KR20110104943A - 근적외선 분광법을 이용한 생리학상 허용되는 중합체 분자 검출 - Google Patents
근적외선 분광법을 이용한 생리학상 허용되는 중합체 분자 검출 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 일반적으로 근적외선 분광법을 사용하여 단백질 상의 중합체 양을 검출하는 방법에 관한 것이다. 단백질 분자 1개당 중합체 부분의 개수를 측정함으로써 제약 조성물 생산에 유용한, 균일한 개수의 중합체 부분을 가진 분자를 생산할 수 있다.
Description
본 출원은 2008년 12월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/121,788호를 우선권 주장하며, 이 가특허 출원은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 단백질에 결합된 생리학상 허용되는 중합체 분자의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다.
단백질의 생체내 기능은 단백질을 생리학상 허용되는 중합체 분자, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜에 결합시킴으로써 개선될 수 있다. 특히, 생리학상 활성인 단백질이 생리학상 허용되는 중합체 분자에 결합하게 되면 생체내 반감기가 실질적으로 연장될 수 있다. 예를 들어, 생리학상 허용되는 중합체 분자가 인자 VIII에 접합하게 되면 인자 VIII 단백질은 트롬빈에 의해 활성화되고, 항원성과 면역반응성은 실질적으로 감소하게 되고, 포유동물의 혈류 중에서의 생체내 소실 시간은 실질적으로 증가하게 된다고 미국 특허 4,970,300에 기술되어 있다. 인자 VIII이 생리학상 허용되는 중합체 분자에 접합하게 되면 (i) 그의 생체내 가수분해에 대한 내성을 증가시켜 투여후 그의 활성을 연장시킴으로써, (ii) 변형되지 않은 단백질에 비해 그의 생체내 순환 기간을 현저히 연장시킴으로써, 및 (iii) 그의 혈류 내로의 흡수 시간을 증가시킴으로써 인자 VIII의 생체내 기능이 개선된다고 국제 특허 출원 WO 94/15625에 기술되어 있다. 추가로, 인자 IX를 생리학상 허용되는 중합체 분자, 특히 폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG")에 결합시킴으로써 그의 생체내 기능을 개선시키는 것이 국제 특허 출원 WO 94/29370에 기술되어 있다.
그러나, 현재 단백질 또는 나노입자에 결합된 생리학상 허용되는 중합체 분자를 정량적으로 측정할 수 있는 신뢰성이 있는 방법은 없다. 비색 방법 (문헌 [Nag et al., Anal Biochem 250:35-43, 1997])은 불감수성이고, 중합체 분자의 함량 예측만 할 수 있으며, 약 1-5 ㎍의 PEG의 검출 한계를 나타낸다. 고성능 액체 크로마토그래피는 약 1-5 ㎍/ml의 검출 한계로 PEG를 검출할 수 있다 (문헌 [Kinahan et al., J Chromatogr 565:297-307, 1991]; [Ryan et al., J Pharm Sci 81:350-352, 1992]; [Ruddy et al., J Chromatogr B Biomed Appl 657:83-92, 1994]). PEG 측정을 위해 상-분리가 사용될 수는 있지만, 분석 감도는 약 1 ㎍ PEG이다 (문헌 [Guermant et al., Anal Biochem 230:254-258, 1995]). 또한, PEG 농도 측정을 위한 모노클로날 항체도 개시된 바 있지만 (미국 특허 6,617,118), 현재까지는 단백질에 결합된 생리학상 허용되는 중합체 분자의 양을 측정할 수 있는 신뢰성이 있는 시스템은 없다.
근적외선 분광법 (NIRVIS)은 샘플에 의한 근적외선 흡수 파장 및 강도를 측정하는 것이다. NIRVIS는 근적외선에서 화학 결합의 진동을 측정하고, 분자 구조에 대한 귀중한 정보를 제공한다 (문헌 [Landau et al., J Agric Food Chem 50:1374-8, 2002]). 근적외선의 파장 범위는 대략 680-2,500 nm (NIR 파수: 약 15,000-4,000 cm-1)에 이르며, 분자 진동의 배음대 (overtone) 및 결합대 (combination)를 보다 고에너지 수준으로 여기시키기에 충분할 정도로 왕성한 에너지를 갖고 있다. 근-IR 대역은 이들 파장 대역의 광을 분석하는데 필요한 기술에 기초하여 대개 단파장 (680-1,100 nm) 및 장파장 (1,100-2,500 nm) 근-IR로 세분화된다 (미국 특허 7,280,866). 장파장 근-IR 흡수는 C--H, N--H 및 O--H 기의 분자 진동의 배음대 및 결합대로부터 일어난다. NIRVIS는 전형적으로 유기 작용기, 특히, O-H, N-H, 및 C=O의 정량적 측정을 위해 사용된다. 검출 한계는 전형적으로 0.1%이며, 제약상의, 농업상의, 중합체 및 임상 분석에 적용되는 것을 포함한다. 적외선 분광법과 비교하여 근적외선 분광법의 편리한 계측 방법은 온라인 모니터링과 프로세스 제어에 더 적합하다.
따라서, 당업계에서는 단백질에 결합된 생리학상 허용되는 중합체 분자의 양을 정량적으로 측정할 수 있는 새로운 시스템의 제공이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 근적외선 분광법이 단백질 분자 상의 중합체 접합체의 정도를 측정하는데 유용하고, 접합 반응으로부터 생성된 단백질-중합체 접합체의 균일성을 측정하는데 유용하다는 발견에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 샘플을 근적외선 스펙트럼 광원과 접촉시키고, 근적외선 파장 범위에 걸쳐 상대 흡광도 수준을 측정하고, 파장 스펙트럼에 기초하여 단백질 또는 단백질 복합체에 접합된 중합체 분자의 개수를 측정하되, 이때, 샘플의 파장 스펙트럼을, 단백질 또는 단백질 복합체에 접합된 중합체 분자의 양이 공지되어 있는 미리 계산된 표준과 비교하는 것을 포함하는, 샘플 중 단백질 또는 단백질 복합체에 접합된 생리학상 허용되는 중합체 부분(moiety)의 개수를 측정하는 방법을 제공한다. NIR 스펙트럼이 파수로 표시되는 것도 고려된다.
한 실시양태에서, 접촉시키는 것은 상기 샘플로부터의 반사 방사선을 다수의 시간-의존성 흡광도 스펙트럼으로서 측정하는 것을 추가로 포함한다.
관련된 실시양태에서, 비교하는 것은 공지 샘플의 근적외선 흡수 스펙트럼 다수로부터 보정 데이터 행렬을 작성하고, 중합체-단백질 접합체를 포함하는 샘플의 분광법 측정치를 비교하는 것을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 근적외선 파장은 680-2,500 nm 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 파장은 680 내지 1,100 nm이다. 또 다른 실시양태에서, 파장은 1,100 내지 2,500 nm이다. 또 다른 실시양태에서, 근적외선 스펙트럼은 파수로 표시되며, 파수는 4,008 cm-1 내지 9,996 cm-1 (약 2,500 내지 1,000 nm)이다.
또 다른 실시양태에서, 생리학상 허용되는 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. PEG는 3 내지 100 kDa, 5 내지 60 kDa, 5 내지 40 kDa, 5 내지 25 kDa, 5 내지 15 kDa 범위, 또는 5 내지 10 kDa 범위인 것이 고려된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 단백질 또는 단백질 복합체가 치료적 응고 인자 (혈액 인자) 단백질 또는 치료적 응고 인자 단백질 복합체인 것을 제공한다. 한 실시양태에서, 단백질 또는 단백질 복합체는 인자 II, 인자 III, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand Factor) 및 피브리노겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈액 인자를 포함한다.
관련된 실시양태에서, 단백질은 폰 빌레브란트 인자이다. 추가 실시양태에서, 단백질 복합체는 폰 빌레브란트 인자 및 인자 VIII을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질을 생리학상 허용되는 분자에 접합시켜 중합체-단백질 복합체의 샘플을 제조하고; 중합체-단백질 복합체에 대해 상기 기술된 방법을 수행하고; 샘플 중에서, 근적외선 흡광도 스펙트럼에 기초하여 동일한 개수의 중합체 분자를 가지는 화합물들을 단리시키는 것을 포함하는, 단백질 또는 단백질 복합체 상에 균일한 개수의 생리학상 허용되는 중합체 분자를 가진 조성물을 제조하는 방법을 고려한다.
도 1은 다중 산란 보정 (MSC: multiplicative scatter correction) 및 PLS-알고리즘을 사용한, 시간 경과에 따른 PEG화 반응 진행을 측정한 보정 모델을 나타낸다.
도 2는 화학측정 (chemometric) 접근법을 사용하여 단백질 상의 중합체 분자의 양을 측정하기 위한 보정 모델을 나타낸다.
도 2는 화학측정 (chemometric) 접근법을 사용하여 단백질 상의 중합체 분자의 양을 측정하기 위한 보정 모델을 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 단백질에 결합된 생리학상 허용되는 중합체 분자의 양의 고감도 정량화 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바, "샘플"이라는 용어는 적어도 하나의 생리학상 허용되는 중합체 분자에 결합된 적어도 하나의 단백질을 함유하는 임의의 샘플, 예컨대, 제약 제품 제조 과정으로부터 기원하는 임의의 유체 또는 용액을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "단백질"이라는 용어는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기로 구성되어 있는, 재조합 단백질, 단백질 복합체 및 폴리펩티드를 비롯한 임의의 단백질, 단백질 복합체 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 단백질은 생체내로부터 단백질의 단리에 의해, 합성 방법에 의해 수득할 수 있거나, 재조합 DNA 기술에 의해 수득할 수 있다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어, 자동 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 재조합 단백질은 본원 하기에 기술되는 바와 같은, 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 단백질은 치료적 단백질 또는 그의 생물학상 활성인 유도체를 비롯한 생리학상 활성인 단백질이다. "생물학상 활성인 유도체"라는 용어는 모체 단백질과 실질적으로 동일한 기능적 및/또는 생물학적 특성을 가진 단백질의 변형물을 지칭한다. "단백질"이라는 용어는 전형적으로 큰 폴리펩티드를 의미한다. "펩티드"라는 용어는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 상호교환적으로 사용된다. "단백질 복합체"란 적어도 하나의 다른 단백질에 결합된 적어도 하나의 단백질로 구성되어 있는 분자를 의미한다. 단백질 복합체의 예로는 보조인자 또는 샤페론 (chaperon) 단백질에 결합한 단백질, 리간드-수용체 복합체, 및 다중 서브유니트 단백질, 예컨대, 인테그린 및 다중 단백질 서브유니트로 구성된 다른 세포 표면 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 폴리펩티드의 "단편"은 단백질 발현 생성물 또는 전장의 폴리펩티드보다 작은 폴리펩티드의 임의의 일부분을 지칭한다. 단편은 전형적으로 전장의 폴리펩티드의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된 것인, 전장의 폴리펩티드의 결실 유사체이다. 따라서, "단편"은 하기 기술하는 결실 유사체들의 아집단이다.
본원에서 사용되는 바, (상호교환적으로 사용될 수 있는) "유사체" 또는 "유도체"는 비록 특정한 경우에는 그 정도가 다르기는 하지만, 천연적으로 발생된 분자와 실질적으로 구조가 유사하고, 생물학적 활성이 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 유사체는 (i) 폴리펩티드의 하나 이상의 말단 및/또는 천연적으로 발생된 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 내부 영역에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, (ii) 폴리펩티드의 하나 이상의 말단 (전형적으로, "부가" 유사체), 및/또는 천연적으로 발생된 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 내부 영역 (전형적으로, "삽입" 유사체)에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 부가, 또는 (iii) 천연적으로 발생된 폴리펩티드 서열에서 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 비롯한, 하나 이상의 돌연변이에 기초하여, 그의 기원이 되는 천연적으로 발생된 폴리펩티드와 비교하여 그의 아미노산 서열의 조성이 상이하다. 치환은 치환되는 아미노산과, 그를 치환하는 아미노산 사이의 물리화학적 또는 기능적 관련성에 기초하여 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다.
한 측면에서, 유사체는 주어진 화합물, 예컨대, 펩티드와 약 70%의 서열 유사성을 보이되, 100% 미만의 서열 유사성을 보인다. 한 측면에서, 그러한 유사체 또는 유도체는 천연적으로 발생된 아미노산 잔기 뿐만 아니라, 비제한적인 일례로, 호모아르기닌, 오르니틴, 페니실라민, 및 노르발린을 비롯한, 비천연적으로 발생된 아미노산 잔기로 구성된다. 또 다른 측면에서, 그러한 유사체 또는 유도체는 하나 또는 다수의 D-아미노산 잔기로 구성되거나, 또는 2개 이상의 아미노산 잔기 사이의 비-펩티드 쇄교 (interlinkage)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "~로부터 유래된"이라는 용어는, 야생형 또는 천연적으로 발생된 폴리펩티드 또는 펩티드 서열의 변형 (아미노산 치환 또는 결실 포함)이며 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 가짐으로써 유도체 서열이 야생형 또는 천연적으로 발생된 서열과 약 70%이되 100% 미만인 서열 유사성을 공유하는 폴리펩티드 또는 펩티드 서열을 의미한다. 한 실시양태에서, 유도체는 야생형 폴리펩티드 중 길이가 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개인 아미노산에 걸쳐 실질적으로 상동성인 (즉, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성인), 폴리펩티드의 단편일 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이, 시험 서열과 비교가 되는 참고 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 시험 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우, 부분서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 참고 서열에 대해 상대적인 시험 서열(들)의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
예컨대, 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 조사 방법에 의해, 이들 알고리즘들의 컴퓨터 실행 (미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 중의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 시각적 조사에 의해서 비교를 위해 서열을 최적으로 정렬할 수 있다. 유용한 알고리즘의 일례는 문헌 [Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)]의 진행적 정렬 방법의 단순화를 사용하며, 문헌 [Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)]에 기술된 방법과 유사한 PILEUP이다. 서열의 다중 정렬을 생성하는데 유용한 또 다른 알고리즘은 클러스탈 더블유(Clustal W) (문헌 [Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994)])이다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 알고리즘 (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]; [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)]; [Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)])이다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해서 공개적으로 이용가능하다.
치환은 치환되는 아미노산과, 그를 치환하는 아미노산 사이의 물리화학적 또는 기능적 관련성에 기초하여 보존적 또는 비보존적 치환이 된다. 이러한 유형의 치환은 당업계에 주지되어 있다. 별법으로, 본 발명은 또한 비보존적 치환을 포함한다. 예시적인 보존적 치환은 문헌 [Lehninger, Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77]에 기술되어 있으며 하기에 제시한다.
별법으로, 예시적인 보존적 치환들을 바로 아래에 제시한다.
본원에서 사용되는 바, "변이체"는 변형을 통해 일반적으로는 분자의 부분이 아닌 추가적인 화학적 부분을 포함하는 단백질 또는 그의 유사체를 지칭한다. 이러한 부분은 분자의 가용성, 흡수, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 별법으로, 상기 부분은 분자의 독성을 감소시키고 분자의 임의의 원치않는 부작용을 제거하거나 약화시킬 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 부분이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)]에 개시되어 있다. 이러한 부분을 분자에 커플링시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 변이체는 단백질에 보다 장기간의 생체내 반감기를 부여하는 화학적 변형을 가진 혈액 응고 인자일 수 있다. 특정 측면에서, 변이체는 당화, PEG화 또는 폴리시알릴화에 의해 변형된 폴리펩티드이다.
본원에서 사용되는 바, 단백질 또는 폴리펩티드에 적용되는 "천연적으로 발생된"이라는 것은 단백질이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연 내의 공급원으로부터 단리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 유기체 (바이러스 포함) 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연적으로 발생된 것이다. "천연적으로 발생된" 및 "야생형"이라는 용어는 명세서 전역에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, 단백질 또는 폴리펩티드에 적용되는 "혈장-유래"라는 것은 대상체의 혈액 혈장 또는 혈청 중에서 발견되는 천연적으로 발생된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 의미한다. 혈장-유래 단백질은 또한 천연적으로 발생된 단백질 및 야생형 단백질일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "생리학상 허용되는 분자" 또는 "생리학상 허용되는 중합체"라는 용어는 수용액 중에서 실질적으로 가용성이거나, 현탁액 형태로 존재할 수 있고 제약상 유효량으로 중합체-단백질-접합체 투여 시에 포유동물에게 실질적으로 부정적인 영향을 주지 않으며, 생체적합성인 것으로 간주될 수 있는 중합체 분자를 의미한다. 한 실시양태에서, 생리학상 허용되는 분자는 약 2 내지 약 2,000개의 반복 단위를 포함한다. 생리학상 허용되는 중합체의 예로는, 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레핀 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체, 폴리(말레산), 폴리(DL-알라닌), 다당류, 예컨대, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 히알루론산 및 키틴, 폴리(메트)아크릴레이트, 및 상기 중 임의의 것의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
생리학상 허용되는 중합체 분자는 특정한 구조로 제한되지 않으며, 선형 (예컨대, 알콕시 PEG 또는 이관능성 PEG), 분지형 또는 다중-아암(arm)형 (예컨대, 포크형 PEG 또는 폴리올 중심에 부착된 PEG), 수지상일 수 있거나, 또는 분해가능한 결합을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 중합체 분자의 내부 구조는 임의의 개수의 상이한 패턴으로 구성된 것일 수 있고, 단일중합체, 교호 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교호 삼원공중합체, 랜덤 삼원공중합체 및 블록 삼원공중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "PEG화된"이라는 용어는 하나 이상의 PEG 부분에 결합된 단백질, 단백질 복합체 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "PEG화"라는 용어는 하나 이상의 PEG를 단백질에 결합하는 과정을 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 PEG의 분자량은 3 내지 100 kDa, 5 내지 60 kDA, 5 내지 40 kDa, 5 내지 25 kDa, 5 내지 15 kDa, 또는 5 내지 10 kDa 범위이다.
"제약 조성물"은 인간 및 포유동물을 비롯한, 대상체 동물에 사용하기 위한 제약상 용도에 적합한 조성물을 지칭한다. 제약 조성물은 약리학상 유효량의 중합체-폴리펩티드 접합체를 포함하고, 또한 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 제약 조성물은 활성 성분(들), 및 담체를 구성하는 불활성 성분(들) 뿐만 아니라, 직접 또는 간접적으로 임의의 2개 이상의 성분들의 조합, 복합체 형성, 또는 응집으로부터, 또는 하나 이상의 성분의 해리로부터, 또는 하나 이상의 성분의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 생성된 임의의 생성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 화합물 또는 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 혼합함으로써 제조되는 임의의 조성물을 포함한다.
"제약상 허용되는 담체"는 임의의 표준 제약상 담체, 완충액, 및 부형제, 예컨대, 인산염 완충처리된 염수 용액, 5% 덱스트로스 수용액, 및 에멀젼, 예컨대, 유/수 또는 수/유 에멀젼 및 각종 유형의 습윤제 및/또는 애주번트 (adjuvant)를 지칭한다. 적합한 제약상 담체 및 제형들은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)]에 기재되어 있다. 바람직한 제약상 담체는 의도하는 활성제 투여 방식에 따라 결정된다. 전형적인 투여 방식으로는 장관 (예컨대, 경구) 또는 비경구 (예컨대, 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주입; 또는 국부, 경피, 또는 경점막 투여)적인 것을 포함한다. "제약상 허용되는 염"은 예컨대, 금속 염 (나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 비롯한, 제약상 용도의 화합물 또는 접합체로 제형화될 수 있는 염이다.
"제약상 허용되는"이란 생물학상 또는 다르게는 바람직하지 못한 것이 아닌 물질, 즉, 임의의 바람직하지 못한 생물학적 효과를 유발하지 않으면서, 또는 이것이 함유되는 조성물의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있는 물질을 지칭한다.
근적외선 (
NIR
)
근적외선의 파장 범위는 700-2,500 nm (NIR 파수: 약 14,000-3,500 cm-1)에 이르며, 분자 진동의 배음대 및 결합대를 보다 고에너지 수준으로 여기시키기에 충분할 정도로 왕성한 에너지를 포함한다. 근적외선 (NIR) 흡수는 분자 진동, 예컨대, 중간-적외선 (MIR) 대역 (라만) 분광법에서 관찰되는 기본 흡수, 및 NIR 대역 (NIR) 분광법에서 발견되는 배음대 및 결합대에서 기원하는 것이다. 장파장 근-IR 흡수는 C--H, N--H 및 O--H 기의 분자 진동의 배음대 및 결합대로부터 일어난다. 근적외선 분광법 (NIRVIS)은 전형적으로 유기 작용기, 특히, O-H, N-H, 및 C=O의 정량적 측정을 위해 사용된다.
근-IR 대역은 대개 이들 파장 대역에서의 광을 분석하는데 필요한 기술에 기초하여 대개 단파장 (680-1,100 nm) 및 장파장 (1,100-2,500 nm) 근-IR로 세분화된다 (미국 특허 7,280,866). NIR 분광법은 또한 대략 750 내지 1,100 nm에서의, 액체에 대한 투과 분광법과, 대략 1,100 내지 2,500 nm에서의 분말 물질에 대한 반사 분광법으로 나누어질 수 있다.
샘플 중의 상이한 구조물들을 검출해 내기 위해, 모든 상이한 구조물들을 검출해 내고자 스펙트럼에서 그 길이가 10 nm 또는 그 미만인 간격으로 NIR 스펙트럼을 취함으로써 다변량 데이터 세트를 얻는다. 그 후에, 다수의 스펙트럼 주파수 조합을 사용하여 생성물 구성 성분들의 농도를 추정하고 이를 화학측정 (통계학적) 방법을 사용함으로써 유용한 데이터 점으로 해석한다.
NIRVIS 기구의 구성 요소와 디자인은 UV 흡수 분광계와 유사하다. 광원은 보통 텅스텐 램프이며, 검출기는 보통 PbS 고체-상태의 검출기이다. 샘플 홀더는 유리 또는 석영일 수 있으며, 전형적인 용매는 CCl4 및 CS2이다. 광은 다수의 단일 파장 광원, 예컨대, 적색/근적외선 영역 (RNIR)의 파장에서의 저간섭성 초발광 다이오드 (SLED)로부터 제공된다. 별법으로, 광은 적절히 노치 필터링된 단일의 광대역 광원으로부터 제공될 수 있다. 2가지 광 파장 모두 유리하게는 단일 빔으로 진행하게 된다.
본 발명에 따른 방법의 구체적인 예에서, 근적외선 흡수 스펙트럼은 약 680 내지 약 2,500의 파장을 사용하여 측정되며, 또 다른 예에서는, 약 680 내지 약 1,100의 파장에서, 추가 예에서는, 약 1,000 내지 약 2,500 nm의 파장에서, 및 또 다른 예에서, 1,100 내지 약 2,500 nm의 파장을 사용하여 측정된다.
관련된 실시양태에서, NIR 흡수는 파수에 따라 측정된다. NIR은 약 15,000 cm-1 내지 4,000 cm-1, 약 15,000 내지 9,000 cm-1, 또는 약 9,000 내지 약 4,000 cm-1에서 측정된다. 한 실시양태에서, NIR은 약 10,000 내지 약 4,000 cm-1에서 측정된다.
근적외선 분광법에 이어, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 단백질 분자 1개당 중합체의 양을 측정한다. 예를 들어, 화학측정 분광법이란, 전형적으로 샘플의 정성적 및 정량적 특성을 그의 스펙트럼으로부터 추론해 내는 다변량 통계학적 방법인 화학측정 데이터 평가 방법과 분광 측정의 직접적인 결합을 기술하는데 사용되는 용어이다 (문헌 [Næs et al., Multivariate Calibration and Classification, NIR Publications, Chichester, 2002]). 화학측정 분석 방법은 문헌 [Roggo et al., J Pharm Biomed Anal 44:683-700, 2007]에 기술되어 있다. 한 실시양태에서, 다중-선형 회귀 (MLR) 또는 부분 최소 자승 (PLS) 회귀가 개별 또는 복합 파라미터의 정량적 측정에 사용된다. 화학측정 분석의 다른 방법으로는 주성분 분석법 (PCA), 선형 판별 분석법 (LDA), 부류 유추에 의한 소프트 독립 모델링(soft independent modeling of class analogy) (SIMCA), 및 판별 부분 최소 자승 (PLS1 및 PLS2) 회귀법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
샘플 중 단백질에 결합된 생리학상 허용되는 중합체 분자의 양을 측정하는 것은 상기 샘플의 근적외선 흡수 스펙트럼을, 정해진 양의 생리학상 허용되는 중합체 분자에 결합된 단백질을 함유하는 샘플의 근적외선 흡수 스펙트럼과 서로 관련시킴으로써 수행한다. 한 실시양태에서, 서로 관련시키는 것은 다양한 정해진 양의 생리학상 허용되는 중합체 분자에 결합된 단백질을 함유하는 샘플의 근적외선 흡수 스펙트럼을 측정함으로써 수득된 보정 곡선을 제공하는 단계를 포함한다.
단백질 및 단백질 복합체
조성물에 사용되는 것으로서 고려되는 단백질로는 대상체에 투여하는 데 유용한 생리학상 활성인 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 생리학상 활성인 단백질은 치료적 단백질이다. 한 측면에서, 생리학상 활성인 단백질은 단백질의 치료적 또는 생물학상 활성 중 일부, 실질적으로 전부, 또는 전부를 계속하여 보유하는 단백질 또는 그의 임의의 단편이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 만약 발현되지 않거나 생산되지 않을 경우, 또는 그 발현 또는 생산이 실질적으로 감소된 경우에는 질병이 발생될 수 있는 그러한 단백질이다. 바람직하게, 단백질은 인간으로부터 유래되거나 수득되는 것이다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 생리학상 허용되는 중합체에 접합된 생리학상 활성인 단백질이 단백질의 생물학상 활성을 갖고 있는 단백질 또는 그의 단편일 경우, 생리학상 활성인 단백질은 비접합 인간 또는 포유동물 단백질 중의 상응하는 부분에 대한 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 접합체의 생리학상 활성인 단백질은 인간 또는 포유동물 종에 고유한 단백질이다. 다른 실시양태에서, 단백질 또는 그의 단편은 상응하는 인간 또는 포유동물 단백질의 천연 서열에 대해 실질적으로 상동성이다 (즉, 길이가 적어도 10, 25, 50, 100, 150, 또는 200개인 아미노산에 걸쳐, 또는 전장의 활성제에 걸쳐 아미노산 서열이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다).
재조합 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 재조합 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 발현시키는, 포유동물 세포를 비롯한 세포를 생산하는 방법은 미국 특허 번호 제6,048,729호, 제5,994,129호, 및 제6,063,630호에 기술되어 있다. 이들 출원 각각의 교시는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 유사체를 발현시키는 데 사용되는 핵산 작제물은 형질감염된 포유동물 세포 중 염색체외에서 (에피좀으로)발현되는 것, 또는 무작위적으로, 또는 상동성 재조합을 통해 미리 선별된 표적 부위에서 수용체 세포의 게놈내로 통합되는 것이다. 염색체외에서 발현되는 작제물는 폴리펩티드 코딩 서열 이외에도, 세포에서의 단백질 발현에 충분한 서열, 및 임의로 작제물 복제에 충분한 서열을 포함한다. 이는 전형적으로 프로모터, 폴리펩티드-코딩 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 단백질을 코딩하는 DNA는 그의 발현이 프로모터의 제어하에 있도록 하는 방식으로 작제물 중에 위치한다. 임의로, 작제물은 추가의 성분들, 예컨대, 스플라이스 부위, 인핸서 서열, 적절한 프로모터의 제어하에 있는 선별가능한 마커 유전자 및 적절한 프로모터의 제어하에 있는 증폭가능한 마커 유전자 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
DNA 작제물이 세포의 게놈내로 통합되는 실시양태에서, DNA 작제물은 폴리펩티드-코딩 핵산 서열을 포함한다. 임의로, 프로모터 및 인핸서 서열, 폴리아데닐화 부위 또는 부위들, 스플라이스 부위 또는 부위들, 선별가능한 마커 또는 마커들을 코딩하는 핵산 서열, 증폭가능한 마커를 코딩하는 핵산 서열, 및/또는 게놈 중 선택된 부위로 DNA를 표적화 통합시키기 위한, 수용체 세포 중의 게놈 DNA에 상동성인 DNA (표적화 DNA 또는 DNA 서열)을 포함할 수 있다.
재조합 단백질을 제조하는데 사용되는 숙주 세포는 세균, 효모, 곤충, 비-포유동물 척추동물, 또는 포유동물 세포이며; 포유동물 세포로는 햄스터, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 소, 돼지, 마우스, 래트, 토끼, 양 및 인간 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포는 무한증식 세포 (세포주), 또는 비-무한증식 (1차 또는 2차) 세포를 포함하고, 매우 다양한 세포 유형들, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 섬유아세포, 각질세포, 상피 세포 (예컨대, 유선 상피 세포, 장 상피 세포), 난소 세포 (예컨대, 차이니즈 햄스터 난소 또는 CHO 세포), 내피 세포, 아교 세포, 신경 세포, 혈액 형성 요소 (예컨대, 림프구, 골수 세포), 근육 세포, 간세포 및 이들 체세포 유형의 전구체 중 임의의 것을 포함한다.
통상 사용되는 숙주 세포로는 원핵생물 세포, 예컨대, 그람 음성 또는 그람 양성 세균, 즉, E. 콜라이(E. coli), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 살모넬라(Salmonella) 등; 진핵생물 세포, 예컨대, CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포; 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포; 인간 신장 293 세포; COS-7 세포; 곤충 세포, 예컨대, D. Mel-2, Sf4, Sf5, Sf9, 및 Sf21 및 High 5; 식물 세포 및 각종 효모 세포, 예컨대, 사카로마이세스 및 피치아(Pichia)를 포함한다.
세포 성장 및 DNA 또는 RNA의 발현에 적절한 조건하에서 폴리펩티드-코딩 DNA 또는 RNA를 함유하는 숙주 세포를 배양한다. 폴리펩티드를 발현하는 세포는 공지된 방법을 사용하여 확인할 수 있으며, 폴리펩티드 생산을 증폭시키거나 또는 증폭시키지 않고, 공지된 방법을 사용함으로써 재조합 단백질을 단리시키고 정제시킬 수 있다. 예컨대, PCR 스크리닝, 써던 블롯 분석에 의한 스크리닝, 또는 단백질 발현에 대한 스크리닝과 같이, 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA의 존재를 암시하는 표현형을 나타내는 유전적으로 변형된 포유동물 세포를 스크리닝하는 것을 통해 확인 절차를 수행할 수 있다. 단백질-코딩 DNA가 도입되어 있는 세포를 선별하는 것은 DNA 작제물 중에 선별가능한 마커를 포함시키고, 오직 선별가능한 마커 유전자를 발현하는 세포만이 생존하는 데 적절한 조건하에서 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 형질감염된 또는 감염된 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 도입된 DNA 작제물을 추가로 증폭시키는 것은 증폭에 적절한 조건하에서 유전적으로 변형된 세포를 배양함으로써 (예컨대, 오직 증폭가능한 마커 유전자의 다중 카피를 함유하는 세포만이 생존할 수 있는 농도의 약물 존재하에 증폭가능한 마커 유전자를 함유하는 유전적으로 변형된 세포를 배양함으로써) 실현될 수 있다.
생리학상 활성인 단백질 또는 치료적 단백질인 재조합 단백질은 사이토카인, 성장 인자, 치료적 응고 단백질 또는 혈액 응고 인자, 효소, 케모카인, 가용성 세포-표면 수용체, 세포 부착 분자, 항체, 호르몬, 세포골격 단백질, 기질 단백질, 샤페론 단백질, 구조 단백질, 대사 단백질, 및 당업자에게 공지되어 있는 다른 치료적 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료제로서 사용되는 재조합 단백질의 예로는 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX 및 폰 빌레브란트 인자, 에리트로포이에틴, 인터페론, 인슐린, CTLA4-Ig, 알파-글루코세레브로시다제, 알파-글루코시다제, 난포 자극 호르몬, 항-CD20 항체, 항-HER2 항체, 항-CD52 항체, TNF 수용체, 및 당업자에게 공지된 다른 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Physicians Desk Reference, 62nd Edition, 2008, Thomson Healthcare, Montvale, NJ]를 참조한다.
한 실시양태에서, 단백질은 인자 II, 인자 III, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 폰 빌레브란트 인자 및 피브리노겐을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 치료적 응고 인자 또는 혈액 (응고) 인자이다. 관련된 실시양태에서, 단백질 복합체는 하나 이상의 혈액 인자를 포함한다.
한 실시양태에서, 단백질은 혈장-유래 및/또는 재조합 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 또는 그의 생물학상 활성인 단편 또는 유사체이다. "혈장-유래 VWF (pVWF)"라는 용어는 포유동물로부터 수득된 성숙한 VWF를 포함한다. 상기 pVWF의 하나의 생물학상 활성인 단편 또는 유사체는 프로-펩티드를 함유하는 프로-VWF이다. 본 발명의 하나의 예에서, 단백질은 내피 세포 및 거대핵세포에 의해 합성되는 전구체 VWF 분자 (프리-프로-VWF)를 포함하는 비성숙 VWF, VWF 프로펩티드 (프로-VWF) 및 각각 전구체 분자의 신호 펩티드 및 프로-펩티드의 분해 시에 수득되는 성숙한 VWF로 이루어진 군으로부터 선택된다. 혈장-유래 VWF의 생물학상 활성인 유도체의 추가 예로는 끝이 절단된 형태, 결실을 가진 형태, 치환을 가진 형태, 전구-형태 이외의 부가를 가진 형태, 성숙한 형태의 단편, 키메라 형태, 및 천연 형태와 비교하여 번역 후 변형을 가진 형태와 같이, 생물학상 활성인 형태로 프로세싱되었거나 전환되었거나, 또는 생물학상 활성인 프로-드럭 (pro-drug)을 포함한다. "재조합 VWF (rVWF)"라는 용어는 약리학상 허용되는 당화 패턴을 임의로 가지는 재조합 DNA 기술을 통해 수득된 VWF를 포함한다. 그의 구체적인 예로는 단백질분해에 대해 내성인 A2 도메인을 갖지 않는 VWF (문헌 [Lankhof et al., Thromb Haemost.;77:1008- 1013,1997]) 및 콜라겐 및 헤파린에 대한 당단백질 Ib-결합 도메인 및 결합 부위를 포함하는 Val 449 내지 Asn 730의 VWF 단편을 포함한다 (문헌 [Pietu et al., Biochem Biophys Res Commun.; 164:1339-1347, 1989]).
관련된 실시양태에서, 단백질은 인자 VIII이다. 생리학상 허용되는 중합체 분자가 인자 VIII에 접합하게 되면 인자 VIII 단백질은 트롬빈에 의해 활성화되고, 항원성과 면역반응성은 실질적으로 감소하게 되고, 포유동물의 혈류 중에서의 생체내 소실율은 실질적으로 증가하게 된다고 이전 실험을 통해 입증된 바 있다 (미국 특허 4,970,300). 인자 VIII이 생리학상 허용되는 중합체 분자에 접합하게 되면 (i) 그의 생체내 가수분해에 대한 내성을 증가시켜 투여후 그의 활성을 연장시킴으로써, (ii) 변형되지 않은 단백질에 비해 그의 생체내 순환 기간을 현저히 연장시킴으로써, 및 (iii) 그의 혈류 내로의 흡수 시간을 증가시킴으로써 인자 VIII의 생체내 기능은 개선된다고 국제 특허 출원 WO 94/15625에 기술되어 있다. 추가로, 인자 IX를 생리학상 허용되는 중합체 분자, 특히 폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG")에 결합시킴으로써 그의 생체내 기능을 개선시키는 것이 국제 특허 출원 WO 94/29370 A1에 기술되어 있다. 그러나, 어떤 문서에서도 인자 VIII 단백질에 결합된 중합체 분자의 개수에 관해 개시한 바 없다.
폴리펩티드
변이체
및 유사체
본 발명의 방법은 샘플 중의 재조합 단백질 뿐만 아니라, 재조합 단백질의 단편, 유사체, 또는 변이체를 신속하게 검출하는 데 유용하고, 추가로, 생체내에서 단편 또는 대립형질 변이체로 존재할 수 있는 천연적으로 발생된 단백질을 검출하는 데도 유용할 수 있으며, 이때, 당화의 차이가 검출될 수 있다.
폴리펩티드 단편, 유사체 또는 변이체의 제조 방법은 당업계에 주지되어 있다. 폴리펩티드 단편은 효소적 절단 (예컨대, 트립신, 키모트립신)을 비롯한, 당업계에 주지된 방법들을 사용하고, 또한 특정 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 단편들을 생성하기 위한 재조합 수단을 사용하여 제조된다. 단편은 리간드-결합 도메인, 수용체-결합 도메인, 이량체화 또는 다량체화 도메인, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 확인가능한 도메인을 포함하도록 생성될 수 있다.
폴리펩티드 유사체의 제조 방법 또한 주지되어 있다. 유사체는 그의 기원이 되는 천연적으로 발생된 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이거나 또는 실질적으로 동일하며, 본 발명에 의해 고려되는 유사체는 천연적으로 발생된 폴리펩티드의 생물학상 활성을 적어도 일부분 보유하고 있는 것이다.
치환 유사체는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 야생형의 하나의 아미노산을 또 다른 것으로 교체하고, 다른 기능 또는 특성의 손실은 없이, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 예컨대, 단백질 분해에 대응하는 안정성을 변화시키도록 디자인될 수 있다. 이러한 종류의 치환은 일반적으로 보존적이다. "보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산이 유사한 화학적 특징의 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 보존적 치환을 하기 위한 유사한 아미노산은 산성 측쇄 (글루탐산, 아스파르트산); 염기성 측쇄 (아르기닌, 리신, 히스티딘); 극성 아미드 측쇄 (글루타민, 아스파라긴); 소수성, 지방족 측쇄 (류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 글리신); 방향족 측쇄 (페닐알라닌, 트립토판, 티로신); 소형 측쇄 (글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌); 또는 지방족 히드록실 측쇄 (세린, 트레오닌) 를 가지는 것들을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 유사체 및 단편은 숙련된 기술자에 의해 천연적으로 발생된 분자와 동일하거나 유사한 생물학상 활성을 가지는, 천연적으로 발생된 분자의 생물학상 활성인 단편, 변이체, 또는 돌연변이체를 코딩하도록 쉽게 생성될 수 있다. 통상적으로 실시되는 방법으로는 PCR 기법, 단백질 분자를 코딩하는 DNA의 효소적 분해 및 이종 폴리뉴클레오티드 서열에의 결찰 등을 포함한다. 예를 들어, 특히 어떤 아미노산 잔기가 단백질 활성과 관련된 특정 활성에 중요한지를 확인하기 위해, PCR 및 당업계에 주지된 다른 기법을 사용하는 점 돌연변이 유발법이 사용될 수 있다. 따라서, 당업자는 DNA 스트랜드 중의 단일 염기 변이를 생성함으로써 코돈을 변경시킬 수 있고, 미스센스 (missense) 돌연변이를 일으킬 수 있다.
단백질 또는 폴리펩티드를 변형시켜 폴리펩티드인 제2 제제를 포함하는 융합 단백질인 유사체를 제조할 수 있다는 것이 추가적으로 고려된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드인 제2 제제는 효소, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 세포-표면 수용체, 세포 표면 수용체의 세포외 도메인, 세포 부착 분자, 또는 상기 기술된 단백질 또는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 다른 유형의 단백질의 단편 또는 활성 도메인이다. 관련된 실시양태에서, 제2 제제는 혈액 응고 인자, 예컨대, 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX 및 폰 빌레브란트 인자이다. 고려되는 융합 단백질은 당업계에서 주지되어 있는 화학적 또는 재조합 기법에 의해 제조된다.
고려되는 단백질 변이체로는, 인간 단백질에서는 일반적으로 발생하지 않는, 유비퀴틴화 (ubiquitination), 당화, 치료제 또는 진단제로의 접합화, 표지화 (예컨대, 방사성 핵종 또는 각종 효소들), 공유 중합체 부착, 예컨대, PEG화 (폴리에틸렌 글리콜과의 유사체화), 비가수분해성 결합의 도입, 및 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 본 발명의 변형되지 않은 분자의 결합 특성을 보유한다.
본 발명의 방법에서 유용한 추가적인 폴리펩티드 변이체는 폴리시알릴레이트 (PSA) 부분을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리시알릴화된 폴리펩티드를 제조하는 방법은 미국 특허 공보 20060160948 및 문헌 [Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006]에 기술되어 있다.
중합체
한 실시양태에서, 본 발명은 단백질 또는 폴리펩티드의 생산, 생존 능력에 유리한 효과를 제공하는 화학적 부분에 연결된 화학적으로 변형된 단백질 또는 폴리펩티드를 고려한다. 예를 들어, 수용성 중합체의 폴리펩티드에의 비특이적 또는 부위-특이적 접합은 잠재적으로 면역원성, 신장 청소율을 감소시키고/거나, 프로테아제 내성을 개선시킴으로써 반감기를 개선시키는 것으로 당업계에 공지되어 있다.
폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥시드) (PEO), 폴리옥시에틸렌 (POE), 폴리비닐 알콜, 히드록시에틸 셀룰로스 또는 덱스트란을 포함하나, 이에 한정되지 않는 수용성 중합체들은 통상적으로 단백질 또는 펩티드에 접합되어 단백질 또는 펩티드의 안정성 또는 크기 등을 증가시킨다.
PEG, PEO 또는 POE는 에틸렌 옥시드의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. PEG 및 PEO는 분자량 분포, 즉, 다분산성 (polydisperse)을 갖는 분자들을 포함한다. 크기 분포는 다분산 지수 (Mw/Mn)로 불리우는, 그의 중량 평균 분자량 (Mw)와 수 평균 분자량 (Mn)의 비를 통계학상 특징으로 한다. Mw 및 Mn은 질량 분광법에 의해 측정될 수 있다. 대부분의 PEG-단백질 접합체, 특히, 1 KD 보다 큰 PEG에 접합된 것들은 모체 PEG 분자의 다분산성에 기인한 분자량 범위를 나타낸다. 예를 들어, mPEG2K (선브라이트(Sunbright) ME-020HS, NOF)의 경우에, 실제 분자량은 1.5 ~ 3.0 KD 범위에 걸쳐 분포되어 있으며, 다분산 지수는 1.036이다. 예외는 별개의 쇄 길이 및 정해진 분자량을 가지는 단일분산계 혼합물로서 특이적으로 제조된, MS(PEG)n에 접합된 단백질 (N=4, 8, 12 또는 24, 예컨대, PEO4, PEO12)-기반 시약 (피어스(Pierce))이다.
본 발명은 유형, 접합, 결합 및 길이가 다른 수용성 중합체의 용도에 고려한다. 예를 들어, PEG-단백질 접합체로는 선형 또는 분지형 접합체, NHS (N-히드록시숙신이미드)- 또는 알데히드-기반 화학물질에 의해 접합된 중합체:단백질, PEG 쇄 및 접합 부위 간의 상이한 화학 결합을 가지는 변이체, 및 길이 면에서 다른 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. PEG의 평균 분자량은 약 3 킬로달톤 ("kDa") 내지 약 100 kDa, 약 5 kDa 내지 약 60 kDa, 약 5 kDa 내지 약 40 kDa, 약 5 kDa 내지 약 25 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위가 될 것이다.
본 발명은 NHS-접합되고, 길이 범위가 -(CH2-CH2-O)n- (여기서, n = 1 내지 2,000)인 선형 PEG-단백질 접합체, 알데히드-접합되고 길이 범위가 -(CH2-CH2-O)n- (여기서, n = 1 내지 2,000)인 선형 PEG-단백질 접합체, NHS-접합되고 길이 범위가 질량으로 3 내지 100 kDa인 이-아암 분지형 PEG-단백질 접합체, 및 NHS-접합된 3-아암 분지형 PEG-단백질 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된 PEG-단백질 접합체를 고려한다. 본 발명은 그의 접합 부위와 PEG 쇄 사이에 상이한 화학 결합 (-CO(CH2)n-, 및 -(CH2)n- (여기서, n = 1 내지 5))을 함유하는 PEG-단백질 접합체 또한 고려한다. 본 발명은 추가로 카르복실화된 화합물, 황산화된 화합물 및 인산화된 화합물 (음이온성)을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 신장 청소율을 감소하기 위한 하전된 음이온성 PEG-단백질 접합체를 고려한다 (문헌 [Caliceti & Veronese, Adv Drug Deliv Rev 2003 55(10): 1261-77]; [Perlman et al., J Clin Endo Metab 2003 88(7):3227-35]; [Pitkin et al., Antimicrob Agents Chemother 1986 29(3): 440-44]; [Vehaskari et al., Kidney Intl 1982 22 127-135]). 추가의 실시양태에서, 펩티드는 비스포스포네이트를 포함하는 부분, 수용성 중합체, 예컨대, PEG 또는 PEO, 당질, 지방산 또는 추가적인 아미노산에 임의로 접합된다.
거대분자 화학적 변형은 비-특이적 양식으로 (변형된 종들의 혼합물 생성) 또는 부위-특이적인 양식으로 (야생형 거대분자 반응성-지정 변형 및/또는 부위-지정 돌연변이유발법 및 화학적 변형의 조합을 사용한 부위-선택적 변형에 기반한 양식으로), 또는 별법으로, 발현된 단백질 결찰 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (문헌 [Curr Opin Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)]).
펩티드의 생체내 치료적 반감기가 PEG화로부터 유리해지는지 여부를 알아보기 위해, 각종의 상이한 PEG-단백질 접합체를 합성하고, 약동학적으로 시험관내 및 생체내 특징을 규명한다. PEG화의 잠재적인 효과를 모두 최적화하기 위해서, PEG의 중합체 길이, 입체형태, 및 전하를 달리하는 디자인 전략법을 사용한다.
본 발명의 PEG화된 단백질을 제조하는 방법은 일반적으로 (a) PEG가 단백질의 N-말단/C-말단에 부착될 수 있도록 하는 조건하에서 관심의 대상이 되는 단백질을 폴리에틸렌 글리콜과 반응시키는 단계 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함한다. 단백질의 PEG화는 단백질의 내인적 활성을 현저하게 변경시킬 수 있기 때문에, 다른 유형의 PEG가 조사되고 있다. 단백질의 PEG화에 사용될 수 있는 화학법으로는 메톡시-PEG (O-[(N-숙신이미딜옥시카르보닐)-메틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜)의 NHS-에스테르를 사용한 단백질의 1차 아민의 아실화를 포함한다. 메톡시-PEG-NHS 또는 메톡시-PEG-SPA의 아실화는 원래의 1차 아민으로부터 전하를 제거하는 아미드 연결을 야기한다 (또한, C-말단을 위한 Boc-PEG). 리보좀 단백질 합성과 달리, 합성 펩티드 합성은 C-말단에서 N-말단으로 진행된다. 따라서, Boc-PEG는 PEG를 펩티드의 C-말단에 부착시키는 한 가지 방법 (즉, tert-부틸 옥시 카르보닐 (Boc, t-Boc) 합성법 사용)이다 (문헌 [R. B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154]). 플루오레닐-메톡시-카르보닐 (FMOC) 화학법 (문헌[Atherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press.])이 바람직한데, 이는 측쇄-보호기를 제거하기 위해 위험하게 플루오르화수소산을 사용할 필요가 없기 때문이다. 본 방법은 중합체:단백질 접합체의 실질적으로 균질성인 혼합물을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "실질적으로 균질성"이라는 것은 오직 중합체:단백질 접합체 분자만이 관찰된다는 것을 의미하는 것이다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지고, 본 "실질적으로 균질성"인 PEG화된 단백질 제제는 균질성 제제의 이점, 예컨대, 로트 대 로트의 약물동력학적 성질에 대한 예측가능성에서 임상적 적용의 용이함을 보이기에 충분할 정도로 균질성인 것이다.
추가의 실시양태에서, 본원에 기술된 PEG화 접근법에서의 사용을 위해 고려되는 중합체 분자는 수용성 중합체 또는 그의 혼합물 중에서 선택될 수 있다. 중합체는 중합도가 조절될 수 있도록 하나의 반응성 기, 예컨대, 아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드를 가질 수 있다. 원하는 경우, 수용성 중합체 또는 그의 혼합물은 예를 들어, PEG, 모노메톡시-PEG, PEO, 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈), 프로필렌 글리콜 단일중합체, 지방산, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예컨대, 글리세롤), HPMA, 플렉시마(FLEXIMAR)™ 및 폴리비닐 알콜, 모노-(C1-C10)알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데히드, 비스-숙신이미딜 카르보네이트 PEG, 셀룰로스, 기타 당질계 중합체 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 선택된 중합체는 그것이 부착된 단백질이 수성 환경, 예컨대, 생리학적 환경에서 침전하지 않도록 수용성이어야 한다. 중합체는 분지형이거나 비분지형일 수 있다. 최종 생성물 제제의 치료적 용도를 위해, 중합체는 제약상 허용되는 것이 바람직하다. PEG 부분을 포함하는 펩티드를 생성하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,824,784를 참고한다.
한 실시양태에서, 반응성 알데히드는 수용성인 PEG-프로피온알데히드 또는 모노-C1-C10 알콕시 또는 그의 아릴옥시 유도체이다 (미국 특허 번호 제5,252,714호를 참고한다). 본원에서 사용되는 바, PEG는 다른 단백질을 유도체화시키는데 사용된 PEG 형태의 임의의 것, 예컨대, 모노-(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 의미를 갖는다. 중합체는 분지형이거나 비분지형일 수 있다. 최종 생성물 제제의 치료적 용도를 위해, 중합체는 제약상 허용되는 것이 바람직하다.
제약 조성물
본 발명은 제약상 허용되는 희석제, 안정화제, 방부제, 가용화제, 유화제, 애주번트 및/또는 담체와 함께, 유효량의 본 발명의 단백질 또는 유도체 생성물을 포함하는 제약 조성물을 고려한다. 그러한 조성물로는 완충제 내용물 (예컨대, 트리스-HCl, 인산염), pH 및 이온 강도가 다양한 희석제; 첨가제, 예컨대, 계면활성제 및 가용화제 (예컨대, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80), 항-산화제 (예컨대, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 방부제 (예컨대, 티메로솔, 벤질 알콜) 및 벌크화 물질 (예컨대, 락토스, 만닛톨)을 포함한다; 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) pages 1435:1712]를 참고할 수 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 활성 성분의 유효량은 치료적, 예방적, 또는 진단적 유효량인 양으로서, 이는 체중, 연령 및 치료적 목적과 같은 인자를 고려함으로써 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명의 중합체-단백질 조성물은 또한 용액의 pH를 원하는 범위 내에 존재하도록 유지시켜 주는 완충제를 포함할 수 있다. 바람직한 제제로는 아세트산나트륨, 인산나트륨, 및 시트르산나트륨을 포함한다. 이러한 완충제의 혼합물 또한 사용될 수 있다. 조성물에서 유용한 완충제의 양은 대개 사용되는 특정 완충액 및 용액의 pH에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 아세테이트는 pH 6보다는 pH 5에서 보다 더 효능이 있는 완충액인 바, 아세테이트는 pH 6보다는 pH 5의 용액에서 더 소량으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 대하여 바람직한 pH 범위는 pH 3.0-7.5이다.
본 발명의 조성물은 용액이 등장성이 되도록 만들고, 주사용으로서 보다 더 적합하도록 하기 위해 등장성-조절제를 추가로 포함할 수 있다. 가장 바람직한 제제는 농도 범위가 0-150 mM인 염화나트륨이다.
본원에 기술된 방법은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 비히클, 및 임의로 다른 치료적 및/또는 예방적 성분과 함께 상기 기술된 분자를 포함하는 제약 조성물을 사용한다. 그러한 부형제로는 액체, 예컨대, 물, 염수, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루론산, 에탄올, 시클로덱스트린, 변형된 시클로덱스트린 (즉, 술포부틸 에테르 시클로덱스트린) 등을 포함한다. 비-액체 제제용으로 적합한 부형제 또한 당업자에게 공지되어 있다.
제약상 허용되는 염이 본 발명의 조성물 중에 사용될 수 있고, 예를 들어, 무기산 염, 예컨대, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산 염, 예컨대, 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제 및 염에 대한 전반적인 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)]에서 이용가능하다.
추가로, 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제, 생물학상 완충화 물질, 계면활성제 등이 상기 비히클 중에 존재할 수 있다. 생물학상 완충액은 사실상 약리학상 허용되며, 원하는 pH, 즉, 생리학상 허용되는 범위의 pH를 갖는 제제를 제공할 수 있는 임의의 용액일 수 있다. 완충액의 예로는 염수, 인산염 완충처리된 염수, 트리스 완충처리된 염수, 행크스(Hank's) 완충처리된 염수 등을 포함한다.
키트
키트 또한 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 전형적인 키트는 표준 개수의 중합체가 부착되어 있는 단백질-중합체 복합체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 키트는 단백질 또는 중합체에 특이적으로 결합하는 결합제를 추가로 포함하는데, 여기서, 결합제는 항체, 가용성 수용체, 리간드, 보조인자, 또는 단백질 또는 중합체에 특이적으로 결합하는 또 다른 제제이다. 키트는 중합체-단백질 복합체의 검출을 위해 샘플 제조용 시약 및 완충액을 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면 및 상세한 설명은 하기 실시예로부터 자명해질 것이나, 이러한 실시예는 제한한다기보다는 예시적인 것으로서 의도된 것이다.
실시예
실시예
1 인간 혈청 알부민의
PEG
화
NIR을 사용하여 단백질 상의 수용성 중합체의 정도를 측정하기 위해, 분자량이 알려진 단백질을 크기가 알려진 PEG에 접합시켰다. 선형 PEG 숙신이미딜 숙시네이트 (PEG-SS/쇄 길이: 5 kDa) (대한민국 안양시 소재의 선바이오 인크.(SunBio Inc.))를 사용하여 리신 잔기를 통해 인간 혈청 알부민을 PEG화시켰다. 25 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 6.2) 중 HSA (농도: 10 mg/ml)의 용액을 제조하고, PEG-SS를 첨가하여 단백질 1 mg당 시약 120 mg의 최종 농도를 수득하였다. 혼합물을 완만하게 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 10분 동안 반응 시간 후, 0.5 M NaOH를 적가하여 pH를 pH 6.2로 조정하였다. 이어서, 1 cm/분의 선형 유속을 사용하여 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 접합체를 정제하였다. DEAE-세파로스 FF로 충진된 파마시아(Pharmacia) XK26 칼럼 (26 mm x 155 mm) (미국 위스콘신주 워키쇼 소재의 GE 헬쓰케어(GE Healthcare))에 200 ml의 반응 혼합물을 적용시키고, 10 칼럼 부피 (CV) 출발 완충액 (25 mM 아세트산나트륨 (pH 6.2))을 사용하여 칼럼을 평형화시켰다. 25 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.5)을 사용하여 PEG-HSA 접합체를 칼럼으로부터 용리시키고, 280 nm에서의 OD를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다.
실시예
2
PEG
화 정도가 다른
HSA
종의 제조
PEG화 정도가 다른 HSA 종을 제조하기 위해, 선형 PEG 숙신이미딜 숙시네이트 (쇄 길이: 5 kDa) 및 다른 양의 시약을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 리신 잔기를 통해 인간 혈청 알부민을 PEG화시켰다. 25 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 6.2) 중 HSA (농도: 10 mg/ml)의 용액을 제조하고, PEG-SS를 첨가하여 단백질 1 mg당 시약 30, 60, 90 및 120 mg의 최종 농도를 수득하였다. 이어서, DEAE-세파로스 FF 상에서 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 접합체를 정제하였다. 25 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.5)을 사용하여 PEG-HSA 접합체를 칼럼으로부터 용리시키고, 280 nm에서의 OD를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 최종적으로, 비색 방법 (문헌 [Nag et al., Anal Biochem 250:35-43, 1997])에 의해 PEG화 정도를 추정하고, mol PEG/mol 단백질로 표시하였다. 상이한 HSA 제제에 대해, PEG화 정도는 단백질 1 mol당 2, 3, 4, 및 5 mole PEG (시약의 양: 단백질 1 mg당 30, 60, 90, 120 mg)인 것으로 측정되었다. 이러한 결과는 하기 실시예 3 및 4에 따른 NIRVIS 방법을 사용하여 PEG화 정도를 측정함으로써 확인되었다.
실시예
3
PEG
화의 프로세스 제어
NIR-분광 분석법의 한 가지 강점은 중합체 접합 반응의 부착을 제어하고, 접합된 분자 상의 중합체의 양을 측정할 수 있다는 것이다. 하기 실시예는 인간 혈청 알부민의 샘플의 PEG화를 분석하기 위해 NIR을 적용시키는 것을 입증한다.
4,008 cm-1 내지 9,996 cm-1 (2,500 nm 내지 1,000 nm)의 스펙트럼 범위에서 표준 NIR 분광계를 사용하여 (상기 기술된 바와 같은) 수용액 중에서 PEG화가 이루어지는 대략 1시간이라는 전체 반응 시간 동안 반사투과 (transflection)형 방식으로 연속하여 NIR 스펙트럼을 수집하였다. 반사투과는 샘플을 통과하는 광 투과량을 측정하는 것인데, 여기서, 광은 샘플 통과 후 샘플 뒤쪽의 반사면에 접촉하게 됨으로써 입사광은 샘플을 2회에 걸쳐 통과하게 되어 있었다.
상기 스펙트럼 세트로부터 PEG 첨가 이전 (값 = 0) 및 반응 종결 시 (값 = 1)에 적절한 개수의 스펙트럼을 선택하여, 당업계에 보편적으로 알려져 있는 바와 같은 데이터 전처리로서 다중 산란 보정 (MSC) 및 부분 최소 자승 (PLS)-알고리즘을 사용하여 분광계의 화학측정 소프트웨어에 의해 보정 곡선을 계산했다.
이러한 보정 모델을 사용하여 반응 동안 수집된 나머지 스펙트럼을 예측하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, PEG-시약 첨가 후 뚜렷한 로그 형태가 얻어졌다.
상기 실험은 PEG화 반응 동안 PEG화 진행을 예측하기 위한 보정 모델 작성이 NIR 분광법의 사용으로 가능하다는 것을 입증한다.
실시예
4
PEG
화의 화학측정에 의한 측정
단백질-결합 PEG를 측정할 수 있는 NIR 방법의 능력을 입증하기 위해, 실시예 2의 조건을 사용함으로써 수득된 PEG화된 HSA 용액을 사용하여 일련의 희석액을 제조하였다. 문헌 [Nag et al., (Anal Biochem 250:35-43, 1997)]의 방법에 따라 PEG화 정도를 측정하고, 질량 분광 분석법에 의해 확인하였다. NIR에 의해 상기 희석액을 분석하고, 표준 NIR-분광계에 의해 대표적인 개수의 근적외선 스펙트럼을 수집하였다. 4,008 cm-1 내지 9,996 cm-1 (2,500 nm 내지 1,000 nm)의 스펙트럼 범위에서 반사투과형 방식으로 스펙트럼을 측정하였다.
수집된 이들 데이터로부터, 데이터 전처리로서 1차 도함수 BCAP 및 PLS-알고리즘을 사용하여 분광계의 화학측정 소프트웨어에 의해 보정 모델을 계산하였다. 이러한 계산 결과를 도 2에 나타내었다.
결과에 제시된 바와 같이, PEG 결합형의 "측정 반응"과 PEG 결합형의 "예측 반응" 사이에는 강력한 상관관계가 존재하였다. 피어슨(Pearson) 상관 계수는 0.996에 달하며, P 값은 0.000이었다. 저농도 범위에서 (용액 1 및 2, 도 2 참조) PEG 분자의 참값에 대한 PEG 분자의 예측값의 평균 편차는 17% 및 6%였다. 고농도 범위에서 (용액 3 및 4, 도 2 참조) 참값으로부터의 평균 편차는 용액 3의 경우 0.8%, 용액 4의 경우 1.4%로 더 낮았다.
이러한 결과는 NIR 방법에 의해 수득된 측정 반응이 샘플 중 단백질-결합 PEG 수준과 우수한 상관관계에 있음을 입증한다. 이는 본 방법이 단백질 분자 상의 PEG화 정도를 예측할 수 있고, 단백질 분자 상의 PEG화 및 다른 중합체 접합의 개수 및 정도를 측정하는데 유용하다는 것을 암시한다.
상기 예시된 실시예에서 기술된 바와 같이, 당업자에게 본 발명에서 많은 수정과 변형이 이루어질 수 있다는 것을 예측할 수 있다. 따라서, 본 발명은 오직 첨부되는 특허청구범위에 기재된 것에 의해서만 제한될 것이다.
Claims (18)
- 샘플을 근적외선 스펙트럼 광원과 접촉시키고, 근적외선 파장 범위에 걸쳐 상대 흡광도 수준을 측정하고,
파장 또는 파수 스펙트럼에 기초하여 단백질 또는 단백질 복합체에 접합된 중합체 분자의 개수를 측정하되, 이때, 샘플의 스펙트럼을, 단백질 또는 단백질 복합체에 접합된 중합체 분자의 양이 공지되어 있는 미리 계산된 표준과 비교하는 것을 포함하는, 샘플 중 단백질 또는 단백질 복합체에 접합된 생리학상 허용되는 중합체 부분 (moiety)의 개수를 측정하는 방법. - 제1항에 있어서, 접촉시키는 것이 상기 샘플로부터의 반사 방사선을 다수의 시간-의존성 흡광도 스펙트럼으로서 측정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 비교하는 것이 공지 샘플의 근적외선 흡수 스펙트럼 다수로부터 보정 데이터 행렬을 작성하고, 중합체-단백질 접합체를 포함하는 샘플의 분광법 측정치를 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 근적외선 파장이 680 nm 내지 2,500 nm 범위인 방법.
- 제4항에 있어서, 파장이 680 nm 내지 1,100 nm인 방법.
- 제4항에 있어서, 파장이 1,100 nm 내지 2,500 nm인 방법.
- 제4항에 있어서, 파장이 1,000 nm 내지 2,500 nm인 방법.
- 제1항에 있어서, 생리학상 허용되는 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 방법.
- 제8항에 있어서, PEG의 분자량 범위가 약 3 kDa 내지 약 100 kDa인 방법.
- 제8항에 있어서, PEG의 분자량 범위가 약 5 kDa 내지 약 60 kDa인 방법.
- 제8항에 있어서, PEG의 분자량 범위가 약 5 kDa 내지 약 40 kDa인 방법.
- 제8항에 있어서, PEG의 분자량 범위가 약 5 kDa 내지 약 15 kDa인 방법.
- 제8항에 있어서, PEG의 분자량 범위가 약 5 kDa 내지 약 10 kDa인 방법.
- 제1항에 있어서, 단백질 또는 단백질 복합체가 치료적 응고 단백질 또는 치료적 응고 단백질 복합체인 방법.
- 제1항에 있어서, 단백질 또는 단백질 복합체가 인자 II, 인자 III, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX , 인자 X, 인자 XI, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand Factor) 및 피브리노겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 인자를 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 단백질이 폰 빌레브란트 인자인 방법.
- 제15항에 있어서, 단백질 복합체가 폰 빌레브란트 인자 및 인자 VIII을 포함하는 것인 방법.
- 단백질을 생리학상 허용되는 분자에 접합시켜 중합체-단백질 복합체의 샘플을 제조하고;
중합체-단백질 복합체에 대해 제1항의 방법을 수행하고;
샘플 중에서, 근적외선 흡광도 스펙트럼에 기초하여 동일한 개수의 중합체 분자를 가지는 화합물들을 단리시키는 것을 포함하는, 단백질 또는 단백질 복합체 상에 균일한 개수의 생리학상 허용되는 중합체 분자를 가진 조성물을 제조하는 방법.
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