샘플을 도 1에 설명된 바와 같이 제조하였다. 기질 (넌크 막시솔프(NUNC Maxisorp) F96)을 15 mM HEPES 내에서 mPEG-NPC 5000으로 1 mg/ml으로 실온에서 2 시간 코팅한 다음 PBS-겔라틴(5 mg/ml)으로 차단하였다. 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액으로 희석하고 웰들 및 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다(SlMIT). 광학 밀도(OD) (수직 축)이 각각의 샘플의 로그 희석(수평 축)에 대해 나타났다. ●, 풀 3 주; □, 풀 SPF(정상 토끼 혈청).
도 4는 VWF 및 PEG-VWF 상의 직접적인 ELISA를 나타낸다. 토끼들을 항원 HSAP-2-SS에 대해 면역화시키고 혈청 샘플을 도 1에 설명된 바와 같이 제조하였다. 기질을 pH 9.6에서 0.1 M 카보네이트 내에서 페길화된 VWF(PEG-VWF)으로 코팅하고, 또 다른 기질을 재조합 VWF(rVWF-12)로 0.1 M 카르보네이트 내에서 pH 9.6에서 코팅하였다. 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액으로 희석하고 웰들 및 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다(SlMIT). 광학 밀도(OD) (수직 축)이 각각의 샘플의 로그 희석(수평 축)에 대해 나타났다. ●, 풀 3 주(코팅: PEG-VWF); □, 풀 3 주(코팅: rVWF-12).
도 5는 VWF-페길화의 검출을 위한 ELISA를 나타낸다. 기질(넌크 막시솔프 F96)을 항-VWF 항체로 코팅하고 감소되는 양의 페길화된 VWF로 배양하고 항-PEG 퍼옥시다아제 접합체로 배양하였다. 결합된 퍼옥시다아제를 슈어블루(SureBlue)와의 색반응으로 검출하였고, 신호 강도는 희석액 내의 페길화된 VWF의 농도와 연관되었다. 광학 밀도(OD) (수직 축)이 각각의 샘플의 로그 mU 항-VWF 항체/ml 희석액 (수평 축)에 대해 나타났다. ■, wP-005-l-SS a (A); Δ, wP-005-l-SS e (E); ◇, wP-005-l-SS f (F); ○, wP-005-l-SS g (G). 샘플 A는 변형 전의 원래의 vVWF를 나타내며, 제제 E, F 및 G는 페길화 시약 PEG-SS-5K를 몰농도 1 mM, 2.5 mM 및 7.5 mM로 사용하여 준비하였다.
도 6은 자유 PEG 5000이 배지로 첨가된 경우의 rVWF-PEG 검출의 억제를 나타낸다.
도 7은 PEG-PEG ELlSA의 용량-반응 곡선을 나타낸다.
도 8은 PEG-PEG ELlSA의 특이성을 도시한다.
도 9는 안정한 페길화된 rVWF에 나타난 것과 같이, PEG-단백질 ELISA를 사용한 PEG 단백질의 강력한 검출을 나타낸다.
도 10은 분리가능한 페길화된 rVWF에 나타난 것과 같이, PEG-단백질 ELISA를 사용한 페길화된 단백질의 강력한 검출을 도시한다.
도 11은 페길화된 rVWF에 나타난 것과 같이, 단백질-결합 PEG에 대한 PEG-단백질 ELISA의 특이성을 도시한다.
도 12는 PEG-rFVIII ELISA의 특이성을 나타낸다.
도 13은 PEG-FVIII ELISA 분석 내의 상이한 항-FVIII 퍼옥시다아제 접합체의 검출의 비교이다.
도 14는 FVIII-결핍 생쥐의 혈장 및 쥐 혈장 내의 PEG-rFVIII ELISA의 검출을 나타낸다.
도 15는 상이한 페길화도를 갖는 페길화된 rFVIII 제제의 검출에서의 ELISA 분석의 비교이다.
도 16은 PEG-rFVIII ELISA에 미치는 자유 PEG의 영향을 나타낸다.
도 17은 분리가능한 페길화된 rFVIII 제제로부터의 PEG 분리를 측정하는 PEG-rFVIII ELISA 분석의 능력을 도시하고 ELISA가 페길화가 상이한 페길화도를 갖는 FVIII 분자를 분별해낼 수 있음을 입증한다.
도 18은 페길화된 단백질이 모든 적용된 농도에서 민감성 ECL 방법을 사용하여 검출가능하였음을 보인다.
도 19는 완충액(도 2a) 또는 인간 혈장(도 2b) 내에서 희석된 페길화된 단백질의 검출 수준의 비교이다.
도 20은 시간에 따른 페길화된 rFVIIa의 페길화도의 변화를 검출하는 방법을 도시한다.
도 21은 본 방법이 페길화도(도 4a, PD=3.7, 도 4b, PD=6)을 분별할 수 있음을 보이며, 여기에서 더 높은 페길화도는 더 강한 신호를 야기한다.

본 발명은 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하는 방법에 관한다.

다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 하기의 참고문헌들은 본 발명에서 사용되는 많은 용어들의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: 문헌[Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag(1991); and Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].

본원에 인용된 각각의 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌들은 본 개시내용과 일치되지 않는 범위까지 그 전체로서 본원에 참고문헌으로 도입되었다.

여기에서 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 것과 같이, 단수형 "하나의" "하나" 및 "그"는 문맥에서 명백히 다르게 지시하지 않는 한, 복수의 것을 포함한다는 것을 주목해야 한다.

본원에서 사용되는 경우, 하기의 용어들은 다르게 명시되지 않는 한 그들에게 속하는 의미를 가진다.

본원에서 사용된 용어 "샘플"은 하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합된 하나 이상의 단백질을 함유하는 임의의 샘플, 예컨대, 제약학적 생성물을 제조하는 과정으로부터 유래된 임의의 유체 또는 용액을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "단백질"은 재조합 단백질, 단백질 복합체 및 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드를 포함하는 임의의 단백질, 단백질 복합체 또는 폴리펩티드를 의미한다. 단백질은 생체 내로부터의 단백질의 단리에 의해, 합성 방법에 의해 획득될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 기술을 통해 획득될 수 있다. 합성 폴리펩티드는 예컨대, 자동화된 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성된다. 본 발명에 따라 사용되는 재조합 단백질은 하기 본원에 기술하는 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 방법으로 생산될 수 있다. 일 실시태양에서, 단백질은 치료 단백질 또는 그의 생물학적 활성 유도체를 포함하는 생리학적 활성 단백질이다. 용어 "생물학적 활성 유도체"는 실질적으로 모체 단백질과 동일한 기능적 및/또는 생물학적 성질을 가지는 단백질의 변형물을 의미한다. 용어 "단백질"은 통상적으로 거대한 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "펩티드"는 통상적으로 짧은 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 사용되는 경우, 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 상호교환가능하게 사용된다. "단백질 복합체"는 하나 이상의 다른 단백질에 결합된 하나 이상의 단백질을 포함하는 분자를 의미한다. 단백질 복합체의 예들로는 보조인자 또는 샤페론 단백질에 결합된 단백질, 리간드-수용체 복합체 및 다중서브유닛 단백질, 예컨대, 인테그린 및 다중 단백질 서브유닛을 포함하는 기타 세포 표면 수용체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 경우, 폴리펩티드의 "단편"은 완전한 길이의 폴리펩티드 또는 단백질 발현 생성물보다 작은 폴리펩티드의 임의의 일부를 지칭한다. 단편들은 통상적으로 완전한-길이의 폴리펩티드의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기들이 제거된, 완전한-길이의 폴리펩티드의 결손 유사체(deletion analog)이다. 따라서, "단편"은 하기에 설명되는 결손 유사체들의 부분 집합이다.

본원에서 사용되는 경우, "유사체" 또는 "유도체"(이들은 상호교환적으로 사용될 수 있다)는 자연-발생 분자와 비록 특정 경우에서 다른 정도일지라도, 실질적으로 구조면에서 유사하고 동일한 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 그 유사체들이 유래된 자연-발생 폴리펩티드에 비교하여 그들의 아미노산 서열의 조성에서 상이한 유사체들은, (i) 폴리펩티드의 하나 이상의 말단들에서의 및/또는 자연-발생 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 내부 영역에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결손, (ii) 폴리펩티드의 하나 이상의 말단(통상적으로, "첨가" 유사체)에서의 및/또는 자연-발생 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 내부 영역(통상적으로, "삽입" 유사체)에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 첨가 또는 (iii) 자연-발생 폴리펩티드 서열에서의 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환에 연관된 하나 이상의 돌연변이에 기초한다. 치환은 대체되는 아미노산 및 이를 대체하는 아미노산의 물리-화학적 또는 기능적 관련성에 기초하여 보존적일 수 있거나 비-보존적일 수 있다.

일 측면에서, 유사체는 주어진 화합물, 예컨대, 펩티드에 대해 약 70 % 서열 유사성, 그러나 100 % 미만의 서열 유사성을 나타낸다. 이러한 유사체 또는 유도체들은 일 측면에서, 예시적인 방법이며 제한하지 않는 측면으로 호모알지닌, 오르니틴, 페니실아민 및 노르발린과 자연 발생 아미노산 잔기를 포함하는 비-자연 발생적 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 유사체 또는 유도체들은 다른 측면에서, 하나 또는 복수의 D-아미노산 잔기를 포함하거나, 둘 이상의 아미노산 잔기 사이의 비-펩티드 상호 연결을 함유한다. 본원에서 사용되는 용어 "로부터 유래된"은 와일드-타입 또는 자연-발생 폴리펩티드 또는 펩티드 서열의 변형물(아미노산 치환 및 결손 포함)이고, 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결손을 가져서, 유도체 서열이 와일드-타입 또는 자연-발생 서열과 약 70 %, 그러나 100 % 미만의 서열 유사성을 공유하는 폴리펩티드 또는 펩티드 서열을 지칭한다. 일 실시태양에서, 유도체는 폴리펩티드의 단편일 수 있으며, 여기에서 단편은 와일드-타입 폴리펩티드의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 실질적으로 상동성(즉, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상 또는 95 % 이상 상동성)이다.

서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 기준 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열이 컴퓨터로 넣는 입력값이고, 필요한 경우 후속 코오디네이트(subsequence coordinates)가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 변수들이 지정된다. 그 후 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 변수들에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

특정 실시태양에서, 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘(local homology algorithm)에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 조사의 방법에 의해, 이들 알고리즘들의 컴퓨터화된 실행(위스콘신주, 메디손, 사이언스 드라이브 575, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA) 또는 시각적 조사에 의해서 비교를 위한 서열의 최적화된 정렬이 수행된다. 유용한 알고리즘의 하나의 예는 문헌[Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)]의 점진적 정렬 방법의 단순화를 사용하며, 문헌[Higgins & Sharp, CABlOS 5:151-153 (1989)]에 기술된 방법에 유사한 파일업(PILEUP)이다. 서열의 다중 정렬을 생성하는 다른 유용한 알고리즘은 클러스탈 더블유(Clustal W)(문헌[Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994)])이다. 서열 동일성 및 서열 유사성의 퍼센트를 결정하는데 적합한 알고리즘의 예는 블라스트(BLAST) 알고리즘(문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989); Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)])이다. 블라스트 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 바이오테크놀로지 정보 국립 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해서 공개적으로 입수가능하다.

치환은 대체되는 아미노산 및 이를 대체하는 아미노산의 물리-화학적 또는 기능적 관련성에 기초하여 보존적이거나 비-보존적이다. 이러한 타입의 치환은 당업계에 잘 공지되어 있다. 다르게는, 본 발명은 또한 비-보존적인 치환들을 아우른다. 예시적인 보존적 치환은 레닌걸(Lehninger)의 문헌[Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77]에 기술되어 있으며 하기에 제시된다.

다르게는, 예시적인 보존적 치환들이 바로 아래에 제시된다.

본원에서 사용되는 경우 "변형물"은 개질되어서 일반적으로는 분자의 부분이 아닌 추가적인 화학적 부분을 포함하는 단백질 또는 그의 유사체를 지칭한다. 이러한 부분들은 분자의 가용성, 흡수, 생물학적 반감기 등의 각종 측면들을 개선시킬 수 있다. 이 부분들은 다르게는 분자의 독성을 감소시키고 분자의 어떠한 적절하지 않은 부작용 등을 제거하거나 감쇠한다. 이러한 효과를 이뤄내는 것이 가능한 부분들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)]에 개시된다. 이러한 부분들을 분자에 커플링하는 과정은 당업계에 공지되어 있다. 특정 측면에서, 제한없이, 변형물은 당화, 페길화 또는 폴리시알화에 의해 개질된 폴리펩티드이다.

본원에서 사용되는 경우, 단백질 또는 폴리펩티드에 적용되는 "자연-발생"은 자연에서 발견되는 단백질을 의미한다. 예컨대, 자연 내의 공급원으로부터 단리되고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 개질되지 않은, 유기물(바이러스 포함) 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연-발생하는 것이다. 용어 "자연-발생" 및 "와일드-타입"은 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 경우, 단백질 또는 폴리펩티드에 적용되는 "혈장-유래"는 대상물의 혈청 또는 혈액 혈장 내에서 발견되는 자연-발생 폴리펩티드 또는 그의 단편을 의미한다.

본원에서 사용되는 "생리학적으로 수용가능한 중합체 분자"는 수용액에 실질적으로 가용성이거나 현탁액의 형태로 존재할 수 있고 치료학적으로 유효한 양으로 중합체-단백질-접합체의 투여 시에 포유동물에 실질적으로 부정적인 영향을 갖지 않고, 생체적합성으로 여겨지는 중합체 분자를 지칭한다. 일 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 분자는 2 내지 약 1000 개, 또는 약 2 내지 약 300 개의 반복 단위를 포함한다. 생리학적으로 수용가능한 중합체의 예는, 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레피닉 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체, 폴리(말레산), 폴리(DL-알라닌), 폴리사카라이드, 예컨대, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 히알루론산 및 키틴, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

생리학적으로 허용가능한 중합체 분자는 특정한 구조에 제한되지 않으며, 특정 측면에서 선형 (예, 알콕시 PEG 또는 이관능성 PEG), 분지형 또는 다중-팔 (예, 갈래진 형태의 PEG 또는 폴리올 중심에 부착된 PEG), 수지상, 또는 분해가능한 연결이다. 또한, 중합체 분자의 내부 구조는 또 다른 측면에서, 임의의 수의 상이한 패턴으로 구성되고, 단독중합체, 교대 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교대 삼원공중합체, 랜덤 삼원공중합체 및 블록 삼원공중합체로 제한없이 구성된 군에서 선택된다.

용어 "연결자"는 생리학적으로 수용가능한 중합체를 생물학적 활성 분자에 연결하는 분자 단편을 지칭한다. 단편은 통상적으로 커플링될 수 있거나 활성화될 수 있어서 생물학적으로 활성인 친핵체와 직접적으로 또는 다른 연결자와 반응할 수 있는 두 개의 관능기를 가진다. 예컨대, 리신과 같은 ω-아미노알카논 산이 통상적으로 사용된다. 본 발명에서, 연결자에는 안정한, 분리가능한 그리고 가수분해성 연결자가 포함된다.

본원에서 사용된 표현 "하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합한 단백질"은 하나 이상의 중합체 분자에 공유 결합 또는 비-공유적으로, 예컨대 이온성, 소수성, 친화성, 생체친화성 상호작용과 같은 상호작용으로 결합된 단백질을 포함한다. 각종 실시태양에서, 중합체 분자는 이관능성 시약의 사용에 의해, 그리고 스페이서 팔(spacer arm)을 통해 단백질에 커플링된다. 또한, 중합체 분자는 친화성 상호작용에 의해 단백질에 커플링된다. 예를 들어, 특정 실시태양에서 단백질은 비오티닐화되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 접합 중합체 분자가 단백질에 결합될 수 있다. 또한, 다중클론성 또는 단일클론성 항체 뿐만 아니라 그의 단편이 중합체 분자에 결합되고, 그 후 이러한 복합체가 단백질에 결합될 수 있다. 중합체 분자는 또한 효소적 방법, 예를 들어, 이를테면 폴리글리코실트랜스퍼라아제에 의한 사카라이드의 전달(US 6,379,933호), 또는 글리코페길화(US 2004 0132640)에 의하여 단백질에 결합된다. 다른 접근법은 예컨대, PEG화 콜라겐 또는 콜라겐 단편을 VWF 단백질의 A1 및 A3 도메인에 결합하는 것과 같은 그들의 생물학적 기능을 기초로 하여 단백질에 중합체 분자를 결합시키는 것이다. 이러한 목적을 위하여, 일부 실시태양에서 VWF와의 강력한 상호작용을 나타내는, 예를 들어 인간 태반으로부터의 타입 I 및 III으로부터의 콜라겐이 사용된다. 특정 실시태양에서, 중합체 분자의 결합은 단백질의 생체 내 적용 후에 생리학적 조건 하에서 비가역적이거나 가역적이다.

본원에서 사용되는 용어 "페길화된(PEGylated)"은 하나 이상의 PEG 부분에 결합된 단백질, 단백질 복합체 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "페길화"는 하나 이상의 PEG를 단백질에 결합하는 공정을 지칭한다. 일 실시태양에서 상기 PEG의 분자량은 3 내지 200 kDa, 5 내지 120 kDa, 10 내지 100 kDa, 20 내지 50 kDa, 5 내지 60 kDa, 5 내지 40 kDa, 5 내지 25 kDa, 5 내지 15 kDa, 또는 5 내지 10 kDa 범위 내에 있다.

생리학적으로 수용가능한 중합체에 용어 "특이적으로 결합" 또는 "특이적인"은 생리학적으로 수용가능한 중합체를 인식하고 결합하나 다른 화합물(또는 기타 항원)에는 그렇지 않은 결합제의 능력을 지칭한다. 예컨대, 동족 항원에 "특이적인" 항체는 항체의 변형가능한 영역이 당해 화합물을 검출가능한 선호성(즉, 항체가 폴리펩티드에 특이적이라면, 국소적인 서열 동일성 또는 상동성의 존재의 가능성 또는 화합물 간의 유사성에 불구하고, 결합 친화력의 면에서 측정가능한 차이를 가지고, 유사한 구조 또는 조성물의 기타 공지된 화합물로부터 당해 화합물을 분별해내는 능력)을 가지고 인식하고 결합하는 것을 나타낸다. 특이적 항체가 다른 단백질(예컨대, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 단백질 A 또는 ELISA 기술 내의 기타 항체)과도 항체의 변형가능한 영역의 서열의 외부 및 특히, 분자의 일정한 영역과의 상호작용을 통해서 또한 상호작용을 할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체의 결합 특이성을 결정하기 위한 스크리닝 분석법은 잘 공지되고 일상적으로 당 업계에서 사용된다. 이러한 분석법의 종합적인 논의를 위해, 문헌[Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6]을 참고하라. 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산될 수 있다.

"검출가능한 표지" 또는 "검출가능한 부분"은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 기타 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예컨대, 본 발명에서 사용하기에 적합한 표지로는 예컨대, 방사성 표지(예, ³²P), 형광단(예, 플루오레세인), 전자 밀집 시약, 효소(예, ELISA에서 통상적으로 사용되는 것), 비오틴, 디곡시제닌 또는 합텐 및 예컨대, 방사성 표지를 합텐 또는 펩티드에 혼입시킴으로서 검출가능하게 만들어지거나 또는 합텐 또는 펩티드와 특이적으로 반응성인 항체를 검출하는데 사용되는 단백질을 포함한다.

용어 "기질" 또는 "운반자 매트릭스"는 임의의 구체적 제한을 의미하지 않으며, 예컨대, 폴리아미드와 같은 유기 중합체 또는 비닐 중합체(예, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리스티렌 및 폴리비닐 알콜 또는 그의 유도체)일 수 있는 불용성 중합체 물질, 천연 중합체, 예컨대, 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로스, 키틴 및 폴리아미노산 또는 무기 중합체, 예컨대, 유리 또는 메탈로히드록사이드를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 기질은 마이크로운반자, 입자, 막, 스트립, 종이, 필름, 펄, 비드, 또는 플레이트, 예컨대, 마이크로타이터 플레이트의 형태이다. 일 측면에서, 하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합된 단백질은 공유 커플링에 의해 또는 연결자 분자와 같은 운반자 또는 기질 상에 고정된 항체를 통해 직접적으로 기질 상에 고정된다.

"치료학적 조성물"은 인간 및 포유동물을 포함하는 대상 동물에 사용하기 위한 치료학적 용도에 적합한 조성물을 지칭한다. 치료학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양의 중합체-폴리펩티드 접합체를 포함하고 또한 치료학적으로 수용가능한 운반자를 포함한다. 치료학적 조성물은 운반자를 이루는 활성 성분(들) 및 불활성 성분(들)을 포함하는 조성물과 직접적으로 또는 간접적으로, 둘 이상의 성분들의 조합에서, 복합에서 또는 응집에서, 또는 하나 이상의 성분의 분열로부터, 또는 하나 이상의 성분의 상호작용 또는 다른 타입의 반응으로부터 생성되는 임의의 생성물을 아우른다. 따라서, 본 발명의 치료학적 조성물은 본 발명의 화합물 또는 접합체를 혼합함으로써 만들어지는 임의의 조성물 및 치료학적으로 수용가능한 운반자를 아우른다.

"치료학적으로 수용가능한 운반자"는 임의의 표준 치료학적 운반자, 완충제, 및 첨가제, 예컨대, 포스파이트 완충된 식염 용액, 덱스트로즈의 5 % 수용액 및 에멀젼, 예컨대, 기름/물 또는 물/기름 에멀젼 및 각종 타입의 습윤제 및/또는 보조제를 지칭한다. 적합한 치료학적 운반자 및 제형들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)]에 설명된다. 바람직한 치료학적 운반자는 활성제 투여의 의도되는 모드에 따라 결정된다. 투여의 통상적인 모드에는 장을 통하는(예, 입) 또는 장관외를 통하는(예, 피하의, 근육 내의, 정맥의 또는 복강 내로의 주입; 또는 국부의, 경피성의 또는 경점막 투여) 것이 포함된다. "치료학적으로 수용가능한 염"은 치료학적 용도의 화합물 또는 접합체로 제형화된 염이며, 예컨대, 금속 염(나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함한다.

"치료학적으로 수용가능한"은 생물학적으로 또는 다르게 적절하지 않은 것이 아닌 물질을 지칭한다. 즉, 물질은 개개인에게 어떠한 적절하지 않는 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 또는 이것이 함유되는 조성물의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 투여될 수 있다.

본 발명의 일 측면은

(a) 하나 이상의 생리학적 수용가능한 중합체 분자에 결합된 하나 이상의 단백질을 제공하는 단계;

(b) 상기 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 제공하는 단계;

(c) 상기 단백질에 결합된 하나 이상의 중합체 분자에 상기 항체를 결합하기에 적합한 조건 하에서 단계 (a)의 단백질과 단계 (b)의 항체를 접촉시키는 단계; 및

(d) 항체 및 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계

를 포함하는, 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 결정하는 방법에 관한다.

항체 및 중합체 분자 사이의 복합체는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출된다. 상술한 복합체 검출의 예시에는 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 대항하도록 지시된 표지된 항체의 사용이 포함되나 이에 제한되지 않거나, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 당업계에서 공지된 임의의 적합한 검출가능한 표지인 검출가능한 표지에 공유적으로 연결된다. 검출가능한 표지를 측정하는 검출 방법은 예컨대, 제한없이, 효소 분석법, 크로모겐(chromogenic) 분석법, 루미노 분석법, 형광생성 분석법 및 방사성면역 분석법으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 검출가능한 표지의 검출을 수행하는 반응 조건은 선택된 검출 방법에 의존한다. 사용될 각각의 검출 시스템에 대한 최적 변수, 예컨대, 완충 시스템, 온도 및 pH를 선택하는 것은 숙련된 기술자의 지식의 범위 내이다.

단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양의 결정을 야기하는 검출가능한 표지의 정량화는 표준 방법에 의해 수행된다. 예컨대, 일 측면에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 효소(예컨대, 퍼옥시다아제)에 접합되고, 검출을 위해서, 효소성 기질 반응이 수행된다. 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양은 정해진 양의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합된 당해 단백질에 의해 획득된 보정 곡선으로부터 계산된다. 당해 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양은 예컨대, SDS-겔 전기영동으로부터의 데이타를 평가하고, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 결합 후의 질량 증가를 결정함으로써 획득된다.

일 측면에서, 본 발명에 따른 항체는 다중클론성 항체, 융합 항체, 종래의 융합 기술로부터 유도된 단일클론성 항체 및 재조합 기술, 예컨대, 파지 디스플레이 또는 리보좀 디스플레이에 의해 획득된 항체 및 항체 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 실시태양에서, 항체는 다중클론성 항체이다.

본 발명에 따르면, 용어 "단백질"은 특정한 규제의 기저를 이루지 않으며, 재조합 단백질, 단백질 복합체 및 재조합 DNA 기술을 통해 획득된 폴리펩티드를 포함하는 임의의 단백질, 단백질 복합체 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 재조합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 이는 (i) 예컨대, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통한 유전 공학에 의한 재조합 DNA의 생산, (ii) 형질감염, 예컨대, 전기천공법 또는 미세주사법에 의한 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내로의 재조합 DNA의 도입, (iii) 상기 형질전환된 세포의, 예컨대 연속식 또는 배치식 방식으로의 배양, (iv) 예컨대, 구성요소적 또는 유도에 의한 단백질의 발현 및 (v) 예컨대, 배양 배지로부터의 단백질의 단리 또는 형질전환된 세포의 수확, 이로 인한 (vi) 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화력 크로마토그래피를 통한 정제된 재조합 단백질의 획득을 위한 당 업계에 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다.

단백질 및 단백질 복합체

조성물 내에 사용하기 위해 고려되는 단백질들에는 대상물에 투여하기에 유용한 생리학적 활성 단백질이 포함된다. 일 실시태양에서, 생리학적 활성 단백질은 치료학적 단백질이다. 일 측면에서, 생리학적 활성 단백질은 단백질의 모든 치료학적 또는 생물학적 활성 또는 그의 일부, 실질적으로는 전부를 여전히 보유하는 단백질 또는 그의 임의의 단편이다. 일부 실시태양에서, 단백질은, 발현되지 않거나 또는 생산되지 않거나 또는 발현 또는 생산에 있어서 실질적으로 감소되면 질병을 야기할 수 있는 것이다. 바람직하게는, 단백질은 포유동물에서 유래되거나 얻어진다.

본 발명의 각종 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체에 접합된 생리학적 활성 단백질이 단백질 또는 단백질의 생물학적 활성을 가지는 그의 단편인 경우, 생리학적 활성 단백질은 접합되지 않은 인간 또는 포유류 단백질의 해당하는 부분의 아미노산 서열에 동일한 아미노산 서열을 가진다. 다른 실시태양에서, 접합체의 생리학적 활성 단백질은 인간 또는 포유류 종에 타고난 단백질이다. 다른 실시태양에서, 단백질 또는 그의 단편은 해당하는 인간 또는 포유류 단백질의 타고난 서열에 실질적으로 상동성이다(즉, 10, 25, 50, 100, 150 또는 200 이상의 아미노산 길이 또는 활성제의 전체 길이에 걸친 아미노산 서열에서 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상 동일).

단백질을 만드는 방법

재조합 단백질을 만드는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 재조합 단백질을 암호화하는 RNA 또는 DNA를 발현하는 포유류 세포를 포함하는, 세포의 생산 방법은 미국 특허 번호 제6,048,729호, 제5,994,129호 및 제6,063,630호에 설명된다. 이들 출원들의 각각의 교시는 그 전체로서 본원에 참고문헌으로 도입되었다.

일 실시태양에서, 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 유사체를 발현하는데 사용되는 핵산 구조는 형질감염된 포유류 세포 내에서 염색체 외적(유전자 부체(副體))으로 발현되는 것 또는 상동 재조합을 통해서 수용자 세포의 게놈 내로 무작위로 또는 사전-선택된 표적 지점에서 통합되는 것이다. 염색체 외적으로 발현되는 구조는 폴리펩티드-암호화 서열에 더해서 세포 내 단백질의 발현 및 임의로는 구조체의 복제에 충분한 서열을 포함한다. 이는 통상적으로 촉진자, 폴리펩티드-암호화 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 단백질을 암호화하는 DNA는 구조체 내에서 그의 발현이 촉진자의 조절 하에 있도록 하는 방식으로 위치한다. 임의로, 구조체는 하나 이상의 하기와 같은 추가적인 성분들을 함유할 수 있다: 스플라이스 부위(splice site), 증진자 서열, 적절한 촉진자의 조절 하에 있는 선택적인 마커 유전자 및 적절한 촉진자의 조절 하에 있는 증폭성 마커 유전자.

DNA 구조체가 세포의 게놈 내로 통합되는 이들 실시태양에서, 폴리펩티드-암호화 핵산 서열만이 포함된다. 임의로, 이는 촉진자 및 증진자 서열, 폴리아데닐화 부위 또는 부위들, 스플라이스 부위 또는 부위들, 선택적인 마커 또는 마커들을 암호화하는 핵산 서열, 증폭성 마커를 암호화하는 핵산 서열 및/또는 게놈 내의 선택 부위(표적 DNA 또는 DNA 서열)로 DNA를 통합하는 것을 표적하는 수용자 세포 내의 게놈성 DNA에 상동성인 DNA을 포함할 수 있다.

숙주 세포

재조합 단백질을 생산하는데 사용되는 숙주 세포들은 박테리아성, 효모, 곤충, 비-포유류 척추동물 또는 포유류 세포이며; 포유류 세포는 햄스터, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 소, 돼지, 생쥐, 쥐, 토끼, 양 및 인간 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 숙주 세포들은 불멸화된 세포(세포 주) 또는 비-불멸화된(1 차 또는 2 차) 세포를 포함하며, 임의의 광범위한 세포 타입, 예컨대, 섬유아세포, 각질세포, 상피 세포(예컨대, 포유류의 상피 세포, 장 상피 세포), 난소 세포(예컨대, 차이니즈 햄스터 난소 또는 CHO 세포), 내피 세포, 아교 세포, 신경 세포, 혈액의 유형 성분(예컨대, 림프구, 골수 세포), 근육 세포, 간세포 및 이들 체세포 타입의 전구체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

흔히 사용되는 숙주 세포는: 원핵 세포, 예컨대, 그램 음성 또는 그램 양성 박테리아, 즉, 대장균, 간균, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 살모넬라 등의 임의의 균주; 진핵 세포, 예컨대, CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포; 아기 햄스터 신장(BHK)세포; 인간 신장 293 세포; COS-7 세포; 곤충 세포, 예컨대, D. Mel-2, Sf4, Sf5, Sf9 및 Sf21 및 하이(High) 5; 식물 세포 및 각종 효모 세포, 예컨대, 사카로마이세스 및 피치아(Pichia)를 포함한다.

폴리펩티드-암호화 DNA 또는 RNA를 함유하는 숙주 세포는 세포의 성장 및 DNA 또는 RNA 발현에 적합한 조건 하에서 배양된다. 폴리펩티드를 발현하는 이들 세포는 공지된 방법을 사용하여 단리되고 정제된 재조합 단백질 및 공지된 방법을 사용하여; 폴리펩티드 생산의 증폭과 함께 또는 증폭 없이 확인된다. 확인은, 예시이며 제한없이, 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA의 존재를 표시하는 표현형을 나타내는 유전적으로 변형된 포유류 세포의 스크리닝, 예컨대, PCR 스크리닝, 서던 블롯(Southern blot) 분석에 의한 스크리닝, 또는 단백질의 발현을 위한 스크리닝을 통해 수행된다. 단백질-암호화 DNA가 혼입된 세포의 선택은 DNA 구조 내에 선택가능한 마커를 포함시키고 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 형질감염되거나 감염된 세포를 선택가능한 마커 유전자를 발현하는 세포들만이 생존하기에 적합한 조건 하에서 배양함으로서 달성될 수 있다. 더욱이, 도입된 DNA 구조의 증폭은 증폭에 적합한 조건 하에서의 유전적으로 변형된 세포의 배양(예컨대, 증폭가능한 마커 유전자의 다중 복제체들을 함유하는 세포들만이 생존할 수 있는 농도의 약물의 존재 하에서, 증폭가능한 마커 유전자를 함유하는 유전자 변형 세포의 배양)에 의해 특정 측면에서 영향을 받는다.

본 발명의 일 실시예에서, 단백질은 생리학적 활성 단백질, 단백질 복합체 또는 폴리펩티드, 특히 치료학적 단백질 또는 그의 생물학적 활성 유도체이다. 본원에서 사용되는 경우, 용어 "생물학적 활성 유도체"는 단백질, 단백질 복합체 또는 상기 단백질, 단백질 복합체 또는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능적 및/또는 생물학적 성질, 예컨대, 결합성 및/또는 동일한 구조적 기초, 예컨대, 펩티드성 주쇄 또는 기본 중합성 단위를 가지는 폴리펩티드의 임의의 유도체를 포함한다.

생리학적으로 활성인 단백질 또는 치료 단백질인 재조합 단백질은 시토킨, 성장 인자, 치료적 응집 단백질 또는 혈액 응고 인자, 효소, 케모킨, 수용성 세포-표면 수용체, 세포 접착 분자, 항체, 호르몬, 세포골격 단백질, 매트릭스 단백질, 샤페론 단백질, 구조 단백질, 대사 단백질 및 기타 당업자에게 공지된 치료 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 치료적으로 사용되는 재조합 단백질의 예시는 인자 VIII, 인자 VIII:C, 항혈우병 인자, 인자 VII, 인자 IX 및 폰 빌레브란트 인자, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 인터페론, 인슐린, CTLA4-Ig, 알파-글루코세레브로시다제, 알파-글루코시다제, 여포 자극 호르몬, 항-CD20 항체, 항-HER2 항체, 항-CD52 항체, TNF 수용체 및 기타 당업계에 공지된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예컨대, 문헌[Physicians Desk Reference, 62^nd Edition, 2008, Thomson Healthcare, Montvale, NJ] 참고.

일 실시태양에서, 단백질은 인자 II, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자, 단백질 C, 안티트롬빈 III 및 이들 단백질의 임의의 하나의 활성 형태를 포함하나 이에 제한되는 않는 치료학적 응집 인자 또는 혈액 (응고) 인자이다. 관련 실시태양에서, 단백질 복합체는 하나 이상의 혈액 인자를 포함한다. 혈액 인자(factos)의 예시적인 단백질 복합체는 FVIII 및 VWF 간의 복합체를 포함한다.

혈액 인자

본 발명의 하나의 구체적인 예에서, 단백질은 혈장-유래(혈장성) 및/또는 재조합 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 또는 그의 생물학적 활성 유도체이다. 용어 "혈장-유래 VWF(pVWF)"는 포유동물로부터 수득된 성숙한 VWF를 포함한다. 상기 pVWF의 하나의 생물학적 활성 유도체는 프로-펩티드를 함유하는 프로-VWF이다. 본 발명의 하나의 예에서 단백질은 내피 세포 및 거대핵세포에 의해 합성되는 전구체 VWF 분자(프리-프로-VWF)를 포함하는 비성숙 VWF, VWF 프로펩티드 (프로-VWF) 및 각각 전구체 분자의 신호 펩티드 및 프로-펩티드의 분해 시에 수득되는 성숙한 혈장-유래 VWF로 구성되는 군에서 선택된다. 혈장성 VWF의 생물학적 활성 유도체의 추가적인 예는 끝이 절단된 형태, 결실을 가진 형태, 치환을 가진 형태, 전구-형태 이외의 첨가를 가진 형태, 성숙한 형태의 단편, 키메릭 형태, 및 천연 형태에 비해 후-번역 변형을 가진 형태와 같이 생물학적으로 활성이거나 생물학적으로 활성인 형태로 전환되거나 가공된 프로-드러그를 포함한다. 용어 "재조합 VWF (rVWF)"는 제약학적으로 수용가능한 당화 패턴을 임의로 가지는 재조합 DNA 기술을 통해 수득된 VWF를 포함한다. 그의 특정한 예는 단백질분해에 대해 내성인 A2 도메인을 갖지 않는 VWF를 포함하고 (문헌[Lankhof et al., Thromb. Haemost; 77: 1008-1013, 1997]), Val449 내지 Asn730의 VWF 단편은 콜라겐 및 헤파린에 대한 당단백질 Ib-결합 도메인 및 결합 부위를 포함한다. 문헌([Pietu 등, Biochem Biophys Res Commun.; 164:1339-1347, 1989]) 참고.

폰 빌레브란트 인자는 혈장 내에 1×10⁶ 내지 2O×1O⁶ 달톤의 분자량을 갖는 일련의 다중체 형태로 존재한다. VWF (Genbank Accession 번호.NP_000543)는 포유동물의 내피 세포 내에서 일차적으로 형성되어 후속적으로 순환계로 분비되는 당단백질이다. 이와 관련하여, 약 220 kD의 분자량을 가지는 폴리펩티드 쇄로부터 시작하여, 550 kD의 분자량을 가지는 VWF 이량체가 수개의 황 결합의 형성에 의해 세포 내에서 형성된다. 추가적으로, 최대 2천만 달톤까지 증가하는 분자량을 갖는 VWF의 중합체가 VWF 이량체의 연결에 의해서 형성된다. 특히 높은-분자 VWF 다중체가 혈액 응집에서 매우 중요하다고 추정된다.

VWF 증후군은 VWF의 생산부족 또는 과잉생산이 있는 경우에 임상적으로 나타난다. VWF의 과잉생산은 증가된 혈전증(혈류를 방해하는 혈관 내의 응괴 또는 혈전의 형성)을 유발하며, VWF의 고-분자 형태의 감소된 수준 또는 이의 부족은 혈소판 응집 및 상처 봉합의 억제에 기인한 증가된 출혈 및 증가된 출혈 시간을 야기한다.

VWF 결핍은 또한 VWF가 기능적 인자 VIII의 필수 성분인바 표현형 혈우병 A를 유발할 수 있다. 이러한 경우에, 인자 VIII의 반감기는 그의 혈액 응고 연쇄단계(blood coagulation cascade)에서의 기능이 약화되는 범위까지 감소된다. 폰 빌레브란트 질병(VWD) 또는 VWF 증후군으로 고통받는 환자는 종종 인자 VIII 결핍을나타낸다. 이러한 환자들에서, 감소된 인자 VIII 활성은 X 염색체 유전자의 손상에 의한 결과가 아니며, 혈장 내의 VWF의 양 및 질적인 변화의 간접적인 결과이다. 혈우병 A와 vWD 사이의 분별은 일반적으로 VWF 항원을 측정하거나 또는 리스토세틴(ristocetin)-보조인자 활성을 결정함으로써 행해질 수 있다. VWF 항원 함량 및 리스토세틴 보조인자 활성 모두는 대부분의 vWD 환자들에서 저하되는 반면, 이들은 혈우병 A 환자들에서는 정상적이다. VWF 증후군의 치료를 위한 VWF 생성물에는 혈장으로부터의 FVIII/VWF 농축물을 포함하는 치료법들인 휴메이트-피(HUMATE-P); 및 이뮤네이트®(IMMUNATE®), 인노브란드®(INNOBRAND®) 및 8Y®이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

관련 실시태양에서, 단백질은 인자 VIII이다. 인자 VIII(FVIII)는 포유동물의 간에서 생산되는 약 260 kDa 분자 질량의 혈액 혈장 당단백질이다.(Genbank Accesion 번호. NP_000123) 이는 혈액 응고를 야기하는 응고 반응의 연쇄단계에서 중요한 성분이다. FVIII와 함께 인자 IXa가 인자 X(Genbank Accession 번호 NP_ 000495)를 활성화된 형태, 인자 Xa로 전환하는 단계가 이러한 연쇄단계 내에 있다. FVIII는 이 단계에서 보조인자로 작용하며, 인자 IXa의 활성을 위해 칼슘 이온 및 인지질이 요구된다. 두 개의 가장 통상정인 혈우병적 질병은 기능적 FVIII(혈우병 A, 모든 경우의 약 80 %) 또는 기능적 인자 IXa(혈우병 B 또는 크리스마스 인자 질병)의 결핍에 의해 야기된다. 혈장 안에서 FVlII는 매우 낮은 농도로 순환하고 비-공유결합적으로 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 결합한다. 지혈 동안, FVIII는 VWF로부터 분리되고 칼슘 및 인지질 또는 세포성 막의 존재 하에서의 활성화 속도를 증가시킴으로써 활성화된 인자 IX (FIXa)-매개 인자 X (FX) 활성화를 위한 보조인자로 작용한다.

FVIII는 도메인 구조 A1-A2-B-A3-C1-C2을 가지고 약 270-330 kD의 단일-쇄 전구체로 합성된다. 혈장으로부터 정제되는 경우, FVIII는 중쇄(Al-A2-B) 및 경쇄(A3-C1-C2)를 포함한다. 경쇄의 분자량은 B 도메인 내의 단백질분해에 기인하여 80 kD인 반면, 중쇄는 90-220 kD의 범위 내에 있다.

FVIII는 또한 출혈 질환에서 치료 용도를 위한 재조합 단백질로 합성된다. 치료약으로서의 재조합 FVIII (rFVIII)의 잠재적인 효능을 결정하기 위한 각종 시험관 내 분석법이 고안되었다. 이러한 분석법은 내생의 FVIII의 생체 내 효과를 모방한다. FVIII의 시험관 내 트롬빈 치료는 시험관 내 분석법에서 측정되는 바와 같이 이의 전구응고제 활성의 급속한 증가와 후속적인 감소를 야기한다. 이러한 활성화 및 불활성화는, FVIII에서 다양한 결합성 에피토프의 이용가능성을 변화시키는, 예를 들어, FVIII이 VWF로부터 분리되어 인지질 표면에 결합하도록 하거나, 특정 단일클론성 항체에 대한 결합능을 변화시키는, 중쇄 및 경쇄 모두에서의 특이적으로 제한된 단백질분해와 일치한다.

최근까지, 혈우병 A의 표준 치료는 인간 공여자의 혈장으로부터 유래된 FVIII 농축액 제제의 빈번한 주입을 포함하였다. 이러한 대체요법이 일반적으로 효과적인 반면, 이러한 처리는 환자를 바이러스-침투성 질병, 예컨대, 간염 및 에이즈에 대한 위험에 처하게 한다. 비록 이런 위험이 단일클론성 항체를 사용한 면역정제법을 사용한 혈장으로부터의 FVIII의 추가적인 정제에 의해서, 그리고 유기 용매 또는 열로 바이러스를 처리하여 불활성화시킴에 의해서 감소되었으나, 이러한 준비는 위험이 없지 않으며, 치료 비용을 현저히 증가시킨다. 이러한 이유로, 환자들은 예방적이기보다는 발생시에 치료를 받는다. 추가적인 합병증으로, 환자의 약 15 %에서 혈장-유래 FVIII에 대해 억제 항체가 나타났다. 1 % 이하의 FVIII 수준을 갖는 중증의 혈우병 A 환자는 일반적으로, 투약들 사이에 FVIII을 1 % 초과로 유지시키는 목적으로 예방적 치료를 한다. 순환계 중의 다양한 FVIII 생성물의 평균 반감기를 고려하여, 이것은 통상적으로 FVIII을 1 주일에 2 내지 3 회 제공함으로써 달성될 수 있다

혈우병 A의 치료에서의 중요한 진보는 인간 FVIII의 완전한 2,351 아미노산 서열을 암호화하는 cDNA 클론의 단리(문헌[Wood et al, Nature, 312:330 (1984)] 및 미국 특허 제4,757,006호 참고) 및 인간 FVIII 유전자 DNA 서열의 제공 및 이의 생산을 위한 재조합 방법이다. 혈우병 치료를 위한 FVIII 상품에는 애드베이트® (ADVATE®) (항혈우병 인자(재조합), 혈장/알부민-프리 방법, rAHF-PFM), 재조합 항혈우병 인자(바이오클레이트^TM(BIOCLATE^TM), 제날크®(GENARC®), 헬리사이트 에프에스® (HELIXATE FS®), 코에이트®(KOATE®), 코지네이트 에프에스®(KOGENATE FS®), 리콤비네이트®(RECOMBINATE®)): 모노클레이트-피®(MONOCLATE-P®), 인자 정제된 VIII:C의 제제, 항혈우병 인자/폰 빌레브란트 인자 복합체 (인간) 휴메이트-피®(HUMATE-P®) 및 알파네이트®(ALPHANATE®), 항-혈우병 인자/폰 빌레브란트 인자 복합체(인간);및 하이에이트 씨®(HYATE C®), 정제된 돼지 인자 VIII가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 애드베이트®는 CHO-세포에서 생산되며, 백스터 헬스케어 코포레이션(Baxter Healthcare Corporation)에 의해서 제조된다. 어떤 인간 또는 동물 혈장 단백질 또는 알부민도 애드베이트®의 세포 배양 과정, 정제 또는 최종 제제화에 첨가되지 않는다.

인자 VII(프로콘베르틴), 세린 프로테아제 효소는 혈액 응고 연쇄단계의 중심 단백질의 하나이다(Genbank Accession 번호. NP_000122). 인자 VII (FVII)의 주요 역할은 조직 인자 (TF)와 함께 응고 과정을 개시하는 것이다. 혈관 부상에 대해, TF는 혈액 및 순환 인자 VII에 노출된다. TF에 일단 결합하면, FVII는 상이한 프로테아제에 의해 트롬빈인 것들(인자 IIa), 활성화된 인자 X 및 FVIIa-TF 복합체 그 자체 중에서, FVIIa으로 활성화된다. 재조합 인간 인자 VIIa (노보세븐®(NOVOSEVEN®))은 대체 응고 인자에 대항하여 억제제가 유발된 혈우병 환자들의 조절할 수 없는 출혈에 사용되기 위해 도입되었다.

인자 IX (FIX, 크리스마스 인자)(Genbank Accession 번호 NP_OO0124)는 (조직 인자 통로의) 인자 XIa 또는 인자 VIIa에 의해 활성화되지 않는 한 불활성인 세린 프로테아제이다. 인자 IXa으로 활성화된 경우, 이는 인자 X의 아르기닌-이소류신 결합을 가수분해함으로써 작용하여 인자 Xa를 형성한다. 인자 VIII는 FIX 프로테아제 활성을 위해 요구되는 보조인자이다.(문헌[Lowe GD, Br. J. Haematol. 115: 507-13, 2002]) 인자 IX의 결핍은 혈우병 B 또는 크리스마스 질병을 야기한다.

추가적인 혈액 인자는 인자 II(트롬빈)(Genbank Accession 번호 NP_000497)결핍을 포함하며 이는 혈전증 및 프로트롬빈혈증이상을 유발하며; 인자 V, (Genbank Accession 번호 NP_000121)는, 결핍된 경우 출혈 체질 또는 혈전성향증을 유발하며, 활성화 C 단백 내성으로 알려진, 인자 XI(Genbank Accession 번호. NP_000119)는, 결핍된 경우 로젠탈 증후군(혈우병 C)를 유발하고, 인자 XIII 서브유닛 A (Genbank Accession 번호 NP_000120) 및 서브유닛 B (Genbank Accession 번호 NP_001985)는, 결핍된 경우 I형 결핍(A 및 B 서브유닛 모두 결핍된 경우) 및 II형 결핍(A 서브유닛만 결핍된 경우)으로 특징지어지고, 이들 모두는 장시간의 출혈 경향, 상처 치료에서의 결함 및 습관적인 유산을 야기할 수 있으며; 인자 XII (Genbank Accession 번호 NP_000496); 단백질 C (Genbank Accession 번호. NP_0OO3O3); 안티트롬빈 III (Genbank Accession 번호 NP_000479) 및 이들의 활성화된 형태를 포함한다.

폴리펩티드 변형물 및 유사체

본 발명의 방법은 샘플 내의 재조합 단백질과 재조합 단백질의 단편들, 유사체들 또는 변형물들을 신속하게 검출하는데 유용하고, 당화의 차이가 검출되는 생체 내에서, 단편 또는 대립형질 변형물로 존재할 수도 있는 자연-발생 단백질을 검출하는데도 또한 유용할 수 있다.

폴리펩티드 단편, 유사체 또는 변형물의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되었다. 폴리펩티드 단편들은 효소적 절단(예컨대, 트립신, 키모트립신)을 포함하는 당업계에 잘 공지된 방법들을 사용하여 만들어지고, 또한 특정 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 단편들을 생성하기 위해서 재조합 수단을 사용한다. 단편들은 리간드-결합 도메인, 수용체-결합 도메인, 이량체화 또는 다중체화 도메인, 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 확인가능한 도메인을 포함하도록 생성될 수 있다.

폴리펩티드 유사체를 만드는 방법 또한 공지되어 있다. 유사체들은 특정 측면에서, 유사체가 유도된 자연-발생 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이거나 또는 실질적으로 동일하며, 본 발명에 의해 고려되는 유사체는 자연-발생 폴리펩티드의 생물학적 활성을 적어도 일부분 보유하고 있는 것들이다.

치환 유사체들은 일반적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 와일드-타입의 하나의 아미노산을 다른 것으로 교환하고, 특정 측면에서, 다른 기능 또는 성질의 손실없이, 단백질 절단에 대응하는 안정성과 같은 폴리펩티드의 성질을 하나 이상 바꾸도록 계획된다. 이러한 타입의 치환은 일반적으로 보존적이다. "보존적 아미노산 치환"은 유사한 화학적 특징의 측쇄를 갖는 아미노산으로의 아미노산의 치환을 의미한다. 보존적 치환을 하기 위한 유사한 아미노산은 산성 측쇄(글루탐산, 아스파르트산); 염기성 측쇄(아르기닌, 리신, 히스티딘); 극성 아미드 측쇄(글루타민, 아스파라긴); 소수성, 지방족 측쇄(류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 글리신); 방향족 측쇄(페닐알라닌, 트립토판, 티로신); 작은 측쇄(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌); 또는 지방족 히드록실 측쇄(세린, 트레오닌)를 가지는 것들을 포함한다.

폴리뉴클레오티드 유사체 및 단편들은 자연 발생 분자와 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가지는 자연 발생 분자의 생물학적 활성 단편, 변형물들, 또는 돌연변이들을 암호화하도록 기술의 숙련자에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 일상적으로 실시되는 방법은 PCR 기술, 단백질 분자를 암호화하는 DNA의 효소적 소화와 비상동 폴리뉴클레오티드 서열에의 결찰 등을 포함한다. 예컨대, PCR 및 당업계에 공지된 다른 기술을 사용한 점 돌연변이 유발(point mutagenesis)은 단백질 활성에 관련된 특정한 활성에 어떤 아미노산 잔기가 중요한지를 특정하게 확인해내는데 사용될 수 있다. 따라서, 당업자는 DNA 가닥 내의 단일 염기 변화를 발생시킬 수 있고, 바뀐 코돈 및 착오 돌연변이를 야기할 수 있다.

단백질 또는 폴리펩티드가 개질되어 폴리펩티드인 제2 약제를 포함하는 융합 단백질인 유사체를 만들 수 있다는 것이 추가적으로 고려된다. 일 실시태양에서, 폴리펩티드인 제2 약제는 효소, 성장 인자, 시토킨, 케모킨, 세포-표면 수용체, 세포 표면 수용체의 세포외 도메인, 세포 접착 분자 또는 상술한 단백질 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 타입의 단백질의 단편 또는 활성 도메인이다. 관련 실시태양에서, 제2 약제는 인자 II, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자, 단백질 C, 안티트롬빈 III 및 이들의 활성화 형태와 같은 혈액 응고 인자이다. 고려되는 융합 단백질은 당업계에 잘 공지된 화학적 또는 재조합 기술에 의해 만들어진다.

고려되는 단백질 변형물로는 인간 단백질에서는 일반적으로 발생하지 않는, 유비퀴틴화, 당화, 치료제 또는 진단제로의 접합, 표지화(예컨대, 방사성 핵종 또는 각종 효소들), 페길화(폴리에틸렌 글리콜과의 유사체화)와 같은 공유 중합체 부착, 비가수분해성 결합의 도입 및 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩티드가 포함된다. 변형물들은 본 발명의 비-변형된 분자의 결합성을 보유한다.

본 발명의 방법에서 유용한 추가적인 폴리펩티드 변형물들은 폴리시알릴레이트(PSA) 부분을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리시알릴화된 폴리펩티드를 제조하는 방법은 미국 특허 공보 20060160948 및 문헌[Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006]에 기술된다.

생리학적으로 수용가능한 중합체

일 실시태양에서, 본 발명은 단백질 또는 폴리펩티드의 생존 능력, 생산에 유익한 효과를 제공하는 화학적 부분에 연결된 화학적으로 변형된 단백질 또는 폴리펩티드를 고려한다. 예컨대, 폴리펩티드에 대한 생리학적으로 수용가능한 중합체의 비특이적 또는 부위-특이적 접합은 잠재적으로 면역원성, 신장 청정을 감소시키거나 및/또는 프로테아제 저항을 개선시킴에 의해서 반감기를 개선시킨다고 당업계에 공지되어 있다.

생리학적으로 수용가능한 중합체 분자는 예컨대, 수용액에 실질적으로 용해성이거나 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있고 실질적으로 부정적인 효과, 예컨대, 중합체 분자-단백질-접합체를 치료학적 유효량으로 포유동물에 투여한 경우에 부작용을 갖지 않으며 생체적합성으로 여겨지는 중합체 분자를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에는 특정한 제한이 없다.

중합체 분자는 예컨대, 약 2 내지 약 1000, 또는 약 2 내지 약 300 개의 반복단위를 가지는 것으로 통상적으로 특징지어진다. 이러한 중합체 분자의 예는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레피닉 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 폴리(알킬렌 옥사이드)중합체, 폴리(말레산), 폴리(DL-알라닌), 폴리사카라이드, 예컨대 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 히알루론산 및 키틴, 폴리(메트)아크릴레이트 및 상기의 임의의 것들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드) (PEO), 폴리옥시에틸렌 (POE), 폴리비닐 알콜, 히드록시에틸 셀룰로오스 또는 덱스트란을 포함하나 이에 제한되지 않는 수용성 중합체들은 통상적으로 단백질 또는 펩티드에 접합되어 단백질 또는 펩티드의 안정성 또는 크기 등을 증가시킨다.

PEG, PEO 또는 POE는 에틸렌 옥사이드의 저중합체 또는 중합체를 지칭한다. PEG들 및 PEO들은 분자량 분포를 가지는, 즉 복잡분산(複雜分散) 분자를 포함한다. 크기 분포는 다분산도(Mw/Mn)라고 칭해지는 그의 중량 평균 분자량(Mw) 및 그의 수 평균 분자량(Mn)의 비로 통계적으로 특징지어진다. 특정 측면에서, Mw 및 Mn은 질량분광학에 의해 측정된다. 대부분의 PEG-단백질 접합체들은, 특히 1 KD 보다 큰 PEG에 접합된 것들은 모체 PEG 분자의 다분산성에 기인한 분자량 범위를 나타낸다. 예컨대, mPEG2K(선브라이트(Sunbright) ME-020HS, NOF)의 경우에, 실제 분자량은 1.5 ~ 3.0 KD 범위에 걸쳐 1.036의 다분산도로 분포된다. 예외는 별개의 쇄 길이 및 정해진 분자량을 가지고 단일분산 혼합물로서 특이적으로 제조되는 MS(PEG)n에 접합된 단백질(N=4, 8, 12 또는 24, 예컨대, PEO4, PEO12)-기반 시약(피어스(Pierce))이다.

생리학적으로 수용가능한 중합체 분자는 특정한 구조에 제한되지 않으며, 각종 측면에서, 선형(예컨대, 알콕시 PEG 또는 이관능성 PEG), 분지형 또는 다중-분지형(예컨대, 갈래진 PEG 또는 폴리올 중심에 부착된 PEG), 수지상, 또는 분해성 연결이다. 게다가, 중합체 분자의 내부 구조는 임의의 수의 상이한 패턴으로 조직화되고 단독중합체, 교차 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교차 삼원공중합체, 랜덤 삼원공중합체 및 블록 삼원공중합체로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일 특정 실시예에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자는 PEG와 그의 유도체이다. 본 발명에 따라 사용되는 PEG에는 특정한 제한이 없다. 예컨대, PEG-단백질 접합체는 선형 또는 분지형 접합체, NHS (N-히드록시숙신이미드)-또는 알데히드-기반 화학에 의해 접합된 중합체:단백질, PEG 쇄 및 접합 부위 간의 상이한 화학적 연결을 가지는 변형물 및 길이 면에서 다른 변형물들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. PEG의 평균 분자량은 약 3 킬로달톤("kDa") 내지 약 200 kDa, 약 5 내지 약 120 kDa, 약 10 내지 약 100 kDa, 약 20 내지 약 50 kDa,약 5 kDa 내지 약 60 kDa, 약 5 kDa 내지 약 40 kDa, 약 3 내지 약 30 kDa, 약 5 kDa 내지 약 25 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위일 것이다. 특정 실시태양에서, PEG는 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa인, 약 35 kDa, 약 40 kDa, 약 45 kDa, 약 50 kDa, 약 55 kDa, 약 60 kDa, 약 65 kDa, 약 70 kDa, 약 75 kDa, 약 80 kDa, 약 85 kDa, 약 90 kDa, 약 95 kDa, 약 100 kDa, 약 110 kDa, 약 120 kDa, 약 130 kDa, 약 140 kDa, 약 150 kDa, 약 160 kDa, 약 170 kDa, 약 180 kDa, 약 190 kDa 또는 약 200 kDa이다.

본 발명은 NHS-접합되고 -(CH2-CH2-O)n- (식 중, n = 1 내지 2000)으로부터의 길이 범위인 선형 PEG-단백질 접합체, 알데히드-접합되고 -(CH2-CH2-O)n-, (식 중, n = 1 내지 2000)으로부터의 길이 범위인 선형 PEG-단백질 접합체, NHS-접합되고 질량에서 3 내지 100 kDa인 길이 범위인 이-분지형 PEG-단백질 접합체 및 NHS-접합된 삼-분지형 PEG-단백질 접합체로 구성되는 군으로부터 선택된 PEG-단백질 접합체를 고려한다. 본 발명은 그의 접합 부위 및 PEG 쇄 사이에 상이한 화학적 연결(-CO(CH2)n-, 및 -(CH2)n- 식 중, n = 1 내지 5)을 함유하는 PEG-단백질 접합체를 또한 고려한다. 본 발명은 추가적으로 카르복실화된, 술페이트화된 및 포스포릴화된 화합물들(음이온성)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신장 천정을 감소하기 위한 하전된, 음이온성 PEG-단백질 접합체를 고려한다.(문헌[Caliceti & Veronese, Adv Drug Deliv Rev 2003 55(10):1261-77; Perlman et al., J Clin Endo Metab 2003 88(7):3227-35; Pitkin et al., Antimicrob Agents Chemother 1986 29(3): 440-44; Vehaskari et al., Kidney Intl 1982 22 127-135]) 추가적인 실시태양에서, 펩티드는 비스포스포네이트를 포함하는 부분, 수용성 중합체, 예컨대, PEG 또는 PEO, 탄수화물, 지방산 또는 추가적인 아미노산에 임의로 접합된다.

거대분자 화학적 변형은, 일 측면에서 비-특이적 방법(변형된 종들의 혼합물을 야기) 또는 부위-특이적 방법(와일드-타입 거대분자 반응성-지시 변형 및/또는 부위-지시 돌연변이 유발 및 화학적 변형의 조합을 사용한 부위-선택적 변형에 기반)으로, 또는 다르게는 발현된 단백질 결찰 방법을 사용하여 수행된다(문헌[Curr Opin Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)] 참고).

펩티드의 생체 내 치료적 반감기가 페길화로부터 유리해질 것인지 알아보기 위해, 다양한 상이한 PEG-단백질 접합체들을 합성하고 약동학적으로 시험관 내 및 생체 내에서 특징화하였다. 페길화의 잠재적인 효과를 모두 최적화하기 위해서, 중합체 길이, 형태에 디자인 전략을 사용하였고, PEG의 전하를 변화시켰다.

본 발명의 페길화된 단백질을 제조하는 방법은 일반적으로 (a) PEG가 단백질의 N-말단/C-말단에 부착되는 조건 하에서 당해 단백질을 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계 및 (b) 반응 생성물(들)을 획득하는 단계를 포함한다. 단백질의 페길화가 단백질의 내재적 활성을 현저하게 변화시킬 수 있는 바, 상이한 타입의 PEG가 탐구된다. 단백질의 페길화에 사용되는 화학은 메톡시-PEG (O-[(N-숙신이미딜옥시카르보닐)-메틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜)의 NHS-에스테르를 사용한 단백질의 1차 아민의 아실화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 메톡시-PEG-NHS 또는 메톡시-PEG-SPA의 아실화는 원래의 일차 아민으로부터 전하를 제거하는 아미드 연결을 야기한다(또한, C-말단을 위한 Boc-PEG). 리보좀 단백질 합성과 달리, 합성 펩티드 합성은 C-말단에서 N-말단으로 진행한다. 따라서, Boc-PEG는 PEG를 펩티드의 C-말단에 부착하는 하나의 방법(즉, tert-(B)부틸 (o)옥시 (c)카르보닐(Boc, t-Boc)을 사용한 합성)이다(문헌[R. B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154)]). (F)플루오레닐-(m)메트(o)옥시-(c)카르보닐 (FMOC) 화학(문헌[Atherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press.])이 선호되며 이는 측쇄-보호기를 제거하기 위해 플루오르화수소산의 위험한 사용을 필요로 하지 않기 때문이다. 본 방법은 중합체:단백질 접합체의 실질적으로 상동한 혼합물을 제공한다. 본원에서 사용되는 경우 "실질적으로 상동성"은 중합체:단백질 접합체 분자만이 관찰되었음을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지고 본 "실질적으로 상동성"인 페길화된 단백질 제제는 상동성 제제의 이점, 예컨대, 다수의 약동학에서의 많은 예측가능성에 힘입은 임상적 적용의 용이함을 보이기에 충분하게 상동성인 것들이다.

당해 폴리펩티드에의 생리학적으로 수용가능한 중합체의 접합을 용이하게 할 수 있는 안정한 연결자의 예시들은 아미드, 아민, 에테르, 카르바메이트, 티오우레아, 우레아, 티오카르바메이트, 티오카르보네이트, 티오에테르, 티오에스테르 및 디티오카르바메이트 연결, 예컨대 ω,ω-아미노알칸, N-카르복시알킬말레이미드 또는 아미노알칸 산, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르, 글루타르알데히드 또는 숙신산 무수물, N-카르복시메틸말레이미드 N,N'-디숙신이미딜 옥살레이트 및 1,1'-비스[6-(트리플루오로메틸)벤조-트리아졸일] 옥살레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

다른 실시태양에서, 생리학적으로 수용가능한 중합체는 분리가능한 연결자를 사용하여 폴리펩티드에 접합된다. 일 실시태양에서, 분리가능한 연결자는 가수분해성 연결자이다. 가수분해성 또는 분해성 결합은 생리학적 조건 하에서 물과 반응하는(예컨대, 가수분해되는) 비교적 약한 결합이다. 물에서 가수분해하려는 결합의 경향은 두 개의 중심 원자를 연결하는 연결의 일반적인 타입 뿐만 아니라 이들 중심 원자에 부착된 치환기에도 의존할 것이다. 가수분해성 연결자를 가지는 수용성 중합체를 포함하는 접합체를 만드는 방법은 미국 특허 제7,259,224호(넥타르 치료법:Nektar Therapeutics) 및 미국 특허 제7,267,941호(넥타르 치료법 및 국립 보건 기관)에 설명되어 있다. 예컨대, PEG는 가수분해되는 중합체 주쇄 내의 에스테르 연결을 가지게 준비될 수 있다. 이러한 가수분해는 중합체를 절단하여 저분자량의 단편들을 생성한다. 적합한 가수분해적으로 불안정한 또는 약한 연결은 카르복실레이트 에스테르, 포스파이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고핵산염, 티오에스테르, 티올에스테르 및 카르보네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 중합체 주쇄 내에 함유될 수 있는 가수분해적으로 분해성인 연결은 카르바메이트, 카르보네이트, 술페이트 및 아실옥시알킬 에테르 연결; 예컨대, 아민 및 알데히드의 반응으로 생성되는 이민 연결([예컨대, 문헌[Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(l):582-3 (1997)]참고); 카르바메이트, 포스파이트 에스테르, 히드라존, 아세탈, 케탈 또는 아세톤-비스-(N-말레이미도에틸)케탈 연결자(MK)를 포함하는 오르토에스테르 연결을 포함한다.

추가적인 실시태양에서, 본원에 설명된 페길화 접근법에서 사용되기 위해 고려되는 중합체 분자는 수용성 중합체 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된다. 중합체는 중합도가 조절될 수 있도록 단일 반응성기, 예컨대, 아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드를 가질 수 있다. 수용성 중합체 또는 이들의 혼합물은 필요한 경우, 예컨대, PEG, 모노메톡시-PEG, PEO, 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈), 프로필렌 글리콜 단독중합체, 지방산, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예컨대, 글리세롤), HPMA, 플렉시마^TM(FLEXIMAR^TM) 및 폴리비닐 알콜, 모노-(Cl-C10)알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데히드, 비스-숙신이미딜 카르보네이트 PEG, 셀룰로오스, 기타 탄수화물-기반 중합체 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 선택된 중합체는 수용성이어서, 그것이 부착된 단백질이 수성 환경, 예컨대, 생리학적 환경에서 침전하지 않는다. 중합체는, 각종 측면에서, 분지형이거나 분지형이 아니다. 일 실시태양에서, 최종 생성물 제제의 치료 용도를 위해, 중합체는 제약학적으로 수용가능하다. PEG 부분을 포함하는 펩티드를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,824,784호를 참고하라.

일 실시태양에서, 반응성 알데히드는 수용성인 PEG-프로피온알데히드 또는 모노-Cl-C10 알콕시 또는 그의 아릴옥시 유도체이다(미국 특허 제5,252,714호를 참고하라). 본원에서 사용되는 경우, PEG는 다른 단백질, 예컨대, 모노-Cl-C10 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜을 유도하는데 사용되는 임의의 형태의 PEG를 아우르도록 의도한다. 일부 실시태양에서, 중합체는 분지형이거나 분지형이 아니다. 일 실시태양에서, 최종 생성물 제제의 치료 용도를 위해, 중합체는 제약학적으로 수용가능하다.

하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합한 단백질은 하나 이상의 중합체 분자에 공유 결합 또는, 예컨대 이온성, 소수성, 친화성, 생체친화성 상호작용에 의한 비-공유 결합으로 결합된 단백질을 포함한다. 일 실시태양에서, 중합체 분자는 이관능성 시약의 사용에 의해, 그리고 스페이서 팔을 통해 단백질에 커플링된다. 관련 실시태양에서, 중합체 분자는 친화성 상호작용에 의해 단백질에 커플링된다. 예를 들어, 단백질은 비오티닐화되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 접합 중합체 분자가 단백질에 결합된다. 또한, 다중클론성 또는 단일클론성 항체뿐만 아니라 그의 단편이 중합체 분자에 결합되고, 그 후 이러한 복합체가 단백질에 결합된다. 중합체 분자는 또한 효소적 방법, 예를 들어 폴리글리코실트랜스퍼라제에 의한 사카라이드의 전달(US 제6,379,933호), 또는 글리코페길화(US 2004 0132640)에 의하여 단백질에 결합된다. 다른 접근법은 예컨대, PEG화 콜라겐 또는 콜라겐 단편을 VWF 단백질의 A1 및 A3 도메인에 결합하는 것과 같은 그들의 생물학적 기능을 기초로 하여 단백질에 중합체 분자를 결합시키는 것이다. 이러한 목적을 위하여, 특정 측면에서 VWF와의 강력한 상호작용을 나타내는, 예를 들어 인간 태반으로부터의 유형 I 및 III으로부터의 콜라겐이 사용된다. 중합체 분자의 결합은 단백질의 생체 내 적용 후에 생리학적 조건 하에서 비가역적이거나 가역적이다.

본 발명의 하나의 예에서, 단계 (a)에서 하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합된 단백질이 기질 또는 운반자 매트릭스 위에, 예컨대, 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 의해 고정된다.

기질 또는 운반자 매트릭스에는 어떠한 특정한 제한도 없으며 예컨대, 유기 중합체, 예컨대 폴리아미드 또는 비닐 중합체(예, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리스티렌 및 폴리비닐 알콜 또는 그의 유도체들), 천연 중합체, 예컨대 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로스, 키틴 및 폴리아미노산 또는 무기 중합체, 예컨대 유리 또는 메탈로히드로옥사이드일 수 있는 불용성 중합체 물질에 관한다. 특정 실시태양에서, 기질은 마이크로운반자, 입자, 막, 스트립, 종이, 필름, 펄, 비드 또는 플레이트,예컨대, 마이크로타이터 플레이트의 형태이다. 일 측면에서, 하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 결합된 단백질은 공유 커플링에 의해 또는 연결자 분자와 같은 운반자 또는 기질 상에 고정된 항체를 통해 직접적으로 기질 상에 고정된다.

검출가능한 표지

일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에 유용한 단백질 또는 중합체는 이의 검출을 용이하게 하기 위해서 표지된다. "표지" 또는 "검출가능한 부분"은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 기타 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다.

사용되는 스크리닝 분석법에 따라, 단백질 또는 그의 단편, 또는 중합체 또는 그의 일부가 표지된다. 사용되는 특정 표지 또는 검출가능한 기는 그것이 접합체의 생물학적 활성을 현저하게 방해하지 않는 한 발명의 중요한 측면이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 가지는 임의의 물질일 수 있다. 따라서, 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다.

본 발명에서 사용되기에 적절한 표지의 예는 형광 염료(예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드(Texas red), 로다민 등), 방사성 표지(예컨대, 3H, 125I,35S, 14C 또는 32P), 효소(예컨대, 서양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타제 및 엘리사에서 통상적으로 사용되는 기타) 및 측색 표지, 예컨대, 콜로이드성 금, 착색된 유리 또는 플라스틱 비드(예컨대, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

표지는 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 적절한 분석 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 일 실시태양에서, 표지는 본 발명에 따른 활성화제의 접합을 위한 이소시아네이트를 사용하여 생중합체에 공유 결합된다. 본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 이관능성 이소시아네이트 시약은 표지를 생중합체에 접합시켜서 표지 생중합체 접합체를 그에 부착된 활성화제 없이 형성하는데 사용된다. 표지 생중합체 접합체는 본 발명에 따른 표지된 접합체의 합성을 위한 중간체로 사용될 수 있거나 또는 생중합체 접합체를 검출하는데 사용될 수 있다. 상기에 나타난 바와 같이, 요구되는 감도, 적절한 분석 성분과의 접합의 용이성, 안정성 요구, 가능한 계측방법 및 폐기 허가에 의존하여 표지가 선택되며, 광범위한 표지가 사용된다. 비-방사성 표지는 종종 간접적 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예컨대, 비오틴)은 분자에 공유적으로 결합된다. 리간드는 고유하게 검출가능한 또는 신호 시스템, 예컨대 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 공유적으로 결합하는 분자인 또 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘)에 결합한다.

특정 측면에서, 접합체는 예컨대, 효소 또는 형광단과의 접합에 의해, 신호-발생 화합물에 직접 접합된다. 표지용으로 적합한 효소는 가수분해 효소, 특히 포스파타아제, 에스터라아제 및 글리코시다아제 또는 옥시도타아제, 특히 퍼옥시다아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 표지용으로 적합한 형광 화합물, 즉 형광단은 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 댄실, 움벨리페론 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 형광단의 추가적인 예는 에오신, TRITC-아민, 퀴논, 플루오레세인 W, 아크리딘 옐로우, 리싸민 로다민, B 술포닐 클로라이드 에리트로세인, 루테늄 (트리스, 비피리디늄), 텍사스 레드, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 표지용으로 적합한 화학발광 화합물은 루시페린 및 2,3-디히드로프탈아진디온, 예컨대, 루미놀을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에서 사용되는 각종 표지 또는 신호 발생 시스템의 검토를 위해 미국 특허 제4,391,904호를 참고하라.

표지의 검출 수단은 당업자에게 잘 공지되었다. 따라서, 예컨대, 표지가 방사성인 경우에는, 검출 수단은 섬광 계수기(예컨대, 방사선면역분석법, 섬광 근접 분석법)(문헌[Pitas et al., Drug Metab Dispos. 34:906-12, 2006]참고) 또는 방사능사진 촬영술에서와 같이 인화지를 포함한다. 표지가 형광 표지인 경우에는, 이는 형광 색소를 적합한 광 파장으로 흥분시켜서 생성된 형광 발광을 검출함으로써(예컨대, 엘리사, 유세포분석 또는 당업계에 공지된 기타 방법) 검출될 수 있다. 형광 발광은 전자 검출기, 예컨대, 전하 결합 소자(CCDs) 또는 광전자 배증관(倍增管)(photomultiplier) 등을 사용함으로써 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소성 표지는 효소에 적합한 기질을 제공하고 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 측색 또는 화학발광 표지는 표지에 관련된 색을 관찰함으로써 간단히 검출될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 기타 표지 및 검출 시스템은 당업자에게 쉽게 명백해보일 것이다.

일 실시태양에서, 표지, 본 방법에서 사용하기 위해 고려되는 단백질:중합체 접합체 또는 단백질:중합체 복합체 접합체는 고체 지지체, 예컨대, 기질 또는 필터, 마이크로운반자, 입자, 막, 스트립, 종이, 필름, 비드 또는 플레이트 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 운반자 매트릭스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 운반자 매트릭스에 연결된다.

표지된 화합물이 용액 내에서 표지될 수 있고 상호작용할 수 있다는 것이 추가적으로 고려된다. 예컨대, 결합이 일어날 때 분자들이 근접하게 있도록, 포획 항체는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 주개 분자로 표지될 수 있고, 표적 분자는 FRET 받개 분자로 표지된다. 다르게는, 표적 분자가 FRET 주개로 표지될 수 있고 항체 분자는 FRET 받개로 표지될 수 있다. 또 다른 가능성은 표적 및 항체가 혼성화 되었을 때 항체 또는 표적 위에 모두 존재하는 소광(消光)(quenching) 및 형광 분자를 분리하는 것이다. 표적 분자들은 만약 그들이 시약과 상호작용한다면 그들의 표지가 방출할 수 있기에 충분한 정도로만 가깝다. 이는 그것이 시약과 상호작용하는 경우에만 분자가 방출하는 시스템을 생산한다(직접 모니터링). 일 실시태양에서, 협대역 패스 필터는 분자의 표지의 파장을 제외한 모든 파장을 차단하는데 사용된다. FRET 분자쌍은 업계에서 상업적으로 입수가능하며(예컨대, 캘리포니아주, 칼스바드, 인비트로젠(Invitrogen)으로부터), 제조업자의 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. FRET 방출은 광학 영상 기술, 예컨대, CCD 카메라를 사용하여 검출된다.

항체-항원 상호작용을 검출하는 또다른 방법은 전자 주개로 표지하는 것이다. 이 주개 표지는 시약이 결합된 전기적 접촉에 전자를 줄 것이다. 예컨대, 전기 면역분석법을 위한 방법 및 그에서 유용한 효소를 설명한 문헌[Ghindilis, A. (Biochem Soc Trans. 28:84-9, 2000) 및 Dai et al. (Cancer Detect Prev. 29:233-40, 2005)]을 참고하라. 전자 접촉은 그 후 A에서 D(아날로그에서 디지탈)로의 전환기에 의해 읽혀져서 정량화될 것이다. 전자 계수(electron count)가 높을수록 상호작용이 더 일어난다.

단일 분자 검출이 가능한 표지의 일 실시태양은 본원에 참고문헌으로 도입된 문헌[Schultz et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., 97:996-1001 (2000)]에 설명된 바와 같이 플라즈몬-공명 입자(PRPs)를 광학적 리포터로 사용하는 것이다. PRP는 통상적으로 직경이 40-100 nm인 금속성 나노입자이며, 금속 내의 전도 전자의 집단 공명(즉, 표면 플라즈몬 공명) 때문에 현저한 효율로 탄성적으로 빛을 산란시킨다. 나노입자와 관련된 플라즈몬 공명의 크기, 피크 파장 및 분광 대역폭들은 입자의 크기, 모양 및 물질 조성물과 지역적 환경에 의존한다. 제조하는 동안 이들 변수들에 영향을 줌으로써 스펙트럼의 가시 범위 내 어딘가에 산란 피크를 가지는 PRP들이 형성된다. 구형 PRP들에서, 반경이 더 클수록 피크 산란 파장 및 산란 효율은 모두 증가하며, 상이하게 착색된 표지를 생산하는 수단을 제공한다. 예컨대, 제조하는 동안 구의 최종 반경을 조정함으로써, 피크 산란 파장이 표적 파장의 약간의 나노미터 내에 있는, 은 구의 모집단이 재생적으로 제조된다. PRP들은 밝고, 또한 나노크기이기 때문에, 이들은 단-분자 검출의 지표로 사용된다; 즉, 시계(視界) 내의 결합 PRP의 존재는 단일 결합 사건을 나타낼 수 있다.

본 분석 및 검출은 단백질 또는 단백질 복합체에 결합된 중합체의 수를 결정하거나 또는 용액, 예컨대, 혈청 또는 혈장 내의 자유 중합체의 범위를 결정하는데 유용하다는 것이 고려된다. 본 방법에서 관찰되는 검출가능한 신호는 공지된 양의 중합체를 가지는 표준에 비교하는 경우 단백질 또는 단백질 복합체에 결합된, 또는 용액 내 자유로운 중합체의 수과 연관된다.

따라서, 일 실시태양에서 본 발명은 중합체를 상기 중합체에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기에서 항체에 의해 결합된 중합체의 수가 공지된 대조군과 비교하는 경우 결합된 검출된 항체의 수준과 연관되는, 단백질 또는 단백질 복합체에 결합되거나 용액 내에서 자유로운 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 수를 결정하는 방법을 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 단백질 또는 단백질 복합체를 상기 단백질 또는 단백질 복합체에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기에서 항체에 의해 결합된 중합체의 수가 공지된 대조군과 비교하는 경우 결합된 검출된 항체의 수준과 연관되는, 단백질 또는 단백질 복합체에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 수를 결정하는 방법을 제공한다.

관련 실시태양에서, 본 발명의 방법은 기타의 검출 요법을 사용하여, 예컨대, 단백질 및 중합체 특이적 항체들이 다음과 같은 임의의 순서대로 수행되며, 여기에서 나열된 제1 항체가 운반자 매트릭스에 결합된 항체이고 제2 항체가 검출가능한 항체 내에 결합된다. 단백질 또는 단백질 복합체에 결합된 중합체의 수를 검출하는데 유용한 예시적인 분석법은 항-중합체-항-단백질 검출 방법, 항-단백질-항-중합체 검출 방법 또는 항-중합체-항-중합체 검출 방법을 포함하며, 여기에서 항-중합체 항체는 각각의 결합 단계에서 동일한 항체이거나, 각각의 단계에서 상이한 중합체-특이적 항체이다. 관련 실시태양에서, 분석이 항-중합체 특이적 항체 또는 항-단백질-특이적 항체만을 사용하여 수행된다.

키트

추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서 그들의 사용을 용이하게 하는 방법으로 포장된 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 일 실시태양에서, 이러한 키트는 생리학적으로 수용가능한 중합체에 접합된 단백질 또는 단백질 복합체, 예컨대, 페길화된 인자 VIII, 항체 또는 단백질 상의 수용성 중합체를 특이적으로 검출하는 기타 분자를 포함하는 조성물을 포함하고, 콘테이너에 부착된 표지와 함께 밀봉된 병 또는 용기와 같은 콘테이너에 포장되거나, 본 방법의 실시에 있어서의 화합물 또는 조성물의 사용을 설명하는 포장용기에 포함된다. 관련 실시태양에서, 결합제는 수용성 수용체, 리간드, 보조인자 또는 단백질, 단백질 복합체 또는 중합체에 특이적으로 결합하는 다른 제제이다. 키트는 중합체-단백질 복합체의 검출을 위한 샘플의 제조를 위한 시약 및 완충액을 임의로 포함한다. 바람직하게는, 화합물 또는 조성물은 단위 용량 형태로 포장된다. 키트는 투여의 특정 경로에 따라 조성물을 투여하는데 적합한 장치를 추가적으로 포함한다. 바람직하게는, 키트는 변형된 혈액 인자 조성물의 용도를 설명하는 표지를 함유한다.

본 발명의 일 실시태양에서, 본 방법은:

(i) 하나 이상의 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자체 결합된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 ELISA 플레이트에 고정화하는 단계;

(ii) 당해 단백질을 고정화된 항체에 결합하는 단계; 및

(iii) 상기 당해 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 의해 단백질에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자의 양을 검출하는 단계

를 포함하는 효소 연결면역 흡수 분석(ELISA)을 포함한다.

본 발명은 하기의 실시예에서, 이에 어떠한 제한됨도 없이 추가적으로 설명될 것이다.

실시예

항원 HSAP -2- SS 위의 직접 효소 연결면역흡수 분석( ELISA ) ( 페길화된 인간 혈청 알부민( hSA ))

동물 내로 주입된 페길화된 항원을 사용하여 PEG에 대한 다중클론성 항체가 생성되었는지를 결정하기 위해서, 인간 혈청 알부민(hSA)을 PEG에 연결하고 단백질 접합체를 토끼 안에 주입하였다. 항-PEG 항체의 양을 그 후 측정하였다.

간략히, 다중클론성 항체는 인간 혈청 알부민(HSA)에 공유적으로 결합된 PEG에 의한 토끼의 면역화(문헌[Richter AW et al. 1983; Int Arch Allergy Appl Immunol 70:124-31]참고)에 의해서 생성된다. 토끼들에 항원 HSAP-2-h-SS 제제를 약 380 ㎍/ml 단백질 및 250 ㎍/ml의 PEG 농도로 함께 접종한다. 모든 동물들의 혈장 샘플들을 시작 전 및 3 및 4 주 후에 취하고 후속적으로 항원 HSAP-2-h-SS에 대항하는 검출가능한 항체의 형성에 대해 시험하였다. 항원 HSAP-2-h-SS (페길화된 hSA)를 pH 9.6에서 1 ㎍/ml에서 0.1 M 카르보네이트 내에서 코팅하였다. 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액 내에서 희석하고 단일 배양 다층 면역 기술(SIMIT: Single Incubation Multilayer Immune Technique)을 사용하여 웰들 그리고 후속적으로 및 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다(문헌[Naser, W., J Immunol Methods. 129:151-7, 1990] 참고). SIMIT에서, 단일 배양 단계 동안 다중층의 면역반응체가 형성되어서 그럼으로써 증강된 분석 감도를 야기하도록, 리간드(예, 항체) 및 리간드 결합제(예, 항-항체)들을 공동-배양하였다. 항원 HSAP-2-h-SS에 대항하는 항체 형성은 검출가능하다. 항원은 플레이트 위에 직접적으로 코팅될 수 있고 면역화 시간에 따라 역가(titer)의 증가가 있다(도 1a).

더욱 구체적으로, 페길화된 hSA를 문헌[Abuchowski et al (J Biol Chem 252: 3578-81, 1977)]에 따라 제조하였다. 페길화된 hSA는 고성능 크기-배재 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 나타난 바와 같이 고분자량을 가졌다. 모든 동물들의 혈장 샘플들을 시작 전 및 3 및 4 주 후에 취하고 풀링하였다. 풀링된 샘플들을 후속적으로 직접 ELISA에 의해 면역 항원에 대항하는 형체의 형성에 대해 시험하였다. 간략히, 페길화된 hSA를 1 ㎍/ml의 농도에서 pH 9.6의 0.1 M 소듐 카르보네이트 완충액에서 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트에 코팅하였다((넌크 막시솔프(Nunc Maxisorp) F96)). 풀링된 토끼 혈장 샘플들을 1 mg/mL 겔라틴을 함유하는 포스페이트-완충된 식염수(PBS)에서 희석하고 웰들 그리고 후속적으로 및 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다. 면역 항원에 대항하는 항체의 형성이 검출가능했다. 추가로, 면역화 시간에 따라 역가의 증가가 있었다(도 1b). 다른 면역화 연구에서 획득한 샘플 내의 항체 역가를 측정하는데 동일한 방법이 사용되었다. 표 1은 시작에서와 36 및 50 일이 지난 후에 취해진 샘플의 바탕값-보정된 광학 밀도(OD)를 나타낸다. 또한 이 경우에, 1/50 및 1/100 샘플 희석액의 결과는 시간에 따라 증가하는 면역 항원에 대항하는 IgG의 형성을 입증한다.

이러한 결과는 PEG 접합된 hSA 단백질이 대상 동물로부터 다중클론성 항체의 생산을 유도한다는 것을 나타낸다.

PEG 에 의한 항원 HSAP -2- SS 상의 직접 ELISA 의 억제

항-PEG 항체의 결합이 PEG에 특이적이었는지 결정하기 위해, 항체 결합을 방해하는 자유 PEG의 능력을 평가하였다.

간략히, 토끼들을 항원 HSAP-2-SS 및 상술한 바와 같이 제조된 혈장 샘플들로 면역화시켰다(실시예 1). 항원 HSAP-2-h-SS를 1 ㎍/ml에서 pH 9.6의 0.1 M 카르보네이트 내에서 표면 위를 코팅하였다. 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액 또는 PBS-겔라틴-1 % PEG 5000 완충액 (+ 1% PEG) 내에서 희석하고 웰들 그리고 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다(SIMIT). 토끼의 면역화에 의해서 획득된 항원(= 페길화된 hSA)에의 항체의 결합은 샘플 희석 완충액에의 PEG 5000의 첨가에 의해 억제될 수 있다(도 2a).

더욱 구체적으로, 페길화된 hSA에 의한 면역화에 의해 획득한 항혈청의 항-PEG 특이성을 억제 연구로 체크하였다. 플레이트(실시예 1)를 10 ㎍/mL의 농도에서 면역 항원 페길화된 hSA로 코팅하였다. 면역화의 시작 후 3 및 4 주 후에 취한 풀링된 토끼 혈청 샘플을 PBS-겔라틴에서 희석하여 1/100 내지 1/100,000 범위의 일련의 희석액을 획득하였다. 페길화된 hSA에의 결합을 억제하기 위해 PEG 5000을 10 mg/mL의 농도에서 첨가하였다. 결합 토끼 IgG를 염소 항-토끼 IgG-퍼옥시다아제 접합체 및 퍼옥시다아제 기질 슈어블루를 사용하여 검출하였다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 5000은 플레이트-고정된 페길화된 hSA에의 토끼 IgG의 결합을 감소시켰다(도 2b).

이러한 결과는 토끼 혈청 내에 함유된 IgG가 PEG를 특이적으로 인지하고 그에 결합한다는 것을 입증한다. PEG 존재에서의 토끼 IgG의 잔여 결합은 hSA를 향해 지정된 항체에 의해 유발된다. 이러한 비-PEG-특이적 IgG들은 고정화된 hSA 상의 친화력 크로마토그래피에 의해 흡착된다.

PEG -변형 플레이트 위의 직접 ELISA

항-PEG 항체가 플라스틱에 직접적으로 결합된 PEG에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 직접 PEG ELISA를 전개하였다.

간략히, 토끼들을 항원 HSAP-2-SS 및 상술한 바와 같이 제조된 혈청 샘플들로 면역화시켰다(실시예 1). 기질(넌크 막시솔프 F96)을 15 mM HEPES 내에서 1 mg/ml에서 mPEG-NPC 5000으로 실온에서 2 시간 동안 코팅하고, PBS-겔라틴(5 mg/ml)으로 차단하였다. 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액 내에서 희석하고 웰들 그리고 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다(SIMIT). 혈청 샘플 내에 존재하는 항체의 PEG-변형 플레이트(넌크 막시솔프 F96)에의 결합이 검출되었다(도 3).

더욱 구체적으로, 토끼들을 페길화된 hSA 및 상술한 바와 같이 제조된 혈청 샘플들로 면역화시켰다(실시예 1). 플레이트(실시예 1)를 15 mM HEPES 내에서 1 mg/ml의 mPEG-p-니트로페닐 카르보네이트 (NPC; 선바이오(SunBio), 대한민국)으로 실온에서 2 시간 동안 코팅하고, PBS-겔라틴으로 차단하였다(5 mg/ml). 혈청 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액으로 희석하고, 웰들 그리고 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-퍼옥시다아제로 배양하였다. PEG-변형 플레이트에의 토끼 혈청 샘플 내에 존재하는 IgG의 명백한 결합이 검출되었다(도 3). 동일한 과정을 폴리리신- 및 NH₂- 활성 플레이트(코스타(Costar))로 수행한 경우, 반응은 관찰될 수 없었다.

이러한 결과는 토끼 혈청 샘플 내에 함유된 항-PEG IgG가 PEG를 인식하고 그에 결합한다는 것을 입증한다.

VWF 및 PEG - VWF 위의 직접 ELISA

항-PEG 항체가 다른 면역 항원이 아닌 페길화된 단백질에 결합할 것인지 여부를 결정하기 위해, 항-PEG 항체를 페길화된 폰 빌레브란트 인자와 함께 ELISA에 사용하였다.

간략히, 토끼들을 항원 HSAP-2-SS 및 상술한 바와 같이 제조된 혈청 샘플들로 면역화시켰다(실시예 1). 기질을 pH 9.6에서 0.1 M 카르보네이트 내에서 페길화된 VWF (PEG-VWF)로 코팅하고, 다른 기질을 pH 9.6에서 0.1 M 카르보네이트 내에서 재조합 VWF (rVWF-12)으로 코팅하였다. 샘플들을 PBS-겔라틴 완충액 내에서 희석하고 웰들 그리고 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다(SIMIT). VWF의 페길화는 SDS-PAGE에 의해 확인된 분자량 증가에 의해 결정되었다. 혈청 샘플 내에 존재하는 항체의 페길화된 재조합 VWF (rVWF)에의 결합이 검출되었다. 혈청 샘플 내에 존재하는 항체의 rVWF에의 결합은 관찰되지 않았다(도 4a).

더욱 구체적으로, 토끼 혈청 샘플(실시예 1 참조)들을 플레이트-고정화된 rVWF 및 페길화된 rVWF와 반응하도록 하였다. 페길화된 rVWF를 문헌[Kozlowski et al (BioDrug 5:419-29, 2001)]에 설명된 바와 같이 페길화 시약을 사용하여 제조하였다. 두 단백질 모두가 폴리스티렌 플레이트에 코팅되었다(실시예 1). 면역화 전 및 3 주 후에 취한 토끼 혈청 샘플을 PBS-겔라틴 완충액 내에서 희석하고 웰들 그리고 후속적으로 염소 항-토끼 IgG-HRP 항체로 배양하였다. 토끼들을 페길화된 hSA로 면역시켰음에도 불구하고 토끼 혈청 샘플 내에 존재하는 IgG의 플레이트-고정화된 페길화된 rVWF에의 결합이 검출되었다. 토끼 혈청 샘플 내에 존재하는 IgG의 rVWF에의 결합은 관찰되지 않았다(도 4b).

이러한 실험은 항-PEG 항체가 비-페길화된 단백질에 비-특이적으로 결합하지 않는다는 것을 입증한다.

VWF - 페길화의 검출을 위한 ELISA

항-PEG 항체의 페길화된 단백질, 예컨대, 페길화된 VWF의 검출 능력을 결정하기 위해, VWF-PEG ELISA를 전개하였다.

간략히, 기질(넌크 막시솔프 F96)을 항-VWF 항체로 코팅하고 감소하는 양의 페길화된 VWF와 배양하고 항-PEG 퍼옥시다아제 접합체와 배양하였다. 결합된 퍼옥시다아제는 슈어블루와의 색 반응에 의해 검출되었고 신호 강도는 희석액 내의 페길화된 VWF의 농도에 연관된다(도 5).

더욱 구체적으로, 하기의 실시예들은 페길화된 단백질의 측정 및 검출을 위해서 바람직하게는 토끼로부터 유래된 효소-접합된 항-PEG IgG과 함께, 바람직하게는 토끼로부터 유래된 단백질-특이적 항체를 사용하는 단백질-PEG ELISA를 설명한다. 기본적으로, 페길화된 단백질은 플레이트-고정된 항-단백질 항체에 의해 포획되고, 그 후 항-PEG IgG-퍼옥시다아제 접합체와 반응하도록 된다. 토끼 항-인간 VWF (다코사이토메이션(DakoCytomation) A-0082)을 소듐 카르보네이트 완충액, pH 9.6에서 1/500 희석하고 폴리스티렌 플레이트에 코팅하였다(실시예 1). 다르게는, 임의의 단일클론성 항체가 적합한 희석액에서 사용될 수 있다. 세척은 PBS를 사용하여 완료하였고, 희석 완충액은 겔라틴을 5 mg/mL으로 함유하였다. rVWF (샘플 A) 및 각종 페길화된 rVWF 제제(샘플 E, F, G)들을 희석 완충액으로 희석하여 0.85 mU/mL의 VWF:Ag 농도가 되었다. 샘플 A는 변형 전의 원래의 rVWF을 나타내는 반면, 제제 E, F 및 G는 페길화 시약 PEG-SS-5K을 1 mM, 2.5 mM and 7.5 mM의 몰농도에서 사용하여 제조하였다. 다섯 개의 추가적인 1+1 희석액들을 제조하고 플레이트-고정 항-VWF IgG로 배양하였다. 결합된 페길화된 rVWF를 항-PEG IgG 퍼옥시다아제 접합체와 퍼옥시다아제 기질 슈어블루와의 반응으로 검출하였다. 표 2는 측정된 상이한 제제의 용량-반응 곡선의 기울기 및 회귀 계수(regression coefficient)를 보인다. 명백히, 비-페길화된 rVWF (샘플 A)는 반응을 보이지 않은 반면, 3 개의 페길화된 rVWF 샘플들 E, F 및 G의 선형 용량-반응 곡선은 명백히 차이가 나는 기울기를 가졌다.

세 개의 페길화된 rVWF 제제들은 비-페길화된 rVWF에 비교하여 SDS PAGE 위에서 증가된 분자량을 나타냈다(도 5). 추가로, 페길화에 적용된 더 높은 PEG 대 rVWF의 비는 페길화된 rVWF 제제의 증가된 분자량과 더 가파른 용량-반응 곡선을 생성하였다. 따라서, 설명된 설계는 단백질-결합 PEG를 특이적으로 검출할 뿐만 아니라, 상이한 등급의 페길화된 제제의 분별도 허용하였다.

PEG 로의 억제에 의해 나타난 바와 같은 rVWF - PEG ELISA 의 특이성

PEG 분석법의 특이성을 측정하기 위해서, 억제 연구를 수행하였다.

본 분석법은 최고의 페길도를 갖는 페길화된 rVWF 제제 G를 사용하여 상술한 바와 같이 완료되었다(실시예 5 참조). 희석된 페길화된 rVWF 샘플(0.85 mU/mL)을 플레이트-고정화된 항-VWF 항체로 배양하고 난 후, PEG 5000 (50 mg/mL 내지 0.024 mg/mL)의 존재 하에 항-PEG IgG-퍼옥시다아제 접합체로 배양하였다. PEG 5000은 0.18 ㎍/mL의 IC₅₀에서 명백한 용량-의존적 억제를 유발했다(도 6).

PEG - PEG ELISA 의 설명

본 실시예는 페길화된 단백질 또는 자유 PEG를 포획하고 검출하기 위한 다중클론성 토끼 항-PEG IgG를 사용하는 PEG-PEG ELISA를 설명한다.

항-알부민-감손 토끼 항-PEG IgG를 pH 9.6, 0.1 M 소듐 카르보네이트 내에서 밤새 폴리스티렌 플리이트에 코팅하였다(실시예 1). 플레이트의 차단을 3 시간 동안 37 ℃에서 2 mM 벤즈아미딘 및 2 % 무-지방 건조 우유를 함유하는 PBS, pH 6.1로 수행하였다. 트윈 20(Tween 20) 또는 기타 폴리에톡시-함유 세제는 전체 분석에서 사용하지 않았다. 차단 완충액을 사용하여 하기의 샘플에 대한 일련의 희석액을 제조하였다: mPEG2-20K-NHS (코즐로우스키(Kozlowski) 등의 문헌[Biodrug 2001; 5: 419-29]에 설명된 것과 같은 안정한 2OK 페길화 시약) 및 이 시약을 사용하여 준비된 안정한 페길화된 rVWF (IU VWF:Ag 당 결합된 PEG 9.8 ㎍); 20K-PEG2-FMOC-NHS (US2008/0234193에 설명된 것과 같은 분지형 "분리가능" 2OK PEG 시약) 및 이 시약을 사용하여 준비된 분리가능한 20K-페길화된 rVWF (IU VWF:Ag 당 결합된 PEG 8.2 ㎍). PEG 시약들을 증류수에 10 mg/mL의 농도로 용해하고 활성 N-히드록시숙신 이미드(NHS)기를 가수분해하도록 밤새 실온에서 정치시켰다. 1 시간 동안 실온에서 플레이트-고정화된 항 PEG 항체에 샘플의 희석액이 결합하도록 했다. 그 후 플레이트를 세척하고 항-PEG IgG 퍼옥시다아제를 가했다. 마지막으로, 결합된 퍼옥시다아제 활성을 측정하였다. 모든 샘플들이 비록 다른 감도였지만, 선형 용량-반응 곡선을 나타냈다.(도 7) 페길화된 rVWF 제제를 결합 PEG의 낮은 ng 범위에서 측정할 수 있었다. 가수분해 후에 비-접합된 자유 PEG 시약들이 또한 이 분석 설계로 측정될 수 있으나, 선형 용량-반응 관계를 위해서는 더 높은 PEG 농도가 요구된다.

이러한 발견은 5K 페길화된 hSA로 면역화된 토끼에 의해 획득된 항-PEG IgG가 (i) 면역화에 사용된 5 k PEG에 결합할 뿐만 아니라, (ii) PEG 쇄 위에 존재하는 반복 에피토프에 결합하며, 단백질-PEG 연결 영역에는 결합하지 않는다는 것을 입증한다. 단백질-결합 PEG의 제거를 위한 전처리를 사용함으로써, 본 분석설계는 예컨대, 페길화 후의 반응 혼합물 내에 남아있는 자유, 비-접합 PEG의 측정에 유용하다. 추가로, 본 분석법은 정제된 PEG-단백질 접합체 내의 비-결합 PEG의 양을 측정하는데도 또한 유용하다.

PEG - PEG ELISA 의 특이성

상술한 PEG-PEG ELISA의 특이성을 상술한 분석 조건을 사용하여 나타내었다(실시예 7). 추가로, 비-페길화된 rVWF 샘플을 PEG-PEG 분석을 사용하여 분석하였고, 100 배 높은 VWF:Ag 농도에서조차 반응을 나타내지 않았다(도 8). 이러한 결과는 항-PEG 항체와 PEG-PEG 분석의 특이성을 입증한다.

안정한 페길화된 rVWF 의 측정을 위한 PEG -단백질 ELISA 의 설명

항-PEG 항체가 포획 항체로서 사용된 경우에 PEG-특이적 ELlSA가 민감한 검출 방법이 되는지 결정하기 위해, 페길화된 단백질을 포획하는데 항-PEG 항체를, 그리고 결합 페길화 단백질을 단백질-특이적 항체를 검출하는데 사용하는 PEG-단백질 ELISA를 전개하였다.

알부민-감손 항-PEG IgG를 0.1 M 카르보네이트 완충액, pH 9.6으로 약 50 ㎍/mL로 희석하고, 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트(넌크 막시솔프 F69)의 웰에 코팅하였다. 그 후 2 시간 동안 37 ℃에서 웰들을 희석 완충액(PBS 안의 3 % 무-지방 건조 우유, 2 mM 벤즈아미딘; pH 6.1)으로 차단하였다. 샘플들의 일련의 희석액을 그 후 적재하고, 웰들로 60 분 동안 실온에서 배양하였다. 세척 후에, 토끼 항-인간 VWF-퍼옥시다아제 (다코사이토메이션)를 첨가하고 슈어블루로 결합 퍼옥시다아제 활성을 측정하였다. 다르게는, 퍼옥시다아제 접합체를 샘플에 첨가하고 선행하는 세척 단계 없이 단일 배양 다층 면역 기술(SIMIT)을 사용하여 배양하였다. 안정한 20K-페길화된 rVWF 제제를 사용했다(실시예 7 참조). PEG-VWF ELISA 분석법의 강건성(robustness)은 폰 빌레브란트 결핍(VWD) 쥐 혈장(혈장 내의 VWF의 최종 농도는 90 %였다)내에서의 이 제제의 희석 및 실시예 7 에 설명된 것과 같은 PEG 시약의 첨가(PEG 시약의 최종 농도: 0.5 IU 페길화된 VWF에서 1 mg/mL) 및 rVWF(rVWF의 최종 농도: 5 IU 페길화된 rVWF에서 7 IU)에 의해 나타난다. 모든 샘플에 대해 순차적인 분석 포맷을 사용하는 경우, 그리고 SIMIT 포맷에 대해서 27 내지 1.7 ng/mL 결합 PEG 범위에서 선형 용량-반응 곡선을 획득했다(도 9).

비-접합된 PEG 시약의 존재 또는 비-페길화된 rVWF의 잉여는 본 분석을 손상시키지 않았다. 또한, VWD 쥐 혈장의 매트릭스도 간섭하지 않았다. 따라서, 본 분석은 PEG-단백질 접합체의 강건성 및 민감성 검출을 입증했다.

분리가능한 페길화된 rVWF 의 측정을 위한 PEG -단백질 ELISA 의 설명

상술한 강건성 연구(실시예 9 참조)를 또한 분리가능한 2OK 페길화된 rVWF 제제로도 수행하였다(실시예 7 참조). 분리가능한 2OK-페길화된 rVWF 제제에 대해서 21 내지 1.3 ng/mL 선형 범위에서 유사한 결과가 얻어졌고(도 10), 어떠한 화합물의 간섭도 검출되지 않았다. 이러한 자료는 PEG 부분을 단백질에 부착하기 위해 사용한 연결자가 PEG-단백질 접합체의 검출/측정에 영향을 끼치지 않았음을 입증한다.

단백질-결합 PEG 에 대한 PEG -단백질 ELISA 의 특이성

PEG-단백질 ELISA의 특이성을 비-접합된 PEG 시약 및 상술한 바와 같이 페길화된 rVWF 제제의 직접적인 측정에 의해 나타내었다.

두 경우 모두에서, 안정하고 분리가능한 시약 및 접합체를 사용하였다. 두 개의 페길화된 rVWF 제제는 모두 유사한 용량-의존적 반응을 보인 반면, 10-배 높은 농도에서 측정한 두 개의 시약은 모두 용량-의존적 신호를 나타내지 않았다(도 11). 이러한 자료는 PEG-단백질 ELISA가 PEG-단백질 접합체를 특이적으로 검출하고 측정한다는 것을 입증한다.

PEG - rFVIII ELISA 의 특이성

본원에 설명된 PEG ELlSA가 추가적인 혈액 응고 인자에 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, PEG-단백질 ELISA에 일반적으로 적용되는 원칙을 상술한 바와 같은 분석 조건을 사용하여 페길화된 rFVIII 제제를 분석함으로써 나타냈다(실시예 9).

항-인간 FVIII 퍼옥시다아제(세더라인(Cedarlane))를 플레이트-결합 페길화된 rFVIII를 검출하는데 항-인간 VWF 퍼옥시다아제 대신에 사용하였다. 1000-배 더 높은 FVIII:Ag 농도에서 분석한 경우에조차 비-페길화된 rFVIII가 어떠한 신호도 나타내지 않았기 때문에 결과들은 PEG-rFVIII ELISA가 특이적임을 나타냈다(도 12).

안정하고 분리가능한 페길화된 rFVIII 으로의 PEG - rFVIII ELISA

PEG ELISA의 특이성을 PEG-FVIII의 안정한 그리고 분리가능한 제제에 대해서 또한 측정하였다.

알부민-감손 항-PEG IgG를 0.1 M 카르보네이트 완충액, pH 9.6으로 약 50 ㎍/mL로 희석하고, 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트의 웰에 코팅하였다. 그 후 2 시간 동안 실온에서 웰들을 희석 완충액(PBS 안의 3 % 무-지방 건조 우유, 2 mM 벤즈아미딘; pH 6.1)으로 차단하였다. 그 후 샘플들의 일련의 희석액을 적재하고, 웰들로 60 분 동안 실온에서 배양하였다. 세척 후에, 양(sheep) 항-인간 FVIII-퍼옥시다아제 (세더라인)을 첨가하고 슈어블루로 결합 퍼옥시다아제 활성을 측정하였다. 안정한 그리고 분리가능한 20K-페길화된 rFVIII 제제를 사용했다. 이러한 제제들은 각각 115 ㎍/mL 및 301 ㎍/mL의 결합 PEG 농도를 가졌다. 표 3은 이러한 샘플들의 분석에 의해 획득한 측정 자료를 나타내고 회귀 곡선의 특징을 가진다.

안정한 페길화된 그리고 분리가능한 페길화된 rFVIII 제제 모두의 분석은 결합 PEG의 나노그램 범위에서 선형 용량-반응 곡선을 생성한다. 추가로, 분석법은 분리가능한 페길화된 rFVIII 제제에 나타난 것과 같이 양호한 재현성을 가지며, 이는 페길화된 FVIII의 정확한 측정을 가능케한다.

분석 수행 상의 상이한 항- FVIII 퍼옥시다아제 접합체의 영향

분석 수행 상의 상이한 항-FVIII 퍼옥시다아제 접합체의 영향을 조사하였다.

상술한 바와 같이 PEG-rFVIII ELISA를 수행하였다(실시예 13 참조). 아세라크롬 및 세더라인(Asserachrom and Cedarlane)으로부터의 항-인간 FVIII 퍼옥시다아제 접합체의 검출을 동일한 분석법에서 비교하였다(도 13). 두 경우 모두에서, 샘플의 FVIII:Ag 수준 및 신호 사이에서 선형 용량-반응성 관계를 획득하고, 두 개의 접합체가 모두 상호교환적으로 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.

이러한 결과들은 PEG ELISA가 적절한 선택성으로 항-단백질 항체 접합체의 임의의 제제에서 유용하다는 것을 시사한다.

FVIII -결핍 생쥐 혈장 및 쥐 혈장에서의 PEG - FVIII ELISA 의 성능

FVIII-결핍 생쥐 혈장 및 쥐 혈장에서 PEG-rFVIII ELISA의 효능 및 감도를 조사하였다.

분리가능한 페길화된 rFVIII 제제를 동물의 혈장 내 또는 희석 완충액 내의 0.5 ㎍ 결합 PEG/mL 농도 당량에서 스파이킹(spike)하였다. 생성된 이들 샘플들의 용량-반응 곡선(도 14)은 완충액 및 동물 혈장에서 매우 유사했다. 추가로, 안정한 페길화된 rFVIII를 FVIII-결핍 생쥐 혈장에 스파이킹하고, 50 ng/mL의 결합 PEG 수준으로 1/10 및 1/20으로 희석하였다. 스파이킹된 농도의 99.8 % 및 97.9 %의 회수율을 측정하였다. 이는 PEG-rFVIII ELISA가 적절한 샘플 희석을 제외한 어떠한 특이적인 샘플 전처리를 필요로 하지 않고 분리가능한 페길화된 rFVIII의 약동학을 높은 감도로 그리고 특이성있게 모니터링하는데 유용함을 입증한다. 페길화된 rVWF의 샘플을 분석한 경우에 유사한 자료가 얻어졌다.

상이한 페길화도를 갖는 분리가능한 페길화된 rFVIII 제제의 측정

상이한 페길화도를 갖는 분리가능한 페길화된 rFVIII 제제를 PEG-FVIII ELISA으로 측정하였다.

상술한 바와 같이 ELISA를 수행하였다.(실시예 13 참조) 추가로, 이들 제제의 FVIII:Ag 수준을 상업적으로 입수가능한 FVIII ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 이들 제제의 페길화도를 HPLC-기반 방법을 사용하여 측정하고 FVIII 몰 당 결합 PEG 몰로 표현하였다. 페길화된 FVIII 제제를 희석 완충액 또는 FVIII-결핍 생쥐 혈장에 첨가하고 이들 샘플들을 PEG-FVIII ELISA로 측정하였다. 그 후, PEG rFVIII ELISA로 측정된 결합 PEG의 농도를 이들 샘플들의 FVIII:Ag 농도로 정규화하고 U FVIII:Ag 당 ㎍ 결합 PEG로 표현하였다. 이들 FVIII:Ag-정규화된 PEG 농도는 완충액 내 및 FVIII-결핍 생쥐의 혈장 내에서 HPLC-기반 방법으로 상이한 제제에 대해 측정된 페길화도와 잘 연관된다.(도 15)

이들 결과는 PEG-rFVIII ELISA가 페길화된 rFVIII 제제를 그들의 페길화도에 따라 식별할 수 있음을 보이며, 공지된 표준에 대한 샘플의 흡수율의 비교는 단백질 샘플의 페길화도를 나타낸다. 추가적으로, 이들 결과는 완충액 내 및 FVIII 결핍 생쥐 혈장의 매트릭스 내에서 달성되고, 분석법은 시험 샘플의 적절한 희석을 제외한 어떠한 특이적 샘플 전처리도 요구하지 않는다. 이는 페길화된 단백질 또는 페길화된 치료 단백질을 수용하는 환자의 혈청 내 다른 PEG 수준을 측정하는 방법을 제공한다.

PEG - FVIII ELISA 에의 자유 PEG 의 영향

PEG ELISA 분석에의 자유 PEG의 가능한 간섭을 최대 1000 ㎍/mL 범위의 PEG 농도에서 조사하였다.

분리가능한 페길화된 rFVIII 제제를 20K-PEG2-FMOC-NHS와 혼합하여 20, 100, 200, 500 및 1000 ㎍/mL의 최종 농도를 수득하였다. PEG 시약을 증류수에 용해하고 페길화된 rFVIII 제제에 첨가하기 전에 밤새 정치시켜서 NHS 활성을 파괴하였다. 이들 샘플들에 대해 획득한 용량-반응 곡선은 매우 유사하였으며(도 16), 그들의 기울기는 10 % 미만으로 차이났다.

본 분석법은 높은 수준의 자유 PEG 조차 PEG-rFVIII ELISA의 검출 수준에 영향을 미치지 못함을 나타낸다.

분리가능한 페길화된 rFVIII 로부터의 PEG 분리의 측정

위에 나타낸 바와 같이, PEG ELISA는 단백질-PEG 접합체로부터의 PEG 중합체의 분리를 측정한다. 분석법이 분리 속도를 측정할 수 있는지 결정하기 위해서, 단백질-결합 PEG의 분리를 촉발시키는 조건 하에 유지된 분리가능한 페길화된 rFVIII 제제를 사용하여 시간에 따른 PEG 분리를 특정하였다.

자유 PEG의 수준을 크기-배재 크로마토그래피로 측정하였다. 단백질-결합 PEG의 수준을 PEG-FVIII ELISA로 측정하고 이들 샘플들의 FVIII:Ag 농도에 연관지었다. FVIII:Ag 정규화된 FVIII-결합 PEG 수준은 자유 PEG의 수준과 양호한 연관관계에 있었다(도 17 참조).

이들 실험은 분리가능한 페길화된 rFVIII 제제로부터의 PEG의 분리를 PEG-FVIII ELISA로 모니터링하는 것이 가능하다는 것을 입증한다. 본 분석법은 페길화된 FVIII 또는 기타 페길화된 치료 단백질을 수용하는 환자에 대해 생체 내 페길화된 단백질의 분리 속도(release kinetic)를 측정하는데 유용하다.

정상 풀링된 쥐 혈장에서의 페길화된 rFVIIa 의 검출

단백질 또는 단백질 복합체의 페길화 수준을 결정하는 다른 방법은 복합체 그 자체의 분자량에 기초한 단백질-중합체 복합체의 검출을 포함한다. 이러한 타입의 분석은 단백질의 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분리 및 항-PEG 웨스턴 블롯 검출 방법을 사용한 단백질 상의 PEG 분자의 검출을 사용하여 수행된다.

이러한 기술을 사용한 혈장 내의 페길화된 단백질 검출을 결정하기 위해, 페길화된 FVIII의 샘플을 쥐 혈장에서 희석하고 페길화된 단백질 수준을 측정하였다.

20-kDa-PEG-FVIIa 및 40-kDa-PEG-FVIIa의 샘플들을 쥐 혈장 (스프라귀 다우레이(Sprague Dawley)) 내에서 100 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 25 ㎍/ml, 12.5 ㎍/ml 및 6.3 ㎍/ml으로 희석하고, 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯을 하였다. 완충액 샘플(누페이지 LDS(NuPAGE LDS) 샘플 완충액, 인브트로겐(Invitrogen))을 혈장 내에서 희석된 생성물 1 ㎕에 첨가하고 성분 (3-8 %) 트리스-아세테이트 SDS 폴리아크릴아미드 겔(누페이지 노벡스(NuPage Novex), 1.0 mm; 인비트로겐(Invitrogen)) 위에 적재하였다. 전기영동을 비-환원성 조건 하에서 트리스-아세테이트 SDS 러닝 완충액에서 수행하였다. 단백질을 16 시간 동안 +4 ℃에서 1.25 W로 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF, 0.2 ㎛) 막(미국, 캘리포니아주, 리치몬드, 바이오-라드, 세퀴-블롯 PVDF(Sequi-Blot PVDF) 막) 위에 블롯팅(blot)하였다. 그 후에 막을 카세인-TBS 용액(미국, 일리노이주, 록포드, 피어스(Pierce))에서 +37 ℃에서 1 시간 동안 차단하였다.

그 후에, 면역블롯들을 단일클론성 토끼 항-PEG 항체(미국, 캘리포니아주, 에피토믹스(Epitomics))와 배양하고, 실온에서 2 시간 동안 1/1000 희석하였다. 항체를 TBS + 0.05 % 트윈20 (TBST) + 10 % 카세인-TBS에서 희석하였다. TBST로의 5 세척 단계 후에, 각각에 대해 10 분간, 제2 항체 염소 항-토끼 IgG (H+L)-고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 접합체를 가하고(덴마크, 글로스트럽(Glostrup), 다코 사이토메이션), 실온(RT)에서 1 시간 동안 TBST/10 % 카세인-TBS에서 1/1000 희석하였다. TBST로의 5 세척 단계 후에, 블롯들을 제조업자(영국, 버킹엄셔, GE 헬쓰케어)의 메뉴얼에 따른 증강된 화학발광(ECL) 플러스 검출 키트(Plus Detection Kit)를 사용하여 전개하였다.

검출을 위해, 덜 민감한 ECL 웨스턴 블롯팅 시약을 사용하여 페길화된 단백질을 시각화하였다. 이러한 기술로도, 페길화된 단백질은 적용된 모든 농도에서 검출가능했다. 제2 항체는 쥐 면역글로불린과 교차-반응을 보였다(도 18에서 *로 표지된 밴드). 이러한 교차반응은 겔에의 적용에 앞선 면역글로불린에 대한 쥐 혈장의 이뮤노디플레이션(immunodepletion)에 의해 회피될 수 있다.

정상 인간 혈장 내의 페길화된 rFVIIa 의 검출

인간 혈장 내의 페길화된 단백질의 검출을 결정하기 위해, 페길화된 FVIII의 샘플들을 희석하고 페길화된 단백질 수준을 측정하였다.

20-kDa-PEG-FVIIa의 샘플을 풀링된 정상 인간(조지 킹 바이오-메디칼(George King Bio-Medical)) 혈장 내 또는 5 % HSA/HNa 완충액 (25 mM HEPES, 175 mM NaCl, pH 7.35)에서 5 ㎍/ml 및 2.5 ㎍/ml로 희석하였다. ECL 플러스 검출 시스템을 사용하고 필름을 매우 단시간(30 초) 동안 노출시켰다(도 2b). 이들 샘플들에 대해, 3-8 % 트리스-아세테이트 구배 겔을 사용한 SDS-PAGE 후에 웨스턴 블롯 분석을 하였다. ECL 플러스 검출 시스템을 사용하여 밴드를 시각화하였다.

비교를 위해, 4-12 % 비스-트리스 구배 겔을 사용한 SDS-PAGE 후에 항-PEG 항체(TBS/0.05 % 무지방 건조 우유 (바이오-라드) 내에서 1/300 희석) 및 TBST/0.1 % 무지방 건조 우유에서 1/2000 희석된 다중클론성 양 항-인간 FVII 항체(캐나다, 온타리오주, 어피니티 바이올로지컬즈(Biologicals))로 검출한 20-kDa-PEG-FVIIa의 100 및 50 ng의 웨스턴 블롯 분석을 하였다. 알칼리 포스파타제 (ALP) 시스템을 적용하여 단백질을 시각화하였다.(도 19A)

페길화된 rFVIIa가 완충액 내 또는 혈장 내에서 희석되었는지와는 무관하게 검출가능성에 차이가 없었으며, 인간 혈장과의 약한 교차 반응만이 관찰되었다(도 19B). 이들 결과는 본 방법이 많은 상이한 단백질들, 예컨대 인간 혈장을 포함하는 샘플 내 낮은 수준의 접합된 단백질을 검출하는데 적절하게 민감하고, 따라서 응고 질병을 치료하기 위하여 혈액 응고 인자를 수용한 환자로부터 취한 샘플 중합체-접합된 단백질을 검출하는데 유용하다는 것을 입증한다.

정상 인간 혈장 내의 20- kDa - PEG - rFVIIa 의 시험관 내 PEG -분리의 검출

페길화는 단백질의 생물학적 기능을 일반적으로 감소시킨다. 그럼에도, 시간에 따라 단백질로부터 분리될 가능성을 가지는, 가역적으로-연결된 PEG로 단백질을 변형시키는 것은 원래의 단백질을 해방시키며, 이는 이의 활성의 완전한 회복에 수반된다. 이러한 과정은 시간에 따른 혈장 내 활성의 증가를 측정함으로써 모니터링된다. 그러나, 측정된 활성은 단백질의 불활성화/제거 및 분리 반응의 속도에 의존한다. 본 발명은 또한 혈장 매트릭스 내의 이러한 단백질의 탈-페길화를 포함하는 구조적 변화를 측정하는데 적합하다.

분리가능한 20-kDa-PEG-rFVIIa 접합체를 정상 인간 혈장 내에서 0.023 ㎍/ml로 희석하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. PEG 분자의 분리는 실시예 1에서 설명한 특이적 항-PEG 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석 및 SDS-PAGE에 의해 결정되었다. 도 20에 보인 바와 같이, 디-페길화된 rFVIIa의 양은 시간에 따라 서서리 감소하였고, 배양 24 시간 후에 완전히 사라졌다. 이와 대조적으로, 모노-PEG 종은 약간의 증가를 처음에 보였고 24 시간 후에도 여전히 존재했다. 따라서, 본 방법은 단백질 분자의 순차적인 탈-페길화를 검출한다.

이러한 결과는 본 방법이 단백질 또는 단백질 복합체 표면의 수용성 중합체의 등급을 결정케하고, 단백질로부터 분리가능한 수용성 중합체의 분리 메카니즘의 결정을 허용케 한다는 것을 설명한다.

정상 인간 혈장에서의 페길화된 FVIII 의 검출

페길화도에서의 변화를 검출하는 본 분석법의 능력을 결정하기 위해, 상이한 페길화도를 나타내는 상이한 PEG 시약과 접합된 두 개의 FVIII 샘플을 인간 혈장 안에서 희석하고 분자의 검출을 측정하였다.

샘플들을 5 내지 1 ㎍/ml 범위 내로 희석하고 3-8 % 구배 트리스-아세테이트 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 적재한 후, 웨스턴 블롯 분석을 하였다. 안정한 20-kDa PEG-FVIII 접합체의 페길화도(PD)는 3.7(도 21a)이었으며, 동일한 PEG 타입의 분리가능한 것의 그것은 6이었다(도 21b).

도 21에 나타난 바와 같이, 더 높은 페길화도는 동일한 전개 조건을 사용한 때 더 강한 신호를 생성했다.

이들 결과는 본원에 설명된 약동학적 연구에서 페길화된 단백질을 추적하는 새로운 방법이 그들의 도메인 구조 및 페길화도에서의 변화를 검출할 수 있음을 나타낸다.

상기 설명적인 실시예에서 제시된 본 발명 내에서 수많은 변형 및 변경이 당업자에게 일어날 것으로 예상된다. 결론적으로, 본 발명에 대해서는 오직 첨부된 청구항에 나타난 바와 같은 이러한 제한만이 적용되어야 한다.

Claims

(i) 단백질에 결합된 하나 이상의 중합체를 갖는 중합체:단백질 접합체 및
(ii) 상기 중합체:단백질 접합체에 결합된 경우 검출가능한, 상기 중합체에 특이적으로 결합하는 항체
사이의 결합 검출 단계
를 포함하고, 공지된 대조군과 비교하는 경우 중합체:단백질 접합체 내의 중합체의 수가 중합체:단백질 접합체에 결합된 검출된 항체의 수준에 연관되는, 중합체-단백질 접합체 내의 단백질 또는 단백질 복합체에 결합된 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자 수의 결정 방법.
제1항에 있어서, 상기 항체가 검출가능한 표지를 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 검출가능 표지가 효소, 방사성 표지, 형광단, 전자 밀집 시약, 비오틴, 디곡시제닌, 합텐 및 임의의 이들 표지의 첨가에 의해 검출가능하게 만들어진 단백질로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중합체:단백질 접합체가 항체에 결합하기에 앞서 운반자 매트릭스에 결합하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 기질이 마이크로운반자, 입자, 막, 스트립, 종이, 필름, 비드 또는 플레이트로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
제4항에 있어서, 상기 검출된 항체의 수준이 검출가능한 표지의 흡광도로 측정되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중합체:단백질 접합체가 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 단리되고, 검출에 앞서 막에 이송되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 중합체:단백질 접합체 내의 중합체의 수가 공지된 대조군과 비교한 단백질-중합체 접합체의 분자량을 기초로 계산되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 중합체-단백질 복합체의 분자량이 중합체 분자를 포함하는 단백질 서브유닛과 연관되는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 또는 단백질 복합체가 혈액 응고 인자 또는 혈액 응고 인자 복합체인 방법.
제10항에 있어서, 상기 혈액 응고 인자 또는 혈액 응고 인자 복합체가 인간인 방법.
제10항에 있어서, 상기 혈액 응고 인자가 인자 II, 인자 III, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자, 단백질 C 및 안티트롬빈 III로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
제11항에 있어서, 상기 혈액 응고 인자 복합체가 인자 VIII:VWF인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 분리가능한 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 가수분해성인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레피닉 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파스파젠, 폴리옥사졸린 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린)으로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 그의 유도체인 방법.
제17항에 있어서, 상기 PEG가 3 내지 100 kDa인 방법.
제18항에 있어서, 상기 PEG의 분자량이 약 5 kDa 내지 약 60 kDa 범위인 방법.
제18항에 있어서, 상기 PEG의 분자량이 약 5 kDa 내지 약 40 kDa 범위인 방법.
제18항에 있어서, 상기 PEG의 분자량이 약 5 kDa 내지 약 15 kDa 범위인 방법.
제18항에 있어서, 상기 PEG의 분자량이 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위인 방법.
생리학적으로 수용가능한 중합체를 상기 중합체와 특이적으로 결합하는 항체와 접촉하는 단계를 포함하고, 상기 항체가 상기 중합체와 결합된 경우 검출가능하며, 항체에 의해 결합된 중합체의 수가 공지된 대조군과 비교하는 경우 결합된 검출된 항체의 수준에 연관되는, 단백질 또는 단백질 복합체에 결합되거나 용액 내에서 자유로운 생리학적으로 수용가능한 중합체 분자 수의 결정 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 다중클론성 항체인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 단일클론성 항체인방법.