JP5568091B2 - 近赤外分光法を用いた生理学的に許容されるポリマー分子の検出 - Google Patents

Description

本出願は、２００８年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／１２１，７８８号の優先権の利益を主張し、この仮特許出願は、本明細書中に参照として援用される。

（発明の分野）
本発明は全般的に、タンパク質に結合した生理学的に許容されるポリマー分子の量を決定する方法に関する。

（発明の背景）
タンパク質のインビボ機能は、タンパク質を生理学的に許容されるポリマー分子、たとえばポリエチレングリコールに結合することにより向上させることができる。特に生理活性タンパク質を生理学的に許容されるポリマー分子に結合すると、そのインビボ半減期を実質的に延長することができる。たとえば特許文献１には、生理学的に許容されるポリマー分子と第ＶＩＩＩ因子とをコンジュゲートすると、第ＶＩＩＩ因子タンパク質はトロンビンによる活性化が可能となり、抗原性および免疫反応性が実質的に低下し、哺乳動物の血流中のインビボ消失時間が実質的に延長されることが記載されている。国際公開第９４／１５６２５号には、第ＶＩＩＩ因子を生理学的に許容されるポリマー分子にコンジュゲートすると、第ＶＩＩＩ因子のインビボ機能が（ｉ）インビボでの加水分解に対する耐性が高まるため、投与後の活性が長く持続することにより、（ｉｉ）非修飾タンパク質に比べインビボでの循環寿命が著しく延長されることにより、（ｉｉｉ）血流中への吸収時間が長くなることにより、向上することが記載されている。さらに国際公開第９４／２９３７０号には、第ＩＸ因子を生理学的に許容されるポリマー分子、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ：ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）」）に結合することにより第ＩＸ因子のインビボ機能が改善されることも記載されている。

しかしながら、現在のところ、タンパク質またはナノ粒子に結合した生理学的に許容されるポリマー分子を定量する信頼性の高い方法は見当たらない。比色法（Ｎａｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５０：３５−４３，１９９７）は感度が低く、ポリマー分子の含有量しか推計することができず、ＰＥＧの検出限界は約１〜５μｇである。高速液体クロマトグラフィーは１〜５μｇ／ｍｌ程度の検出限界でＰＥＧの検出が可能である（Ｋｉｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ５６５：２９７−３０７，１９９１）；Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８１：３５０−３５２，１９９２）；Ｒｕｄｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｐｐｌ ６５７：８３−９２，１９９４）。ＰＥＧの測定に相分配を使用することもできるが、ＰＥＧの分析感度は約１μｇである（Ｇｕｅｒｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３０：２５４−２５８，１９９５）。さらに、ＰＥＧ濃度の測定用のモノクローナル抗体も開示されている（特許文献２）が、これまで、タンパク質に結合した生理学的に許容されるポリマー分子の量の信頼できる測定法は見当たらない。

近赤外分光法（ＮＩＲＶＩＳ：Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）は、サンプルによる近赤外光での吸収の波長および強度を測定する。ＮＩＲＶＩＳは近赤外光で化学結合の振動を測定し、分子の構造に関する有益な情報を与える（Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ５０：１３７４−８，２００２）。近赤外光は、約６８０〜２５００ｎｍ（ＮＩＲの波数：約１５，０００〜４，０００ｃｍ^−１）の波長域の光であり、分子振動の上音および結合音を励起してより高いエネルギー準位に移すだけのエネルギーがある。近ＩＲ領域は、この波長領域の光分析に必要な技術に基づき、短い近ＩＲ波長（６８０〜１１００ｎｍ）と長い近ＩＲ波長（１１００〜２５００ｎｍ）とに細分される場合が多い（特許文献３）。長波長の近ＩＲ吸収は、Ｃ−−Ｈ基、Ｎ−−Ｈ基およびＯ−−Ｈ基の分子振動の上音および結合音バンドで起こる。ＮＩＲＶＩＳは有機官能基、特にＯ−Ｈ、Ｎ−ＨおよびＣ＝Ｏの定量測定に使用されるのが一般的である。検出限界は通常０．１％であり、用途は薬学的分析、農業分析、ポリマー分析および臨床分析などである。近赤外分光法は赤外分光法に比べて器械が簡便なため、近赤外分光法はオンラインモニタリングおよびプロセス制御により好適である。

以上のように、当技術分野においては、タンパク質に結合した生理学的に許容されるポリマー分子の量を定量的に測定する新しいシステムを提供することが求められている。

米国特許第４，９７０，３００号明細書 米国特許第６，６１７，１１８号明細書 米国特許第７，２８０，８６６号明細書

（発明の要旨）
本発明は、近赤外分光法が、タンパク質分子におけるポリマーコンジュゲートの程度の測定、およびコンジュゲーション反応によるタンパク質−ポリマーコンジュゲートの均一性の決定に有用であるという発見に関する。

一態様では、本発明は、サンプル中の、タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされた生理学的に許容されるポリマー部分の数を決定する方法であって、サンプルを近赤外スペクトルの光源と接触させて、近赤外波長域の相対吸光度レベルを測定すること、タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされたポリマー分子の数を波長スペクトルに基づき決定することを含み、サンプルの波長スペクトルを、タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされた既知量のポリマー分子を含む予め計算された標準と比較する、方法を提供する。ＮＩＲスペクトルは波数で表すことをも意図している。

一実施形態では、接触は、前記サンプルからの反射放射線を複数の時間依存吸収度スペクトル（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）として測定することをさらに含む。

関連する実施形態では、比較は、既知のサンプルの複数の近赤外吸収スペクトルからの較正データマトリックスを作成すること、およびポリマー−タンパク質コンジュゲートを含むサンプルの測定したスペクトロスコピーを比較することを含む。

さらなる実施形態では、近赤外波長は６８０〜２５００ｎｍの範囲である。別の実施形態では、波長は６８０〜１１００ｎｍである。なお別の実施形態では、波長は１１００〜２５００ｎｍである。なおさらなる実施形態では、近赤外スペクトルは波数で表され、波数は４００８ｃｍ^−１〜９９９６ｃｍ^−１（約２５００〜１０００ｎｍ）である。

別の実施形態では、生理学的に許容されるポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは３〜１００ｋＤａ、５〜６０ｋＤａ、５〜４０ｋＤａ、５〜２５ｋＤａ、５〜１５ｋＤａの範囲であるか、または５〜１０ｋＤａの範囲であることを意図している。

さらなる実施形態において、本発明では、タンパク質またはタンパク質複合体は治療用凝固因子（血液因子）タンパク質または治療用凝固因子タンパク質複合体である。一実施形態では、タンパク質またはタンパク質複合体は、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびフィブリノーゲンからなる群から選択される（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｏｒ）血液因子を含む。

関連する実施形態では、タンパク質はｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子である。追加の実施形態では、タンパク質複合体はｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子および第ＶＩＩＩ因子を含む。

別の態様では、本発明は、タンパク質またはタンパク質複合体上に生理学的に許容される一定数のポリマー分子を有する組成物を製造するプロセスであって、タンパク質を生理学的に許容される分子にコンジュゲートしてポリマー−タンパク質複合体のサンプルを製造すること；ポリマー−タンパク質複合体に上述の方法を実施すること；および近赤外吸収度スペクトルに基づきサンプル中で同じ数のポリマー分子を含む化合物を単離することを含む、プロセスを意図している。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
サンプル中の、タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされた生理学的に許容されるポリマー部分の数を決定する方法であって、前記サンプルを近赤外スペクトルの光源と接触させ、近赤外波長域の相対吸収度レベルを測定する工程、
前記タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされた前記ポリマー分子の前記数を波長または波数スペクトルに基づき決定する工程を含み、前記サンプルの前記スペクトルは、タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされた既知量のポリマー分子を有する予め計算された標準と比較される、方法。
（項目２）
前記接触させる工程は、前記サンプルからの反射放射線を複数の時間依存吸収度スペクトルとして測定する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記比較が既知のサンプルの複数の近赤外吸収スペクトルから較正データマトリックスを作成する工程、および前記ポリマー−タンパク質コンジュゲートを含む前記サンプルの前記測定したスペクトロスコピーを比較する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記近赤外波長は６８０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記波長は６８０ｎｍ〜１１００ｎｍである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記波長は１１００ｎｍ〜２５００ｎｍである、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記波長は１０００ｎｍ〜２５００ｎｍである、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記生理学的に許容されるポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＰＥＧの分子量は約３ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ＰＥＧの分子量は約５ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記ＰＥＧの分子量は約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲である、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記ＰＥＧの分子量は約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲である、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記ＰＥＧの分子量は約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である、項目８に記載の方法。
（項目１４）
前記タンパク質またはタンパク質複合体は治療用凝固タンパク質または治療用凝固タンパク質複合体である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記タンパク質またはタンパク質複合体は第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびフィブリノーゲンからなる群から選択される血液因子を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記タンパク質はｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記タンパク質複合体はｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子および第ＶＩＩＩ因子を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
タンパク質またはタンパク質複合体に生理学的に許容される一定数のポリマー分子を有する組成物を製造するプロセスであって：
前記タンパク質を生理学的に許容される分子にコンジュゲートしてポリマー−タンパク質複合体のサンプルを生産する工程；
前記ポリマー−タンパク質複合体に項目１に記載の方法を実施する工程；および
近赤外吸収度スペクトルに基づき前記サンプル中で同じ数の前記ポリマー分子を含む化合物を単離する工程
を含む、プロセス。

図１は、一定期間におけるＰＥＧ化反応の進行を決定するため多重散乱補正（ＭＳＣ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）およびＰＬＳ−アルゴリズムを用いた較正モデルを示す。 図２は、タンパク質上のポリマー分子の量を決定するためケモメトリクス手法（ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ）を用いた較正モデルを示す。

（詳細な説明）
本発明は、タンパク質に結合した生理学的に許容されるポリマー分子の量の高感度な定量を行う方法を対象とする。

「サンプル」という用語は、本明細書で使用する場合、医薬品の調製プロセスから生じる任意の液体または溶液など、少なくとも１種の生理学的に許容されるポリマー分子に結合した少なくとも１種のタンパク質を含む任意のサンプルをいう。

「タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、ペプチド結合により結合したアミノ酸残基からなる組換えタンパク質、タンパク質複合体およびポリペプチドなど任意のタンパク質、タンパク質複合体またはポリペプチドをいう。タンパク質はインビボからタンパク質を単離して得ても、合成法によって得ても、あるいは組換えＤＮＡ技術により得てもよい。合成ポリペプチドは、たとえば自動ポリペプチド合成機を使用して合成することができる。本発明によって使用される組換えタンパク質は、本明細書に以下に記載するような当技術分野において公知の任意の方法で作製すればよい。一実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質またはその生物活性のある誘導体などの生理活性タンパク質である。「生物活性のある誘導体」という用語は、親タンパク質と実質的に同じ機能的および／または生物学的特性を持つタンパク質の改変体をいう。「タンパク質」という用語は通常、大きなポリペプチドをいう。「ペプチド」という用語は通常、短いポリペプチドをいう。本明細書で使用する場合、ポリペプチド、タンパク質およびペプチドは互換的に使用される。「タンパク質複合体」とは、少なくとも１種の他のタンパク質と結合した少なくとも１種のタンパク質からなる分子をいう。タンパク質複合体の例として、補助因子またはシャペロンタンパク質に結合したタンパク質、リガンド−受容体複合体、ならびにインテグリンおよび複数のタンパク質サブユニットからなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ｏｆ）他の細胞表面受容体などのマルチサブユニットタンパク質があるが、これに限定されるものではない。

本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「フラグメント」とは、全長ポリペプチドまたはタンパク質発現産物より小さいポリペプチドの任意の部分をいう。フラグメントは通常、全長ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている、全長ポリペプチドの欠失アナログである。したがって、「フラグメント」は以下に記載する欠失アナログのサブセットである。

本明細書で使用する場合、「アナログ」または「誘導体」（互換的に使用することができる）とは、場合によって程度の差はあるものの、天然に存在する分子と構造がかなり類似しており、同じ生物活性を有するポリペプチドをいう。アナログはアナログが誘導される天然に存在するポリペプチドと比較して（ｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域における１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端における１つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加（通常「付加」アナログ）および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域における１つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加（通常「挿入」アナログ）、または（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列における１つまたは複数のアミノ酸の他のアミノ酸に代えての置換など、１つまたは複数の変異により、アミノ酸配列の組成が異なっている。置換は、置換されるアミノ酸と、その置換されるアミノ酸を置換するアミノ酸の物理化学的または機能的関係に基づいた、保存的置換でも、または非保存的置換であってもよい。

一態様では、アナログは、所与の化合物、たとえばペプチドとの配列類似性が約７０％であるが、１００％未満である。一態様では、こうしたアナログまたは誘導体は、限定としてではなく例として、天然に存在するアミノ酸残基のほか、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミンおよびノルバリンなど非天然のアミノ酸残基からなる。別の態様では、こうしたアナログまたは誘導体は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基からなるか、または２つ以上のアミノ酸残基間に非ペプチド結合を含む。「誘導された（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリペプチドまたはペプチド配列が野生型または天然に存在するポリペプチドまたはペプチド配列の改変体（アミノ酸置換または欠失を含む）であり、誘導体の配列の配列類似性が野生型または天然に存在する配列に対して約７０％であるが、１００％未満であるように、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失を有することをいう。一実施形態では、誘導体はポリペプチドのフラグメントでもよく、この場合フラグメントは、野生型ポリペプチドと少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長が実質的に相同（すなわち少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が相同）である。

配列の比較の場合、通常、ある配列を参照配列とし、これと被検配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被検配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。その後、指定したプログラムのパラメーターに基づき、配列比較アルゴリズムにより参照配列に対する被検配列（単数または複数）のパーセント配列同一性が計算される。

比較のための配列の最適なアライメントは、たとえばＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらアルゴリズムのコンピューターインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査により行うことができる。有用なアルゴリズムの一例としてＰＩＬＥＵＰがあり、これはＦｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の累進（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）法を簡略化したものを用い、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）により記載された方法と類似したものである。配列のマルチプルアライメントの作成に有用な別のアルゴリズムにＣｌｕｓｔａｌ Ｗがある（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０（１９９４））。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの例としてはＢＬＡＳＴアルゴリズムがある（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）；Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３））。ＢＬＡＳＴ解析を実行するソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから一般に入手可能である。

置換は、置換されるアミノ酸と、その置換されるアミノ酸を置換するアミノ酸の物理化学的または機能的関係に基づいた、保存的置換または非保存的置換である。この種の置換は、当技術分野において周知である。あるいは、本発明は、非保存的置換である置換をも包含する。例示的な保存的置換については、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１〜７７］に記載されており、以下に示す。

あるいは、例示的な保存的置換を下記に示す。

本明細書で使用する場合、「変異体」とは、通常分子の一部ではない他の化学部分を含むように修飾されたタンパク質またはそのアナログをいう。こうした部分は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを向上させ得る。あるいは、この部分は、分子の毒性を低下させ、分子の望ましくない任意の副作用などを除去または減らし得る。そうした作用を媒介できる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。そうした部分を分子に連結する手順は、当技術分野において周知である。たとえば、変異体は、タンパク質のインビボでの半減期を延長する化学修飾を受けた血液凝固因子であってもよい。ある態様では、変異体は、グリコシル化、ＰＥＧ化またはポリシアル酸化により修飾されたポリペプチドである。

本明細書で使用する場合、タンパク質またはポリペプチドに使用される「天然に存在する」とは、そのタンパク質が天然に見出され得ることをいう。たとえば、天然供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）内に存在し、実験室で意図的に人為的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。「天然の」および「野生型」という用語は、全体を通して互換的に使用される。

本明細書で使用する場合、タンパク質またはポリペプチドに用いられる「血漿由来」とは、被験体の血漿または血清に認められる天然に存在するポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。また、血漿由来タンパク質は、天然に存在するタンパク質および野生型タンパク質であってもよい。

「生理学的に許容される分子」または「生理学的に許容されるポリマー」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に水溶液に可溶であるか、または懸濁液の形で存在することができ、ポリマー−タンパク質コンジュゲートを薬学的有効量で投与した際、哺乳動物に好ましくない影響（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｍｐａｃｔ）を実質的に与えずに生体適合性として見なし得るポリマー分子をいう。一実施形態では、生理学的に許容される分子は約２〜約２０００の繰り返し単位を含む。例示的な生理学的に許容されるポリマーとして、ポリ（アルキレングリコール）、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ：ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、多糖類、たとえばカルボキシメチルセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸およびキチン、ポリ（メタ）アクリラート、ならびに前述のポリマーのいずれかの組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。

生理学的に許容されるポリマー分子は特定の構造に限定されるものではなく、線状（たとえばアルコキシＰＥＧまたは二官能性ＰＥＧ）でも、分枝状でも、またはマルチアーム型（たとえばフォーク状ＰＥＧまたはポリオールコアに結合したＰＥＧ）でも、樹状でも、または分解性結合を含んでいてもよい。さらに、ポリマー分子の内部構造は、幾つもの異なるパターンで構築されていてもよく、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマーおよびブロックトリポリマーからなる群から選択され得る。

「ＰＥＧ化された」という用語は、本明細書で使用する場合、タンパク質、タンパク質複合体またはポリペプチドが１つまたは複数のＰＥＧ部分に結合されていることをいう。「ＰＥＧ化」という用語は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数のＰＥＧをタンパク質に結合するプロセスをいう。一実施形態では、前記ＰＥＧの分子量は３〜１００ｋＤａ、５〜６０ｋＤａ、５〜４０ｋＤａ、５〜２５ｋＤａ、５〜１５ｋＤａまたは５〜１０ｋＤａの範囲である。

「薬学的組成物」とは、ヒトおよび哺乳動物などの被験体動物における薬学的使用に好適な組成物をいう。薬学的組成物は、薬理学的有効量のポリマー−ポリペプチドコンジュゲートを含み、さらに薬学的に許容されるキャリアをも含む。薬学的組成物は、活性成分（単数または複数）、およびキャリアを構成する不活性成分（単数または複数）のほか、２つ以上の任意の成分の組み合わせ、複合体形成または凝集により直接的または間接的に生じる、あるいは成分の１つまたは複数の解離により直接的または間接的に生じる、あるいは成分の１つまたは複数の他の種類の反応または相互作用により直接的または間接的に生じる任意の生成物を含む組成物を包含する。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物またはコンジュゲートと薬学的に許容されるキャリアとを混合して製造される任意の組成物を包含する。

「薬学的に許容されるキャリア」とは、リン酸塩緩衝生理食塩水溶液、デキストロースの５％水溶液、およびエマルジョン、たとえば油／水または水／油エマルジョン、ならびに様々な種類の湿潤剤および／またはアジュバントなど標準的な薬学的キャリア、バッファーおよび賦形剤のいずれかをいう。好適な薬学的キャリアおよび製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。好ましい薬学的キャリアは、活性薬の予定の投与モードによって異なる。典型的な投与モードとしては、経腸投与（たとえば経口投与）または非経口投与（たとえば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射または腹腔内注射；または局所投与、経皮投与または経粘膜投与）が挙げられる。「薬学的に許容される塩」は、たとえば金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）およびアンモニアまたは有機アミンの塩など、薬学的使用のための化合物またはコンジュゲートに製剤化できる塩である。

「薬学的に許容される」とは、ある材料が、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではないこと、すなわち、その材料を、いかなる望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用を何ら引き起こすことなく、個体に投与できることをいう。

近赤外（ＮＩＲ）
近赤外光は、７００〜２５００ｎｍ（ＮＩＲの波数：約１４，０００〜３，５００ｃｍ^−１）の波長域の光であり、分子振動の上音および結合音を励起してより高いエネルギー準位に移すだけのエネルギーを含む。近赤外（ＮＩＲ）吸収は、中赤外（ＭＩＲ：ｍｉｄ−ｉｎｆｒａｒｅｄ）バンド（ラマン）分光法で観測される基礎吸収、およびＮＩＲバンド（ＮＩＲ）分光法で観測される上音および結合音などの分子振動に由来する。長波長近ＩＲ吸収は、Ｃ−−Ｈ基、Ｎ−−Ｈ基およびＯ−−Ｈ基の分子振動の上音および結合音バンドに由来する。近赤外分光法（ＮＩＲＶＩＳ）は通常、有機官能基、特にＯ−Ｈ、Ｎ−ＨおよびＣ＝Ｏの定量測定に使用される。

近ＩＲ領域は、この波長領域の光分析に必要な技術に基づき、短い近ＩＲ波長（６８０〜１１００ｎｍ）と長い近ＩＲ波長（１１００〜２５００ｎｍ）とに細分される場合が多い（米国特許第７，２８０，８６６号）。ＮＩＲ分光法はさらに、液体の透過分光法、約７５０〜１１００ｎｍ、および粉体材料の反射分光法、約１１００〜２５００ｎｍに分類することができる。

サンプルの異なる構造を検出するには、ＮＩＲスペクトルを長さ１０ｎｍ以下の間隔で取得してスペクトルの異なる構造をすべて検出することにより、多変量データセットを得る。このため、ケモメトリクス（統計的）手法を用いて、有用なデータポイントに分解された生成物の成分の濃度を推計するには、多くのスペクトルの周波数の組み合わせを使用する。

ＮＩＲＶＩＳの計測手段の要素および設計は、ＵＶ吸光度計と類似している。光源は通常タングステンランプであり、検出器はＰｂＳ固体状態検出器が一般的である。サンプルホルダーはガラスでも、または石英でもよく、典型的な溶媒はＣＣｌ_４およびＣＳ_２である。光源光は、赤／近赤外域（ＲＮＩＲ：ｒｅｄ／ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｒａｎｇｅ）の波長の低コヒーレンス性スーパールミネセントダイオード（ＳＬＥＤ：ｓｕｐｅｒｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｄｉｏｄｅ）など、複数の単一波長光源から供給される。あるいは、光は、適切なノッチフィルターを用いた単一の広帯域光源から供給してもよい。光の波長はどちらもシングルビームであてると都合がよい。

本発明による方法の具体的な例では、近赤外吸収スペクトルを約６８０〜約２５００の波長を用いて、別の例では約６８０〜約１１００の波長で、さらなる例では約１０００〜約２５００ｎｍの波長を用いて、なおさらなる例では１１００〜約２５００ｎｍを用いて測定する。

関連する実施形態では、ＮＩＲ吸収を波数により測定する。ＮＩＲは、約１５０００ｃｍ^−１〜４０００ｃｍ^−１、約１５０００〜９０００ｃｍ^−１または約９０００〜約４０００ｃｍ^−１で測定する。一実施形態では、ＮＩＲを約１００００〜約４０００ｃｍ^−１で測定する。

近赤外分光測定の後、当技術分野において公知の技法を用いてタンパク質１分子あたりのポリマーの量を決定する。たとえば、ケモメトリクスを用いた分光法とは、分光学的測定とケモメトリクスによるデータ評価手順とを直接組み合わせたものを記載するために用いられる用語であり、典型的にはサンプルのスペクトルからその定性的および定量的特徴を推定する多変量統計解析法である（Ｎａｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＮＩＲ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，２００２）。解析におけるケモメトリクス法についてはＲｏｇｇｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ ４４：６８３−７００，２００７）に記載されている。一実施形態では、個々のまたは組み合わせたパラメーターの定量に線形重回帰分析（ＭＬＲ：ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）または部分最小二乗（ＰＬＳ：ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ）回帰分析を用いる。ケモメトリクス解析の他の方法として、主成分分析（ＰＣＡ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、線形判別分析（ＬＤＡ：ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、ソフトインディペンデントモデリングオブクラスアナロジー（ｓｏｆｔ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｌａｓｓ ａｎａｌｏｇｙ）（ＳＩＭＣＡ）および判別部分最少二乗（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ）（ＰＬＳ１およびＰＬＳ２）回帰分析があるが、これに限定されるものではない。

サンプル中のタンパク質に結合した生理学的に許容されるポリマー分子の量の決定は、前記サンプルの近赤外吸収スペクトルと、規定量の生理学的に許容されるポリマー分子に結合したタンパク質を含むサンプルの近赤外吸収スペクトルとを関連付けることにより行う。一実施形態では、この関連付けは、様々な規定量の生理学的に許容されるポリマー分子に結合したタンパク質を含むサンプルの近赤外吸収スペクトルを測定して得られた検量線を提供する工程を含む。

タンパク質およびタンパク質複合体
本組成物中での使用を意図しているタンパク質として、被験体への投与に有用な生理活性タンパク質がある。一実施形態では、生理活性タンパク質は治療用タンパク質である。一態様では、生理活性タンパク質は、タンパク質、またはタンパク質の治療活性または生物活性の一部、実質的に全部または全部をなお保持しているタンパク質の任意のフラグメントである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、発現または産生されていない場合、あるいは発現または産生が実質的に低下した場合に疾患を引き起こすことになるタンパク質である。好ましくは、タンパク質はヒト由来であるか、またはヒトから採取される。

本発明の種々の実施形態では、生理学的に許容されるポリマーにコンジュゲートされた生理活性タンパク質が、タンパク質またはタンパク質の生物活性を有するそのフラグメントである場合、生理活性タンパク質のアミノ酸配列は、対応するコンジュゲートされていないヒトまたは哺乳動物のタンパク質の部分のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、コンジュゲートの生理活性タンパク質は、ヒトまたは哺乳動物種に固有のタンパク質である。他の実施形態では、タンパク質またはそのフラグメントは、対応するヒトまたは哺乳動物のタンパク質のネイティブ配列と実質的に相同である（すなわち、活性薬の少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０または２００アミノ酸長または全長にわたるアミノ酸配列において少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である）。

組換えタンパク質を作製する方法は、当技術分野において周知である。組換えタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを発現する哺乳動物細胞などの細胞の作製方法は、米国特許第６，０４８，７２９号、同第５，９９４，１２９号および同第６，０６３，６３０号に記載されている。これらの出願の教示内容は、参照によってその全体を本明細書に援用する。

一実施形態では、ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはアナログの発現に使用する核酸コンストラクトは、トランスフェクト哺乳動物細胞の染色体外に（エピゾーマルに）発現する核酸コンストラクトであるか、あるいは、ランダムにまたは相同組換えにより予め選択した標的部位で、レシピエント細胞のゲノムに組み込む核酸コンストラクトである。染色体外に発現するコンストラクトは、ポリペプチドコード配列以外に、細胞中でタンパク質を発現するのに十分な配列、および場合により、コンストラクトの複製に十分な配列を含む。染色体外に発現するコンストラクトは通常、プロモーター、ポリペプチドコードＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を含む。タンパク質をコードするＤＮＡは、その発現がプロモーターの制御下にあるようにコンストラクトに配置する。場合により、コンストラクトは、スプライス部位、エンハンサー配列、適切なプロモーターの制御下で選択可能なマーカー遺伝子、および適切なプロモーターの制御下で増幅可能なマーカー遺伝子の１つまたは複数など追加の要素を含んでもよい。

ＤＮＡコンストラクトを細胞のゲノムに組み込むこれらの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、ポリペプチドコード核酸配列を含む。場合により、ＤＮＡコンストラクトは、プロモーターおよびエンハンサー配列、ポリアデニル化部位（単数または複数）、スプライス部位（単数または複数）、選択可能なマーカー（単数または複数）をコードする核酸配列、増幅可能なマーカーをコードする核酸配列、および／またはゲノムの選択部位（標的ＤＮＡまたはＤＮＡ配列）へのＤＮＡの組み込みを目的とし、レシピエント細胞のゲノムＤＮＡと相同なＤＮＡを含んでもよい。

組換えタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は細菌、酵母、昆虫、非哺乳動物の脊椎動物または哺乳動物の細胞であり、哺乳動物細胞として、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヒトの細胞があるが、これに限定されるものではない。宿主細胞は、不死化細胞（細胞株）または非不死化（初代または２代）細胞を含み、さらに以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（たとえば、哺乳類の上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（たとえばチャイニーズハムスターの卵巣、すなわちＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形成分（ｆｏｒｍｅｄ ｅｌｅｍｅｎｔ）（たとえばリンパ球、骨髄細胞）、筋細胞、肝実質細胞およびこれらの体細胞型の前駆体など種々様々な細胞型のいずれかを含む。

繁用される宿主細胞として、グラム陰性またはグラム陽性菌などの原核細胞、すなわちＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなどの任意の株；ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞などの真核細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞；ヒト腎臓２９３細胞；ＣＯＳ−７細胞；Ｄ．Ｍｅｌ−２、Ｓｆ４、Ｓｆ５、Ｓｆ９およびＳｆ２１およびＨｉｇｈ５などの昆虫細胞；植物細胞およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａなどの様々な酵母細胞が挙げられる。

ポリペプチドコードＤＮＡまたはＲＮＡを含む宿主細胞は、細胞の増殖およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適切な条件下で培養する。ポリペプチドを発現しているそうした細胞は、既知の方法を用いて特定し、その組換えタンパク質はポリペプチドの産生を増幅してあるいはせずに既知の方法を用いて単離し、精製することができる。細胞の特定は、たとえばタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示唆する表現型を示す遺伝子改変哺乳動物細胞を、ＰＣＲスクリーニング、サザンブロット解析によるスクリーニングまたはタンパク質発現のスクリーニングなどでスクリーニングすることにより行うことができる。タンパク質コードＤＮＡを組み込んだ細胞の選択については、ＤＮＡコンストラクトに選択可能なマーカーを含み、選択可能なマーカー遺伝子を含むトランスフェクト細胞または感染細胞を、選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞のみが生存するのに適切な条件下で培養することにより達成することができる。また、導入したＤＮＡコンストラクトの増幅は、増幅に適切な条件下で遺伝子改変細胞を培養する（たとえば、増幅可能なマーカー遺伝子の複数コピーを含む細胞のみが生存できる濃度の薬剤の存在下で、増幅可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子改変細胞を培養する）ことにより行うことができる。

生理活性タンパク質または治療用タンパク質である組換えタンパク質として、サイトカイン、増殖因子、治療用凝固タンパク質または血液凝固因子、酵素、ケモカイン、可溶性細胞表面受容体、細胞接着分子、抗体、ホルモン、細胞骨格タンパク質、マトリクスタンパク質、シャペロンタンパク質、構造タンパク質、代謝タンパク質、および当業者に公知の他の治療用タンパク質があるが、これに限定されるものではない。治療剤として使用される例示的な組換えタンパク質としては、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子およびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インスリン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、α−グルコセレブロシダーゼ、α−グルコシダーゼ、卵胞刺激ホルモン、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ５２抗体、ＴＮＦ受容体および当技術分野において公知の他の治療剤があるが、これに限定されるものではない。たとえば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，６２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪを参照されたい。

一実施形態では、タンパク質は、以下に限定されるものではないが、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびフィブリノーゲンなどの治療用凝固因子または血液（凝固）因子である。関連する実施形態では、タンパク質複合体は、１種または複数種の血液因子を含む。

一実施形態では、タンパク質は血漿由来および／または組換えｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）、またはその生物活性フラグメントもしくはアナログである。「血漿由来ＶＷＦ（ｐＶＷＦ）」という用語は、哺乳動物から得られる成熟ＶＷＦを含む。前記ｐＶＷＦの生物活性フラグメントまたはアナログの１つとして、プロ−ペプチドを含むプロ−ＶＷＦがある。本発明の一例では、タンパク質は、内皮細胞および巨核球で合成される前駆体ＶＷＦ分子（プレ−プロ−ＶＷＦ）を含む未成熟ＶＷＦ、ＶＷＦプロペプチド（プロ−ＶＷＦ）、および前駆体分子のシグナルペプチドおよびプロ−ペプチドがそれぞれ切断されると得られる成熟血漿ＶＷＦからなる群から選択される。血漿由来ＶＷＦの生物活性のある誘導体のさらなる例としてはプロドラッグが挙げられるが、プロドラッグは、生物活性形態に処理または変換されるもの、あるいは、切断型、欠失型、置換型、プロ−形態以外の付加型、成熟形態のフラグメント、キメラ形態、および天然形態と比較して翻訳後修飾を受けた形態などとして生物活性があるものである。「組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）」という用語は、組換えＤＮＡ技術により得られ、場合により、薬理学的に許容されるグリコシル化パターンを有するＶＷＦを含む。その具体的な例として、Ａ２ドメインがないためタンパク質分解抵抗性を示すＶＷＦ（Ｌａｎｋｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．；７７：１００８−１０１３，１９９７）、および糖タンパク質Ｉｂ−結合ドメインとコラーゲンおよびヘパリンの結合部位とを含む、Ｖａｌ４４９〜Ａｓｎ７３０のＶＷＦフラグメント（Ｐｉｅｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．；１６４：１３３９−１３４７，１９８９）が挙げられる。

関連する実施形態では、タンパク質は第ＶＩＩＩ因子である。以前の実験から、生理学的に許容されるポリマー分子を第ＶＩＩＩ因子にコンジュゲートすると、第ＶＩＩＩ因子タンパク質がトロンビンにより活性化され、哺乳動物の血流中の抗原性および免疫反応性が実質的に低下し、インビボでのクリアランス速度が実質的に増加されることが明らかになった（米国特許第４，９７０，３００号）。国際公開第９４／１５６２５号には、第ＶＩＩＩ因子を生理学的に許容されるポリマー分子にコンジュゲートすると、第ＶＩＩＩ因子のインビボ機能が（ｉ）インビボでの加水分解に対する耐性が高まるため、投与後の活性が長く持続することにより、（ｉｉ）非修飾タンパク質を超えてインビボでの循環寿命が著しく延長されることにより、（ｉｉｉ）血流中への吸収時間が長くなることにより、向上することが記載されている。さらに国際公開第９４／２９３７０Ａ１号には、第ＩＸ因子を、生理学的に許容されるポリマー分子、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）に結合することにより第ＩＸ因子のインビボ機能が改善されることも記載されている。しかしながら、これらの文書で第ＶＩＩＩ因子タンパク質に結合したポリマー分子の数について開示しているものはない。

ポリペプチドの変異体およびアナログ
本発明の方法は、サンプル中の組換えタンパク質、および組換えタンパク質のフラグメント、アナログまたは変異体の迅速な検出に有用であり、さらに、グリコシル化の違いが検出され得るフラグメントまたは対立遺伝子の変異体としてインビボで存在する場合がある天然に存在するタンパク質の検出にも有用である場合がある。

ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは変異体の調製方法は、当技術分野において周知である。ポリペプチドのフラグメントは、酵素的切断（たとえば、トリプシン、キモトリプシン）、さらに特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントを作製する組換え手段などの当技術分野において周知の方法を用いて調製される。フラグメントは、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、二量体化または多量体化ドメイン、または当技術分野において公知の他の任意の同定可能なドメインを含むように作製してもよい。

ポリペプチドアナログの作製方法もよく知られている。アナログは、アナログを誘導する元となった天然に存在するポリペプチドと実質的に相同であるか、または実質的に同一であってもよく、本発明が意図しているアナログは、天然に存在するポリペプチドの生物活性の少なくとも一部を保持するアナログである。

置換アナログは通常、タンパク質の１つまたは複数の部位で、野生型のあるアミノ酸が別のアミノ酸と交換されたものであり、他の機能または特性を失うことなく、タンパク質分解切断に対する安定性などポリペプチドの１つまたは複数の特性を調節するように設計してもよい。この種の置換は一般に保存的置換である。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸を化学的特性が類似した側鎖を持つアミノ酸で置換することをいう。保存的置換を行うための類似アミノ酸としては、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）；塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）；極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）；疎水性脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）；芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）；小さな側鎖（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）；または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、トレオニン）を有するアミノ酸が挙げられる。

天然に存在する分子の生物活性と同一または類似の生物活性を有する天然に存在する分子の生物活性フラグメント、変異体またはミュータントをコードするポリヌクレオチドのアナログおよびフラグメントは、当業者であれば容易に作製することができる。通常行われている方法として、ＰＣＲ法、タンパク質分子をコードするＤＮＡの酵素消化、および異種のポリヌクレオチド配列のライゲーションなどが挙げられる。たとえば、タンパク質活性に関連する個々の活性においてどのアミノ酸残基が重要であるかを詳細に特定するには、ＰＣＲおよび当技術分野において周知の他の技法を用いた点変異誘発を利用してもよい。そうすれば、当業者は、ＤＮＡ鎖に一塩基を変化させたものを作製し、変異コドンおよびミスセンス変異を得ることができる。

さらに、タンパク質またはポリペプチドを修飾して、ポリペプチドである第２の剤を含む融合タンパク質であるアナログを作製し得ることも意図している。一実施形態では、ポリペプチドである第２の剤は酵素、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体、細胞表面受容体の細胞外ドメイン、細胞接着分子、または上述のタンパク質もしくは当技術分野において公知の他の任意の種類のタンパク質のフラグメントまたは活性ドメインである。関連する実施形態では、第２の剤は、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子およびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子などの血液凝固因子である。意図している融合タンパク質については、当技術分野において周知の化学的技法または組換え技法により作製される。

意図しているタンパク質変異体として、ユビキチン化、グリコシル化、治療薬または診断剤のコンジュゲーション、標識（たとえば、放射性核種または様々な酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などのポリマーの共有結合、非加水分解性結合の導入、およびヒトタンパク質では通常起こらない、オルニチンなどアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技法により化学修飾されたポリペプチドが挙げられる。変異体は、本発明の非修飾分子の結合特性を保持する。

本発明の方法に有用な他のポリペプチド変異体としては、ポリシアリラート（ＰＳＡ：ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｅ）部分を含むポリペプチドが挙げられる。ポリシアル酸化ポリペプチドの調製方法は、米国特許出願公開第２００６０１６０９４８号およびＳａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １２：４２−５１，２００６に記載されている。

ポリマー
一実施形態では、本発明は、タンパク質またはポリペプチドの生成、存続能に有利な作用を提供する化学部分に結合された化学修飾タンパク質またはポリペプチドを意図している。たとえば、免疫原性、腎クリアランスを強く低下させ、および／またはプロテアーゼ抵抗性を改善することにより半減期を改善する水溶性ポリマーのポリペプチドへの非特異的または部位特異的コンジュゲーションは、当技術分野において公知である。

以下に限定されるものではないが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ：ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ））、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ：ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ポリビニルアルコール 、ヒドロキシエチルセルロースまたはデキストランなどの水溶性ポリマーは、タンパク質またはペプチドに一般にコンジュゲートされ、タンパク質またはペプチドの安定性または大きさなどを増大させる。

ＰＥＧ、ＰＥＯまたはＰＯＥとは、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーをいう。ＰＥＧおよびＰＥＯは、分子量の分布を持っている分子、すなわち、多分散分子である。サイズ分布は、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）により統計的に特徴付けることができ、その比を多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ）と呼ぶ。ＭｗおよびＭｎは、質量分析により測定することができる。ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの大部分、特に１ＫＤを超えるＰＥＧにコンジュゲートされたものは、親ＰＥＧ分子の多分散性のため様々な分子量を示す。たとえば、ｍＰＥＧ２Ｋ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−０２０ＨＳ，ＮＯＦ）の場合、実際の分子量は、１．５〜３．０ＫＤの範囲にわたって分布し、多分散性指数は１．０３６である。例外として、ＭＳ（ＰＥＧ）ｎ（Ｎ＝４、８、１２または２４、たとえばＰＥＯ４、ＰＥＯ１２）ベースの試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）にコンジュゲートされたタンパク質があり、これは、個々の鎖長に規定の分子量を持つ単分散混合物として特別に調製される。

本発明は、種類、コンジュゲーション、結合および長さが異なる水溶性ポリマーの使用を意図している。たとえば、ＰＥＧタンパク質コンジュゲートとして、直鎖または分枝コンジュゲート、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）またはアルデヒドを用いた化学反応によりコンジュゲートされたポリマー：タンパク質、ＰＥＧ鎖とコンジュゲーション部位との間に異なる化学結合を持つ変異体、および長さが異なる変異体が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＰＥＧの平均分子量は、約３キロダルトン（「ｋＤａ」）〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａまたは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である。

本発明は、ＮＨＳにコンジュゲートされ、長さが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、式中、ｎ＝１〜２０００の範囲である直鎖ＰＥＧタンパク質コンジュゲート、アルデヒドにコンジュゲートされ、長さが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、式中、ｎ＝１〜２０００の範囲である直鎖ＰＥＧタンパク質コンジュゲート、ＮＨＳにコンジュゲートされ、長さが質量３〜１００ｋＤａの範囲である２アーム型分枝ＰＥＧタンパク質コンジュゲート、およびＮＨＳにコンジュゲートされた３アーム型分枝ＰＥＧタンパク質コンジュゲートからなる群から選択されるＰＥＧタンパク質コンジュゲートを意図している。本発明はさらに、コンジュゲーション部位とＰＥＧ鎖との間に異なる化学結合（−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−および−（ＣＨ２）ｎ−、式中、ｎ＝１〜５）を含むＰＥＧタンパク質コンジュゲートも意図している。本発明はさらに、腎クリアランスを低下させるためアニオン性の電荷を持つＰＥＧタンパク質コンジュゲートをも意図しており、カルボキシル化化合物、硫酸化化合物およびリン酸化化合物（アニオン性）があるが、これに限定されるものではない（Ｃａｌｉｃｅｔｉ ＆ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２００３ ５５（１０）：１２６１−７７；Ｐｅｒｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏ Ｍｅｔａｂ ２００３ ８８（７）：３２２７−３５；Ｐｉｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ １９８６ ２９（３）：４４０−４４；Ｖｅｈａｓｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ １９８２ ２２ １２７−１３５）。さらなる実施形態では、ペプチドは場合により、ビスホスホナート、ＰＥＧまたはＰＥＯなどの水溶性ポリマー、炭水化物、脂肪酸、またはさらなるアミノ酸などの部分にコンジュゲートされる。

高分子の化学修飾は、非特異的に（修飾を受けた種の混合物が得られる）行っても、または部位特異的に（野生型高分子の反応性誘導修飾および／または部位特異的変異誘発および化学修飾を併用する部位選択的修飾に基づいて）行ってもよく、あるいは、発現タンパク質ライゲーション（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ）法（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（４）：２９７−３０３（２００２））を用いて行ってもよい。

ＰＥＧ化によりインビボでのペプチド治療薬の半減期に効果が得られたかどうかを確認するには、多種多様なＰＥＧタンパク質コンジュゲートを合成し、薬物動態についてインビトロおよびインビボで特徴付けを行う。インビトロおよびインビボでＰＥＧ化の潜在的効果を最適化するには、ＰＥＧのポリマーの長さ、コンホメーションおよび電荷を変化させる設計戦略を利用する。

本発明のＰＥＧ化タンパク質の調製方法は一般に、（ａ）ＰＥＧがタンパク質のＮ末端／Ｃ末端に結合する条件下で目的のタンパク質をポリエチレングリコールと反応させる工程、および（ｂ）反応生成物（単数または複数）を得る工程を含む。タンパク質をＰＥＧ化すると、タンパク質固有の活性が大きく変化する場合があるため、様々な種類のＰＥＧについて検討する。タンパク質のＰＥＧ化に使用してもよい化学反応として、メトキシ−ＰＥＧ（Ｏ−［（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）のＮＨＳ−エステルを用いたタンパク質の第一級アミンのアシル化が挙げられる。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳまたはメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡでアシル化した場合、元の第一級アミンの電荷を消失させるアミド結合（さらにＣ末端のＢｏｃ−ＰＥＧ）が生じる。リボソームタンパク質の合成と異なり、合成ペプチドの合成はＣ末端からＮ末端に進行する。したがって、Ｂｏｃ−ＰＥＧは、ペプチドのＣ末端にＰＥＧを結合する（すなわちｔｅｒｔ−（Ｂ）ｕｔｙｌ（ｏ）ｘｙ（ｃ）ａｒｂｏｎｙｌ（Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｏｃ）合成を使用する）方法である（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）。「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１４）：２１４９−２１５４）。（Ｆ）ｌｕｏｒｅｎｙｌ−（ｍ）ｅｔｈ（ｏ）ｘｙ−（ｃ）ａｒｂｏｎｙｌ（ＦＭＯＣ）化学反応（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（１９８９）．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ．）は、側鎖保護基を除去するために有害なフッ化水素酸を使用する必要がないため、好ましいものである。本方法は、ポリマー：タンパク質コンジュゲートの実質的に均一な混合物を提供する。「実質的に均一な」とは、本明細書で使用する場合、ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子のみが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質コンジュゲートは生物活性を有するものであり、本発明の「実質的に均一な」ＰＥＧ化タンパク質の調製物は、均一な調製物の利点を示すのに十分に均一な調製物であり、たとえば臨床応用の際にロット間の薬物動態が予測しやすい。

さらなる実施形態では、本明細書に記載のＰＥＧ化アプローチでの使用を意図しているポリマー分子は、水溶性ポリマーまたはその混合物の中から選択することができる。ポリマーは、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなど単一の反応基を有していてもよく、そのため重合の程度を制御することができる。水溶性ポリマーまたはその混合物は、必要に応じて、たとえば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ＰＥＧ、ＰＥＯ、デキストラン、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）、プロピレングリコールホモポリマー、脂肪酸、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（たとえばグリセロール）、ＨＰＭＡ、ＦＬＥＸＩＭＡＲ（商標）およびポリビニルアルコール、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカルボナートＰＥＧ、セルロース、他の炭水化物ベースのポリマー、またはこれらの混合物からなる群から選択される。選択されるポリマーは、ポリマーを結合するタンパク質が生理的環境など水性環境で沈殿しないように水溶性であるべきである。ポリマーは分枝でも、または非分枝でもよい。好ましくは、治療用の最終生成物の調製では、ポリマーは薬学的に許容されるものとする。ＰＥＧ部分を含むペプチドの作製方法は、当技術分野において周知である。たとえば米国特許第５，８２４，７８４号を参照されたい。

一実施形態では、反応性アルデヒドは、水に安定なＰＥＧ−プロピオンアルデヒド、またはモノ−Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照）。本明細書で使用する場合、ＰＥＧは、他のタンパク質の誘導体化に使用した、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールなどのＰＥＧの形態のいずれかを包含するものとする。ポリマーは、分枝でも、または非分枝でもよい。好ましくは、治療用の最終生成物の調製では、ポリマーは薬学的に許容されるものとする。

薬学的組成物
本発明は、有効量の本発明のタンパク質または誘導体生成物と共に、薬学的に許容される希釈剤、安定剤、防腐剤、可溶化剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアを含む薬学的組成物を意図している。こうした組成物は、様々なバッファー内容物（たとえば、トリス−ＨＣｌ、ホスファート）の希釈物、ｐＨおよびイオン強度；添加剤、たとえば洗浄剤および可溶化剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（たとえばポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（たとえばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（たとえばＴｈｉｍｅｒｏｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量剤（たとえば、ラクトース、マンニトール）を含む。たとえば参照によって本明細書に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）ｐａｇｅｓ １４３５：１７１２を参照されたい。活性成分の有効量は、治療的に、予防的にまたは診断的に有効な量であり、当業者であれば、体重、年齢および治療目標などの要因を考慮して容易に決定することができる。

本発明のポリマー−タンパク質組成物は、溶液のｐＨを所望の範囲内に維持するため緩衝剤をさらに含んでもよい。好ましい緩衝剤として、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムが挙げられる。これらの緩衝剤の混合物を使用してもよい。組成物に有用な緩衝剤の量は、使用する個々のバッファーおよび溶液のｐＨによって大きく異なる。たとえば、アセタートは、ｐＨ６よりもｐＨ５でより有効なバッファーであるため、ｐＨ５の溶液では、ｐＨ６の溶液より使用するアセタートを少なくしてもよい。本発明の組成物の好ましいｐＨ範囲はｐＨ３．０〜７．５である。

本発明の組成物は、溶液を等張にして注射により適した溶液にするための等張性調節剤をさらに含んでもよい。最も好ましい等張性調節剤は、０〜１５０ｍＭの濃度範囲の塩化ナトリウムである。

本明細書に記載の方法は、上述の分子と共に１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル、および場合により他の治療成分および／または予防成分を含む薬学的組成物を使用する。こうした賦形剤として、液体、たとえば水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノール、シクロデキストリン、修飾シクロデキストリン（すなわちスルホブチルエーテルシクロデキストリン）などが挙げられる。非液体製剤の好適な賦形剤も当業者に知られている。

本発明の組成物には、薬学的に許容される塩を使用してもよく、たとえば、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ホスファート、スルファートなどのような鉱酸塩；およびアセタート、プロピオナート、マロナート、ベンゾアートなどのような有機酸の塩が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤および塩の詳しい考察については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に示されている。

こうしたビヒクルにはさらに、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質、界面活性剤などのような補助物質が存在していてもよい。生物学的バッファーは、薬理学的に許容され、かつ所望のｐＨ、すなわち、生理学的に許容される範囲のｐＨを製剤に与えるのであれば実質的にどのような溶液でもよい。バッファー溶液の例として、食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、トリス緩衝食塩水、ハンクス緩衝食塩水などが挙げられる。

キット
さらに、キットも本発明の範囲内にあるものとして意図している。典型的なキットは、標準的な数のポリマーが結合したタンパク質−ポリマー複合体を含んでいてもよい。一実施形態では、キットは、タンパク質またはポリマーに特異的に結合する結合剤をさらに含み、この場合の結合剤は抗体、可溶性受容体、リガンド、補助因子、またはタンパク質もしくはポリマーに特異的に結合する別の作用物質である。キットは場合により、ポリマー−タンパク質複合体の検出のためのサンプル調製用の試薬およびバッファーを含んでいてもよい。

本発明の他の態様および詳細は、以下の実施例により明らかになるであろう。実施例は限定的なものではなく、例示的なものであることを意図している。

（実施例１）
ヒト血清アルブミンのＰＥＧ化
ＮＩＲを用いてタンパク質上の水溶性ポリマーの程度を測定するため、既知分子量のタンパク質を既知サイズのＰＥＧにコンジュゲートした。直鎖ＰＥＧスクシンイミジルスクシナート（ＰＥＧ−ＳＳ／鎖長：５ｋＤａ）（ＳｕｎＢｉｏ Ｉｎｃ．，Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いてヒト血清アルブミンを、リジン残基を介してＰＥＧ化した。２５ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．２中のＨＳＡ（濃度：１０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を調製し、ＰＥＧ−ＳＳを加えて最終濃度を１２０ｍｇ試薬／ｍｇタンパク質とした。この混合物を緩やかに振盪しながら１時間室温でインキュベートした。１０分の反応時間後、０．５ＭのＮａＯＨを滴下して加えｐＨをｐＨ６．２に調整した。続いてこのコンジュゲートを陰イオン交換クロマトグラフィーにより１ｃｍ／ｍｉｎの線流速で精製した。２００ｍｌの反応混合物を、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）を充填したＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ２６カラム（２６ｍｍ×１５５ｍｍ）に導入し、カラムは、１０カラム体積（ＣＶ：ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）の開始バッファー（２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．２）で平衡化した。ＰＥＧ−ＨＳＡコンジュゲートを２５ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．５でカラムから溶出し、２８０ｎｍのＯＤを測定してタンパク質濃度を決定した。

（実施例２）
様々なＰＥＧ化程度のＨＳＡ種の調製
様々なＰＥＧ化の程度のＨＳＡ種を調製するには、直鎖ＰＥＧスクシンイミジルスクシナート（鎖長：５ｋＤａ）および異なる量の試薬を用いて実施例１に記載されているようなリジン残基を介してヒト血清アルブミンをＰＥＧ化する。２５ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．２中のＨＳＡ（濃度：１０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を調製し、ＰＥＧ−ＳＳを最終濃度３０、６０、９０および１２０ｍｇ試薬／ｍｇタンパク質になるように加える。続いてこのコンジュゲートを、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。２５ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．５でＰＥＧ−ＨＳＡコンジュゲートをカラムから溶出し、２８０ｎｍのＯＤを測定してタンパク質濃度を決定する。最後にＮａｇ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５０：３５−４３，１９９７）に従い、ＰＥＧ化の程度を比色法により見積り、ｍｏｌ ＰＥＧ／ｍｏｌ タンパク質で表す。様々なＨＳＡの調製物について、２、３、４および５ｍｏｌｅ ＰＥＧ／ｍｏｌ タンパク質（試薬の量：３０、６０、９０、１２０ｍｇ／ｍｇタンパク質）のＰＥＧ化の程度を決定する。以下の実施例３および４に従いＮＩＲＶＩＳ法によりＰＥＧ化の程度を測定してその結果を確認する。

（実施例３）
ＰＥＧ化のプロセス制御
ＮＩＲ分光法の１つの強みは、ポリマーのコンジュゲーション反応に関する結合の管理が実行可能であり、かつコンジュゲートされた分子のポリマーの量の決定が実行可能である。以下の実施例により、ヒト血清アルブミンのサンプルのＰＥＧ化分析へのＮＩＲの応用が実証される。

（上記のような）水溶液中での約１時間のＰＥＧ化反応時間全体にわたり、ＮＩＲスペクトル（ｓｐｅｃｔｒａｓ）を透過反射（ｔｒａｎｓｆｌｅｃｔｉｏｎ）モードで連続的に取得した。標準的なＮＩＲスペクトロメーターを使用してスペクトル域は４００８ｃｍ^−１〜９９９６ｃｍ^−１（２５００ｎｍ〜１０００ｎｍ）とした。透過反射法は、サンプルを通る光の透過量を測定する。この場合、光はサンプルを通ってからサンプルの後方のリフレクターに接触するため、入射光はサンプルを２回透過する。

これらのスペクトルのセットから、ＰＥＧ添加前（ｖａｌｕｅ＝０）および反応終了時（ｖａｌｕｅ＝１）の十分な数のスペクトル（ｓｐｅｃｔｒａｓ）を選択して、データの前処理としての多重散乱補正（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）（ＭＳＣ）と、当技術分野において一般に公知の部分最小二乗（ＰＬＳ）アルゴリズムとを用いてスペクトロメーターのケモメトリクスソフトウェアにより検量線をコンピューターで作成した。

この較正モデルを使用して、反応中に取得される残りのスペクトルを予測した。図１に示すように、ＰＥＧ試薬の添加後に明らかな対数トレンドが得られる。

こうした実験から、ＮＩＲ分光法を用いて、ＰＥＧ化反応の間のＰＥＧ化の進行を予測する較正モデルの作成が可能であることが実証される。

（実施例４）
ケモメトリクスを用いたＰＥＧ化の測定
タンパク質結合ＰＥＧを測定するＮＩＲ法の能力を実証するため、実施例２の条件を使用して得たＰＥＧ化ＨＳＡ溶液を用いて希釈系列を調製した。Ｎａｇ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５０：３５−４３，１９９７）の方法に従いＰＥＧ化の程度を決定し、質量分析法により確認した。これらの希釈物はＮＩＲにより分析し、標準的なＮＩＲ−スペクトロメーターによりいくつかの代表的な近赤外スペクトル（ｓｐｅｃｔｒａｓ）を収集した。スペクトル（ｓｐｅｃｔｒａｓ）は、スペクトル域４００８ｃｍ^−１〜９９９６ｃｍ^−１（２５００ｎｍ〜１０００ｎｍ）において透過反射モードで測定した。

これらの収集データから、データの前処理としての１次導関数ＢＣＡＰとＰＬＳ−アルゴリズムとを用いてスペクトロメーターのケモメトリクスソフトウェアにより較正モデルをコンピューターで作成した。その計算結果を図２に示す。

その結果に示されるように、ＰＥＧ結合の「測定応答」とＰＥＧ結合の「予測応答」との間に強い相関関係が存在する。ピアソン相関係数は０．９９６、Ｐ値は０．０００である。低濃度範囲（溶液１および２、図２を参照）の場合、ＰＥＧ分子の真の値に対するＰＥＧ分子の予測値の平均偏差は１７％および６％であった。高濃度範囲（溶液３および４、図２を参照）の場合、真の値に対する平均偏差がより小さく、溶液３で０．８％、溶液４で１．４％であった。

これらの（Ｔｈｅｓｅｓ）結果から、ＮＩＲ法により得られる測定応答はサンプル中のタンパク質結合ＰＥＧのレベルとよく相関することが実証される。これは、この方法によりタンパク質分子のＰＥＧ化の程度を予測することができ、この方法がタンパク質分子のＰＥＧ化および他のポリマーコンジュゲーションの数および程度の決定に有用であることを示唆する。

当業者であれば、上記の例示的実施例に記載したような本発明において多くの修正および変形に想到すると予想される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に記載されるような限定によってのみ限定されるものとする。

Claims (18)

1. サンプル中の、タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされた水溶性ポリマー部分の数を決定する方法であって、
   前記サンプルを近赤外スペクトルの光源と接触させ、近赤外波長域の相対吸収度レベルを測定する工程、および
   前記タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされた前記ポリマー分子の前記数を波長または波数スペクトルに基づき決定する工程を含み、
   前記サンプルの前記スペクトルは、タンパク質またはタンパク質複合体にコンジュゲートされた既知量のポリマー分子を有する予め計算された標準と比較される、方法。
2. 前記接触させる工程は、前記サンプルからの反射放射線を複数の時間依存吸収度スペクトルとして測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記比較が既知のサンプルの複数の近赤外吸収スペクトルから較正データマトリックスを作成する工程、および前記ポリマー−タンパク質コンジュゲートを含む前記サンプルの前記測定したスペクトロスコピーを比較する工程を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記近赤外波長は６８０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲である、請求項１に記載の方法。
5. 前記波長は６８０ｎｍ〜１１００ｎｍである、請求項４に記載の方法。
6. 前記波長は１１００ｎｍ〜２５００ｎｍである、請求項４に記載の方法。
7. 前記波長は１０００ｎｍ〜２５００ｎｍである、請求項４に記載の方法。
8. 前記水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１に記載の方法。
9. 前記ＰＥＧの分子量は約３ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＰＥＧの分子量は約５ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲である、請求項８に記載の方法。
11. 前記ＰＥＧの分子量は約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲である、請求項８に記載の方法。
12. 前記ＰＥＧの分子量は約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲である、請求項８に記載の方法。
13. 前記ＰＥＧの分子量は約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である、請求項８に記載の方法。
14. 前記タンパク質またはタンパク質複合体は治療用凝固タンパク質または治療用凝固タンパク質複合体である、請求項１に記載の方法。
15. 前記タンパク質またはタンパク質複合体は第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびフィブリノーゲンからなる群から選択される血液因子を含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記タンパク質はｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記タンパク質複合体はｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子および第ＶＩＩＩ因子を含む、請求項１５に記載の方法。
18. タンパク質またはタンパク質複合体に一定数の水溶性ポリマー分子を有する組成物を製造するプロセスであって：
    前記タンパク質を水溶性ポリマー分子にコンジュゲートしてポリマー−タンパク質複合体のサンプルを生産する工程；
    前記ポリマー−タンパク質複合体に請求項１に記載の方法を実施する工程；および
    近赤外吸収度スペクトルに基づき前記サンプル中で同じ数の前記ポリマー分子を含む化合物を単離する工程
    を含む、プロセス。