JP2011508884A - 生理学的に許容されるポリマー分子を特異的に検出するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定するための方法、生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる抗体または他の組成物、および前記抗体または組成物を含むキットに関する。一実施形態において、ポリマー−タンパク質結合体中のタンパク質またはタンパク質複合体に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の数を決定するための方法が提供され、この方法は（ｉ）該タンパク質に結合した１つ以上のポリマーを有するポリマー：タンパク質結合体と（ｉｉ）該ポリマーに特異的に結合する抗体であって、該抗体は、該ポリマー：タンパク質結合体に結合している場合に検出可能である、抗体との間での結合を検出する工程を包含する。

Description

この出願は、２００７年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／００９，３２７号（これは、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定するための方法、生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる抗体、および上記抗体を含むキットに関する。

発明の背景
タンパク質のインビボでの機能は、それを生理学的に許容されるポリマー分子に結合させることによって改善される。特に、生理学的に許容されるポリマー分子に対する生理学的に活性なタンパク質の結合は、そのインビボでの半減期を実質的に長くすることが明らかにされている。例えば、特許文献１には、生理学的に許容されるポリマー分子の第ＶＩＩＩ因子に対する結合により、トロンビンによって活性化させることができ、そして実質的に低下した抗原性および免疫反応性と、哺乳動物の血流の中での実質的に延長したインビボでの消失時間とを持つ第ＶＩＩＩ因子タンパク質が生じることが記載されている。

特許文献１には、ポリマー分子（デキストラン）の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）への結合により、トロンビンによって活性化させることができ、そして、実質的に低下した抗原性および免疫反応性と、哺乳動物の血流の中での実質的に延長したインビボでの保持時間とを持つＦＶＩＩＩタンパク質が生じることが記載されている。特許文献２には、第ＶＩＩＩ因子の生理学的に許容されるポリマー分子への結合により、（ｉ）インビボでの加水分解に対するその耐性が増大し、したがって投与後のその活性が長く持続することによって、（ｉｉ）未修飾のタンパク質よりもインビボでのその循環寿命が有意に長くなることによって、および（ｉｉｉ）血流へのその吸収時間が長くなることによって、第ＶＩＩＩ因子のインビボでの機能が改善されることが記載されている。特許文献３には、ＦＶＩＩＩと第ＩＸ因子（ＦＩＸ）との結合体が記載されており、ここでは、このタンパク質は、タンパク質中にあるカルボニル基を介してポリ（アルキレンオキサイド）に共有結合させられている。さらに、生理学的に許容されるポリマー分子（特に、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」））に第ＩＸ因子を結合させることによる第ＩＸ因子のインビボ機能の改善は、特許文献４に記載されている。特異的活性を保持しているＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、特許文献５に開示されている。生理学的に許容されるポリマーの活性物質（例えば、タンパク質）への結合は、安定なポリマー−タンパク質結合体、あるいは生理学的に許容されるポリマーが放出することができる共有結合（プロドラッグの概念）、すなわち、加水分解することができるかまたは放出することができるリンカーを介してタンパク質に結合させられたポリマー−タンパク質結合体を調製することによって行われる。例えば、放出することができるＰＥＧ部分が、２つのＰＥＧ鎖を含む９−フルオレンメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）結合システム（Ｎｅｋｔａｒ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ）を使用して開発されている。加えて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基（これは、タンパク質のリジン残基の化学修飾に有用である）をメトキシカルボニル基を介してフルオレン環システムに連結させて、放出することができるＰＥＧ部分を作製することができる。特許文献６（引用により本明細書中に組み入れられる）には、放出することができるＰＥＧの概念に基づくＰＥＧ化された組み換え体ＦＶＩＩＩ変異体のシリーズが記載されている。

しかし、現在のところ、タンパク質またはナノ粒子に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の定量のための信頼できる方法は、感度の低い比色法を除いて存在しない（非特許文献１）。比色法は、生理学的に許容されるポリマー分子の含有量を予測ができるにすぎない。さらに、ＰＥＧ濃度の決定のためのモノクローナル抗体が開示されている（特許文献７）が、今までのところ、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量の信頼できる決定に利用できるシステムはない。

米国特許第４，９７０，３００号明細書 国際公開第９４／１５６２５号 米国特許第６，０３７，４５２号明細書 国際公開第９４／２９３７０号 国際公開第２００７／１２６８０８号 国際公開第２００８／０８２６６９号 米国特許第６，６１７，１１８号明細書

Ｎａｇら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９７）２５０：３５−４３

したがって、タンパク質（特に、生理学的に活性なタンパク質）に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子（特に、ＰＥＧ）の量を決定するための新規のシステムが必要とされている。

本発明は、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定するための方法に関する。さらに、生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる抗体（ここでは、例えば、上記ポリマー分子は、タンパク質に結合させられた状態で存在する）が本発明にしたがって提供される。さらに、本発明は、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定するための上記抗体の使用に関する。

１つの態様では、本発明により、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定するための方法が提供される。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられた少なくとも１つのタンパク質を提供する工程；（ｂ）上記生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗体を提供する工程；（ｃ）上記タンパク質に結合させられた少なくとも１つのポリマー分子に対する上記抗体の結合に適している条件下で、工程（ｂ）の抗体を工程（ａ）のタンパク質と接触させる工程；および（ｄ）抗体と生理学的に許容されるポリマー分子との間での複合体の形成を検出する工程。

１つの実施形態では、工程（ａ）において、少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられたタンパク質は、基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）または担体マトリックス上に固定される。

１つのさらなる実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる群より選択される。

別の実施形態では、タンパク質は、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）またはその誘導体である。１つのさらなる実施形態では、タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子またはその誘導体である。

いくつかの実施形態では、生理学的に許容されるポリマー分子は、以下からなる群より選択される：ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）。関連する実施形態では、生理学的に許容されるポリマー分子は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体である。

別の態様では、本発明により、生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる抗体が意図される。１つの実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。

関連する実施形態では、生理学的に許容されるポリマー分子がタンパク質に結合させられる。１つのさらなる実施形態では、タンパク質は、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）またはその誘導体である。別の実施形態では、生理学的に許容されるポリマー分子は、以下からなる群より選択される：ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（□−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）。関連する実施形態では、生理学的に許容されるポリマー分子は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体である。

さらなる態様では、本発明により、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定するためのキットが提供され、これには、本明細書中に記載されるような抗体が含まれる。

別の態様では、本発明により、ポリマー−タンパク質結合体中のタンパク質またはタンパク質複合体に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の数を決定するための方法が提供される。この方法には、（ｉ）該タンパク質に結合した１つ以上のポリマーを有するポリマー：タンパク質結合体と（ｉｉ）上記ポリマーに特異的に結合する抗体との間での結合を検出する工程が含まれる。上記抗体は、上記ポリマー：タンパク質結合体に結合していると検出することができ、ここでは、ポリマー：タンパク質結合体中のポリマーの数は、既知の対照と比較した、ポリマー：タンパク質結合体に結合した検出される抗体のレベルと相関関係がある。

１つの実施形態では、抗体には検出可能な標識が含まれる。関連する実施形態では、検出可能な標識は、酵素、放射性標識、フルオロフォア、電子密度試薬、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、およびこれらの標識のいずれかの付加によって検出可能になるタンパク質からなる群より選択される。

１つのさらなる実施形態では、ポリマー：タンパク質結合体は、抗体との結合の前に担体マトリックスに結合させられる。特定の実施形態では、担体マトリックスは、マイクロキャリア、粒子、メンブレン、細片、紙、薄膜、ビーズ、またはプレートからなる群より選択される。関連する実施形態では、ポリマー：タンパク質結合体は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して単離され、そして検出の前にメンブレンに移される。１つのさらなる実施形態では、ポリマー−タンパク質複合体の分子量は、ポリマー分子を含むタンパク質サブユニットと相関関係がある。

なお別の実施形態では、検出される抗体のレベルは、検出可能な標識の吸光度として測定される。関連する実施形態では、ポリマー：タンパク質結合体中のポリマーの数は、既知の対照と比較したタンパク質−ポリマー結合体の分子量に基づいて計算される。既知の対照についてポリマー分子を測定するための例示的な方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および質量スペクトル法が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の１つの実施形態では、タンパク質またはタンパク質複合体は、血液凝固因子または血液凝固因子複合体である。関連する実施形態では、血液凝固因子または血液凝固因子複合体はヒトのものである。なおさらなる実施形態では、血液凝固因子は、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩ、およびそれらの活性化形態からなる群より選択される。別の実施形態では、血液凝固因子複合体は、第ＶＩＩＩ因子：ＶＷＦである。

特定の実施形態では、ポリマーは放出することができる。関連する実施形態では、ポリマーは加水分解することができる。１つの実施形態では、生理学的に許容される分子は、リンカーを介してタンパク質またはタンパク質複合体に結合させられる。

１つの実施形態では、ポリマーは、以下からなる群より選択される：ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）およびポリ（β−ヒドロキシ酸））、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、ならびにポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）。

関連する実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である。別の実施形態では、ＰＥＧは、約３ｋＤａ〜約２００ｋＤａである。１つのさらなる実施形態では、ＰＥＧは、約５ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲の分子量を持つ。別の実施形態では、ＰＥＧは、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲の分子量を持つ。なお別の実施形態では、ＰＥＧは、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲の分子量を持つ。そして、なおさらなる実施形態では、ＰＥＧは、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲の分子量を持つ。本明細書中で使用が意図されるさらなるＰＥＧ組成物としては、約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、および約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの範囲にあるＰＥＧ、ならびに、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５５ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約８５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約９５ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約１６０ｋＤａ、約１７０ｋＤａ、約１８０ｋＤａ、約１９０ｋＤａ、または約２００ｋＤａの分子量を持つＰＥＧが挙げられるがこれらに限定されない。

別の態様では、本発明により、タンパク質もしくはタンパク質複合体に結合させられたか、または溶液中に遊離している生理学的に許容されるポリマー分子の数を決定するための方法が提供される。この方法には、上記ポリマーを上記ポリマーに特異的に結合する抗体と接触させる工程が含まれ、上記抗体は、上記ポリマーに結合すると検出可能であり、ここでは、抗体が結合したポリマーの数は、既知の対照と比較した、結合した検出される抗体のレベルと相関関係がある。

関連する態様では、本発明により、タンパク質またはタンパク質複合体に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の数を決定するための方法が意図される。この方法には、上記タンパク質またはタンパク質複合体を、上記タンパク質またはタンパク質複合体に特異的に結合する抗体と接触させる工程が含まれ、上記抗体は、上記タンパク質またはタンパク質複合体に結合すると検出可能であり、ここでは、抗体が結合したポリマーの数は、既知の対照と比較した、結合した検出される抗体のレベルと相関関係がある。

関連する実施形態では、本発明の方法はＥＬＩＳＡ技術を使用して行われる。ＥＬＩＳＡ試薬が以下のように使用されることが意図され、ここでは、列挙される第１の抗体は、基体に結合させられた抗体であり、第２の抗体は検出可能な抗体に結合させられる。タンパク質またはタンパク質複合体に結合させられたポリマーの数を検出するために有用な例示的なアッセイとしては、抗ポリマー−抗タンパク質検出法、抗タンパク質−抗ポリマー検出法、または抗ポリマー−抗ポリマー検出法が挙げられる。ここでは、抗ポリマー抗体は、それぞれの結合工程について同じ抗体であるか、またはそれぞれの工程について異なるポリマー特異的抗体である。関連する実施形態では、アッセイは、抗ポリマー特異的抗体または抗タンパク質特異的抗体だけを使用して行われる。

図１は、抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳ（ＰＥＧ化ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ））についての直接の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を示す。ウサギに、約３８０μｇ／ｍｌのタンパク質と２５０μｇ／ｍｌのＰＥＧ濃度を持つ抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳの調製物を接種した。全ての動物の血清試料を、開始前と開始後３週間および４週間で採取し、続いて、抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳに対する検出可能な抗体の形成について試験した。抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳを、０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中で、１μｇ／ｍｌで表面上にコーティングした。試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液中に希釈し、ウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体とともに、Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＩＭＩＴ）を使用してインキュベートした。光学密度（ＯＤ）（縦軸）を、それぞれの試料の対数希釈率（横軸）について示す：黒塗りの三角、ＳＰＦ（正常なウサギ血清）；黒塗りの菱形、０週でのプール（４匹の動物、実験前）；黒塗りの四角、３週でのプール（４匹の動物）；黒塗りの丸、４週でのプール（４匹の動物）。 図２は、ＰＥＧによる抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳについての直接のＥＬＩＳＡの阻害を示す。ウサギを抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳで免疫化し、血清試料を図１に記載するように調製した。抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳを、０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中で、１μｇ／ｍｌで表面上にコーティングした。試料を、ＰＢＳ−ゼラチン緩衝液またはＰＢＳ−ゼラチン−１％のＰＥＧ ５０００緩衝液（＋１％のＰＥＧ）中に希釈し、そしてウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＳＩＭＩＴ）とともにインキュベートした。光学密度（ＯＤ）（縦軸）を、それぞれの試料の対数希釈率（横軸）について示す：白抜きの四角、３週＋１％のＰＥＧ；黒塗りの四角、３週；白抜きの丸、４週＋１％のＰＥＧ；黒塗りの丸、４週。 図２は、ＰＥＧによる抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳについての直接のＥＬＩＳＡの阻害を示す。ウサギを抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳで免疫化し、血清試料を図１に記載するように調製した。抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳを、０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中で、１μｇ／ｍｌで表面上にコーティングした。試料を、ＰＢＳ−ゼラチン緩衝液またはＰＢＳ−ゼラチン−１％のＰＥＧ ５０００緩衝液（＋１％のＰＥＧ）中に希釈し、そしてウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＳＩＭＩＴ）とともにインキュベートした。光学密度（ＯＤ）（縦軸）を、それぞれの試料の対数希釈率（横軸）について示す：白抜きの四角、３週＋１％のＰＥＧ；黒塗りの四角、３週；白抜きの丸、４週＋１％のＰＥＧ；黒塗りの丸、４週。 図３は、ＰＥＧ修飾プレート上での直接のＥＬＩＳＡを示す。ウサギを抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳで免疫化し、血清試料を図１に記載するように調製した。基体（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６）を１５ｍＭのＨＥＰＥＳ中の１ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ−ＮＰＣ ５０００で、室温で２時間コーティングし、その後、ＰＢＳ−ゼラチン（５ｍｇ／ｍｌ）でブロックした。試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液中に希釈し、ウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＳＩＭＩＴ）とともにインキュベートした。光学密度（ＯＤ）（縦軸）を、それぞれの試料の対数希釈率（横軸）について示す。光学密度（ＯＤ）（縦軸）を、それぞれの試料の対数希釈率（横軸）について示す：黒塗りの丸、３週でのプール；黒塗りの四角、プールＳＰＦ（正常なウサギ血清）。 図４は、ＶＷＦおよびＰＥＧ−ＶＷＦについての直接のＥＬＩＳＡを示す。ウサギを抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳで免疫化し、血清試料を図１に記載するように調製した。１つの基体を０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中のＰＥＧ化ＶＷＦ（ＰＥＧ−ＶＷＦ）でコーティングし、別の基体を０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中の組み換え体ＶＷＦ（ｒＶＷＦ−１２）でコーティングした。試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液中に希釈し、そしてウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＳＩＭＩＴ）とともにインキュベートした。光学密度（ＯＤ）（縦軸）を、それぞれの試料の対数希釈率（横軸）について示す：黒塗りの丸、３週でのプール（コーティング：ＰＥＧ−ＶＷＦ）；黒塗りの四角、３週でのプール（コーティング：ｒＶＷＦ−１２）。 図５は、ＶＷＦ−ＰＥＧ化の検出のためのＥＬＩＳＡを示す。基体（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６）を抗ＶＷＦ抗体でコーティングし、漸減量のＰＥＧ化ＶＷＦとともにインキュベートし、続いて抗ＰＥＧペルオキシダーゼ結合体とともにインキュベーションした。結合したペルオキシダーゼをＳｕｒｅＢｌｕｅを用いた比色反応によって検出し、シグナル強度は、希釈物中のＰＥＧ化ＶＷＦの濃度と相関関係がある。光学密度（ＯＤ）（縦軸）を、それぞれの試料の抗ＶＷＦ抗体のｍＵ数／ｍｌ対数希釈率（横軸）について示す：黒塗りの四角、ｗＰ−００５−ｌ−ＳＳ ａ（Ａ）；黒塗りの三角、ｗＰ−００５−ｌ−ＳＳ ｅ（Ｅ）；白抜きの菱形、ｗＰ−００５−ｌ−ＳＳ ｆ（Ｆ）；黒塗りの丸、ｗＰ−００５−ｌ−ＳＳ ｇ（Ｇ）。試料Ａは修飾前の天然のｒＶＷＦを示し、一方、調製物Ｅ、Ｆ、およびＧは、１ｍＭ、２．５ｍＭ、および７．５ｍＭのモル濃度のＰＥＧ化試薬ＰＥＧ−ＳＳ−５Ｋを使用して調製した。 図５は、ＶＷＦ−ＰＥＧ化の検出のためのＥＬＩＳＡを示す。基体（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６）を抗ＶＷＦ抗体でコーティングし、漸減量のＰＥＧ化ＶＷＦとともにインキュベートし、続いて抗ＰＥＧペルオキシダーゼ結合体とともにインキュベーションした。結合したペルオキシダーゼをＳｕｒｅＢｌｕｅを用いた比色反応によって検出し、シグナル強度は、希釈物中のＰＥＧ化ＶＷＦの濃度と相関関係がある。光学密度（ＯＤ）（縦軸）を、それぞれの試料の抗ＶＷＦ抗体のｍＵ数／ｍｌ対数希釈率（横軸）について示す：黒塗りの四角、ｗＰ−００５−ｌ−ＳＳ ａ（Ａ）；黒塗りの三角、ｗＰ−００５−ｌ−ＳＳ ｅ（Ｅ）；白抜きの菱形、ｗＰ−００５−ｌ−ＳＳ ｆ（Ｆ）；黒塗りの丸、ｗＰ−００５−ｌ−ＳＳ ｇ（Ｇ）。試料Ａは修飾前の天然のｒＶＷＦを示し、一方、調製物Ｅ、Ｆ、およびＧは、１ｍＭ、２．５ｍＭ、および７．５ｍＭのモル濃度のＰＥＧ化試薬ＰＥＧ−ＳＳ−５Ｋを使用して調製した。 図６は、遊離のＰＥＧ ５０００を培養物に添加した場合のｒＶＷＦ−ＰＥＧの検出の阻害を示す。 図７は、ＰＥＧ−ＰＥＧ ＥＬｌＳＡの用量応答曲線を示す。 図８は、ＰＥＧ−ＰＥＧ ＥＬＩＳＡの特異性を説明する。 図９は、安定なＰＥＧ化ｒＶＷＦを用いて示した、ＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡを使用したＰＥＧタンパク質の強い検出を示す。 図１０は、放出することができるＰＥＧ化ｒＶＷＦを用いて示した、ＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡを使用したＰＥＧ化タンパク質の強い検出を説明する。 図１１は、ＰＥＧ化ｒＶＷＦを用いて示した、タンパク質を結合させたＰＥＧについてのＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡの特異性を説明する。 図１２は、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡの特異性を示す。 図１３は、ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡアッセイにおける様々な抗ＦＶＩＩＩペルオキシダーゼ結合体の検出の比較である。 図１４は、ＦＶＩＩＩ欠損マウスの血漿中、およびラットの血漿中でのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡの検出を示す。 図１５は、ＰＥＧ化の程度が異なるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物の検出におけるＥＬＩＳＡアッセイの比較である。 図１６は、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡに対する遊離のＰＥＧの影響を示す。 図１７は、放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物からのＰＥＧの放出を測定するＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡアッセイの能力を示し、そしてＥＬＩＳＡによってＰＥＧ化の程度が異なるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子を区別できることを明らかにしている。 図１８は、ＰＥＧ化タンパク質を、用いた全ての濃度で高感度ＥＣＬ法を使用して検出できたことを示している。 図１９は、緩衝液中に（図２Ａ）またはヒト血漿中に（図２Ｂ）希釈したＰＥＧ化タンパク質の検出のレベルの比較である。 図２０は、この方法により、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩａのＰＥＧ化の程度の変化を経時的に検出することを説明している。 図２１は、この方法によってＰＥＧ化の程度を区別できることを示している（図４Ａ、ＰＤ＝３．７、図４Ｂ、ＰＤ＝６）。ここでは、ＰＥＧ化の程度が高いほど強いシグナルが生じた。

発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定するための方法に関する。

他の場所で明確に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。以下の参考文献によって本発明で使用される多くの用語の一般的な定義が当業者に提供されている：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ，ら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。

本明細書中で引用される個々の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示と矛盾しない程度で、その全体が引用により本発明に組み込まれる。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合は、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈によって明確に示されている場合を除き、複数についての言及も含まれる。

本明細書中で使用される場合は、以下の用語は、他の場所で明確に示されていない限りは、それらについて記載されている意味を有する。

用語「試料」は、本明細書中で使用される場合は、少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられた少なくとも１つのタンパク質を含む任意の試料、例えば、薬学的産物を調製するためのプロセスによって生じる任意の流体または溶液をいう。

用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合は、任意のタンパク質、タンパク質複合体、またはポリぺプチドをいい、これには、組み換え体タンパク質、タンパク質複合体、およびペプチド結合によって連結させられたアミノ酸残基からなるポリペプチドが含まれる。タンパク質は、インビボからのタンパク質の単離によって得ることができ、合成方法によって得ることができ、また、組み換えＤＮＡ技術によって得ることもできる。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成される。本発明にしたがって使用される組み換え体タンパク質は、本明細書中で以下に記載されるように、当該分野で公知の任意の方法によって生成させることができる。１つの実施形態では、タンパク質は生理学的に活性なタンパク質であり、これには、治療用タンパク質または生物学的活性のあるその誘導体が含まれる。用語「生物学的活性のある誘導体」は、もとのタンパク質と実質的に同じ機能的および／または生物学的特性を有しているタンパク質の修飾体をいう。用語「タンパク質」は、通常は、大きなポリペプチドをいう。用語「ペプチド」は、通常は、短いポリペプチドをいう。本明細書中で使用される場合は、ポリペプチド、タンパク質、およびペプチドは互換的に使用される。「タンパク質複合体」は、少なくとも１つの他のタンパク質に結合させられた少なくとも１つのタンパク質からなる１つの分子をいう。タンパク質複合体の例としては、補因子またはシャペロンタンパク質に結合させられたタンパク質、リガンド−受容体複合体、および多量体タンパク質（例えば、インテグリン）、ならびに複数のタンパク質サブユニットからなる他の細胞表面受容体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合は、ポリペプチドの「断片」は、全長のポリペプチドまたはタンパク質発現産物よりも小さい、ポリペプチドの任意の部分をいう。断片は、通常は、全長のポリペプチドの欠失アナログであり、ここでは、１つ以上のアミノ酸残基が、全長のポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去されている。したがって、「断片」は、以下に記載される欠失アナログの１つのサブセットである。

本明細書中で使用される場合は、「アナログ」または「誘導体」（これらは互換的に使用される場合がある）は、構造が実質的に類似しており、同じ生物学的活性を有しているポリペプチドをいうが、特定の場合には、自然界に存在している分子とは異なる程度の活性を有する。アナログは、以下を含む１つ以上の突然変異に基づいて、そのアナログが誘導された自然界に存在しているポリペプチドと比較してそれらのアミノ酸配列の組成が異なる：（ｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端および／または自然界に存在しているポリペプチド配列の１つ以上の内部領域での１つ以上のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端での１つ以上のアミノ酸の挿入もしくは付加（通常は、「付加」アナログ）、および／または自然界に存在しているポリペプチド配列の１つ以上の内部領域での１つ以上のアミノ酸の挿入もしくは付加（通常は、「挿入」アナログ）、あるいは、（ｉｉｉ）自然界に存在しているポリペプチド配列中の他のアミノ酸での１つ以上のアミノ酸の置換。置換は、置き換えられるアミノ酸とそれに置き換わるアミノ酸との物理化学的または機能的関係性に基づいて、保存的であるかまたは非保存的である。

１つの態様では、アナログは、特定の化合物（例えば、ペプチド）と、約７０％の配列類似性、しかし１００％未満の配列類似性を示す。そのようなアナログまたは誘導体には、１つの態様では、自然界には存在しないアミノ酸残基（これには限定ではないが、例えば、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミン、およびノルバリンが含まれる）、ならびに自然界に存在しているアミノ酸残基が含まれる。そのようなアナログまたは誘導体には、別の態様では、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基が含まれるか、あるいは、２つ以上のアミノ酸残基の間での非ペプチド相互結合が含まれる。用語「〜に由来する」は、本明細書中で使用される場合は、野生型または自然界に存在しているポリペプチドもしくはペプチド配列の修飾体（アミノ酸の置換または欠失を含む）であり、そして誘導体の配列が野生型または自然界に存在している配列に対して約７０％であるが１００％未満の配列類似性を持つように１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を有するポリペプチドあるいはペプチド配列をいう。１つの実施形態では、誘導体はポリペプチドの１つの断片であり得、ここでは、断片は、野生型ポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個のアミノ酸の長さにわたって実質的に相同である（すなわち、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％相同である）。

配列比較のためには、通常は、１つの配列が参照配列とされ、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムが使用される場合は、試験配列と参照配列がコンピューターに入力され、続いて必要に応じて、座標が設計され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが設計される。その後、配列比較アルゴリズムによって、参照配列に対する試験配列（単数または複数）についての配列同一性の割合（％）が、設計されたプログラムのパラメーターに基づいて計算される。

比較のための最適な配列アラインメントは、特定の実施形態では、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法のための検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューターでの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって行われる。有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰであり、これは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の進行性アラインメント法（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）の簡素化手法を使用し、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）によって記載されている方法と類似している。配列の複数のアラインメントを作製するために有用な別のアルゴリズムは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０（１９９４））である。配列同一性および配列類似性の割合（％）を決定するために適しているアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）；Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３））である。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に入手することができる。

置換は、置き換えられるアミノ酸とそれに置き換わるアミノ酸の物理化学的または機能的関係性に基づいて、保存的であるかまたは非保存的である。このタイプの置換は当該分野で周知である。あるいは、本発明には、非保存的でもある置換も含まれる。例示的な保存的置換はＬｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に記載されており、以下に示される。

あるいは、例示的な保存的置換がすぐ下に示される。

本明細書中で使用される場合は、「変異体」は、通常はその分子の一部ではないさらなる化学的部分を含むように修飾されているタンパク質またはアナログをいう。そのような部分は、様々な態様において、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善する。あるいは、これらの部分は、分子の毒性を下げ、そしてその分子についての任意の望ましくない副作用を排除するかまたは弱めるなどである。そのような作用を媒介することができる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。そのような部分を分子に結合させるための手順は当該分野で周知である。特定の態様では、限定ではないが、変異体は、グリコシル化、ＰＥＧ化、またはポリシアル化によって修飾されたポリぺプチドである。

本明細書中で使用される場合は、「自然界に存在している」は、タンパク質またはポリペプチドに適用される場合は、自然界でみられるタンパク質をいう。例えば、自然界の供給源から単離された生物体（ウイルスを含む）の中に存在し、そして実験室において人によって意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクオチド配列が、自然界に存在しているものである。用語「自然界に存在している」および「野生型」は、本明細書全体を通じて互換的に使用される。

本明細書中で使用される場合は、「血漿由来」は、タンパク質またはポリペプチドに適用される場合は、被検体の血漿または血清中でみられる自然界に存在しているポリペプチドあるいはそれらの断片をいう。

用語「生理学的に許容されるポリマー分子」は、本明細書中で使用される場合は、水溶液中に実質的に可溶であるかまたは懸濁液の形態で存在し得、そして薬学的有効量でポリマー−タンパク質結合体が投与された際に、哺乳動物に対して実質的に悪影響がなく、生体適合性とみなされるポリマー分子をいう。１つの実施形態では、生理学的に許容される分子には、２〜約１０００、または約２〜約３００の繰り返し単位が含まれる。例示的な生理学的に許容されるポリマーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなど、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキサイド）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、ポリサッカライド、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸およびキチン、ポリ（メタ）アクリレート、ならびに上記の任意の組み合わせ。

生理学的に許容されるポリマー分子は特定の構造に限定されず、特定の態様では、直鎖状（例えば、アルコキシＰＥＧもしくは二官能性ＰＥＧ）、分岐状、または複数のアームを持つ（例えば、フォーク型ＰＥＧもしくはポリオールコアに結合させられたＰＥＧ）、樹状であるか、あるいは分解することができる結合を持つ。さらに、なお他の態様では、ポリマー分子の内部構造はあらゆるパターンで構成され、以下からなる群より選択されるが、これらに限定されない：ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｔｒｉｐｏｌｙｍｅｒ）、ランダムトリポリマー（ｒａｎｄｏｍ ｔｒｉｐｏｌｙｍｅｒ）、およびブロックトリポリマー。

用語「リンカー」は、生物学的に活性な分子に対して生理学的に許容されるポリマーを連結する分子の断片をいう。この断片は、通常は、別のリンカーもしくは生物学的に活性な求核基に結合させることができるか、または別のリンカーもしくは生物学的に活性な求核基と直接反応するように活性化させることができる２つの官能基を持つ。一例として、ω−アミノアルカン酸（例えば、リジン）が一般的に使用される。本発明では、リンカーには、安定なリンカー、放出することができるリンカー、および加水分解することができるリンカーが含まれる。

表現「少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられたタンパク質」には、本明細書中で使用される場合は、相互作用（例えば、イオン性、疎水性、親和性、生体親和性相互作用）によって、１つ以上のポリマー分子に共有結合させられたかまたは共有以外の結合によって結合させられたタンパク質が含まれる。様々な実施形態では、ポリマー分子は、二官能性試薬の使用によって、そしてスペーサーアームを介してタンパク質に結合させられる。加えて、ポリマー分子は、親和性相互作用によってタンパク質に結合させられる。例えば、特定の実施形態では、タンパク質はビオチニル化され、ポリマー分子に結合させられたアビジンまたはストレプトアビジンがタンパク質に結合させられ得る。さらに、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体ならびにそれらの断片がポリマー分子に結合させられ、その後、この複合体がタンパク質に結合させられ得る。ポリマー分子はまた、例えば、ポリグリコシルトランスフェラーゼを用いたサッカライドの転移（ＵＳ６，３７９，９３３）またはグリコペグ化（ＵＳ２００４ ０１３２６４０）のような酵素的方法によってもタンパク質に結合させられる。別のアプローチは、例えば、ＶＷＦタンパク質のＡ１ドメインおよびＡ３ドメインに対するＰＥＧ化コラーゲンまたはコラーゲン断片の結合のような、それらの生物学的機能に基づくタンパク質に対するポリマー分子の結合である。この目的のためには、いくつかの実施形態では、例えば、ヒトの胎盤に由来する、ＶＷＦと強い相互作用を示すＩ型およびＩＩＩ型由来のコラーゲンが使用される。特定の実施形態では、ポリマー分子の結合は、タンパク質のインビボでの適用後の生理学的条件下で可逆的であるか、または不可逆的である。

用語「ＰＥＧ化」は、本明細書中で使用される場合は、１つ以上のＰＥＧ部分に結合させられたタンパク質、タンパク質複合体、またはポリペプチドをいう。用語「ＰＥＧ化」は、本明細書中で使用される場合は、タンパク質に対して１つ以上のＰＥＧを結合させるプロセスをいう。１つの実施形態では、上記ＰＥＧの分子量は、３ｋＤａ〜２００ｋＤａ、５ｋＤａ〜１２０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、２０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、５ｋＤａ〜６０ｋＤＡ、５ｋＤａ〜４０ｋＤａ、５ｋＤａ〜２５ｋＤａ、５ｋＤａ〜１５ｋＤａ、または５ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲内である。

用語生理学的に許容されるポリマー「に特異的に結合する」または生理学的に許容されるポリマーに「特異的」であるは、生理学的に許容されるポリマーを認識し、結合するが、他の化合物（または他の抗原）は認識せず、結合しない結合試薬の能力をいう。例えば、その同種抗原に「特異的」な抗体は、抗体の可変領域が検出することができる優先性を持つ目的の化合物を認識し、結合する（すなわち、抗体がポリペプチドに特異的である場合には、化合物間に局所的な配列同一性または相同性、あるいは類似性が存在する可能性があるにもかかわらず、目的の化合物を類似する構造または組成の他の公知の化合物と、結合親和性についての測定可能な差によって区別することができる）ことを示す。特異的抗体はまた、抗体の可変領域の外側にある（特に、分子の定常領域の中の）配列との相互作用を通じて他のタンパク質（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用する場合があることが理解されるであろう。本発明の方法で使用される抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは当該分野で周知であり、日常的に行われている。そのようなアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），第６章を参照のこと。本発明で使用される抗体は、当該分野で公知の任意の方法を使用して生産することができる。

「検出可能な標識」または「検出可能な部分」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出することができる組成物である。例えば、本発明での使用に適している標識としては、例えば、放射性標識（例えば、^３２Ｐ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、電子密度試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されているような）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および（例えば、ハプテンもしくはペプチドの中に放射性標識を取り込ませることによって）検出できるようになるか、またはハプテンもしくはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用されるタンパク質が挙げられる。

用語「基体」または「担体マトリックス」は、何らかの具体的な限定を意味するものではなく、例えば、不溶性のポリマー材料をいう。これは、有機ポリマー（例えば、ポリアミドまたはビニルポリマー（例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、およびポリビニルアルコール、またはそれらの誘導体））、天然のポリマー（例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、キチン、およびポリアミノ酸）、あるいは無機ポリマー（例えば、ガラスまたは金属水酸化物）であり得る。特定の実施形態では、基体は、マイクロキャリア、粒子、メンブレン、細片、紙、薄膜、パール（ｐｅａｒｌ）、ビーズ、またはプレート（例えば、マイクロタイタープレート）の形態である。１つの態様では、少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられたタンパク質は、共有結合によって直接、または担体（例えば、リンカー分子）を介して基体上に固定されるか、あるいは、基体上に固定された抗体である。

「薬学的組成物」は、ヒトおよび哺乳動物を含む被験動物での薬学的使用に適している組成物をいう。薬学的組成物には、薬理学的有効量のポリマー−ポリペプチド結合体が含まれ、そしてまた、薬学的に許容される担体も含まれる。薬学的組成物には、有効成分（単数または複数）と、担体を構成する不活性な成分（単数または複数）、ならびに任意の２種類以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集によって、または１種類以上の成分の解離によって、または１種類以上の成分の他のタイプの反応もしくは相互作用によって、直接あるいは間接的に生じる任意の産物を含む組成物が含まれる。したがって、本発明の薬学的組成物には、本発明の化合物または結合体と薬学的に許容される担体とを混合することによって生成される任意の組成物が含まれる。

「薬学的に許容される担体」は、任意の標準的な薬学的担体、緩衝液、および賦形剤、例えば、リン酸緩衝化生理食塩溶液、５％のデキストロース水溶液、およびエマルジョン（例えば、油／水エマルジョンもしくは水／油エマルジョン）、ならびに様々なタイプの湿潤剤および／またはアジュバントをいう。適切な薬学的担体および処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。好ましい薬学的担体は、活性物質についての意図される投与様式に応じて様々である。典型的な投与様式としては、腸（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、もしくは腹腔内注射；または局所投与、経皮投与、もしくは経粘膜投与）が挙げられる。「薬学的に許容される塩」は、薬学的に使用される化合物または結合体になるように処方される塩であり、これには例えば、金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩など）およびアンモニアまたは有機アミンの塩が含まれる。

「薬学的に許容される」は、生物学的に望ましくないものではないか、または別な意味で望ましくないものではない物質をいう。すなわち、これらの物質は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、また、その中に含まれる組成物の成分のいずれとも有害な方法で相互作用することもなく、個体に投与することができる。

本発明の１つの態様は、タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定するための方法に関する。この方法には以下の工程が含まれる：
（ａ）少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられた少なくとも１つのタンパク質を提供する工程；
（ｂ）上記生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗体を提供する工程；
（ｃ）上記タンパク質に結合させられた少なくとも１つのポリマー分子に対する上記抗体の結合に適している条件下で、工程（ｂ）の抗体を工程（ａ）のタンパク質と接触させる工程；および
（ｄ）抗体と生理学的に許容されるポリマー分子との間での複合体の形成を検出する工程。

抗体とポリマー分子との間での複合体は、当該分野で周知の方法によって検出される。上記複合体の検出のための例としては、生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる抗体に対して特異的な標識された抗体の使用が挙げられるがこれに限定されないか、または、生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる抗体は、当該分野で公知の任意の適切な検出可能な標識である、検出可能な標識に共有結合させられる。検出可能な標識を測定するための検出方法は、例えば、酵素アッセイ、発色アッセイ、発光アッセイ、蛍光アッセイ、および放射免疫アッセイからなる群より選択されるが、これらに限定されない。検出可能な標識の検出を行うための反応条件は、選択される検出方法に応じて様々である。使用されるそれぞれの検出システムについての最適なパラメーター（例えば、緩衝液システム、温度、およびｐＨ）を選択することは、当業者の能力の範囲内である。

タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量の決定を生じる検出可能な標識の定量は、標準的な方法によって行われる。例えば、１つの態様では、生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる抗体は、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）に結合させられ、そして検出のために酵素基質反応が行われる。生理学的に許容されるポリマー分子の量は、規定量の生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられた目的のタンパク質によって得られた検量線から計算される。目的のタンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量は、例えば、ＳＤＳ−ゲル電気泳動によるデータを評価し、そして生理学的に許容されるポリマー分子の結合後の質量の増大を決定することによって得ることができる。

１つの態様では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、従来のハイブリドーマ技術によって導かれたモノクローナル抗体、および組み換え技術（例えば、ファージディスプレイまたはリボソーマルディスプレイ）によって得られた抗体または抗体断片からなる群より選択される。本発明の１つの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。

本発明によると、用語「タンパク質」は具体的な限定をなすものではなく、これには、任意のタンパク質、タンパク質複合体、またはポリペプチド（これには、組み換えＤＮＡ技術によって得られた組み換え体タンパク質、タンパク質複合体、およびポリペプチドが含まれる）が含まれ得る。本発明にしたがって使用される組み換え体タンパク質は、当該分野で公知の任意の方法によって生産することができる。これには、（ｉ）遺伝子操作による（例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅による）組み換え体ＤＮＡの生産、（ｉｉ）トランスフェクションによる（例えば、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによる）原核生物細胞または真核生物細胞への組み換え体ＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）上記の形質転換された細胞の（例えば、連続様式または回分様式での）培養、（ｉｖ）タンパク質の（例えば、構成的または誘導の際の）発現、ならびに、（ｖ）例えば、培養培地からまたはトランスフェクトされた細胞を回収することによる、タンパク質の単離、それにより（ｖｉ）（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって）精製された組み換え体タンパク質を得るための任意の当該分野で公知の方法が含まれ得る。

タンパク質およびタンパク質複合体
組成物中での使用が意図されるタンパク質としては、被検体への投与に有用な生理学的に活性なタンパク質が挙げられる。１つの実施形態では、生理学的に活性なタンパク質は治療用タンパク質である。生理学的に活性なタンパク質は、１つの態様では、タンパク質の治療的活性もしくは生物学的活性の一部、実質的に全て、または全てをなおも保持しているタンパク質あるいは任意の断片である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、発現されないかもしくは生産されない場合、または発現もしくは生産が実質的に低下している場合に、疾患を引き起こす可能性があるタンパク質である。好ましくは、タンパク質は哺乳動物に由来するかまたは哺乳動物から得られるものである。

本発明の様々な実施形態では、生理学的に許容されるポリマーに結合させられた生理学的に活性なタンパク質がタンパク質であるか、またはそのタンパク質の生物学的活性を持つその断片である場合には、生理学的に活性なタンパク質は、結合させられていないヒトまたは哺乳動物のタンパク質の対応している部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、結合体の生理学的に活性なタンパク質は、ヒトまたは哺乳動物の種にとって天然のものであるタンパク質である。他の実施形態では、タンパク質またはその断片は、対応するヒトまたは哺乳動物のタンパク質の天然の配列に対して実質的に相同である（すなわち、活性物質の少なくとも１０個、２５個、５０個、１００個、１５０個、もしくは２００個のアミノ酸の長さ、または全長にわたり、アミノ酸配列において少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）。

タンパク質の作製方法
組み換え体タンパク質を作製するための方法は当該分野で周知である。組み換え体タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを発現する細胞（哺乳動物細胞を含む）の生成方法は、米国特許第６，０４８，７２９号、同第５，９９４，１２９号、および同第６，０６３，６３０号に記載されている。これらの出願のそれぞれの教示は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。

１つの実施形態では、ポリペプチドまたはその断片もしくはアナログを発現させるために使用される核酸構築物は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞中で染色体外で（エピソームとして）発現されるもの、またはレシピエント細胞のゲノムの中に、無作為に組み込まれるかもしくは相同組み換えによって予め選択された標的化部位に組み込まれるかのいずれかであるものである。染色体外で発現される構築物には、ポリペプチドをコードする配列に加えて、細胞中でのタンパク質の発現のため、そして状況によっては構築物の複製のために十分な配列が含まれる。これには、通常、プロモーター、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位が含まれる。タンパク質をコードするＤＮＡは、その発現がプロモーターの制御下で行われるように構築物の中に配置される。状況に応じて、この構築物には、以下の１つ以上のようなさらなる成分が含まれる場合がある：スプライシング部位、エンハンサー配列、適切なプロモーターの制御下にある選択マーカー遺伝子、および適切なプロモーターの制御下にある増幅可能なマーカー遺伝子。

ＤＮＡ構築物が細胞のゲノムに組み込まれるこれらの実施形態では、これには、ポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる。状況に応じて、これには、プロモーター配列およびエンハンサー配列、ポリアデニル化部位（単数または複数）、スプライシング部位（単数または複数）、選択マーカー（単数または複数）をコードする核酸配列、増幅可能なマーカーをコードする核酸配列、および／またはゲノム中の選択された部位へのＤＮＡの組み込みを標的化するためのレシピエント細胞中のゲノムＤＮＡと相同なＤＮＡ（標的化ＤＮＡまたはＤＮＡ配列）が含まれ得る。

宿主細胞
組み換え体タンパク質を生産させるために使用される宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物以外の脊椎動物の細胞、または哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞としては、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヒトの細胞が挙げられるがこれらに限定されない。宿主細胞としては、不死化細胞（細胞株）または非不死化（初代もしくは二次）細胞が挙げられ、これには、任意の多種多様な細胞のタイプ（例えば、線維芽細胞、ケラチン生成細胞、上皮細胞（例えば、乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、すなわちＣＨＯ細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の構成成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋細胞、肝細胞、およびこれらの体細胞タイプの前駆体であるが、これらに限定されない）が含まれる。

一般的に使用されている宿主細胞としては、以下が挙げられる：原核生物細胞（例えば、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなどの任意の株）；真核生物細胞（例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞）；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；ヒト腎臓２９３細胞；ＣＯＳ−７細胞；昆虫細胞（例えば、Ｄ．Ｍｅｌ−２、Ｓｆ４、Ｓｆ５、Ｓｆ９、およびＳｆ２ｌ、ならびにＨｉｇｈ５）；植物細胞、ならびに様々な酵母細胞（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａ）。

ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む宿主細胞は、細胞増殖、およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適している条件下で培養される。ポリペプチドを発現するこれらの細胞は公知の方法を使用して同定され、組み換え体タンパク質が公知の方法を使用して、ポリペプチド産物の増幅を行って、またはポリペプチド産物の増幅を行わずにのいずれかで、単離、精製される。同定は、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在の指標となる表現形を示す遺伝子修飾された哺乳動物細胞のスクリーニング（例えば、ＰＣＲスクリーニング）、サザンブロット分析によるスクリーニング、あるいは、タンパク質の発現についてのスクリーニングによって行われるが、これらに限定されない。タンパク質をコードするＤＮＡが取り込まれている細胞の選択は、ＤＮＡ構築物の中に選択マーカーを含めること、そして選択マーカー遺伝子を発現する細胞だけが生存できる適切な条件下で選択マーカー遺伝子を含むトランスフェクトされたかまたは感染させられた細胞を培養することによって行われ得る。導入されたＤＮＡ構築物のさらなる増幅は、特定の態様では、遺伝子修飾された細胞を増幅に適している条件下で培養すること（例えば、多コピーの増幅可能なマーカー遺伝子を含む細胞だけが生存できる薬物濃度の存在下で、増幅可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子修飾された細胞を培養すること）によって行われる。

本発明の１つの例では、タンパク質は、生理学的に活性なタンパク質、タンパク質複合体、またはポリペプチド、特に、治療用タンパク質または生物学的活性のあるその誘導体である。本明細書中で使用される場合は、用語「生物学的活性のある誘導体」には、タンパク質、タンパク質複合体、もしくはポリペプチドと実質的に同じ機能的および／または生物学的特性（例えば、結合特性）、ならびに／あるいは、同じ構造的基礎（例えば、ペプチド骨格または基本的なポリマー単位）を有している、上記タンパク質、タンパク質複合体、もしくはポリペプチドの任意の誘導体が含まれる。

生理学的に活性なタンパク質または治療用タンパク質である組み換え体タンパク質としては、サイトカイン、成長因子、治療用の凝固タンパク質、または血液凝固因子、酵素、ケモカイン、可溶性の細胞表面受容体、細胞接着分子、抗体、ホルモン、細胞骨格タンパク質、マトリックスタンパク質、シャペロンタンパク質、構造タンパク質、代謝タンパク質、ならびに当業者に公知の他の治療用タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。治療薬として使用される例示的な組み換え体タンパク質としては、第ＶＩＩｌ因子、第ＶＩＩＩ因子：Ｃ、抗血友病因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、およびフォン・ヴィレブランド因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インシュリン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、α−グルコセレブロシダーゼ、α−グルコシダーゼ、卵胞刺激ホルモン、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ５２抗体、ＴＮＦ受容体、および当該分野で公知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，第６２版，２００８，Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪを参照のこと。

１つの実施形態では、タンパク質は、治療用の凝固因子または血液（凝固）因子であり、これには、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子，プロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩ、およびこれらのタンパク質のうちの任意のものの活性化形態が含まれるが、これらに限定されない。関連する実施形態では、タンパク質複合体には、１つ以上の血液因子が含まれる。例示的な血液因子のタンパク質複合体としては、ＦＶＩＩＩとＶＷＦとの間での複合体が挙げられる。

血液因子
本発明の１つの特異的な例においては、タンパク質は、血漿由来（細胞質）および／または組み換え体フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、あるいは生物学的活性のあるそれらの誘導体である。用語「血漿由来ＶＷＦ（ｐＶＷＦ）」には、哺乳動物から得られる成熟ＶＷＦが含まれる。上記ｐＶＷＦの１つの生物学的活性のある誘導体はｐｒｏ−ＶＷＦであり、これには、プロ−ペプチドが含まれる。本発明の１つの例においては、タンパク質は、内皮細胞および巨核球によって合成される前駆体ＶＷＦ分子（プレ−プロ−ＶＷＦ）、ＶＷＦプロペプチド（プロ−ＶＷＦ）を含む未成熟ＶＷＦ、ならびに、前駆体分子のそれぞれシグナルペプチドおよびプロ−ペプチドの切断によって得られる成熟血漿由来ＶＷＦからなる群より選択される。細胞質ＶＷＦの生物学的活性のある誘導体のさらなる例としては、生物学的に活性な形態になるようにプロセシングされるかまたはそのような形態に変換されるプロドラッグ、あるいは、生物学的に活性なプロドラッグ（例えば、短縮型、欠失を含む形態、置換を含む形態、プロ形態ではない付加を持つ形態、成熟形態の断片、キメラ形態、および天然の形態と比較して翻訳後修飾を持つ形態）が挙げられる。用語「組み換え体ＶＷＦ（ｒＶＷＦ）」には、組み換えＤＮＡ技術によって得られた、状況に応じて薬理学的に許容されるグリコシル化パターンを持つＶＷＦが含まれる。その特別な例としては、Ａ２ドメインを持たず、それにより、タンパク質分解に耐性であるＶＷＦ（Ｌａｎｋｈｏｆら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．；７７：１００８−１０１３，１９９７）および糖タンパク質Ｉｂ結合ドメインとコラーゲンおよびヘパリンの結合部位を含むＶａｌ４４９〜Ａｓｎ７３０のＶＷＦ断片（Ｐｉｅｔｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．；１６４：１３３９−１３４７，１９８９）が挙げられる。

フォン・ヴィレブランド因子は、１×１０^６ダルトン〜２０×１０^６ダルトンの分子量の１つのシリーズの多量体の形態で血漿中に存在する。ＶＷＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００５４３）は、哺乳動物の内皮細胞の中で主に形成され、続いて循環へと分泌される糖タンパク質である。これに関連して、およそ２２０ｋＤの分子量を持つポリペプチド鎖から始めて、５５０ｋＤの分子量を持つＶＷＦ二量体が、いくつかの硫黄結合の形成によって細胞の中で生産される。２０００万ダルトンまでの漸増する分子量を持つ複数のＶＷＦのさらなるポリマーが、ＶＷＦ二量体の連結によって形成させられる。特に、高分子量ＶＷＦ多量体が血液の凝固において不可欠な重要性を持つと推測される。

ＶＷＦ症候群は、ＶＷＦの低生産または過剰生産のいずれかがある場合に臨床的に現れる。ＶＷＦの過剰生産は、血栓形成の増加（血管内での血餅または血栓の形成、血流を塞ぐ）を引き起こし、一方、高分子量のＶＷＦ形態のレベルの低下または高分子量のＶＷＦ形態が存在しないことによっては、血小板の凝集および創縫合の阻害が原因である出血量の増加および出血時間の延長が起こる。

ＶＷＦ欠損はまた、ＶＷＦが機能性の第ＶＩＩＩ因子の必須構成成分であるので、血友病Ａの表現型を引き起こす場合がある。これらの場合には、第ＶＩＩＩ因子の半減期は、血液の凝固カスケードにおけるその機能が損なわれる程に短くなる。フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）またはＶＷＦ症候群に罹患している患者は、第ＶＩＩＩ因子欠損を示す場合が頻繁にある。これらの患者においては、第ＶＩＩＩ因子活性の低下は、Ｘ番染色体遺伝子の欠損の結果ではなく、血漿中のＶＷＦの量的および質的変化の間接的な結果である。血友病ＡとｖＷＤの区別は、通常は、ＶＷＦ抗原を測定することによって、またはリストセチン−補因子活性を決定することによって行われ得る。ＶＷＦ抗原含有量とリストセチン補因子活性の両方が、ほとんどのｖＷＤ患者においては低いが、これらは血友病Ａ患者においては正常である。ＶＷＦ症候群の処置のためのＶＷＦ製品としては、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ；ならびに、ＩＭＭＵＮＡＴＥ（登録商標）、ＩＮＮＯＢＲＡＮＤ（登録商標）、および８Ｙ（登録商標）（血漿由来のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ濃縮物を含む治療薬）が挙げられるが、これらに限定されない。

関連する実施形態では、タンパク質は第ＶＩＩＩ因子である。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、哺乳動物の肝臓の中で生産される約２６０ｋＤａの分子量の血漿糖タンパク質である。（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１２３）。これは、血液の凝固を導く凝固反応のカスケードの重要な成分である。このカスケードには、第ＩＸａ因子がＦＶＩＩＩとともに第Ｘ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００４９５）を活性化形態である第Ｘａ因子に変換させる工程がある。ＦＶＩＩＩは、この工程において補因子として働き、第ＩＸａ因子の活性にはカルシウムイオンとリン脂質が必要である。これらの２つの最も一般的な血友病は、機能性のＦＶＩＩＩの欠損（血友病Ａ、全ての症例の約８０％）または機能性の第ＩＸａ因子の欠損（血友病Ｂもしくはクリスマス因子病）によって引き起こされる。ＦＶＩＩＩは、極めて低い濃度で血漿中を循環し、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に非共有的に結合する。止血の間に、ＦＶＩＩＩはＶＷＦから分離され、カルシウムおよびリン脂質または細胞膜の存在下での活性化速度を増大させることによって、活性化第ＩＸ因子（ＦΙＸａ）に媒介される第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化のための補因子として働く。

ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を持つおよそ２７０ｋＤ〜３３０ｋＤの単鎖前駆体として合成される。血漿から精製された場合には、ＦＶＩＩＩは、重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）と軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成される。軽鎖の分子量は８０ｋＤであるが、Ｂドメイン内でのタンパク質分解が原因で、重鎖は９０ｋＤ〜２２０ｋＤの範囲である。

ＦＶＩＩＩはまた、出血性疾患における治療的使用のために組み換え体タンパク質としても合成される。治療薬としての組み換え体ＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的有効性を決定するための様々なインビトロアッセイが考案されている。これらのアッセイは、内因性のＦＶＩＩＩのインビボでの作用を模倣する。ＦＶＩＩＩのインビトロでのトロンビンでの処理によっては、インビトロアッセイによって測定されるような、その凝固促進活性の迅速な増大とそれに続く低下が生じる。この活性化と不活化は、重鎖と軽鎖の両方の特異的な限定されたタンパク質分解と合致し、これにより、ＦＶＩＩＩの様々な結合エピトープの利用できる度合いが変化する。例えば、ＦＶＩＩＩがＶＷＦから解離できるようになり、リン脂質表面に結合するか、または、特定のモノクローナル抗体に対する結合能力が変化する。

最近まで、血友病Ａの標準的な処置には、ヒトドナーの血漿に由来するＦＶＩＩＩ濃縮物の調製物の頻繁な注入が含まれていた。この補充療法は一般的には有効であるが、そのような治療法は、患者を、肝炎およびＡＩＤＳのようなウイルス伝染性疾患のリスクにさらす。このリスクはモノクローナル抗体を使用する免疫精製による、および有機溶媒もしくは熱のいずれかでの処理によってウイルスを不活化させることによる、血漿由来のＦＶＩＩＩのさらなる精製によって低下させられているが、そのような調製物についての処理コストが大幅に増大し、また、リスクもないわけではない。これらの理由から、患者は予防的ではなく、発症時に処置されている。さらに厄介な問題は、患者のうちの約１５％が血漿由来ＦＶＩＩＩに対する抑制抗体を生じることである。ＦＶＩＩＩレベルが１％に満たない重症の血友病Ａ患者には、通常、次の投与まで１％を上回るＦＶＩＩＩを維持する目的のために、予防的治療が行われる。循環の中にある様々なＦＶＩＩＩ産物の平均半減期を考慮して、これは通常は、１週間に２回から３回ＦＶＩＩＩを投与することによって行うことができる。

血友病Ａの処置における重要な進展は、ヒトＦＶＩＩＩの完全な２，３５１アミノ酸の配列をコードするｃＤＮＡクローンの単離（Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０（１９８４）および米国特許第４，７５７，００６号を参照のこと）と、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列およびその生産のための組み換え方法の提供であった。血友病の処置のためのＦＶＩＩＩ製品としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（抗血友病因子（組み換え体）、血漿／アルブミンを含まない方法、ｒＡＨＦ−ＰＦＭ）、組み換え体である抗血友病因子（ＢＩＯＣＬＡＴＥ（商標）、ＧＥＮＡＲＣ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ ＦＳ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標））：ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、第ＶＩＩＩ因子：Ｃの精製された調製物、抗血友病因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体（ヒト）ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）およびＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）、抗血友病因子／フォン・ヴィレブランド因子複合体（ヒト）；ならびにＨＹＡＴＥ Ｃ（登録商標）、精製されたブタ第ＶＩＩＩ因子。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）は、ＣＨＯ細胞中で生産され、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されている。ヒトのものではないか、または動物のものではない血漿タンパク質またはアルブミンが、細胞培養プロセス、精製、または最終的なＡＤＶＡＴＥ（登録商標）の処方物に添加される。

セリンプロテアーゼ酵素である第ＶＩＩ因子（プロコンベルチン）は、血液凝固カスケードの中心的なタンパク質のうちの１つである（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１２２）。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の主要な役割は、組織因子（ＴＦ）と協働して凝固プロセスを開始することである。血管が損傷すると、ＴＦは血液と循環している第ＶＩＩ因子に曝される。ＴＦに結合すると、ＦＶＩＩは様々なプロテアーゼ（中でも特に、トロンビン（第ＩＩａ因子））によって活性化させられてＦＶＩＩａとなり、第Ｘ因子とＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体自体を活性化させる。組み換え体であるヒト第ＶＩＩａ因子（ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標））は、補充凝固因子に対して阻害剤を生じた血友病患者の制御できない出血において使用されるために導入されている。

第ＩＸ因子（ＦＩＸ、クリスマス因子）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１２４）は、（組織因子経路の）第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子によって活性化されない限りは不活性であるセリンプロテアーゼである。活性化されて第ＩＸａ因子になると、これは、第Ｘ因子中のアルギニン−イソロイシン結合を加水分解することによって作用し、第Ｘａ因子を形成させる。第ＶＩＩＩ因子は、ＦＩＸプロテアーゼ活性に必要な補因子である（Ｌｏｗｅ ＧＤ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５：５０７−１３，２００２）。第ＩＸ因子の欠損は血友病Ｂまたはクリスマス病を引き起こす。

さらに別の血液因子としては以下が挙げられる：第ＩＩ因子（トロンビン）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００４９７）（この欠損によっては、血栓症およびプロトロンビン異常症が生じる）；第Ｖ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１２１）（この欠損によっては、出血性素因または血栓性素因の１つの形態（これは、活性化プロテインＣ耐性として知られている）が生じる）、第ＸＩ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１１９）（この欠損によっては、ローゼンタール症候群（血友病Ｃ）が生じる）、ならびに、第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１２０）およびサブユニットＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１９８５）（この欠損は、Ｉ型欠損（サブユニットＡとサブユニットＢの両方の欠損）およびＩＩ型欠損（サブユニットＡだけの欠損）として特性決定され、このいずれもが生まれたときからの出血の傾向、創傷の治癒の障害、および習慣流産を生じ得る）；第ＸＩＩ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００４９６）；プロテインＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００３０３）；アンチトロンビンＩＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００４７９）、およびそれらの活性化形態。

ポリペプチド変異体およびアナログ
本発明の方法は、試料中の組み換え体タンパク質、ならびに、上記組み換え体タンパク質の断片、アナログ、または変異体を迅速に検出するために有用であり、さらに、断片または対立遺伝子変異体として存在し得る自然界に存在しているタンパク質をインビボで検出する（ここでは、グリコシル化の差異が検出される）ために有用であり得る。

ポリペプチド断片、アナログ、または変異体を調製するための方法は当該分野で周知である。ポリペプチドの断片は、酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン）による切断を含む当該分野で周知の方法を使用して調製され、また、特異的なアミノ酸配列を有しているポリペプチド断片を作製するための組み換え手段を使用して調製される。断片は、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、二量体化または多量体化ドメイン、あるいは当該分野で公知の任意の他の同定可能なドメインを含むように作製することができる。

ポリペプチドアナログの作製方法もまた周知である。アナログは、特定の態様では、アナログが由来する自然界に存在しているポリペプチドと実質的に相同であるかまたは実質的に同じであり、本発明によって意図されるアナログは、自然界に存在しているポリペプチドの生物学的活性の少なくとも一部を保持しているものである。

置換アナログは、通常は、タンパク質の中の１つ以上の部位で野生型の１つのアミノ酸が別のアミノ酸に交換されており、特定の態様では、他の機能もしくは特性を失うことなくポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、タンパク質分解的切断に対する安定性）を調節するように設計される。この種の置換は一般的には保存的である。「保存的アミノ酸置換」によっては、類似する化学的特性の側鎖を持つアミノ酸での１つのアミノ酸の置換が意味される。保存的置換を作製するための類似するアミノ酸としては、以下が挙げられる：酸性側鎖を持つアミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）；塩基性側鎖を持つアミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）；極性アミド側鎖を持つアミノ酸（グルタミン、アスパラギン）；疎水性脂肪族側鎖を持つアミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）；芳香族側鎖を持つアミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）；小さい側鎖を持つアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）；または脂肪族ヒドロキシル側鎖を持つアミノ酸（セリン、スレオニン）。

自然界に存在している分子と同じまたは類似する生物学的活性を持つ、自然界に存在している分子の生物学的活性のある断片、変異体、または突然変異体をコードするポリヌクオチドアナログおよび断片は、当業者によって容易に作製され得る。日常的に行われている方法としては、ＰＣＲ技術、タンパク質分子をコードするＤＮＡの酵素による消化、および異種ポリヌクレオチド配列への連結などが挙げられる。例えば、ＰＣＲおよび当該分野で周知の他の技術を使用する点突然変異は、どのアミノ酸残基がタンパク質活性と関係がある特定の活性に重要であるかを、特殊性をもって同定するために使用され得る。したがって、当業者は、コドンの変更およびミッセンス変異を生じるようにＤＮＡ鎖の中に１つの塩基変化を作製することができるであろう。

タンパク質またはポリペプチドが、ポリペプチドである第２の化学物質を含む融合タンパク質であるアナログが作製されるように修飾されることが、さらに意図される。１つの実施形態では、ポリペプチドである第２の化学物質は、酵素、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体、細胞表面受容体の細胞外ドメイン、細胞接着分子、あるいは上記タンパク質もしくは当該分野で公知の任意の他のタイプのタンパク質の断片または活性ドメインである。関連する実施形態では、第２の化学物質は、血液凝固因子、例えば、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩ、およびそれらの活性化形態である。意図される融合タンパク質は、当該分野で周知の化学的技術または組み換え技術によって作製される。

意図されるタンパク質変異体としては、ユビキチン化、グリコシル化、治療薬または診断薬への結合、（例えば、放射性核種または様々な酵素での）標識化、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールでの誘導）のようなポリマーの共有結合、加水分解不可能な結合の導入、および（ヒトタンパク質の中には通常は存在しない）オルニチンのようなアミノ酸の化学合成による挿入または置換のような技術によって化学修飾されたポリペプチドが挙げられる。変異体は、本発明の修飾されていない分子の結合特性を保持している。

本発明の方法において有用なさらに別のポリペプチド変異体としては、ポリシアル酸（ＰＳＡ）部分を含むポリペプチドが挙げられる。ポリシアル化ポリペプチドを調製するための方法は、米国特許公開番号２００６０１６０９４８およびＳａｅｎｋｏら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２：４２−５１，２００６に記載されている。

生理学的に許容されるポリマー
１つの実施形態では、本発明により、タンパク質またはポリペプチドの生産、生存性に有利な影響を与える化学的部分に連結させられた、化学修飾されたタンパク質またはポリペプチドが意図される。例えば、免疫原性、腎クリアランスを潜在的に下げること、および／またはプロテアーゼ耐性を改善することによって半減期を改善するための、ポリペプチドに対する生理学的に許容されるポリマーの非特異的結合または部位特異的結合は当該分野で公知である。

生理学的に許容されるポリマー分子としては、例えば、水溶液中で実質的に可溶であるか、または懸濁液の形態で存在し得、そして薬学的有効量でポリマー分子−タンパク質結合体が投与されると、哺乳動物に対して副作用のようなネガティブな影響を実質的に与えない、そして生体適合性とみなされるポリマー分子が挙げられる。本発明にしたがって使用される生理学的に許容されるポリマー分子に関して具体的な制限はない。

ポリマー分子は、通常は、例えば、約２個〜約１０００個の繰り返し単位、または約２個〜約３００個の繰り返し単位を持つとして特性決定される。そのようなポリマー分子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなど）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキサイド）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、ポリサッカライド（例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、およびキチン）、ポリ（メタ）アクリレート、ならびに上記の任意の組み合わせ。

例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、またはデキストランを含むがこれらに限定されない水溶性ポリマーは、一般的には、タンパク質もしくはペプチドの安定性または大きさなどを増大させるために、タンパク質あるいはペプチドに結合させられる。

ＰＥＧ、ＰＥＯ、またはＰＯＥは、エチレンオキサイドのオリゴマーまたはポリマーをいう。ＰＥＧおよびＰＥＯには、分子量の分布を持つ、すなわち、多分散性の分子が含まれる。大きさの分布は、その重量平均分子量（Ｍｗ）とその数平均分子量（Ｍｎ）によって統計学的に特性決定され、それらの比は多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ）と呼ばれる。特定の態様では、ＭｗとＭｎが質量スペクトル分析によって測定される。ＰＥＧ−タンパク質結合体のほとんど（特に、１ＫＤを超えるＰＥＧに結合させられたもの）は、もとのＰＥＧ分子の多分散性の性質が原因で、分子量の範囲を示す。例えば、ｍＰＥＧ２Ｋ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−０２０ＨＳ，ＮＯＦ）の場合には、実際の分子量は１．５ＫＤ〜３．０ＫＤの範囲に分布し、１．０３６の多分散性指数を持つ。例外はＭＳ（ＰＥＧ）ｎ（Ｎ＝４、８、１２、または２４、例えば、ＰＥＯ４、ＰＥＯ１２）をベースとする試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させられたタンパク質であり、これらは、個別の鎖の長さと定義された分子量を持つ単分散性の混合物として特別に調製される。

生理学的に許容されるポリマー分子は、特定の構造には限定されず、様々な態様において、直鎖状（例えば、アルコキシＰＥＧもしくは二官能性ＰＥＧ）、分岐状、または複数のアームを持つ（例えば、フォーク型ＰＥＧもしくはポリオールコアに結合させられたＰＥＧ）、樹状であるか、あるいは分解することができる結合を持つ。さらに、ポリマー分子の内部構造はあらゆるパターンで構成され、以下からなる群より選択される：ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマー。

本発明の１つの特異的な例においては、生理学的に許容されるポリマー分子は、ＰＥＧおよびその誘導体である。本発明にしたがって使用されるＰＥＧについては具体的な制限はない。例えば、ＰＥＧ−タンパク質結合体としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：直鎖状または分岐状の結合体、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）をベースとするか、もしくはアルデヒドをベースとする化学によって結合させられたポリマー：タンパク質、ＰＥＧ鎖と結合部位との間に様々な化学結合を持つ変異体、および長さが異なる変異体。ＰＥＧの平均分子量は、約３キロダルトン（「ｋＤａ」）〜約２００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約３ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲であろう。特定の実施形態では、ＰＥＧは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５５ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約８５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約９５ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約１６０ｋＤａ、約１７０ｋＤａ、約１８０ｋＤａ、約１９０ｋＤａ、または約２００ｋＤａである。

本発明により、以下からなる群より選択されるＰＥＧ−タンパク質結合体が意図される：直鎖状ＰＥＧ−タンパク質結合体（これは、ＮＨＳに結合させられており、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−（式中、ｎ＝１〜２０００）の長さの範囲である）、直鎖状ＰＥＧ−タンパク質結合体（これは、アルデヒドに結合させられており、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−（式中、ｎ＝１〜２０００）の長さの範囲である）、２つのアームを持つ分岐状ＰＥＧ−タンパク質結合体（これは、ＮＨＳに結合させられており、長さに範囲があり、３ｋＤａ〜１００ｋＤａの質量の範囲である）、および３つのアームを持つ分岐状ＰＥＧ−タンパク質結合体（これは、ＮＨＳに結合させられている）。本発明によってはまた、様々な化学結合（−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、および−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ＝１〜５））をその結合部位とＰＥＧ鎖との間に含む、ＰＥＧ−タンパク質結合体が意図される。本発明によってはさらに、腎クリアランスを低下させるための、電荷を持つ陰イオン性ＰＥＧ−タンパク質結合体が意図され、これには、カルボキシル化化合物、硫酸化化合物、およびリン酸化化合物（陰イオン性）が含まれるが、これらに限定されない（Ｃａｌｉｃｅｔｉ ＆ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２００３ ５５（１０）：１２６１−７７；Ｐｅｒｌｍａｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏ Ｍｅｔａｂ ２００３ ８８（７）：３２２７−３５；Ｐｉｔｋｉｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ １９８６ ２９（３）：４４０−４４；Ｖｅｈａｓｋａｒｉら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ １９８２ ２２ １２７−１３５）。１つのさらなる実施形態では、ペプチドは、状況に応じて、ビスホスホネート、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはＰＥＯ）、炭水化物、脂肪酸、またはさらなるアミノ酸を含む部分に結合させられる。

マクロ分子の化学修飾は、１つの態様では、非特異的様式で（修飾された種の混合物が導かれる）、または部位特異的様式で（野生型のマクロ分子反応性を狙った修飾、および／または部位特異的突然変異誘発と化学修飾との組み合わせを使用する部位選択的修飾に基づく）、あるいは、発現させられたタンパク質の連結方法を使用して（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（４）：２９７−３０３（２００２））行われる。

ペプチドのインビボでの治療的半減期がＰＥＧ化によって恩恵を受けるかどうかを明らかにするために、多種多様なＰＥＧ−タンパク質結合体が合成され、薬物動態についてインビトロおよびインビボで特性決定される。ＰＥＧ化の潜在的効果を両方最適化するために、設計ストラテジーが使用され、ここでは、ＰＥＧのポリマーの長さ、立体構造、および電荷が変化させられる。

本発明のＰＥＧ化タンパク質を調製するための方法には、一般的には、以下の工程が含まれる：（ａ）目的のタンパク質をポリエチレングリコールと、ＰＥＧが上記タンパク質のＮ末端／Ｃ末端に結合する条件下で反応させる工程、および（ｂ）反応産物（単数または複数）を得る工程。タンパク質をＰＥＧ化させることによりタンパク質の固有の活性が有意に変わる可能性があるので、様々なタイプのＰＥＧが調査される。タンパク質のＰＥＧ化に使用される化学としては、メトキシ−ＰＥＧ（Ｏ−［（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）のＮＨＳエステルを使用するタンパク質の第１級アミンのアシル化が挙げられるが、これに限定されない。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳまたはメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡでのアシル化によっては、もとの第１級アミン（また、Ｃ末端についてはＢｏｃ−ＰＥＧ）から電荷を排除するアミド結合が生じる。リボソームタンパク質の合成とは異なり、合成ペプチドの合成はＣ末端からＮ末端方向に進む。したがって、Ｂｏｃ−ＰＥＧは、ペプチドのＣ末端にＰＥＧを結合させるための１つの方法である（すなわち、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ−（Ｂ）ｕｔｙｌ（ｏ）ｘｙ（ｃ）ａｒｂｏｎｙｌ）（Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｏｃ）合成）（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）．「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１４）：２１４９−２１５４）を使用する。フルオレニルメトキシカルボニル（（Ｆ）ｌｕｏｒｅｎｙｌ−（ｍ）ｅｔｈ（ｏ）ｘｙ−（ｃ）ａｒｂｏｎｙｌ）（ＦＭＯＣ）化学（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（１９８９）．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ．）が好ましい。なぜなら、これには、側鎖保護基を除去するための有害なフッ化水素酸の使用は必要ないからである。本発明の方法により、ポリマー：タンパク質結合体の実質的に均質な混合物が提供される。「実質的に均質な」は、本明細書中で使用される場合は、ポリマー：タンパク質結合体分子だけが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質結合体は生物学的活性を持ち、本発明の「実質的に均質な」ＰＥＧ化タンパク質調製物は、均質な調製物の利点（例えば、ロット間での薬物動態の予測可能性における臨床的適用の容易さ）を示すために十分に均質な調製物である。

目的のポリペプチドに対する生理学的に許容されるポリマーの結合を容易にすることができる例示的な安定なリンカーとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミド、アミン、エーテル、カルバメート、チオウレア、尿素、チオカルバメート、チオカルボネート、チオエーテル、チオエステル、およびジチオカルバメート結合（例えば、ω，ω−アミノアルカン、Ｎ−カルボキシアルキルマレイミド、もしくはアミノアルカン酸）、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド、または無水コハク酸、Ｎ−カルボキシメチルマレイミドＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート、および１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾ−トリアゾリル］オキサレート。

他の実施形態では、生理学的に許容されるポリマーは、放出することができるリンカーを使用してポリペプチドに結合させられる。１つの実施形態では、放出することができるリンカーは加水分解することができるリンカーである。加水分解することができるかまたは分解することができる結合は、生理学的条件下で水と反応する（すなわち、加水分解される）比較的弱い結合である。水中で加水分解される結合の傾向は、２つの中心原子をつないでいる連結の一般的なタイプだけではなく、これらの中心原子に結合させられた置換基にも依存するであろう。加水分解することができるリンカーを持つ水溶性ポリマーを含む結合体を作製する方法は、米国特許第７，２５９，２２４号（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）および同第７，２６７，９４１号（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）に記載されている。例えば、加水分解されるポリマー骨格中にエステル結合を持つＰＥＧを調製することができる。この加水分解により、より小さい分子量の断片へのポリマーの切断が生じる。適している加水分解に対して不安定であるかまたは弱い結合としては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド、チオエステル、チオールエステル、および炭酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー骨格に含まれ得る加水分解によって分解することができる結合としては、カルバミン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、およびアシルオキシアルキルエーテル結合；例えば、アミンとアルデヒドとの反応によって生じるイミン結合（例えば、Ｏｕｃｈｉら、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，３８（ｌ）：５８２−３（１９９７）を参照のこと）；カルバミン酸塩、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、またはオルトエステル結合（アセトン−ビス−（Ｎ−マレイミドエチル）ケタールリンカー（ＭＫ）を含む）が挙げられる。

１つのさらなる実施形態では、本明細書中に記載されるＰＥＧ化アプローチでの使用が意図されるポリマー分子は、特に、水溶性ポリマーまたはそれらの混合物から選択される。ポリマーは、１つの反応基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有し得、その結果、重合の程度が制御され得る。水溶性ポリマーまたはその混合物は、所望される場合には、例えば、以下からなる群より選択され得る：ＰＥＧ、モノメトキシ−ＰＥＧ、ＰＥＯ、デキストラン、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）、プロピレングリコールホモポリマー、脂肪酸、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ＨＰＭＡ、ＦＬＥＸＩＭＡＲ（商標）、およびポリビニルアルコール、モノ−（Ｃｌ−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカルボネートＰＥＧ、セルロース、他の炭水化物をベースとするポリマー、またはそれらの混合物。特定の実施形態では、選択されるポリマーは、それに結合させられるタンパク質が水性の環境（例えば、生理学的環境）で沈殿しないように、水溶性である。ポリマーは、様々な態様では、分岐状であるかまたは分岐していない。１つの実施形態では、最終的な調製産物の治療的使用のためには、ポリマーは薬学的に許容されるものである。ＰＥＧ部分を含むペプチドを作製するための方法は当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，８２４，７８４号を参照のこと。

１つの実施形態では、反応性アルデヒドは、ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド（これは水安定性である）またはモノ−Ｃ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。本明細書中で使用される場合は、ＰＥＧは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールのような他のタンパク質を誘導するために使用されているＰＥＧの任意の形態を含むように意味される。いくつかの実施形態では、ポリマーは分岐状であるか、または分岐していない。１つの実施形態では、最終的な調製産物の治療的使用のためには、ポリマーは薬学的に許容されるものである。

少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられたタンパク質には、イオン性、疎水性、親和性、生体親和性相互作用のような相互作用によって、１つ以上のポリマー分子に共有結合させられたかまたは共有結合以外の結合によって結合させられたタンパク質が含まれる。１つの実施形態では、ポリマー分子は、二官能性試薬の使用によって、およびスペーサーアームを介してタンパク質に結合させられる。関連する実施形態では、ポリマー分子は、親和性相互作用によってタンパク質に結合させられる。例えば、タンパク質はビオチニル化され、ポリマー分子に結合させられたアビジンまたはストレプトアビジンがタンパク質に結合させられる。さらに、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体ならびにそれらの断片がポリマー分子に結合させられ、その後、この複合体がタンパク質に結合させられる。ポリマー分子は、例えば、ポリグリコシルトランスフェラーゼを用いたサッカライドの転移（ＵＳ６，３７９，９３３）またはグリコペグ化（ＵＳ２００４ ０１３２６４０）のような酵素的方法によってもまたタンパク質に結合させられる。別のアプローチは、例えば、ＶＷＦタンパク質のＡ１ドメインおよびＡ３ドメインに対するＰＥＧ化コラーゲンまたはコラーゲン断片の結合のような、それらの生物学的機能に基づくタンパク質に対するポリマー分子の結合である。この目的のためには、特定の態様では、例えば、ヒトの胎盤に由来する、ＶＷＦと強い相互作用を示すＩ型およびＩＩＩ型由来のコラーゲンが使用される。ポリマー分子の結合は、タンパク質のインビボでの適用後の生理学的条件下で可逆的であるか、または不可逆的である。

本発明の１つの例においては、工程（ａ）において、少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられたタンパク質が、基体または担体マトリックス上に、例えば、上記タンパク質に特異的に結合することができる抗体によって固定される。

基体または担体マトリックスは、何らかの具体的な限定を意味するものではなく、例えば、不溶性のポリマー材料をいう。これは、有機ポリマー（例えば、ポリアミドまたはビニルポリマー（例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、およびポリビニルアルコール、またはそれらの誘導体））、天然のポリマー（例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、キチン、およびポリアミノ酸）、あるいは無機ポリマー（例えば、ガラスまたは金属水酸化物）であり得る。特定の実施形態では、基体は、マイクロキャリア、粒子、メンブレン、細片、紙、薄膜、パール、ビーズ、またはプレート（例えば、マイクロタイタープレート）の形態である。１つの態様では、少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられたタンパク質は、共有結合によって直接、または担体（例えば、リンカー分子）を介して基体上に固定されるか、あるいは、基体上に固定された抗体である。

検出可能な標識
いくつかの実施形態では、本発明の方法に有用なタンパク質またはポリマーは、その検出を容易にするために標識される。「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出することができる組成物である。

使用されるスクリーニングアッセイに応じて、タンパク質またはその断片、あるいはポリマーまたはその断片が標識される。使用される特定の標識または検出可能な基は、これが結合体の生物学的活性を有意に妨害しない限りは、本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有している任意の物質である。したがって、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出することができる任意の組成物である。

本発明での使用に適している標識の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されている他のもの）、ならびに比色標識（例えば、コロイド金または着色ガラスもしくはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）。

標識は、当該分野で周知の方法にしたがって、所望されるアッセイの成分に対して直接または間接的に結合させられ得る。好ましくは、標識は、１つの実施形態では、本発明の活性物質を結合させるためのイソシアネート試薬を使用して、生体ポリマーに共有結合させられる。本発明の１つの態様では、本発明の二官能性イソシアネート試薬が、生体ポリマーに対して標識を結合させて、それに活性物質が結合させられていない標識生体ポリマー結合体を形成させるために使用される。標識生体ポリマー結合体は、本発明の標識された結合体の合成のための中間体として使用することができ、また、生体ポリマー結合体を検出するためにも使用することができる。上記で示されるように、多種多様な標識が、必要な感度、アッセイの所望される成分との結合の容易さ、必要な安定性、利用できる機器、および廃棄設備に応じた標識の選択とともに使用され得る。非放射性標識は多くの場合、間接的手法によって結合させられる。一般的には、リガンド分子（例えば、ビオチン）が分子に共有結合させられる。リガンドは別の分子（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合し、これは、それ自体を検出することができるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物のようなシグナルシステムに共有結合させられるかのいずれかである。

特定の態様では、結合体は、例えば、酵素またはフルオロフォアとの結合によって、シグナルを生じる化合物に直接結合させられる。標識としての使用に適している酵素としては、ヒドロラーゼ（特に、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ）またはオキシドターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）（特に、ペルオキシダーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。標識としての使用に適している蛍光化合物（すなわち、フルオロフォア）としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。適しているフルオロフォアのさらなる例としては、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニン、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロライドエリスロセイン（Ｂ ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｅｒｙｔｈｒｏｓｃｅｉｎ）、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。標識としての使用に適している化学発光化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法において使用される様々な標識またはシグナル産生システムの概要については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。

標識を検出する手段は当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性である場合は、検出手段には、オートラジオグラフィーにおけるような、シンチレーション・カウンター（例えば、ラジオイムノアッセイ、シンチレーション近接アッセイ）（Ｐｉｔａｓら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ．３４：９０６−１２，２００６）または写真用フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合は、これは、光の適切な波長でフルオロフォアを励起させること、および得られた蛍光を検出することによって検出され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、フローサイトメトリー、または当該分野で公知の他の方法）。蛍光は、電化結合素子（ＣＣＤｓ）または光電子増倍管などのような電子検出器の使用によって視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、酵素に適切な基質を提供すること、および得られた反応産物を検出することにより検出され得る。比色分析または化学発光による標識は、標識に付随する色を観察することにより簡単に検出することができる。本発明の方法での使用に適している他の標識および検出システムは、当業者に容易に明らかとなるであろう。

標識の１つの実施形態では、その方法での使用が意図されるタンパク質：ポリマー結合体またはポリマー：タンパク質複合結合体は、基体または担体マトリックスのような固体支持体（フィルター、マイクロキャリア、粒子、メンブレン、細片、紙、薄膜、ビーズ、もしくはプレート、または当該分野で公知の任意の他の担体マトリックスを含むがこれらに限定されない）に連結させられる。

標識された化合物が溶液中で標識され得、そして相互作用させられ得ることがさらに意図される。例えば、捕捉抗体が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ドナー分子で標識され得、標的分子はＦＲＥＴアクセプター分子で標識され、その結果、これらの分子は結合が起こると接近して存在する。あるいは、標的分子がＦＲＥＴドナーで標識され得、抗体分子がＦＲＥＴアクセプターで標識され得る。別の可能性は、標的と抗体がハイブリダイズしている場合に抗体または標的上に両方が存在する、消光性の分子と蛍光分子を分離することである。標的分子は、それが試薬と相互作用している場合にだけ、その標識を発光させるために十分に接近する。これは、分子が試薬（直接モニタリングされる）と相互作用した場合にのみ発光するシステムを生じる。１つの実施形態では、フィルターを通過した狭いバンドが、分子の標識の波長を除くすべての波長をブロックするために使用される。ＦＲＥＴ分子対は当該分野で市販されており（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）、そして製造業者のプロトコールにしたがって使用され得る。ＦＲＥＴの発光は、光学的画像化技術（例えば、ＣＣＤカメラ）を使用して検出される。

抗体−抗原相互作用を検出する別の方法は、電子ドナーでそれを標識することである。このドナー標識は、それに対して試薬が結合させられる電気接点に電子を提供する（例えば、Ｇｈｉｎｄｉｌｉｓ，Ａ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２８：８４−９，２０００）およびＤａｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ．２９：２３３−４０，２００５）（ここでは、電気免疫アッセイに有用な酵素とそのための方法が記載されている）を参照のこと）。電気接点は、その後、ＡＤ（アナログからデジタルへの）変換器によって読み取られ、定量される。電子係数が高いほど、より多くの相互作用が起こる。

単一分子の検出が可能な標識の１つの実施形態は、引用により本明細書中に組み入れられる、Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９９６−１００１（２０００）に記載されているような、光学的レポーターとしてのプラズモン共鳴粒子（ＰＲＰ）の使用である。ＰＲＰは、典型的には、４０ｎｍ〜１００ｎｍの直径の金属ナノ粒子である、これは、金属の内部での伝導電子の集団共鳴（すなわち、表面プラズモン共鳴）が原因で、並はずれた効率で弾性的に光を散乱させる。ナノ粒子に伴うプラズモン共鳴の大きさ、ピーク波長、およびスペクトル幅は、ナノ粒子の大きさ、形状、および物質の組成、ならびに局所環境に依存する。調製の際にこれらのパラメーターに影響を与えることにより、スペクトルの可視範囲に散乱ピークを持つＰＲＰが形成される。球形のＰＲＰについては、ピークの散乱波長と散乱効率の両方が半径が大きくなるに伴って増大し、それにより、異なる色に着色された標識を生じさせるための手段が提供される。例えば、調製の際に球の最終半径を調節することによって、それについてのピークの散乱波長が目的とされた波長の数ナノメートル以内にある銀色の球の集団が、再現可能な方法で調製される。ＰＲＰは明るく、なおもナノサイズであるので、これらは、単一分子の検出の指標として使用される。すなわち、視野の中に結合したＰＲＰが存在することは、１つの結合事象を示し得る。

アッセイおよび検出が、タンパク質またはタンパク質複合体に結合したポリマーの数を決定するため、あるいは、溶液（例えば、血清または血漿）中の遊離のポリマーの程度を決定するために有用であることが意図される。この方法において観察される検出可能なシグナルは、既知の量のポリマーを含む標準物と比較した、タンパク質またはタンパク質複合体に結合させられた、あるいは、溶液中に遊離しているポリマーの数と相関関係がある。

したがって、１つの実施形態では、本発明により、溶液中の、タンパク質またはタンパク質複合体に結合させられたか、あるいは遊離の、生理学的に許容されるポリマー分子の数を決定するための方法が提供される。この方法には、上記ポリマーを上記ポリマーに特異的に結合する抗体と接触させる工程が含まれる。ここでは、抗体が結合したポリマーの数は、既知の対照と比較した、結合した検出される抗体のレベルと相関関係がある。

別の実施形態では、本発明により、タンパク質またはタンパク質複合体に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の数を決定するための方法が意図される。この方法には、上記タンパク質またはタンパク質複合体を、上記タンパク質またはタンパク質複合体に特異的に結合する抗体と接触させる工程が含まれる。ここでは、抗体が結合したポリマーの数は、既知の対照と比較した、結合した検出される抗体のレベルと相関関係がある。

関連する実施形態では、本発明の方法は、他の検出レジュメを使用して行われる。例えば、ここでは、タンパク質とポリマー特異的抗体が、以下のように任意の順序で使用される。ここでは、列挙される第１の抗体は担体マトリックスに結合させられた抗体であり、第２の抗体は検出可能な抗体に結合させられる。タンパク質またはタンパク質複合体に結合させられたポリマーの数を検出するために有用な例示的なアッセイとしては、抗ポリマー−抗タンパク質検出法、抗タンパク質−抗ポリマー検出法、または抗ポリマー−抗ポリマー検出法が挙げられる。ここでは、抗ポリマー抗体は、それぞれの結合工程について同じ抗体であるか、またはそれぞれの工程について異なるポリマー特異的抗体である。関連する実施形態では、アッセイは、抗ポリマー特異的抗体または抗タンパク質特異的抗体だけを使用して行われる。

キット
さらなる態様として、本発明には、本発明の方法を実施するためのそれらの使用を容易にする方法でパッケージされた１種類以上の化合物または組成物を含むキットが含まれる。
１つの実施形態では、そのようなキットには、容器（例えば、密閉された瓶もしくは器）の中にパッケージされた、生理学的に許容されるポリマーに結合させられたタンパク質またはタンパク質複合体（例えば、ＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子）と、タンパク質上の水溶性ポリマーを特異的に検出する抗体または他の分子とを含む組成物が、この方法を実施する際の化合物または組成物の使用を記載している容器に貼られたかまたはパッケージ中に含まれるラベルとともに含まれる。関連する実施形態では、結合因子は、可溶性受容体、リガンド、補因子、またはタンパク質、タンパク質複合体、もしくはポリマーに特異的に結合する別の化学物質である。キットには、状況に応じて、ポリマー−タンパク質複合体の検出のための試料の調製のための試薬と緩衝液が含まれ得る。好ましくは、化合物または組成物は、単位投薬形態でパッケージされる。キットにはさらに、特定の投与経路にしたがって組成物を投与するために適しているデバイスが含まれ得る。好ましくは、キットには、修飾された血液因子組成物の使用を記載しているラベルが含まれる。

本発明の１つの実施形態では、この方法には、以下の工程を含む酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる：
（ｉ）ＥＬＩＳＡプレートに対して、少なくとも１つの生理学的に許容されるポリマー分子に結合させられたタンパク質に特異的に結合することができる抗体を固定する工程；
（ｉｉ）固定された抗体に対して目的のタンパク質を結合させる工程；および
（ｉｉｉ）目的の上記タンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子に特異的に結合することができる抗体によってタンパク質に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の量を検出する工程。

本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これらに限定されない。

実施例１
抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳ（ＰＥＧ化ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ））に対する直接の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
動物に注射したＰＥＧ化抗原を使用してＰＥＧに対するポリクローナル抗体が生じるかどうかを決定するために、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）をＰＥＧに連結させ、タンパク質結合体をウサギに注射した。その後、抗ＰＥＧ抗体の量を測定した。

簡単に説明すると、ポリクローナル抗体を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に共有結合させたＰＥＧでのウサギの免疫化によって作製した（Ｒｉｃｈｔｅｒ ＡＷら、１９８３；Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７０：１２４−３１）。ウサギに約３８０μｇ／ｍｌのタンパク質と２５０μｇ／ｍｌのＰＥＧ濃度を持つ抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳの調製物を接種した。全ての動物の血清試料を、開始前と開始後３週間および４週間で採取し、続いて、抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳに対する検出可能な抗体の形成を試験した。抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳ（ＰＥＧ化ｈＳＡ）を、０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍｌでコーティングした。試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液中に希釈し、ウェルとともに、続いて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体とともに、Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＩＭＩＴ）（Ｎａｓｅｒ，Ｗ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２９：１５１−７，１９９０）を使用してインキュベートした。ＳＩＭＩＴにおいては、リガンド（例えば、抗体）とリガンド結合試薬（例えば、抗体に対する抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ））を、１回のインキュベーション工程の間に、免疫反応物の複数の層が形成され、それによってアッセイ感度の増大が生じるように、同時にインキュベートした。抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳに対する抗体の形成を検出することができた。この抗原はプレート上に直接コーティングすることができ、免疫化時間に伴って力価が増大した（図１Ａ）。

さらに具体的には、ＰＥＧ化ｈＳＡを、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５２：３５７８−８１，１９７７）にしたがって調製した。ＰＥＧ化ｈＳＡは、高速サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるように、より大きな分子量を有していた。全ての動物の血清試料を、開始前と開始後３週間および４週間で採取し、プールした。これらのプールした試料を、続いて、直接のＥＬＩＳＡによって免疫化抗原に対する抗体の形成について試験した。簡単に説明すると、ＰＥＧ化ｈＳＡを、０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍＬの濃度で、９６ウェルポリスチレンマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６）にコーティングした。プールしたウサギ血清試料を、１ｍｇ／ｍＬのゼラチンを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、ウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体とともにインキュベートした。免疫化抗原に対する抗体の形成を検出することができた。加えて、免疫化時間とともに力価が増大した（図１Ｂ）。同じ方法を、別の免疫化実験で得られた試料中の抗体力価を測定するために使用した。表１は、開始時と、開始後３６日目および５０日目に採取した試料の、ブランクによって補正した光学密度（ＯＤ）を示す。この場合にもまた、希釈率１／５０および１／１００の試料についての結果は、免疫化抗原に対するＩｇＧの形成が時間に伴って増加したことを示していた。

これらの結果は、ＰＥＧが結合したｈＳＡタンパク質が、被検動物からのポリクローナル抗体の生産を誘導したことを示している。

実施例２
ＰＥＧによる抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳについての直接のＥＬＩＳＡの阻害
抗ＰＥＧ抗体の結合がＰＥＧに特異的であったかどうかを決定するために、抗体の結合を妨害する遊離のＰＥＧの能力を評価した。

簡単に説明すると、ウサギを抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳで免疫化し、血清試料を上記のように調製した（実施例１）。抗原ＨＳＡＰ−２−ｈ−ＳＳを表面上に、０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍｌでコーティングした。試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液またはＰＢＳ−ゼラチン−１％のＰＥＧ ５０００緩衝液（＋１％のＰＥＧ）中に希釈し、ウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＳＩＭＩＴ）とともにインキュベートした。ウサギの免疫化によって得られた抗原（＝ＰＥＧ化ｈＳＡ）に対する抗体の結合を、試料希釈緩衝液にＰＥＧ ５０００を添加することによって阻害することができた（図２Ａ）。

さらに具体的には、ＰＥＧ化ｈＳＡでの免疫化によって得られた抗血清の抗ＰＥＧ特異性を、阻害実験を用いてチェックした。プレート（実施例１）を、免疫化抗原であるＰＥＧ化ｈＳＡで、１０μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。免疫化の開始後３週間および４週間で採取したプールしたウサギの血清試料をＰＢＳ−ゼラチン中に希釈して、１／１００〜１／１００，０００の範囲の希釈系列を得た。ＰＥＧ ５０００を、ＰＥＧ化ｈＳＡの結合を阻害するために、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した。結合したウサギＩｇＧを、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体とペルオキシダーゼ基質であるＳｕｒｅｂｌｕｅを使用することによって検出した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５０００は、プレートに固定したＰＥＧ化ｈＳＡに対するウサギＩｇＧの結合を減少させた（図２Ｂ）。

これらの結果は、ウサギ血清中に含まれるＩｇＧがＰＥＧを特異的に認識し、これに結合することを示している。ＰＥＧの存在下に残っているウサギＩｇＧの結合は、ｈＳＡに対する抗体によって生じた。これらの非ＰＥＧ特異的ＩｇＧを、固定したｈＳＡ上にアフィニティークロマトグラフィーによって吸着させた。

実施例３
ＰＥＧ修飾プレートについての直接のＥＬＩＳＡ
抗ＰＥＧ抗体がプラスチックに直接結合させられたＰＥＧに結合するかどうかを決定するために、直接のＰＥＧ ＥＬＩＳＡを開発した。

簡単に説明すると、ウサギを抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳで免疫化し、血清試料を上記のように調製した（実施例１）。基体（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６）を、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ中の１ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ−ＮＰＣ ５０００で室温で２時間コーティングし、その後、ＰＢＳ−ゼラチン（５ｍｇ／ｍｌ）でブロックした。試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液中に希釈し、ウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＳＩＭＩＴ）とともにインキュベートした。ＰＥＧ修飾プレート（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６）に対する血清試料中に存在する抗体の結合を検出した（図３）。

さらに具体的には、ウサギをＰＥＧ化ｈＳＡで免疫化し、血清試料を上記のように調製した（実施例１）。プレート（実施例１）を、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ中の１ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ；ＳｕｎＢｉｏ，Ｋｏｒｅａ）５０００で、室温で２時間コーティングし、次いで、ＰＢＳ−ゼラチン（５ｍｇ／ｍｌ）でブロックした。血清試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液で希釈し、ウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼとともにインキュベートした。ＰＥＧ修飾プレートに対するウサギ血清試料中に存在するＩｇＧの明らかな結合が検出された（図３）。同じ手順をポリリジン活性化プレートおよびＮＨ_２活性化プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を用いて行った場合には、反応は観察できなかった。

これらの結果は、ウサギの血清試料中に含まれる抗ＰＥＧ ＩｇＧがＰＥＧを認識し、これに結合したことを示している。

実施例４
ＶＷＦおよびＰＥＧ−ＶＷＦについての直接のＥＬＩＳＡ
抗ＰＥＧ抗体が免疫化抗原以外のＰＥＧ化タンパク質に結合するかどうかを決定するために、抗ＰＥＧ抗体を、ＰＥＧ化フォン・ヴィレブランド因子とともにＥＬＩＳＡにおいて使用した。

簡単に説明すると、ウサギを抗原ＨＳＡＰ−２−ＳＳで免疫化し、血清試料を上記のように調製した（実施例１）。１つの基体を０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中のＰＥＧ化ＶＷＦ（ＰＥＧ−ＶＷＦ）でコーティングし、別の基体を０．１Ｍの炭酸塩（ｐＨ９．６）中の組み換え体ＶＷＦ（ｒＶＷＦ−１２）でコーティングした。試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液中に希釈し、ウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＳＩＭＩＴ）とともにインキュベートした。ＶＷＦのＰＥＧ化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した分子量の増大として決定した。ＰＥＧ化組み換え体ＶＷＦ（ｒＶＷＦ）に対する血清試料中に存在する抗体の結合を検出した。血清試料中に存在する抗体のｒＶＷＦに対する結合は観察されなかった（図４Ａ）。

さらに具体的には、ウサギの血清試料（実施例１を参照のこと）を、プレートに固定したｒＶＷＦおよびＰＥＧ化ｒＶＷＦと反応させた。ＰＥＧ化ｒＶＷＦは、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら（ＢｉｏＤｒｕｇ ５：４１９−２９，２００１）に記載されているようにＰＥＧ化試薬を使用することによって調製した。両方のタンパク質をポリスチレンプレートにコーティングした（実施例１）。免疫化の前および３週間後に採取したウサギの血清試料をＰＢＳ−ゼラチン緩衝液中に希釈し、ウェルとともに、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体とともにインキュベートした。ウサギをＰＥＧ化ｈＳＡで免疫化したにもかかわらず、プレートに固定したＰＥＧ化ｒＶＷＦに対するウサギの血清試料中に存在するＩｇＧの結合が検出された。ｒＶＷＦに対するウサギの血清試料中に存在するＩｇＧの結合は観察されなかった（図４Ｂ）。

これらの実験は、抗ＰＥＧ抗体が非ＰＥＧ化タンパク質に非特異的には結合しないことを示している。

実施例５
ＶＷＦ−ＰＥＧ化の検出のためのＥＬＩＳＡ
ＰＥＧ化タンパク質（例えば、ＰＥＧ化ＶＷＦ）を検出する抗ＰＥＧ抗体の能力を決定するために、ＶＷＦ−ＰＥＧ ＥＬＩＳＡを開発した。

簡単に説明すると、基体（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６）を抗ＶＷＦ抗体でコーティングし、漸減量のＰＥＧ化ＶＷＦとともにインキュベーションし、続いて、抗ＰＥＧペルオキシダーゼ結合体とともにインキュベーションした。結合したペルオキシダーゼをＳｕｒｅＢｌｕｅを用いた比色反応によって検出し、シグナル強度は希釈物中のＰＥＧ化ＶＷＦと相関関係があった（図５）。

さらに具体的に、以下の実施例に、タンパク質特異的抗体（好ましくはウサギ由来）を酵素を結合させた抗ＰＥＧ ＩｇＧ（好ましくはウサギ由来）と組み合わせて、ＰＥＧ化タンパク質の検出および測定のために使用する、タンパク質−ＰＥＧ ＥＬＩＳＡを記載する。基本的には、ＰＥＧ化タンパク質を、プレートに固定した抗タンパク質抗体によって捕捉し、その後、抗ＰＥＧ ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体と反応させた。ウサギ抗ヒトＶＷＦ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ａ−００８２）を、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に１／５００に希釈し、ポリスチレンプレートにコーティングした（実施例１）。代わりに、任意のモノクローナル抗体を適切な希釈率で使用することができる。ＰＢＳで洗浄を行い、希釈緩衝液にゼラチンを５ｍｇ／ｍＬで含めた。ｒＶＷＦ（試料Ａ）と様々なＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物（試料Ｅ、Ｆ、Ｇ）を希釈緩衝液で希釈して、０．８５ｍＵ／ｍＬのＶＷＦ：Ａｇ濃度とした。試料Ａは、修飾前の天然のｒＶＷＦを示し、一方、調製物Ｅ、Ｆ、およびＧは、１ｍＭ、２．５ｍＭ、および７．５ｍＭのモル濃度のＰＥＧ化試薬であるＰＥＧ−ＳＳ−５Ｋを使用して調製した。さらに５種類の１＋１希釈物を調製し、プレートに固定した抗ＶＷＦ ＩｇＧとともにインキュベートした。結合したＰＥＧ化ｒＶＷＦを、抗ＰＥＧ ＩｇＧペルオキシダーゼ結合体とペルオキシダーゼ基質であるＳｕｒｅＢｌｕｅを用いた反応によって検出した。表２は、測定した様々な調製物の用量応答曲線の傾きと回帰係数を示す。明らかに、非ＰＥＧ化ｒＶＷＦ（試料Ａ）は応答を示さず、一方、３種類のＰＥＧ化ｒＶＷＦ試料Ｅ、Ｆ、およびＧの直線的な用量応答曲線は明らかに異なる傾きを有していた。

３種類のＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物は、非ＰＥＧ化ｒＶＷＦと比較して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で大きい分子量を示した（図５）。加えて、ＰＥＧ化に利用した、ｒＶＷＦに対するＰＥＧの比が大きいほど、大きな分子量のＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物と、より急勾配の用量応答曲線が生じた。したがって、記載した設計によっては、タンパク質に結合させられたＰＥＧが特異的に検出されるだけではなく、ＰＥＧ化の程度が異なる調製物を区別することもまた可能であった。

実施例６
ＰＥＧを用いた阻害によって示されるｒＶＷＦ−ＰＥＧ ＥＬＩＳＡの特異性
ＰＥＧアッセイの特異性を評価するために、阻害実験を行った。

アッセイは上記のように（実施例５を参照のこと）、高いＰＥＧ化の程度を持つＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物を用いて行った。希釈したＰＥＧ化ｒＶＷＦ試料（０．８５ｍＵ／ｍＬ）を、プレートに固定した抗ＶＷＦ抗体とともに、続いて、ＰＥＧ ５０００（５０ｍｇ／ｍＬ〜０．０２４ｍｇ／ｍＬ）の存在下で抗ＰＥＧ ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体とともにインキュベートした。ＰＥＧ ５０００は、明らかな用量依存性の阻害を生じ（図６）、０．１８μｇ／ｍＬのＩＣ_５０を有していた。

実施例７
ＰＥＧ−ＰＥＧ ＥＬＩＳＡの詳細
本実施例では、ＰＥＧ化タンパク質または遊離のＰＥＧを捕捉し、検出するためにポリクローナルウサギ抗ＰＥＧ ＩｇＧを使用する、ＰＥＧ−ＰＥＧ ＥＬＩＳＡを記載する。

抗アルブミン枯渇ウサギ抗ＰＥＧ ＩｇＧを、０．１Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中で一晩、ポリスチレンプレートにコーティングした（実施例１）。プレートのブロックは、２％の脱脂粉乳と２ｍＭのベンズアミジンを含むＰＢＳ（ｐＨ６．１）を用いて、３７℃で３時間行った。Ｔｗｅｅｎ ２０または他のポリエトキシ含有界面活性剤は、アッセイ全体について使用しなかった。ブロッキング緩衝液を使用して、以下の試料について希釈系列を調製した：ｍＰＥＧ２−２０Ｋ−ＮＨＳ（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら［Ｂｉｏｄｒｕｇ ２００１；５：４１９−２９］によって記載されているような、安定な２０Ｋ ＰＥＧ化試薬）およびこの試薬を使用して調製した安定なＰＥＧ化ｒＶＷＦ（１ＩＵのＶＷＦ：Ａｇあたり９．８μｇの結合したＰＥＧ）；２０Ｋ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ（ＵＳ２００８／０２３４１９３に記載されているような、分岐状の「放出することができる」２０Ｋ ＰＥＧ試薬）およびこの試薬を使用して調製した放出することができる２０Ｋ−ＰＥＧ化ｒＶＷＦ（１ＩＵのＶＷＦ：Ａｇあたり８．２μｇの結合したＰＥＧ）。ＰＥＧ試薬を蒸留水中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、室温で一晩維持して活性なＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を加水分解させた。これらの試料の希釈物を、プレートに固定した抗ＰＥＧ抗体に、室温で１時間結合させた。その後、プレートを洗浄し、抗ＰＥＧ ＩｇＧペルオキシダーゼを添加した。最後に、結合したペルオキシダーゼ活性を測定した。全ての試料が直線的な用量応答曲線を示したが（図７）、感度は様々であった。ＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物は、低いｎｇ範囲の結合したＰＥＧで測定することができた。結合していない遊離のＰＥＧ試薬は、加水分解後もまた、このアッセイの設計を用いて測定することができたが、直線的な用量応答関係にはより高いＰＥＧ濃度が必要であった。

これらの知見は、５Ｋ ＰＥＧ化ｈＳＡでのウサギの免疫化によって得られた抗ＰＥＧ ＩｇＧが、（ｉ）免疫化に使用した５ｋ ＰＥＧだけに結合するのではなく、（ｉｉ）ＰＥＧ鎖上に提示される反復エピトープにも結合し、タンパク質−ＰＥＧ連結領域には結合しないことを示している。タンパク質が結合させられたＰＥＧの除去のための前処理を使用することにより、このアッセイの設計は、遊離の結合していないＰＥＧの測定に有用である。なぜなら、遊離の結合していないＰＥＧは、例えば、ＰＥＧ化後に反応混合物中に残っているからである。加えて、このアッセイはまた、精製されたＰＥＧ−タンパク質結合体中の結合していないＰＥＧの量を測定するためにも有用である。

実施例８
ＰＥＧ−ＰＥＧ ＥＬＩＳＡの特異性
上記のＰＥＧ−ＰＥＧ ＥＬＩＳＡの特異性を、上記アッセイ条件（実施例７）を使用して示した。加えて、非ＰＥＧ化ｒＶＷＦ試料をＰＥＧ−ＰＥＧアッセイを使用して分析し、これは、さらに１００倍高いＶＷＦ：Ａｇ濃度でもなお応答がなかったことを示していた（図８）。これらの結果は、抗ＰＥＧ抗体およびＰＥＧ−ＰＥＧアッセイの特異性を示している。

実施例９
安定なＰＥＧ化ｒＶＷＦの測定のためのＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡの詳細
ＰＥＧ特異的ＥＬｌＳＡが、抗ＰＥＧ抗体を捕捉抗体として使用した場合に感度の高い検出方法であるかどうかを決定するために、ＰＥＧ化タンパク質を捕捉するための抗ＰＥＧ抗体と、結合したＰＥＧ化タンパク質を検出するためのタンパク質特異的抗体とを使用するＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡを開発した。

アルブミン枯渇抗ＰＥＧ ＩｇＧを０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で約５０μｇ／ｍＬに希釈し、これを９６ウェルポリスチレンマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６）のウェルにコーティングした。その後、ウェルを、希釈緩衝液（ＰＢＳ中の３％の脱脂粉乳、２ｍＭのベンズアミジン；ｐＨ６．１）で、３７℃で２時間ブロックした。その後、試料の希釈系列をロードし、ウェルとともに室温で６０分間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗ヒトＶＷＦ−ペルオキシダーゼ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を添加し、結合したペルオキシダーゼ活性をＳｕｒｅＢｌｕｅを用いて測定した。あるいは、ペルオキシダーゼ結合体を試料に添加し、１回のインキュベーションによる多層免疫技術（ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（ＳＩＭＩＴ）を使用して予備洗浄工程を行わずにインキュベートした。安定な２０Ｋ−ＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物（実施例７を参照のこと）を使用した。ＰＥＧ−ＶＷＦ ＥＬＩＳＡアッセイのロバスト性を、フォン・ヴィレブランド欠損（ＶＷＤ）マウス血漿中にこの調製物を希釈する（血漿中でのＶＷＦの最終濃度は９０％であった）ことによって、そして実施例７に記載したようなＰＥＧ試薬（ＰＥＧ試薬の最終濃度：０．５ＩＵのＰＥＧ化ＶＷＦで１ｍｇ／ｍＬ）とｒＶＷＦ（ｒＶＷＦの最終濃度：５ＩＵのＰＥＧ化ｒＶＷＦで７ＩＵ）の添加によって示した。直線的な用量応答曲線が、連続アッセイ形式を使用した場合に、またＳＩＭＩＴ形式についても、２７ｎｇ／ｍＬ〜１．７ｎｇ／ｍＬの範囲の結合したＰＥＧ中の全ての試料について得られた（図９）。

非結合ＰＥＧ試薬の存在だけではなく、非ＰＥＧ化ｒＶＷＦの過剰も、アッセイを損なうことはなかった。また、ＶＷＤマウス血漿のマトリックスも妨害することはなかった。したがって、このアッセイは、ＰＥＧ−タンパク質結合体の堅実（ｒｏｂｕｓｔ）で感度の高い検出を示す。

実施例１０
放出することができるＰＥＧ化ｒＶＷＦの測定のためのＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡの詳細
上記のロバスト性の実験（実施例９を参照のこと）をまた、放出することができる２０Ｋ ＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物を用いて行った（実施例７を参照のこと）。同様の結果が、放出することができる２０Ｋ−ＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物について、２１ｎｇ／ｍＬ〜１．３ｎｇ／ｍＬの直線的範囲で得られ（図１０）、そしていずれの化合物の妨害も検出されなかった。これらのデータは、タンパク質にＰＥＧ部分を結合させるために使用したリンカーがＰＥＧ−タンパク質結合体の検出／測定に影響を与えなかったことを示していた。

実施例１１
タンパク質を結合させたＰＥＧについてのＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡの特異性
ＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡの特異性を、上記のような非結合ＰＥＧ試薬とＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物の直接の測定によって示した。

いずれの場合にも、安定な放出することができる試薬と結合体を使用した。ＰＥＧ化ｒＶＷＦ調製物はいずれも、類似する用量依存性の応答を示したが、いずれの試薬も、１０倍高い濃度で測定した場合には、用量依存性のシグナルを示さなかった（図１１）。これらのデータは、ＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡがＰＥＧ−タンパク質結合体を特異的に検出し、測定することを示している。

実施例１２
ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡの特異性
本明細書中に記載したＰＥＧ ＥＬｌＳＡをさらなる血液凝固因子について使用できるかどうかを決定するために、ＰＥＧ−タンパク質ＥＬＩＳＡの一般的に適応できる原理を、上記のアッセイ条件（実施例９）を使用してＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物を分析することによって示した。

抗ヒトＦＶＩＩＩペルオキシダーゼ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を、プレートに結合させたＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを検出するための抗ヒトＶＷＦペルオキシダーゼの代わりに使用した。結果は、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡが特異的であったことを示していた。なぜなら、非ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、１０００倍高いＦＶＩＩＩ：Ａｇ濃度で分析した場合にもなおシグナルを全く示さなかったからである（図１２）。

実施例１３
安定であり放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを用いたＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡ
ＰＥＧ ＥＬＩＳＡの特異性をまた、ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩの安定であり放出することができる調製物についても測定した。

アルブミン枯渇抗ＰＥＧ ＩｇＧを、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて約５０μｇ／ｍＬに希釈し、これを９６ウェルポリスチレンマイクロプレートのウェルにコーティングした。その後、ウェルを希釈緩衝液（ＰＢＳ中の３％の脱脂粉乳、２ｍＭのベンズアミジン；ｐＨ６．１）で室温で２時間ブロックした。その後、試料の希釈系列をロードし、ウェルとともに室温で６０分間インキュベートした。洗浄後、ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩ−ペルオキシダーゼ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を添加し、結合したペルオキシダーゼ活性をＳｕｒｅＢｌｕｅを用いて測定した。安定であり放出することができる２０Ｋ−ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物を使用した。これらの調製物はそれぞれ、１１５μｇ／ｍＬおよび３０１μｇ／ｍＬの結合したＰＥＧの濃度を有していた。表３は、これらの試料の分析についての得られた測定データを示しており、回帰曲線の特徴を提供する。

安定なＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物と放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物の両方の分析により、結合したＰＥＧのナノグラム範囲において直線的な用量応答曲線が生じた。加えて、このアッセイは、放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物について示されるように優れた再現性があり、これによりＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの正確な測定が可能である。

実施例１４
アッセイの性能に対する様々な抗ＦＶＩＩＩペルオキシダーゼ結合体の影響
アッセイの性能に対する様々な抗ＦＶＩＩＩペルオキシダーゼ結合体の影響を調べた。

ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡを上記のように行った（実施例１３を参照のこと）。Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ａｎｄ Ｃｅｄａｒｌａｎｅによる抗ヒトＦＶＩＩＩペルオキシダーゼ結合体の検出を同じアッセイにおいて比較した（図１３）。いずれの場合にも、直線的な用量応答関係が、シグナルと試料のＦＶＩＩＩ：Ａｇレベルとの間で得られ、これによって両方の結合体を互換的に使用できることを確認した。

これらの結果は、ＰＥＧ ＥＬＩＳＡが適切な選択性で利用できる抗タンパク質抗体結合体の任意の調製物を用いた場合に有用であることを示唆している。

実施例１５
ＦＶＩＩＩ欠損マウスの血漿およびラットの血漿中でのＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡの性能
ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡの有効性と感度を、ＦＶＩＩＩ欠損マウスの血漿中、およびラットの血漿中で調べた。

放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物を、動物の血漿中または希釈緩衝液中で、０．５μｇの結合させたＰＥＧ／ｍＬに等しい濃度になるようにスパイクした。緩衝液中および動物の血漿中にあるこれらの試料について得られた用量応答曲線（図１４）は非常に類似していた。加えて、安定なＰＥＧ化ｒＦＶｌｌｌを、１／１０および１／２０に希釈したＦＶＩＩＩ欠損マウス血漿に、５０ｎｇ／ｍＬの結合させたＰＥＧのレベルでスパイクした。スパイクした濃縮物の９９．８％および９７．９％の回収率が測定された。これは、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬｌＳＡが、高い感度と特異性で放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの薬物動態をモニターするために有用であり、これには、適切な試料の希釈以外の特別な試料の前処理の必要がないことを示していた。同様のデータが、ＰＥＧ化ｒＶＷＦを含む試料を分析した場合に得られた。

実施例１６
ＰＥＧ化の程度が異なる放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物の測定
ＰＥＧ化の程度が異なる放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物を、ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡで分析した。

ＥＬＩＳＡを上記のように行った（実施例１３を参照のこと）。加えて、これらの調製物のＦＶＩＩＩ：Ａｇレベルを、市販されているＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。これらの調製物のＰＥＧ化の程度をＨＰＬＣに基づく方法で測定し、１モルのＦＶＩＩＩあたりの結合したＰＥＧのモル数として表わした。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ調製物を、希釈緩衝液に、またはＦＶＩＩＩ欠損マウス血漿に添加し、これらの試料をＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡで測定した。その後、ＰＥＧ ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡを用いて測定した結合したＰＥＧの濃度を、これらの試料のＦＶＩＩＩ：Ａｇ濃度に対して正規化し、１ＵのＦＶＩＩＩ：Ａｇあたりの結合したＰＥＧのμｇ数として表わした。これらのＦＶＩＩＩ：Ａｇで正規化したＰＥＧ濃度は、緩衝液中でも、ＦＶＩＩＩ欠損マウスの血漿中でも、ＨＰＬＣに基づく方法で様々な調製物について測定したＰＥＧ化の程度と十分に相関関係があった（図１５）。

これらの結果は、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡが、それらのＰＥＧ化の程度にしたがってＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物を区別することができ、既知の標準物に対する試料の吸光度の比較がタンパク質試料のＰＥＧ化の程度を示すことを示している。さらに、これらの結果は、緩衝液中でも、またＦＶＩＩＩ欠損マウス血漿のマトリックス中でも達成される。なぜなら、このアッセイには、試験試料の適切な希釈以外の特別な試料の前処理が全く必要ないからである。これは、ＰＥＧ化された治療用タンパク質が投与されている患者の血清中でのＰＥＧ化タンパク質または他のＰＥＧレベルを測定するための方法を提供する。

実施例１７
ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡに対する遊離のＰＥＧの影響
ＰＥＧ ＥＬＩＳＡアッセイに対して遊離のＰＥＧが起こし得る影響を、１０００μｇ／ｍＬまでのＰＥＧ濃度範囲で調べた。

放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物を２０Ｋ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳと混合して、２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの最終濃度とした。ＰＥＧ試薬を蒸留水中に溶解させ、これをＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物に添加する前にＮＨＳ反応性をなくすために一晩維持した。これらの試料について得られた用量応答曲線は非常に類似しており（図１６）、これらの傾きは１０％未満しか異ならなかった。

このアッセイは、なおも高い遊離のＰＥＧのレベルでも、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡの検出レベルには影響がなかったことを示している。

実施例１８
放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩからのＰＥＧの放出の測定
上記に示したように、ＰＥＧ ＥＬＩＳＡは、タンパク質−ＰＥＧ結合体からのＰＥＧポリマーの放出を測定する。このアッセイによって放出速度を測定できるかどうかを決定するために、タンパク質を結合させたＰＥＧの放出を誘発する条件で維持した放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物を、ＰＥＧの放出を経時的に測定するために使用した。

遊離のＰＥＧのレベルを、サイズ排除クロマトグラフィーで測定した。タンパク質を結合させたＰＥＧのレベルをＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡで測定し、これは、これらの試料のＦＶＩＩＩ：Ａｇ濃度と関係があった。ＦＶＩＩＩ：Ａｇで正規化したＦＶＩＩＩが結合したＰＥＧのレベルは、遊離のＰＥＧのレベルと十分な相関関係にあった（図１７を参照のこと）。

これらの実験は、ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡによって、放出することができるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ調製物からのＰＥＧの放出をモニターすることができたことを示していた。このアッセイは、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩまたは他のＰＥＧ化された治療用タンパク質が投与されている患者について、インビボでのＰＥＧ化タンパク質の放出動態を測定するために有用である。

実施例１９
正常なプールしたラットの血漿中でのＰＥＧ化ｒＦＶＩＩａの検出
タンパク質またはタンパク質複合体のＰＥＧ化のレベルを決定するための代わりの方法としては、複合体自体の分子量に基づくタンパク質−ポリマー複合体の検出が挙げられる。このタイプのアッセイは、タンパク質のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による単離と、抗ＰＥＧウェスタンブロット検出法を使用したタンパク質上のＰＥＧ分子の検出を使用して行われる。

この技術を使用して血漿中のＰＥＧ化タンパク質の検出を決定するために、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの試料をラットの血漿中に希釈し、ＰＥＧ化タンパク質のレベルを測定した。

２０−ｋＤａ−ＰＥＧ−ＦＶＩＩａの試料と４０−ｋＤａ−ＰＥＧ−ＦＶＩＩａの試料を、ラットの血漿（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）中で１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、および６．３μｇ／ｍｌに希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットを行った。サンプリング緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、血漿中に希釈した１μｌの産物に対して添加し、勾配（３％〜８％）トリス−酢酸ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ，１．０ｍｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードした。電気泳動を、トリス−酢酸ＳＤＳランニング緩衝液中で、非還元条件下で行った。タンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ、０．２μｍ）メンブレン（Ｓｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦメンブレン、ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上に、＋４℃で１．２５Ｗで１６時間、ブロットした。その後、メンブレンを、カゼイン−ＴＢＳ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）中で＋３７℃で１時間ブロックした。

その後、免疫ブロットを、１／１０００に希釈したモノクローナルウサギ抗ＰＥＧ抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに室温で２時間インキュベートした。抗体を、ＴＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）＋１０％のカゼイン−ＴＢＳ中に希釈した。ＴＢＳＴでの５回の、それぞれ１０分間の洗浄後、二次抗体であるヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体を加え（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＴＢＳＴ／１０％のカゼイン−ＴＢＳ中に１／１０００に、室温（ＲＴ）で１時間かけて希釈した。ＴＢＳＴでの５回の洗浄工程の後、ブロットを製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によるマニュアルにしたがって高感度ケミルミネッセンス法（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＥＣＬ）Ｐｌｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して現像した。

検出のために、感度の低いＥＣＬウェスタンブロッティング試薬を、ＰＥＧ化タンパク質を視覚化させるために使用した。この技術を用いてもなお、ＰＥＧ化タンパク質は用いた全ての濃度で検出できた。二次抗体は、ラットの免疫グロブリンと交差反応を示した（図１８の中で^＊で示したバンド）。この交差反応は、ゲルにのせる前に免疫グロブリンについてラットの血漿を免疫抑制させることによって回避することができた。

実施例２０
正常なヒト血漿中でのＰＥＧ化ｒＦＶＩＩａの検出
ヒト血漿中でのＰＥＧ化タンパク質の検出を決定するために、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの試料を希釈し、ＰＥＧ化タンパク質のレベルを測定した。

２０−ｋＤａ−ＰＥＧ−ＦＶＩＩａの試料を、プールした正常なヒト（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ）血漿中に、または５％のＨＳＡ／ＨＮａ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１７５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３５））中に、５μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌに希釈した。ＥＣＬ ｐｌｕｓ検出システムを使用し、そして薄膜をごく短時間（３０秒間）感光させた（図２Ｂ）。これらの試料について、３％〜８％のトリス−酢酸勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、続いてウェスタンブロット分析を行った。ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍをバンドを視覚化させるために使用した。

比較のために、４％〜１２％のビス−トリス勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて２０−ｋＤａ−ＰＥＧ−ＦＶＩＩａの１００ｎｇおよび５０ｎｇのウェスタンブロット分析を、抗ＰＥＧ抗体（ＴＢＳ／０．０５％の脱脂粉乳（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中に１／３００に希釈した）およびＴＢＳＴ／０．１％の脱脂粉乳中に１／２０００に希釈したポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＶＩＩ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて検出した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）システムを、タンパク質を視覚化させるために適用した（図１９Ａ）。

ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩａを緩衝液中または血漿中に希釈したかどうかを検出できるほどの差はなく、ヒト血漿との弱い交差反応性しか観察されなかった（図１９Ｂ）。これらの結果は、この方法には、多くの異なるタンパク質を含む試料（例えば、ヒト血漿）中での結合したタンパク質の低いレベルを検出するために適している感度があり、したがって、凝固障害を処置するために血液凝固因子が投与されている患者から採取された試料についてポリマーが結合させられたタンパク質を検出するために有用であることを示している。

実施例２１
正常なヒト血漿中の２０−ｋＤａ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩｌａのインビトロでのＰＥＧの放出の検出
ＰＥＧ化は、通常は、タンパク質の生物学的機能を低下させる。しかし、可逆的に連結させられたＰＥＧ（これは、時間が経つに伴いタンパク質から解離してしまう可能性がある）でのタンパク質の修飾は、天然のタンパク質の遊離を可能にするはずであり、これには、その活性の完全な回復が伴う。このプロセスは、血漿中での活性の増大を経時的に測定することによってモニターされる。しかし、測定される活性は、タンパク質の放出反応および不活化／排除の速度に依存する。本発明はまた、血漿マトリックス中のそのようなタンパク質の脱ＰＥＧ化を含む構造変化を測定するためにも適している。

放出することができる２０−ｋＤａ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩｌａ結合体を、正常なヒト血漿中に０．０２３μｇ／ｍｌに希釈し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＰＥＧ分子の放出を、実施例１に記載したように、特異的抗ＰＥＧ抗体を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって決定した。図２０に示すように、ジ−ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩａの量は、時間とともにわずかに減少し、２４時間のインキュベーション後に完全に消滅した。対照的に、モノ−ＰＥＧ種は、最初はわずかな増加を示し、２４時間後も依然存在していた。したがって、これらの方法によってタンパク質分子の連続的な脱ＰＥＧ化が検出される。

これらの結果は、本発明の方法により、タンパク質またはタンパク質複合体の表面の水溶性ポリマーの程度を決定することができること、そしてまた、タンパク質からの放出することができる水溶性ポリマーの放出の機構も決定できることを示している。

実施例２２
正常なヒト血漿中のＰＥＧ化ＦＶＩｌＩの検出
ＰＥＧ化の程度の変化を検出する本発明のアッセイの能力を決定するために、様々なＰＥＧ化の程度を示す様々なＰＥＧ試薬と結合させた２種類のＦＶＩＩＩ試料を、ヒト血漿中に希釈し、そして分子の検出を測定した。

試料を５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲に希釈し、３％〜８％の勾配トリス−酢酸ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、続いて、ウェスタンブロット分析を行った。安定な２０−ｋＤａ ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ結合体のＰＥＧ化の程度（ＰＤ）は３．７であり（図２１Ａ）、同じタイプのＰＥＧを持つ放出することができるものについてのＰＥＧ化の程度は６であった（図２１Ｂ）。

図２１に示すように、ＰＥＧ化の程度が高いほど、同じ現像条件を使用すると、より強いシグナルが生じた。

これらの結果は、本明細書中に記載した薬物動態実験においてＰＥＧ化タンパク質を追跡するための新規の方法によって、それらのドメイン構造およびＰＥＧ化の程度の変化を検出できることを示している。

上記の説明のための実施例に示されたような本発明において多数の変更およびバリエーションが、当業者によって行われると予想される。結果として、添付の特許請求の範囲に示されるような限定だけが、本発明に適用されるべきである。

Claims (25)

1. ポリマー−タンパク質結合体中のタンパク質またはタンパク質複合体に結合させられた生理学的に許容されるポリマー分子の数を決定するための方法であって、該方法は：
   （ｉ）該タンパク質に結合した１つ以上のポリマーを有するポリマー：タンパク質結合体と
   （ｉｉ）該ポリマーに特異的に結合する抗体であって、該抗体は、該ポリマー：タンパク質結合体に結合している場合に検出可能である、抗体と、
   の間での結合を検出する工程を包含し、ここで、該ポリマー：タンパク質結合体中のポリマーの数は、既知の対照と比較したとき、該ポリマー：タンパク質結合体に結合した検出される抗体のレベルと相関関係がある、方法。
2. 前記抗体が検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記検出可能な標識が、酵素、放射性標識、フルオロフォア、電子密度試薬、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、およびこれらの標識のいずれかの付加によって検出可能になるタンパク質からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記ポリマー：タンパク質結合体が前記抗体との結合の前に担体マトリックスに結合させられる、請求項１に記載の方法。
5. 基体が、マイクロキャリア、粒子、メンブレン、細片、紙、薄膜、ビーズ、またはプレートからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
6. 検出される抗体のレベルが前記検出可能な標識の吸光度として測定される、請求項４に記載の方法。
7. 前記ポリマー：タンパク質結合体が、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して単離され、そして前記検出する工程の前にメンブレンに移される、請求項１に記載の方法。
8. 前記ポリマー：タンパク質結合体中のポリマーの数が、既知の対照と比較した、該タンパク質−ポリマー結合体の分子量に基づいて計算される、請求項７に記載の方法。
9. 前記ポリマー−タンパク質複合体の分子量が、該ポリマー分子を含む該タンパク質サブユニットと相関関係がある、請求項７に記載の方法。
10. 前記タンパク質またはタンパク質複合体が血液凝固因子または血液凝固因子複合体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記血液凝固因子または血液凝固因子複合体がヒトのものである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記血液凝固因子が、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、およびアンチトロンビンＩＩＩからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
13. 前記血液凝固因子複合体が第ＶＩＩＩ因子：ＶＷＦである、請求項１１に記載の方法。
14. 前記ポリマーが放出可能である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ポリマーが加水分解可能である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記ポリマーが以下からなる群より選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法：ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）。
17. 前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記ＰＥＧが３ｋＤａ〜１００ｋＤａである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ＰＥＧが約５ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲の分子量を持つ、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ＰＥＧが約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲の分子量を持つ、請求項１８に記載の方法。
21. 前記ＰＥＧが約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲の分子量を持つ、請求項１８に記載の方法。
22. 前記ＰＥＧが約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲の分子量を持つ、請求項１８に記載の方法。
23. タンパク質またはタンパク質複合体に結合させられたか、または溶液中に遊離している状態である、生理学的に許容されるポリマー分子の数を決定するための方法であって、該方法は：
    該ポリマーを該ポリマーに特異的に結合する抗体と接触させる工程であって、該抗体は、該ポリマーに結合している場合に検出可能である、工程
    を包含し、ここで、該抗体が結合したポリマーの数は、既知の対照と比較したとき、結合した検出される抗体のレベルと相関関係がある、方法。
24. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。