ES2430335T3 - Detección de moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables utilizando espectroscopia infrarroja cercana - Google Patents

Detección de moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables utilizando espectroscopia infrarroja cercana Download PDF

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Abstract

Método para determinar el número de fracciones poliméricas solubles en agua conjugadas a una proteína o complejo de proteína en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con una fuente luminosa en el espectro infrarrojo cercano y medir los niveles de absorbancia relativa en un intervalo de longitudes de onda del infrarrojo cercano, determinar el número de moléculas poliméricas conjugadas a la proteína o el complejo de proteína en base a los espectros de longitudes de onda o números de onda, comparándose los espectros de la muestra con un patrón previamente calculado que tiene una cantidad conocida de moléculas poliméricas conjugadas a una proteína o complejo de proteína, estando la longitud de onda del infrarrojo cercano en el intervalo de 680 nm a 2.500 nm.

Description

Deteccion de moleculas polimericas fisiologicamente aceptables utilizando espectroscopia infrarroja cercana.
CAMPO DE LA INVENCION
En general, la presente invencion se refiere a un metodo para determinar la cantidad unida a una proteina de una molecula polimerica fisiologicamente aceptable.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La funcion in vivo de una proteina se puede mejorar uniendo esta a una molecula polimerica fisiologicamente aceptable, por ejemplo polietilenglicol. En particular, la union de una proteina fisiologicamente activa a una molecula polimerica fisiologicamente aceptable puede prolongar considerablemente su vida media in vivo. Por ejemplo, la patente US
4.970.300 describe que la conjugacion de una molecula polimerica fisiologicamente aceptable con Factor VIII resulta en una proteina de Factor VIII que puede ser activada por trombina y que presenta una reduccion considerable de su antigenicidad e inmunorreactividad y un aumento considerable del tiempo de desaparicion en la corriente sanguinea de un mamifero. La solicitud de patente internacional WO 94/15625 describe que la conjugacion del Factor VIII con una molecula polimerica fisiologicamente aceptable mejora la funcion in vivo del Factor VIII (i) aumentando su resistencia a la hidrolisis in vivo y prolongando asi su actividad despues de la administracion, (ii) prolongando significativamente su vida en circulacion in vivo en comparacion con la proteina no modificada y (iii) aumentando su tiempo de absorcion en la corriente sanguinea. Ademas, en la solicitud de patente internacional WO 94/29370 se describe la mejora de la funcion in vivo del Factor IX mediante la union de este a moleculas polimericas fisiologicamente aceptables, en particular a poli(etilenglicol) ("PEG").
Sin embargo, actualmente no se dispone de un metodo fiable para la determinacion cuantitativa de moleculas polimericas fisiologicamente aceptables unidas a proteinas o nanoparticulas. Los metodos colorimetricos (Nag y col., Anal Biochem 250:35-43, 1997) no tienen suficiente sensibilidad y solo permiten estimar el contenido de moleculas polimericas, teniendo un limite de deteccion de aproximadamente 1-5 Ig PEG. La cromatografia liquida de alta resolucion puede detectar PEG con un limite de deteccion de aproximadamente 1-5 Ig/ml (Kinahan y col., J Chromatogr 565:297-307, 1991; Ryan y col., J Pharm Sci 81:350-352, 1992; Ruddy y col. J Chromatogr B Biomed Appl 657:83-92, 1994). Para medir el PEG se puede emplear la division de fases, pero la sensibilidad del ensayo es de aproximadamente 1 Ig PEG (Guermant y col., Anal Biochem 230:254-258, 1995). Tambien se han dado a conocer anticuerpos monoclonales para determinar las concentraciones de PEG (Patente US 6.617.118), pero hasta la fecha no existe ningun sistema para determinar de forma fiable la cantidad de una molecula polimerica fisiologicamente aceptable unida a una proteina. Meng y col., 2008 Bioconjugate Chem 19: 1352-1360, describe una seroalbumina humana PEGilada y un metodo para detectar la extincion de fluorescencia de triptofano intrinseca mediante PEG en los conjugados despues de una excitacion a 295 nm.
La espectroscopia infrarroja cercana (NIRVIS) es la medida de la longitud de onda y de la intensidad de la absorcion de luz infrarroja cercana por una muestra. La NIRVIS mide la vibracion de los enlaces quimicos bajo luz infrarroja cercana y proporciona una valiosa informacion sobre la estructura molecular (Landau y col., J Agric Food Chem 50:1374-8, 2002). La luz infrarroja cercana abarca un rango de longitudes de onda de aproximadamente 680-2.500 nm (numeros de onda NIR: aproximadamente 15.000-4.000 cm-1) y tiene suficiente energia para excitar armonicos superiores y combinaciones de vibraciones moleculares a mayores niveles de energia. Con frecuencia, la region IR cercana se subdivide en longitudes de onda IR cercano cortas (680-1.100 nm) y largas (1.100-2.500 nm), en funcion de la tecnologia requerida para analizar la luz en tales rangos de longitudes de onda (Patente US 7.280.866). Las absorciones en IR cercano de longitud de onda larga se producen por armonicos superiores y bandas de combinacion de vibraciones moleculares de los grupos C-H, N-H y O-H. Normalmente, se emplea la NIRVIS para medir cuantitativamente grupos funcionales organicos, en especial O-H, N-H y C=O. Los limites de deteccion habituales son del 0,1% y sus aplicaciones incluyen analisis farmaceuticos, agricolas, polimericos y clinicos. La instrumentacion conveniente de la espectroscopia infrarroja cercana en comparacion con la espectroscopia infrarroja la hace mucho mas adecuada para la supervision en linea y el control de proceso. Duan y col. (Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 2384-2386) describen el uso de NIRVIS para determinar el grado de marcado de un anticuerpo.
Por consiguiente, en la tecnica se requiere un nuevo sistema para determinar cuantitativamente la cantidad unida a una proteina de una molecula polimerica farmaceuticamente aceptable.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que la espectroscopia infrarroja cercana es util para medir el grado de conjugado polimerico en una molecula de proteina y para determinar la uniformidad del conjugado proteinapolimero resultante de una reaccion de conjugacion.
En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para determinar el numero de fracciones polimericas solubles en agua conjugadas a una proteina o complejo de proteina en una muestra, que consiste en poner en contacto la muestra con una fuente de luz en el espectro infrarrojo cercano y medir los niveles de absorbancia relativa en un intervalo de longitudes de onda del infrarrojo cercano, determinando el numero de moleculas polimericas conjugadas a la proteina o el complejo de proteina en base a los espectros de longitud de onda, comparandose tales espectros de la muestra con un patron previamente calculado que tiene una cantidad conocida de moleculas polimericas conjugadas a una proteina
o complejo de proteina. Esta previsto que los espectros NIR se expresen tambien en numero de onda.
En una realizacion, dicho contacto tambien comprende medir la radiacion reflejada por dicha muestra como una pluralidad de espectros de absorbancia dependientes del tiempo.
En una realizacion relacionada, la comparacion incluye construir una matriz de datos de calibracion a partir de multiples espectros de absorcion en el infrarrojo cercano de muestras conocidas y comparar la espectroscopia medida de la muestra que comprende el conjugado polimero-proteina.
La longitud de onda del infrarrojo cercano esta en el rango de 680-2.500 nm. En otra realizacion, la longitud de onda esta en el rango de 680 a 1.100 nm. En otra realizacion, la longitud de onda esta en el rango de 1.100 a 2.500 nm. En una realizacion mas, los espectros de infrarrojo cercano se expresan en numeros de onda y el numero de onda esta en el rango de 4.008 cm-1 a 9.996 cm-1 (aproximadamente 2.500 a 1.000 nm).
En otra realizacion, el polimero fisiologicamente aceptable es polietilenglicol (PEG). Esta previsto que un PEG en un intervalo de 3 a 100 kDa, 5 a 60 kDa, 5 a 40 kDa, 5 a 25 kDa, 5 a 15 kDa, o en un intervalo de 5 a 10 kDa.
En otra realizacion, la invencion preve que la proteina o el complejo de proteina sea una proteina de factor de coagulacion terapeutico (factor sanguineo) o un complejo de proteina de factor de coagulacion terapeutico. En una realizacion, la proteina o el complejo de proteina comprende un factor sanguineo seleccionado entre el grupo consistente en Factor II, Factor III, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor von Willebrand y fibrinogeno.
En una realizacion relacionada, la proteina es Factor von Willebrand. En otra realizacion, el complejo de proteina comprende Factor von Willebrand y Factor VIII.
En otro aspecto, la invencion preve un proceso para preparar una composicion que tiene una cantidad uniforme de moleculas polimericas solubles en agua en una proteina o un complejo de proteina, proceso que comprende: conjugar la proteina con una molecula soluble en agua para producir una muestra de un complejo de polimero-proteina; aplicar el metodo arriba descrito en el complejo de polimero-proteina; y aislar aquellos compuestos dentro de la muestra que tienen el mismo numero de moleculas polimericas en base a los espectros de absorbancia en el infrarrojo cercano.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1: muestra un modelo de calibracion para determinar el progreso de la reaccion de PEGilacion con el tiempo utilizando una correccion de dispersion multiplicativa (MSC) y un algoritmo PLS.
Figura 2: muestra un modelo de calibracion para determinar la cantidad de una molecula polimerica en una proteina utilizando un metodo quimiometrico.
DESCRIPCION DETALLADA
La presente invencion se refiere a metodos para la cuantificacion sensible de la cantidad unida a una proteina de una molecula polimerica fisiologicamente aceptable.
Tal como se utiliza aqui, el termino "muestra" se refiere a cualquier muestra que contenga al menos una proteina unida al menos a una molecula polimerica fisiologicamente aceptable, tal como cualquier fluido o solucion derivada de un proceso para preparar productos farmaceuticos.
Tal como se utiliza aqui, el termino "proteina" se refiere a cualquier proteina, complejo de proteina o polipeptido, incluyendo proteinas, complejos de proteinas y polipeptidos recombinantes compuestos por residuos aminoacidos unidos por enlaces peptidicos. Las proteinas se pueden obtener mediante aislamiento de una proteina in vivo, mediante metodos sinteticos o por tecnologia de ADN recombinante. Los polipeptidos sinteticos se pueden sintetizar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de polipeptidos automatico. Se puede producir una proteina recombinante a utilizar de acuerdo con la presente invencion por cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como se describe mas abajo. En una realizacion, la proteina es una proteina fisiologicamente activa, incluyendo una proteina terapeutica o un derivado biologicamente activo de la misma. La expresion "derivado biologicamente activo" se refiere a una proteina modificada que tiene esencialmente las mismas propiedades funcionales y/o biologicas que la proteina madre. El termino "proteina" se refiere normalmente a polipeptidos grandes. El termino "peptido" se refiere normalmente a polipeptidos cortos. Tal como se utilizan aqui, los terminos polipeptido, proteina y peptido se emplean indistintamente. Un "complejo de proteina" se refiere a una molecula que esta formada por al menos una proteina unida al menos a otra proteina. Los ejemplos de complejos de proteina incluyen, de forma no exclusiva, una proteina unida a un cofactor o proteina chaperona, complejos ligando-receptor y proteinas multisubunidad tales como integrinas y otros receptores de superficie celular formados por multiples subunidades proteicas.
Tal como se utiliza aqui, un "fragmento" de un polipeptido se refiere a cualquier porcion del polipeptido mas pequefa que el polipeptido de longitud completa o que el producto de expresion proteinica. Los fragmentos consisten normalmente en analogos de delecion del polipeptido de longitud completa donde uno o mas residuos aminoacidos se han eliminado del extremo amino-terminal y/o del carboxi-terminal del polipeptido de longitud completa. Por consiguiente, los "fragmentos" consisten en un subgrupo de los analogos de delecion descritos mas abajo.
Tal como se utiliza aqui, un "analogo" o "derivado" (que pueden ser utilizados indistintamente) se refiere a un polipeptido que es esencialmente similar en la estructura y que tiene la misma actividad biologica, aunque en ciertos casos en un grado diferente, que una molecula natural. Los analogos se diferencian en la composicion de sus secuencias de aminoacidos en comparacion con el polipeptido natural del que se deriva, debido a una o mas mutaciones que incluyen
(i)
delecion de uno o mas residuos aminoacidos en uno o mas extremos del polipeptido y/o de una o mas regiones internas de la secuencia del polipeptido natural, (ii) insercion o adicion de uno o mas aminoacidos en uno o mas extremos (generalmente un analogo de "adicion") del polipeptido y/o una o mas regiones internas (generalmente un analogo de "insercion") de la secuencia del polipeptido natural, o (iii) sustitucion de uno o mas aminoacidos por otros aminoacidos en la secuencia del polipeptido natural. Las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras, en funcion de la relacion fisicoquimica o funcional del aminoacido sustituido y del aminoacido que lo sustituye.
En un aspecto, un analogo presenta aproximadamente un 70% de analogia de secuencia pero menos de un 100% de analogia de secuencia con un compuesto dado, por ejemplo un peptido. Estos analogos o derivados estan formados, en un aspecto, por residuos de aminoacidos no naturales, incluyendo, por ejemplo y de forma no exclusiva, homoarginina, ornitina, penicilamina y norvalina, asi como residuos de aminoacidos naturales. En otro aspecto, estos analogos o derivados estan formados por uno o mas residuos de D-aminoacidos o contienen enlaces no peptidicos entre dos o mas residuos de aminoacidos. La expresion "derivado de", tal como se utiliza aqui, se refiere a una secuencia de polipeptido
o peptido que consiste en una modificacion (incluyendo sustitucion o delecion de aminoacidos) de una secuencia del polipeptido o peptido salvaje o natural y presenta una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos, de modo que la secuencia derivada tiene aproximadamente un 70% pero menos del 100% de analogia de secuencia con la secuencia salvaje o natural. En una realizacion, el derivado puede ser un fragmento de un polipeptido, siendo el fragmento esencialmente homologo (es decir, con una homologia de al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95%) en al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoacidos del polipeptido natural.
Para la comparacion de secuencias, normalmente una secuencia actua como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de ensayo y las de referencia se introducen en un ordenador, despues se designan coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se designan los parametros algoritmicos del programa de secuencias. Despues, el algoritmo de comparacion de secuencias calcula el porcentaje de identidad de la(s) secuencia(s) de ensayo con respecto a la secuencia de referencia segun los parametros de programa designados.
La alineacion optima de secuencias para la comparacion se puede llevar a cabo, por ejemplo, con el algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineacion por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el metodo de busqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), con aplicaciones informaticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o por inspeccion visual. Un ejemplo de algoritmo util es PILEUP, que utiliza una simplificacion del metodo de alineacion progresiva de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987) y es similar al metodo descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). Otro algoritmo util para generar multiples alineaciones de secuencias es el Clustal W (Thompson y col., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994)). Un ejemplo de algoritmo adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y analogia de secuencias es el algoritmo BLAST (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989); Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). El software para realizar el analisis BLAST esta disponible al publico en el National Center for Biotechnology Information.
Las sustituciones son conservativas o no conservativas en funcion de la relacion fisicoquimica o funcional del aminoacido sustituido y del aminoacido que lo sustituye. Las sustituciones de este tipo son bien conocidas en la tecnica. Alternativamente, la invencion incluye sustituciones que tambien son no conservativas. Ejemplos de sustituciones conservativas se describen en Lehninger [Biochemistry, 2a Edicion; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp. 71-77]
y se exponen mas abajo.
Sustituciones conservativas
Caracteristicas de la cadena lateral
Aminoacido
No polar (hidrofobo):
A. Alifatico
A L I V P
Caracteristicas de la cadena lateral
Aminoacido
B. Aromatico
F W
C. Con contenido de azufre
M
D. Limite
G
No cargado-polar:
A. Hidroxilo
STY
B. Amidas
N O
C. Sulfhidrilo
C
D. Limite
G
Cargado positivamente (basico)
K R H
Cargado negativamente (acido)
D E
A continuacion se indican ejemplos alternativos de sustituciones conservativas.
Sustituciones conservativas ii
Residuo original Ejemplo de sustituci6n
Ala (A) Val, Leu, Ile Arg (R) Lys, Gln, Asn Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gln (O) Asn Glu (E) Asp His (H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe Lys (K) Arg, Gln, Asn Met (M) Leu, Phe, Ile Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala Pro (P) Gly Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala
Tal como se utiliza aqui, una "variante" se refiere a una proteina o a un analogo de la misma que esta modificado de modo que comprende fracciones quimicas adicionales que normalmente no forman parte de la molecula. Estas fracciones pueden mejorar la solubilidad, absorcion, vida media biologica, etc. de la molecula. Alternativamente, las fracciones pueden reducir la toxicidad de la molecula y eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseado de la misma, etc. En Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) se dan a conocer fracciones que pueden provocar dichos efectos. Los procedimientos para acoplar estas fracciones a una molecula son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la variante puede consistir en un factor de coagulacion sanguinea que incluye una modificacion quimica que le confiere mayor vida media in vivo a la proteina. En ciertos aspectos, las variantes son polipeptidos modificados por glicosilacion, PEGilacion o polisialilacion.
Tal como se utiliza aqui, el termino "natural" aplicado a una proteina o polipeptido se refiere al hecho de que es posible encontrar la proteina en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptido o polinucleotido que esta presente en un organismo (incluyendo virus), que puede ser aislada de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio, es natural. Los terminos "natural" y "salvaje" se utilizan indistintamente en todo el documento.
Tal como se utiliza aqui, la expresion "derivado de plasma" aplicado a una proteina o polipeptido se refiere a un polipeptido natural o a un fragmento del mismo que se encuentra en el plasma sanguineo o suero de un sujeto. Una proteina derivada de plasma tambien puede ser una proteina natural y una proteina salvaje.
Las expresiones "molecula fisiologicamente aceptable" y "polimero fisiologicamente aceptable", tal como se utilizan aqui, se refieren a moleculas polimericas que son esencialmente solubles en solucion acuosa o que pueden estar presentes en forma de suspension, y que esencialmente no tienen ningun impacto negativo en los mamiferos en caso de administracion de un conjugado polimero-proteina en una cantidad farmaceuticamente eficaz y pueden ser consideradas como biocompatibles En una realizacion, las moleculas fisiologicamente aceptables comprenden entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2.000 unidades de repeticion. Ejemplos de polimeros fisiologicamente aceptables incluyen, de forma no exclusiva, poli(alquilenglicoles) como polietilenglicol (PEG), poli(propilenglicol) (PPG), copolimeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poliol poli(oxetilado), alcohol poili(olefinico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacaridos), poli(a-hidroxiacido), alcohol poli(vinilico), polifosfasfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), polimeros de oxido de poli(alquileno), poli(maleico), poli(DLalanina), polisacaridos, como carboximetilcelulosa, dextrano, acido hialuronico y quitina, poli(met)acrilatos y cualquier combinacion de estos polimeros.
La molecula polimerica fisiologicamente aceptable no esta limitada a ninguna estructura particular, pudiendo ser lineal (por ejemplo alcoxi-PEG o PEG bifuncional), ramificada o con multiples brazos (por ejemplo PEG en horquilla o PEG unido a un nucleo de poliol), dendritica o con enlaces degradables. Ademas, la estructura interna de la molecula polimerica se puede organizar en cualquier cantidad de patrones diferentes, pudiendo seleccionarse de entre el grupo consistente en homopolimeros, copolimeros alternantes, copolimeros aleatorios, copolimeros en bloque, tripolimeros alternantes, tripolimeros aleatorios y tripolimeros en bloque.
El termino "PEGilado", tal como se utiliza aqui, se refiere a una proteina, complejo de proteina o polipeptido unido a una
o mas fracciones de PEG. El termino "PEGilacion", tal como se utiliza aqui, se refiere al proceso de unir uno o mas PEG a una proteina. En una realizacion, el peso molecular de dicho PEG oscila entre 3 y 100 kDa, entre 5 y 60 kDa, entre 5 y 40 kDa, entre 5 y 25 kDa, entre 5 y 15 kDa o entre 5 y 10 kDa.
La expresion "composicion farmaceutica" se refiere a una composicion adecuada para uso farmaceutico en un animal, incluyendo humanos y mamiferos. Una composicion farmaceutica comprende una cantidad eficaz de un conjugado de polimero-polipeptido y tambien incluye un vehiculo farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica incluye una composicion farmaceutica que comprende el o los ingredientes activos y el o los ingredientes inertes que constituyen el vehiculo, asi como cualquier producto resultante, directa o indirectamente, de la combinacion, complejacion o agregacion de dos o mas ingredientes cualquiera, o de la disociacion de uno o mas de los ingredientes,
o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o mas de los ingredientes. Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion abarcan cualquier composicion preparada mezclando un compuesto o conjugado de la presente invencion y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
La expresion "vehiculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquiera vehiculo, tampon y excipiente farmaceutico estandar, tal como solucion salina con tampon fosfato, solucion acuosa de dextrosa al 5%, y emulsiones, como emulsion aceite/agua o agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes. En Remington's Pharmaceuticals Sciences, 19 Edicion (Mack Publishing Co., Easton, 1995), se describen vehiculos farmaceuticos y formulaciones adecuados. Los vehiculos farmaceuticos preferentes dependen del modo de administracion previsto del agente activo. Los modos de administracion tipicos incluyen la administracion enteral (por ejemplo oral) o parenteral (por ejemplo inyeccion subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal; o administracion topica, transdermica o transmucosa). Una "sal farmaceuticamente aceptable" es una sal que se puede formular en un compuesto o conjugado para uso farmaceutico, incluyendo, por ejemplo, sales metalicas (sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.) y sales de amonio o aminas organicas.
La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a un material que no sea biologicamente o de otro modo adverso, es decir, el material se puede administrar a un individuo sin que provoque ningun efecto biologico adverso o sin que interactue de un modo perjudicial con cualquiera de los componentes de la composicion en la que esta contenido.
Infrarrojo cercano (NIR)
La luz infrarroja cercana abarca un rango de longitud de onda de 700-2.500 nm (numeros de onda NIR: aproximadamente 14.000-3.500 cm-1) y tiene suficiente energia para excitar armonicos superiores y combinaciones de vibraciones moleculares a niveles de energia mas altos. La absorcion en el infrarrojo cercano (NIR) tiene su origen en vibraciones moleculares, tales como las absorciones fundamentales halladas en la espectroscopia de banda infrarroja media (MIR) (Raman), y los armonicos superiores y combinaciones hallados en la espectroscopia de banda NIR (NIR). Las absorciones IR cercano de longitud de onda larga resultan de armonicos superiores y bandas de combinacion de las vibraciones moleculares de grupos C-H, N-H y O-H. La espectroscopia infrarroja cercana (NIRVIS) se utiliza tipicamente para la medicion cuantitativa de grupos funcionales organicos, en especial O-H, N-H y C=O.
A menudo, la region IR cercana se subdivide en longitudes de onda IR cercano cortas (680-1.100 nm) y largas (1.100
2.500 nm), en funcion de la tecnologia requerida para analizar la luz en dichas regiones de longitud de onda (Patente US 7.280.866). La espectroscopia NIR tambien se puede dividir en espectroscopia de transmision de liquidos, aproximadamente 750 a 1.100 nm, y espectroscopia de reflexion de materiales en polvo, aproximadamente 1.100 a
2.500 nm.
Con el fin de detectar diferentes estructuras en una muestra, el espectro NIR se toma a intervalos de longitud de 10 nm
o menos para detectar todas las estructuras diferentes en el espectro, lo que conduce a un conjunto de datos multivariable. Asi, para estimar la concentracion de los constituyentes de un producto se utiliza una combinacion de multiples frecuencias espectrales, que se resuelven en puntos de datos utiles utilizando metodos quimiometricos (estadisticos).
Los componentes y el disefo de la instrumentacion NIRVIS son similares a los espectrometros de absorcion UV. La fuente luminosa normalmente es una lampara de tungsteno y el detector habitual es un detector de estado solido de PbS. Los portamuestras pueden ser de vidrio o cuarzo y los disolventes tipicos son CCl4 y CS2. La luz es proporcionada por multiples fuentes de longitud de onda individuales, tales como diodos superluminiscentes de baja coherencia (SLED) con longitudes de onda en el rango rojo/infrarrojo cercano (RNIR). Alternativamente, la luz puede ser suministrada por una fuente de banda ancha individual apropiadamente filtrada con un filtro de banda eliminada. Las dos longitudes de onda de la luz se dirigen ventajosamente en un solo haz.
En el metodo de acuerdo con la presente invencion, el espectro de absorcion en el infrarrojo cercano se mide utilizando una longitud de onda entre aproximadamente 680 y aproximadamente 2.500, en otro ejemplo a una longitud de onda entre aproximadamente 680 y aproximadamente 1.100, en otro ejemplo utilizando una longitud de onda entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 2.500 nm y en otro ejemplo mas entre 1.100 y aproximadamente 2.500 nm.
En una realizacion relacionada, la absorcion NIR se mide de acuerdo con los numeros de onda. El NIR se mide entre aproximadamente 15.000 cm-1 y 4.000 cm-1, entre aproximadamente 15.000 cm-1 y 9.000 cm-1 o entre aproximadamente
9.000 cm-1 y aproximadamente 4.000 cm-1. En una realizacion, el NIR se mide entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 4.000 cm-1.
Despues de la espectroscopia infrarroja cercana, la cantidad de polimero por molecula de proteina se determina utilizando tecnicas conocidas. Por ejemplo, la espectroscopia quimiometrica es el termino utilizado para describir la combinacion directa de una medida espectroscopica con un procedimiento de evaluacion de datos quimiometricos, que consiste habitualmente en un metodo estadistico multivariable que permite deducir las propiedades cualitativas y cuantitativas de una muestra a partir de su espectro (Naes y col., Multivariate Calibration and Classification, NIR Publications, Chichester, 2002). En Roggo y col. (J Pharm Biomed Anal 44:683-700, 2007) se describen metodos de analisis quimiometricos, En una realizacion se utiliza la regresion multilineal (MLR) o la regresion de minimos cuadrados parciales (PLS) para determinar cuantitativamente parametros individuales o combinados. Otros metodos de analisis quimiometricos incluyen, de forma no exclusiva, analisis de componentes principales (PCA), analisis de discriminacion lineal (LDA), modelizacion soft independiente de analogia de clases (SIMCA) y regresion de minimos cuadrados parciales discriminante (PLS1 y PLS2).
La determinacion de la cantidad de una molecula polimerica fisiologicamente aceptable unida a una proteina en una muestra se lleva a cabo poniendo en correlacion el espectro de absorcion en el infrarrojo cercano de dicha muestra con el espectro de absorcion en el infrarrojo cercano de una muestra que contiene la proteina unida a una cantidad determinada de molecula polimerica fisiologicamente aceptable. En una realizacion, la correlacion incluye el paso de preparar una curva de calibracion obtenida por medicion de los espectros de absorcion en el infrarrojo cercano de muestras que contienen proteinas unidas a diversas cantidades determinadas de las moleculas polimericas fisiologicamente aceptables.
Proteinas y complejos de proteinas
Las proteinas consideradas para su uso en las composiciones incluyen proteinas fisiologicamente activas utiles para ser administradas a un sujeto. En una realizacion, la proteina fisiologicamente activa es una proteina terapeutica. En un aspecto, la proteina fisiologicamente activa es una proteina o cualquier fragmento de la misma que mantenga una parte, esencialmente toda, o toda la actividad terapeutica o biologica de la proteina. En algunas realizaciones, la proteina es una proteina que si no fuera expresada o producida, o si su expresion o produccion se redujera esencialmente, daria lugar a una enfermedad. Preferentemente, la proteina se deriva o se obtiene de un humano.
En diversas realizaciones de la invencion, cuando la proteina fisiologicamente activa conjugada con un polimero fisiologicamente aceptable es una proteina o un fragmento de la misma que tiene la actividad biologica de la proteina, la proteina fisiologicamente activa tiene una secuencia de aminoacidos identica a la secuencia de aminoacidos de la porcion correspondiente de la proteina humana o de mamifero no conjugada. En otras realizaciones, la proteina fisiologicamente activa del conjugado es una proteina nativa de la especie humana o del mamifero. En otras realizaciones, la proteina o el fragmento de la misma son esencialmente homologos (es decir, al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identicos en la secuencia de aminoacidos a lo largo de una longitud de al menos 10, 25, 50, 100, 150 o 200 aminoacidos, o de toda la longitud del agente activo) a una secuencia nativa de la proteina humana o de mamifero correspondiente.
En la tecnica se conocen metodos para producir proteinas recombinantes. En las patentes US n° 6.048.729, 5.994.129 y
6.063.630 se describen metodos para producir celulas, incluyendo celulas de mamifero, que expresan ADN o ARN codificador de una proteina recombinante.
En una realizacion, un constructo de acido nucleico empleado para expresar un polipeptido o un fragmento o analogo del mismo es aquel que es expresado de forma extracromosomica (episomal) en la celula de mamifero transfectada o un constructo que se integra, aleatoriamente o en un sitio diana preseleccionado, mediante recombinacion homologa, en el genoma de la celula receptora. Un constructo que se expresa de forma extracromosomica comprende, ademas de secuencias codificadoras de polipeptido, suficientes secuencias para la expresion celular de la proteina y, opcionalmente, para replicar el constructo. Normalmente incluye un promotor, una secuencia de ADN codificadora de polipeptido y un sitio de poliadenilacion. El ADN codificador de la proteina esta situado en el constructo de modo que su expresion esta bajo el control del promotor. Opcionalmente, el constructo puede contener componentes adicionales, por ejemplo uno o mas de los siguientes: un sitio de corte y empalme, una secuencia intensificadora, un gen marcador genetico bajo el control de un promotor apropiado y un gen marcador amplificable bajo el control de un promotor apropiado.
En aquellas realizaciones donde el constructo de ADN se integra en el genoma de la celula, este incluye las secuencias de acidos nucleicos codificadoras de polipeptido. Opcionalmente puede incluir un promotor y una secuencia intensificadora, uno o mas sitios de poliadenilacion, uno o mas sitios de corte y empalme, secuencias de acidos nucleicos que codifican uno o mas marcadores geneticos, secuencias de acidos nucleicos que codifican un marcador amplificable y/o ADN homologo al ADN genomico de la celula receptora para la integracion dirigida del ADN en un sitio seleccionado del genoma (ADN o secuencias de ADN dirigidos).
Las celulas huesped utilizadas para producir proteinas recombinantes son celulas bacterianas, de levadura, de insecto, de vertebrado no mamifero o de mamifero; las celulas de mamifero incluyen, de forma no exclusiva, celulas de hamster, mono, chimpance, perro, gato, bovino, porcino, raton, rata, conejo, oveja y celulas humanas. Las celulas huesped incluyen celulas inmortalizadas (una linea celular) o celulas no inmortalizadas (primarias o secundarias) e incluyen cualquiera de una gran variedad de tipos celulares, tales como, de forma no exclusiva, fibroblastos, queratinocitos, celulas epiteliales (por ejemplo celulas epiteliales mamarias, celulas epiteliales intestinales), celulas ovaricas (por ejemplo ovario de hamster chino o celulas CHO), celulas endoteliales, celulas gliales, celulas neurales, elementos sanguineos formados (por ejemplo linfocitos, celulas de medula osea), celulas musculares, hepatocitos y precursores de estos tipos de celulas somaticas.
Las celulas huesped normalmente utilizadas incluyen celulas procarioticas tales como bacterias gramnegativas o grampositivas, es decir, cualquier cepa de E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Salmonella, y similares; celulas eucarioticas tales como celulas CHO (ovario de hamster chino); celulas de rifon de cachorro de hamster (BHK); celulas 293 de rifon humano; celulas COS-7; celulas de insecto tales como D. Mel-2, Sf4, Sf5, Sf9, y Sf21 y High 5; celulas vegetales y diversas celulas de levadura tales como Saccharomyces y Pichia.
Las celulas huesped que contienen el ADN o ARN codificador de polipeptido se cultivan bajo condiciones apropiadas para el crecimiento celular y la expresion del ADN o ARN. Las celulas que expresan el polipeptido se pueden identificar, utilizando metodos conocidos, pudiendose aislar y purificar la proteina recombinante tambien por metodos conocidos, con o sin amplificacion de la produccion de polipeptidos. La identificacion se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante cribado (screening) de celulas de mamifero modificadas geneticamente que presentan un fenotipo indicativo de la presencia de ADN o ARN codificador de la proteina, tal como screeing por RPC, por analisis Southern blot o para la expresion de la proteina. La seleccion de las celulas que incorporan el ADN codificador de proteina se puede llevar a cabo incluyendo un marcador genetico en el constructo de ADN y cultivando las celulas transfectadas o infectadas que contienen un gen marcador genetico bajo condiciones apropiadas para que sobrevivan solo aquellas que expresan el gen marcador genetico. Es posible llevar a cabo una amplificacion adicional del constructo de ADN introducido, cultivando las celulas modificadas geneticamente bajo condiciones apropiadas para la amplificacion (por ejemplo, cultivando las celulas modificadas geneticamente que contienen un gen marcador amplificable en presencia de una concentracion de un farmaco al que solo pueden sobrevivir las celulas que contienen multiples copias del gen marcador amplificable).
Las proteinas recombinantes que son proteinas fisiologicamente activas o proteinas terapeuticas incluyen, de forma no exclusiva, citoquinas, factores de crecimiento, proteinas de coagulacion terapeuticas o factores de coagulacion sanguinea, enzimas, quimioquinas, receptores de superficie celular solubles, moleculas de adhesion celular, anticuerpos, hormonas, proteinas citoesqueleticas, proteinas de matriz, proteinas chaperonas, proteinas estructurales, proteinas metabolicas y otras proteinas terapeuticas conocidas por los especialistas. Ejemplos de proteinas recombinantes que pueden ser utilizadas como agentes terapeuticos incluyen, de forma no exclusiva, Factor VIII, Factor VII, Factor IX y Factor von Willebrand, eritropoyetina, interferones, insulina, CTLA4-Ig, alfa-glucocerebrosidasa, alfaglucosidasa, hormona estimulante del foliculo, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-HER2, anticuerpo anti-CD52, receptor de TNF y otras proteinas conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Physicians Desk Reference, 62 Edicion, 2008, Thomson Healthcare, Montvale, NJ).
En una realizacion, la proteina es un factor de coagulacion terapeutico o factor (de coagulacion) sanguineo, incluyendo, de forma no exclusiva, Factor II, Factor III, Factor V, Factor VIII, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor von Willebrand y fibrinogeno. En una realizacion relacionada, el complejo de proteina comprende uno o mas factores sanguineos.
En una realizacion, la proteina es Factor von Willebrand (FvW) derivado de plasma y/o recombinante o un fragmento biologicamente activo o analogo del mismo. La expresion "FvW derivado de plasma (FvWp)" incluye FvW maduro obtenido de un mamifero. Un fragmento biologicamente activo o analogo de dicho FvWp es el pro-FvW que contiene el pro-peptido. En un ejemplo de la presente invencion, la proteina se selecciona de entre el grupo consistente en FvW inmaduro, incluyendo la molecula de FvW precursora (pre-pro-FvW) sintetizada por celulas endoteliales y megacariocitos, el propeptido de FvW (pro-FvW) y FvW plasmatico maduro obtenido despues de la segmentacion del peptido y pro-peptido de sefal, respectivamente, de la molecula precursora. Otros ejemplos de derivados biologicamente activos de FvW derivado de plasma incluyen pro-farmacos que se procesan o convierten en la forma biologicamente activa o que son biologicamente activos como tales, formas truncadas, formas que presentan deleciones, formas que tienen sustituciones, formas que tienen adiciones diferentes de pro-formas, fragmentos de la forma madura, formas quimericas y formas que presentan modificaciones post-traduccion en comparacion con la forma natural. La expresion "FvW recombinante (FvWr)" incluye FvW obtenido a traves de tecnologia de ADN recombinante que tiene opcionalmente un patron de glicosilacion farmacologicamente aceptable. Ejemplos especificos de estos incluyen FvW sin dominio A2 y en consecuencia resistente a la proteolisis (Lankhof y col., Thromb Haemost.; 77: 10081013,1997) y el fragmento de GFvW de Val 449 a Asn 730 incluyendo el dominio de union de glicoproteina Ib y sitios de union para colageno y heparina (Pietu y col., Biochem Biophys Res Commun.; 164:1339-1347, 1989).
En una realizacion relacionada, la proteina es Factor VIII. Experimentos anteriores demostraron que la conjugacion de una molecula polimerica fisiologicamente aceptable con Factor VIII resulta en una proteina de Factor VIII que es activable por trombina y que presenta una antigenicidad y una inmunorreactividad esencialmente reducidas y un aumento considerable de la velocidad de eliminacion in vivo en la corriente sanguinea de un mamifero (Patente US 4.970.300). La solicitud de patente internacional WO 94/15625 describe que la conjugacion del Factor VIII con una molecula polimerica fisiologicamente aceptable mejora la funcion in vivo del Factor VIII (i) aumentando su resistencia a la hidrolisis in vivo y prolongando asi su actividad despues de la administracion, (ii) prolongando considerablemente su vida en circulacion in vivo en comparacion con la proteina no modificada y (iii) aumentando su tiempo de absorcion en la corriente sanguinea. Ademas, en la solicitud de patente internacional WO 94/29370 A1 se describe la mejora de la funcion in vivo del Factor IX mediante la union de este a moleculas polimericas fisiologicamente aceptables, en particular poli(etilenglicol) (PEG). Sin embargo, ninguno de estos documentos da a conocer el numero de moleculas polimericas unidas a la proteina de Factor VIII.
Variantes yanalogos de polipeptidos
Los metodos de la invencion son utiles para detectar rapidamente proteinas recombinantes en una muestra, asi como fragmentos, analogos o variantes de la proteina recombinante, y ademas pueden ser utiles para detectar proteinas naturales que pueden estar presentes como fragmentos o variantes alelicas in vivo donde se pueden detectar diferencias de glicosilacion.
En la tecnica son bien conocidos los metodos para preparar fragmentos, analogos o variantes de polipeptidos. Los fragmentos de un polipeptido se preparan utilizando metodos conocidos en la tecnica, incluyendo segmentacion enzimatica (por ejemplo tripsina, quimiotripsina) y utilizando tambien medios recombinantes para generar un fragmento de polipeptido con una secuencia de aminoacidos especifica. Se pueden generar fragmentos que comprendan un dominio de union de ligando, un dominio de union a receptor, un dominio de dimerizacion o multimerizacion, o cualquier otro dominio identificable conocido en la tecnica.
Tambien se conocen metodos para preparar analogos de polipeptidos. Los analogos pueden ser esencialmente homologos o esencialmente identicos al polipeptido natural del que se deriva el analogo, y los analogos que entran en consideracion para la invencion son aquellos que conservan al menos parte de la actividad biologica del polipeptido natural.
Los analogos de sustitucion tipicamente intercambian un aminoacido de tipo salvaje por otro en uno o mas sitios dentro de la proteina, pudiendose disefar para modular una o mas propiedades del polipeptido, por ejemplo la estabilidad frente a la segmentacion proteolitica, sin perdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones de este tipo son generalmente conservadoras. La expresion "sustitucion de aminoacidos conservadora" significa la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido que tiene una cadena lateral de caracter quimico similar. Los aminoacidos similares para realizar sustituciones conservadoras incluyen aquellos que tienen una cadena lateral acida (acido glutamico, acido aspartico); una cadena lateral basica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral amida polar (glutamina, asparagina); una cadena lateral alifatica hidrofoba (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromatica (fenilalanina, triptofano, tirosina); una cadena lateral pequefa (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral hidroxilo alifatica (serina, treonina).
El experto puede generar facilmente analogos y fragmentos de polinucleotidos para codificar fragmentos, variantes o mutantes biologicamente activos de la molecula natural que poseen una actividad biologica igual o similar a la de la molecula natural. Los metodos rutinarios incluyen tecnicas PCR, digestion enzimatica y codificacion por ADN de la molecula de proteina y ligacion con secuencias de polinucleotido heterologas y similares. Por ejemplo, puede emplearse la mutagenesis puntual utilizando PCR y otras tecnicas bien conocidas para identificar en particular aquellos residuos aminoacidos importantes en actividades particulares asociadas a la actividad proteica. Por consiguiente, el especialista podra generar cambios de bases simples en la cadena de ADN para obtener un codon alterado y una mutacion sin sentido invertida.
Tambien esta previsto que la proteina o el polipeptido pueda modificarse para producir un analogo que sea una proteina de fusion que incluya un segundo agente consistente en un polipeptido. En una realizacion, el segundo agente que es un polipeptido es una enzima, un factor de crecimiento, una citoquina, una quimioquina, un receptor de superficie celular, el dominio extracelular de un receptor de superficie celular, una molecula de adhesion celular, un fragmento o dominio activo de una proteina arriba descrita o de cualquier otro tipo de proteina conocido en la tecnica. En una realizacion relacionada, el segundo agente es un factor de coagulacion sanguinea, como Factor VIII, Factor VII, Factor IX y Factor von Willebrand. La proteina de fusion prevista se produce mediante tecnicas quimicas o recombinantes bien conocidas.
Las variantes de proteina que entran en consideracion incluyen polipeptidos modificados quimicamente por tecnicas tales como ubiquitinacion, glicosilacion, conjugacion con agentes terapeuticos o de diagnostico, marcacion (por ejemplo con radionucleotidos o diversas enzimas), union de polimero covalente tal como PEGilacion (derivacion con polietilenglicol), introduccion de enlaces no hidrolizables, e insercion o sustitucion mediante sintesis quimica de aminoacidos tales como ornitina, que normalmente no estan presentes en proteinas humanas. Las variantes mantienen las propiedades de union de las moleculas no modificadas de la invencion.
Otras variantes de polipeptido adicionales utiles en los metodos de la presente invencion incluyen polipeptidos que comprenden fracciones de polisialilato (PSA). En la Publicacion de Patente US 20060160948 y en Saenko y col., Haemophilia 12:42-51, 2006, se describen metodos para preparar polipeptidos polisialilados.
Polimeros
En una realizacion, la invencion preve proteinas o polipeptidos modificados quimicamente que han sido unidos a una fraccion quimica que proporciona efectos ventajosos para la produccion y viabilidad de la proteina o el polipeptido. Por ejemplo, en la tecnica se conoce la conjugacion no especifica o especifica en cuanto al sitio de polimeros solubles en agua con polipeptidos para mejorar la vida media mediante la reduccion potencial de la inmunogenicidad, el aclaramiento renal y/o mediante el aumento de la resistencia a proteasas.
Polimeros solubles en agua, incluyendo, de forma no exclusiva, poli(etilenglicol) (PEG), oxido de poli(etileno) (PEO), polioxietileno (POE), alcoholes polivinilicos, hidroxietilcelulosas o dextranos, se conjugan habitualmente con proteinas o peptidos para aumentar la estabilidad o el tamafo, etc. de una proteina o peptido.
Los terminos PEG, PEO o POE se refieren a oligomeros o polimeros de oxido de etileno. Los PEG y PEO incluyen moleculas con una distribucion de peso molecular, es decir, polidispersas. La distribucion de tamafo se puede caracterizar estadisticamente mediante su peso molecular promedio en peso (Mw) y su peso molecular promedio en numero (Mn), cuya relacion se denomina indice de polidispersidad (Mw/Mn). Los valores de Mw y Mn se pueden medir por espectroscopia de masas. La mayor parte de los conjugados de PEG-proteina, en particular los conjugados con PEG mayor de 1 KD, presentan una variedad de pesos moleculares debido a una naturaleza polidispersa de la molecula PEG madre. Por ejemplo, en el caso del mPEG2K (Sunbright ME-020HS, NOF), las masas moleculares reales estan distribuidas en un intervalo de 1,5 � 3,0 KD con un indice de polidispersidad de 1,036. Como excepciones se pueden mencionar proteinas conjugadas con reactivos basados en MS(PEG)n (N=4, 8, 12 o 24, por ejemplo PEO4, PEO12) (Pierce), que se preparan especialmente como mezclas monodispersas con una longitud de cadena discreta y un peso molecular determinado.
La invencion preve el uso de polimeros solubles en agua que varian en el tipo, la conjugacion, la union y la longitud. Por ejemplo, los conjugados de PEG-proteina incluyen, de forma no exclusiva, conjugados lineales o ramificados, polimero:proteinas conjugados mediante quimica basada en NHS (N-hidroxisuccinimida) o en aldehidos, variantes con una union quimica diferente entre la cadena de PEG y el sitio de conjugacion y variantes de longitudes diferentes. El peso molecular medio del PEG oscila entre aproximadamente 3 kilodalton ("kDa") y aproximadamente 100 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 60 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 40 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 25 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 15 kDa, o entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 10 kDa,
La invencion preve conjugados de PEG-proteina seleccionados de entre el grupo consistente en conjugados de PEGproteina lineales que estan conjugados por NHS y cuya longitud oscila en el intervalo de -(CH2-CH2-O)n-, siendo n = 1 a 2.000, conjugados de PEG-proteina lineales que estan conjugados por aldehido y cuya longitud oscila en el intervalo de -(CH2-CH2-O)n-, siendo n = 1 a 2.000, conjugados de PEG-proteina ramificados de dos brazos que estan conjugados por NHS y cuya longitud oscila entre 3 y 100 kDa de masa y conjugados de PEG-proteina ramificados de tres brazos que estan conjugados por NHS. La invencion tambien preve conjugados de PEG-proteina que contienen diferentes enlaces quimicos (-CO(CH2)n-, y -(CH2)n-, siendo n = 1 a 5) entre su sitio de conjugacion y la cadena PEG. La invencion tambien preve conjugados de PEG-proteina anionicos cargados para reducir el aclaramiento renal, incluyendo, de forma no exclusiva, compuestos (anionicos) carboxilados, sulfatados y fosforilados (Caliceti y Veronese, Adv Drug Deliv Rev 2003 55(10):1261-77; Perlman y col., J Clin Endo Metab 2003 88(7):3227-35; Pitkin y col., Antimicrob Agents Chemother 1986 29(3): 440-44; Vehaskari y col., Kidney Intl 1982 22 127-135). En otra realizacion, el peptido esta conjugado opcionalmente con una fraccion que incluye un bifosfonato, un polimero soluble en agua tal como PEG o PEO, carbohidratos, acidos grasos u otros aminoacidos.
La modificacion quimica macromolecular se puede llevar a cabo de forma no especifica (lo que conduce a mezclas de especies modificadas) o de forma especifica en cuanto al sitio (basada en una modificacion dirigida a la reactividad macromolecular de tipo salvaje y/o una modificacion selectiva en cuanto al sitio utilizando una combinacion de mutagenesis dirigida al sitio y modificacion quimica) o, alternativamente, utilizando metodos de ligacion de proteina expresada (Curr Opin Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)).
Para averiguar si la PEGilacion influiria positivamente en la vida media terapeutica in vivo de un peptido, se sintetizan diversos conjugados de PEG-proteina caracterizados en cuanto a la farmacocinetica in vitro e in vivo. Con el fin de optimizar en ambos casos los efectos potenciales de la PEGilacion, se emplea una estrategia de disefo en la que se varian la longitud del polimero, la conformacion y la carga de PEG.
En general, los metodos para preparar la proteina PEGilada de la presente invencion comprenden los pasos de (a) someter a reaccion la proteina en cuestion con polietilenglicol bajo condiciones en las que el PEG se une al extremo Nterminal/C-terminal de la proteina y (b) obtener el o los productos de reaccion. Dado que la PEGilacion de una proteina puede alterar considerablemente la actividad intrinseca de esta, se examinan diferentes tipos de PEG. La quimica a utilizar para la PEGilacion de la proteina incluye la acilacion de las aminas primarias de la proteina utilizando el ester NHS de metoxi-PEG (O-[(N-succinimidiloxicarbonil)metil]-O'-metilpolietilenglicol). La acilacion con metoxi-PEG-NHS o metoxi-PEG-SPA conduce a una union de amida que elimina la carga de la amina primaria original (tambien, Boc-PEG para el extremo C-terminal). A diferencia de la sintesis ribosomica de proteinas, la sintesis de peptidos sinteticos tiene lugar desde el extremo C-terminal hacia el extremo N-terminal. Por consiguiente, Boc-PEG es un metodo (es decir, utilizando sintesis de terc-(b)util (o)xi (c)arbonilo (Boc, t-Boc)) para unir PEG al extremo C-terminal del peptido (R. B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. 1. The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 21492154). La quimica de (f)luorenil-(m)et(o)xi-(c)arbonilo (FMOC) (Atherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press.) es preferible porque no requiere el uso del peligroso acido fluorhidrico para eliminar los grupos protectores de la cadena lateral. Los presentes metodos preven una mezcla esencialmente homogenea de conjugado polimero:proteina. Tal como se utiliza aqui, "esencialmente homogeneo" significa que unicamente se observan moleculas del conjugado polimero:proteina. El conjugado polimero:proteina tiene actividad biologica y las presentes preparaciones de proteina PEGilada "esencialmente homogeneas" son aquellas que son suficientemente homogeneas para presentar las ventajas de una preparacion homogenea, por ejemplo, facilidad de aplicacion clinica en la predictibilidad de la farmacocinetica lote a lote.
En otra realizacion, las moleculas polimericas que entran en consideracion para ser utilizadas en los procesos de PEGilacion aqui descritos se pueden seleccionar de entre polimeros solubles en agua o mezclas de los mismos. El polimero puede tener un grupo reactivo simple, tal como un ester activo para la acilacion o un aldehido para la alquilacion, lo que permite controlar el grado de polimerizacion. El polimero soluble en agua, o la mezcla de polimeros solubles en agua si asi se desea, se puede seleccionar entre de el grupo consistente en, por ejemplo, PEG, monometoxi-PEG, PEO, dextrano, poli-(N-vinilpirrolidona), homopolimeros de propilenglicol, acidos grasos, copolimeros de oxido de polipropileno/oxido de etileno, polioles polioxetilados (por ejemplo glicerol), HPMA, FLEXIMART, y alcohol polivinilico, mono-alcoxi(C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, tresil-monometoxi-PEG, PEG-propionaldehido, bissuccinimidilcarbonato-PEG, celulosa, otros polimeros basados en carbohidratos o sus mezclas. El polimero seleccionado debe ser soluble en agua, de modo que la proteina a la que esta unido no precipite en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiologico. El polimero puede ser ramificado o no ramificado. Preferentemente, para el uso terapeutico de la preparacion del producto final, el polimero sera farmaceuticamente aceptable. En la tecnica se conocen metodos para generar peptidos que comprenden una fraccion de PEG. Vease, por ejemplo, la Patente US
5.824.784.
En una realizacion, el aldehido reactivo es PEG-propionaldehido, que es estable en agua, o derivados mono-alcoxi(C1-C10) o ariloxi del mismo (vease la Patente US 5.252.714). Tal como se utiliza aqui, el termino "PEG" abarca todas las formas de PEG que han sido utilizadas para derivar otras proteinas, como mono-alcoxi(C1-C10)- o ariloxi-polietilenglicol. El polimero puede ser ramificado o no ramificado. Preferentemente, para el uso terapeutico de la preparacion del producto final, el polimero es farmaceuticamente aceptable.
Composiciones farmaceuticas
La presente invencion preve composiciones farmaceuticas que comprenden cantidades eficaces de proteina o productos derivados de la invencion junto con diluyentes, estabilizadores, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehiculos farmaceuticamente aceptables. Dichas composiciones incluyen diluyentes con diferentes contenidos en tampon (por ejemplo Tris-HCl, fosfato), pH y fuerza ionica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo polisorbato 20, polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo acido ascorbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo trimerosol, alcohol bencilico) y agentes de carga (por ejemplo lactosa, manitol) (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Edicion, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa, paginas 1435:1712). Una cantidad eficaz de ingrediente activo es una cantidad terapeutica, profilactica o diagnosticamente eficaz, que puede ser determinada facilmente por un experto en la tecnica teniendo en cuenta factores tales como el peso corporal, la edad y el objetivo terapeutico.
Las composiciones de polimero-proteina de la presente invencion tambien pueden incluir un agente tampon para mantener el pH de la solucion en un intervalo deseado. Los agentes preferentes incluyen acetato de sodio, fosfato de sodio y citrato de sodio. Tambien es posible utilizar mezclas de estos agentes tampon. La cantidad de agente tampon a emplear en la composicion depende en gran medida del tampon particular utilizado y del pH de la solucion. Por ejemplo, el acetato es un tampon mas eficaz a pH 5 que a pH 6, de modo que en una solucion de pH 5 se puede utilizar menos acetato que en una solucion de pH 6. El intervalo de pH preferentes para las composiciones de la presente invencion es pH 3,0-7,5.
Las composiciones de la presente invencion pueden incluir ademas un agente de ajuste de la isotonicidad para volver la solucion isotonica y mas compatible para la inyeccion. El agente especialmente preferente es cloruro de sodio en un intervalo de concentracion de 0-1.500 mM.
Los metodos aqui descritos utilizan composiciones farmaceuticas que comprenden las moleculas arriba descritas, junto con uno o mas excipientes o vehiculos farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente otros ingredientes terapeuticos y/o profilacticos. Dichos excipiente incluyen liquidos como agua, solucion salina, glicerol, polietilenglicol, acido hialuronico, etanol, ciclodextrinas, ciclodextrinas modificadas (es decir, sulfobutil eter ciclodextrinas), etc. Los expertos en la tecnica tambien conocen excipientes adecuados para formulaciones no liquidas.
En las composiciones de la presente invencion se pueden utilizar sales farmaceuticamente aceptables, que incluyen, por ejemplo, sales de acidos inorganicos tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y sales de acidos organicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. En Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Edicion (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990) esta disponible una descripcion a fondo de excipientes y sales farmaceuticamente aceptables.
Adicionalmente, dichos vehiculos pueden incluir sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tampon biologicas, agentes tensioactivos y similares. Un tampon biologico puede ser practicamente cualquier solucion que sea farmacologicamente aceptable y que proporcione el pH deseado a la formulacion, es decir, un pH en el intervalo fisiologicamente aceptable. Ejemplos de soluciones tampon incluyen solucion salina, solucion salina con tampon fosfato, solucion salina con tampon Tris, solucion salina tamponada de Hank y similares.
Kits
Tambien estan previstos kits. Un kit tipico puede comprender un complejo de proteina-polimero con un numero estandar de polimeros unidos. En una realizacion, el kit comprende ademas un agente de union que se une especificamente a la proteina o el polimero, consistiendo el agente de union en un anticuerpo, un receptor soluble, un ligando, un cofactor u otro agente que se une especificamente a la proteina o el polimero. El kit puede incluir opcionalmente reactivos y tampones para preparar las muestras para la deteccion del complejo polimero-proteina.
Otros aspectos y detalles de la invencion se desprenden claramente de los siguientes ejemplos, que tienen caracter ilustrativo y no limitativo.
Ejemplos
Ejemplo 1: PEGilaci6n de seroalbumina humana
Con el fin de medir el nivel de polimero soluble en agua en una proteina utilizando NIR, una proteina de peso molecular conocido se conjugo con un PEG de tamafo conocido. Una seroalbumina humana se PEGilo a traves de residuos de lisina utilizando PEG succinimidil succinato lineal (PEG-SS / longitud de cadena: 5 kDa) (SunBio Inc., Anyang City, Corea del Sur). Se preparo una solucion de seroalbumina humana (HSA) (concentracion: 10 mg/ml) en tampon de acetato de sodio 25 mM, pH 6,2, y se afadio PEG-SS para obtener una concentracion final de 120 mg reactivo/mg de proteina. La mezcla se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitacion moderada. Despues de 10 minutos de reaccion, el pH se ajusto a 6,2 mediante adicion gota a gota de NaOH 0,5M. A continuacion, el conjugado se purifico por cromatografia de intercambio anionico utilizando un caudal lineal de 1 cm/min. Luego se dispusieron 200 ml de la mezcla de reaccion en una columna Pharmacia XK26 (26 mm x 155 mm) rellena de DEAE-Sepharose FF (GE Healthcare, Waukesha, WI) y la columna se equilibro con 10 volumenes de columna (VC) de tampon de partida (acetato de sodio 25 mM, pH 6,2). El conjugado de PEG-HSA se eluyo desde la columna con tampon de acetato de sodio 25 mM, pH 4,5 y se midio la DO a 280 nm para determinar la concentracion de proteina.
Ejemplo 2: Preparaci6n de especies de HSA con diferente grado de PEGilaci6n
Para la preparacion de especies de HSA con diferente grado de PEGilacion, una seroalbumina humana se PEGilo a traves de residuos de lisina tal como se describe en el Ejemplo 1 utilizando PEG succinimidil succinato lineal (longitud de cadena: 5 kDa) y diferentes cantidades de reactivo. Se preparo una solucion de HSA (concentracion: 10 mg/ml) en tampon de acetato de sodio 25 mM, pH 6,2, y se afadio PEG-SS para obtener concentraciones finales de 30, 60, 90 y 120 mg de reactivo/mg de proteina. A continuacion, los conjugados se purificaron por cromatografia de intercambio anionico en DEAE-Sepharose FF. Los conjugados de PEG-HSA se eluyeron de la columna con tampon de acetato de sodio 25 mM, pH 4,5, midiendose las DO a 280 nm para determinar la concentracion de proteina. Finalmente se estimo el grado de PEGilacion mediante el metodo colorimetrico de acuerdo con Nag y col. (Anal Biochem 250:35-43, 1997), expresandose en mol de PEG/mol de proteina. En las diferentes preparaciones de HSA se determinaron los grados de PEGilacion con 2, 3, 4 y 5 moles de PEG/mol de proteina (cantidades de reactivo: 30, 60, 90, 120 mg/mg de proteina). Los resultados se confirmaron midiendo el grado de PEGilacion utilizando el metodo NIRVIS de acuerdo con los siguientes Ejemplos 3 y 4.
Ejemplo 3 Control de proceso de PEGilaci6n
Un punto fuerte de la espectrometria NIR radica en la posibilidad de controlar la union de la reaccion de conjugacion del polimero y determinar la cantidad de polimero presente en la molecula conjugada. El siguiente ejemplo demuestra la aplicacion NIR para analizar la PEGilacion de una muestra de seroalbumina humana.
Durante todo el tiempo de la reaccion, aproximadamente una hora, de PEGilacion en solucion acuosa (tal como se describe mas arriba) se recogieron continuamente los espectros NIR en modo transflexion con un espectrometro NIR estandar en el rango espectral de 4.008 cm-1 a 9.996 cm-1 (2.500 nm a 1.000 nm). La transflexion mide la transmision de luz a traves de una muestra, incidiendo esta despues en un reflector por detras de la muestra para permitir que la luz entrante se transmita dos veces a traves de la muestra.
A partir de estos grupos de espectros, se selecciono un numero adecuado de espectros antes de afadir PEG (valor = 0) y al final de la reaccion (valor =1) para calcular la curva de calibracion con un software quimiometrico del espectrometro utilizando correccion de dispersion multiplicativa (MSC) como tratamiento previo de los datos y un algoritmo de minimos cuadrados parciales (PLS) tal como se conoce normalmente en la tecnica.
Este modelo de calibracion se utilizo para predecir los espectros restantes recogidos durante la reaccion. Tal como muestra la Figura 1, despues de la adicion del reactivo de PEG se obtiene una tendencia claramente logaritmica.
Estos experimentos demuestran que utilizando espectroscopia NIR es posible crear modelos de calibracion para predecir del progreso de la PEGilacion durante una reaccion de PEGilacion.
Ejemplo 4: Medida quimiometrica de la PEGilaci6n
Con el fin de demostrar la capacidad del metodo NIR para medir el PEG unido a proteina, se preparo una serie de diluciones utilizando una solucion de HSA PEGilada obtenida aplicando las condiciones del Ejemplo 2. El grado de PEGilacion se determino de acuerdo con el metodo de Nag y col. (Anal Biochem 250:35-43, 1997) y se confirmo por espectrometria de masas. Estas diluciones se analizaron por NIR y se recogio una cantidad representativa de espectros en el infrarrojo cercano con un espectrometro NIR estandar. Los espectros se midieron en el modo de transflexion en el rango espectral de 4.008 cm-1 a 9.996 cm-1 (2.500 nm a 1.000 nm).
A partir de estos datos recogidos, se calculo un modelo de calibracion con el software quimiometrico del espectrometro utilizando la primera derivada BCAP como tratamiento previo de los datos y un algoritmo de PLS. Los resultados de estos calculos se muestran en la Figura 2.
Tal como muestran los resultados, existe una fuerte correlacion entre la "respuesta medida" del PEG unido y la "respuesta prevista" del PEG unido. El coeficiente de correlacion de Pearson se eleva a 0,996 con un valor P de 0,000. En el intervalo de menor concentracion (soluciones 1 y 2, vease la Figura 2) se alcanzo una desviacion media del 17% y el 6% del valor previsto de moleculas de PEG con respecto al valor real de moleculas de PEG. En el intervalo de mayor concentracion (soluciones 3 y 4, vease la Figura 2), la desviacion media con respecto al valor real fue menor, del 0,8% en el caso de la solucion 3 y el 1,4% en el caso de la solucion 4.
Estos resultados demuestran que las respuestas medidas obtenidas mediante el metodo NIR presentan una buena
5 correlacion con los niveles de PEG unido a proteina en la muestra. Esto implica que el metodo permite predecir el grado de PEGilacion en una molecula de proteina y es util para determinar el numero y grado de PEGilacion y otras conjugaciones de polimero en una molecula de proteina.
Es de suponer que a los expertos en la tecnica se les ocurriran numerosas modificaciones y variaciones de la invencion tal como se explica en los anteriores ejemplos ilustrativos. Por consiguiente, la invencion solo debe estar sometida a las
10 limitaciones de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Metodo para determinar el numero de fracciones polimericas solubles en agua conjugadas a una proteina o complejo de proteina en una muestra, que comprende
    poner en contacto la muestra con una fuente luminosa en el espectro infrarrojo cercano y medir los niveles de absorbancia relativa en un intervalo de longitudes de onda del infrarrojo cercano,
    determinar el numero de moleculas polimericas conjugadas a la proteina o el complejo de proteina en base a los espectros de longitudes de onda o numeros de onda, comparandose los espectros de la muestra con un patron previamente calculado que tiene una cantidad conocida de moleculas polimericas conjugadas a una proteina o complejo de proteina, estando la longitud de onda del infrarrojo cercano en el intervalo de 680 nm a 2.500 nm.
  2. 2.
    Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicho contacto tambien incluye medir la radiacion reflejada por la muestra como una pluralidad de espectros de absorbancia dependiente del tiempo.
  3. 3.
    Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la comparacion incluye construir una matriz de datos de calibracion a partir de multiples espectros de absorcion en el infrarrojo cercano de muestras conocidas y comparar la espectroscopia medida de la muestra que comprende el conjugado polimero-proteina.
  4. 4.
    Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la longitud de onda del infrarrojo cercano esta en el intervalo de 680 nm a 1.100 nm o de 1.100 nm a 2.500 nm o de 1.000 nm a 2.500 nm.
  5. 5.
    Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el polimero fisiologicamente aceptable es polietilenglicol (PEG).
  6. 6.
    Metodo segun la reivindicacion 5, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 3 kDa a 100 kDa.
  7. 7.
    Metodo segun la reivindicacion 5, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 5 kDa a 60 kDa.
  8. 8.
    Metodo segun la reivindicacion 5, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 5 kDa a 40 kDa.
  9. 9.
    Metodo segun la reivindicacion 5, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 5 kDa a 15 kDa.
  10. 10.
    Metodo segun la reivindicacion 5, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 5 kDa a 10 kDa.
  11. 11.
    Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la proteina o el complejo de proteina es una proteina de coagulacion terapeutica o un complejo de proteina de coagulacion terapeutico.
  12. 12.
    Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la proteina o el complejo de proteina comprende un factor sanguineo seleccionado entre el grupo consistente en Factor II, Factor III, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor von Willebrand y fibrinogeno.
  13. 13.
    Metodo segun la reivindicacion 12, caracterizado porque la proteina es Factor von Willebrand.
  14. 14.
    Metodo segun la reivindicacion 12, caracterizado porque el complejo de proteina comprende Factor von Willebrand y Factor VIII.
  15. 15.
    Proceso para preparar una composicion que tiene una cantidad uniforme de moleculas polimericas solubles en agua en una proteina o un complejo de proteina, que comprende:
    conjugar la proteina con una molecula soluble en agua para producir una muestra de un complejo de polimero-proteina;
    aplicar el metodo de la reivindicacion 1 al complejo de polimero-proteina;
    y aislar compuestos dentro de la muestra que tienen el mismo numero de moleculas polimericas en base a los espectros de absorbancia en el infrarrojo cercano.
    Figura 1
    Control
    Figura 2
    Respuestapre�ista
    Muestra 4 Muestra 3 Muestra 2 Muestra 1
    Respuesta medida
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