JP5066498B2 - アッセイ方法 - Google Patents
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Description
前記披験物質または前記特異的結合物質のいずれか一方と結合可能な物質で修飾した標識物質の複合体からの標識物質シグナルを検出することが好ましい。前記複数の液体が増幅溶液を含み場合には、該増幅溶液の送液によって増幅された前記標識物質の複合体からの標識物質シグナルを検出することが好ましい。
前記標識物質は金属微粒子を含む物質からなることが好ましい。この場合、前記増幅溶液が銀イオンを含む液体であることが好ましい。
前記試薬溶液として、前記増幅溶液に含まれる銀イオンの還元剤を含む液体を用いることが好ましい。
以下、本発明のアッセイ方法に用いられる検体溶液、試薬溶液などの各種溶液、標識物質、不溶性担体等について説明する。
本発明のアッセイ方法で分析することのできる検体溶液としては、被験物質(天然物、毒素、ホルモンまたは農薬等の生理活性物質あるいは環境汚染物質等)を含む可能性のあるものである限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(特にヒト)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体(スワブ)、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を後述の希釈液で希釈したもの等を挙げることができる。
本発明で使用することができる標識物質としては、一般的なイムノクロマトグラフ法で用いられるような金属微粒子、着色ラテックス粒子、酵素など、有色で視認できる、または、反応により検出できるようになる標識物であれば特に限定されることなく用いることができるが、標識物質を触媒とした金属イオンの還元反応によって、標識物質への金属の沈着でシグナルを増幅する場合には、その触媒活性の観点から金属微粒子が好ましい。
特異的結合物質としては、被検物質に対して親和性を持つものならば特に限定されることはなく、一例として抗体を挙げることができる。例えば、その被験物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被験物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、又はFv]を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
本発明のアッセイ方法が、標識物質として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるアッセイ方法による場合には、金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、被験物質と標識物質の複合体の形成後に、無機銀塩、有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が金属系標識を核として金属系標識上に沈着するので、金属系標識が増幅され、被験物質の分析を高感度に実施することができる。
イムノクロマトグラフ用ストリップは図2および3に示すように、被験物質と結合可能な特異的結合物質を含む少なくとも1つの検出ラインを有する担体であり、展開方向の上流から下流に向かって、試料添加パッド、標識物質保持パッド、クロマトグラフ担体、及び吸収パッドに分画され、この順に、粘着シート上に配置されてなる。イムノクロマトグラフ用ストリップの材質は、多孔性であることが好ましく、例えば、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましく挙げられる(なお、各パッド、クロマトグラフ担体のより好ましい材質は下記にそれぞれ記載する)。
送液用不溶性担体は、洗浄液を添加できれば特に限定されるものではなく、グラスファイバーパッドやセルロースメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。
吸収用不溶性担体は、洗浄液を吸水することができる物質であれば特に限定されるものではなく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。
試薬溶液は、増幅溶液や検出溶液の補足的な役割を持つ薬品を含む溶液を意味し、例えば、増幅溶液が後述する銀イオン溶液である場合には、その銀イオンの還元剤となるハイドロキノンや2価鉄イオン溶液などが挙げられる。ペルオキシダーゼ酵素での増幅をする場合には、過酸化水素の溶液が試薬溶液となる。また、アッセイ系において洗浄機能を有する洗浄液もこれに含まれる。
増幅溶液は、含まれる薬剤が標識物質や被験物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる溶液であり、例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。
以下、増幅溶液として銀イオンを含む化合物と銀イオンの還元剤等について説明する。
銀イオン含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に0.001モル/m2〜0.2モル/m2、好ましくは0.01モル/m2〜0.05モル/m2含有されることが好ましい。
銀イオンの還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe2+を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
色素増幅液は、非特許文献「臨床検査 Vol.41 no.9 1020 H2O2-POD系を利用した染色」に記載されているような、西洋わさびペルオキシダーゼ検出の発色基質などを、好適に用いることがでる。また、特願2007-332287号記載の発色基質は特に好ましく用いることができる。
検出溶液とは、含まれる薬剤が標識物質や被験物質などと反応し、変色、着色した化合物の生成、発光等の変化が生じる溶液を意味例えば、被験物質であるカルシウムイオンと錯体化することで呈色するオルソクレゾールフタレインコンプレキソンや、被験物質であるタンパク質と反応し変色する銅イオン溶液などが挙げられる。また、被験物質に対して特異的に結合する標識化された複合体の溶液もこれに含まれる。例えば、ハイブリダイゼーションによりDNAやRNAを検出する標識化DNAや標識化RNA、抗原を検出する抗体感作粒子や抗体標識化酵素などが挙げられる。
増幅溶液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なpHに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。
以下に本発明のアッセイ方法を実施例を用いてさらに詳細に説明する。
(1-1) 抗インフルエンザA型B型抗体修飾金コロイドの作製
(1-1-1) 抗インフルエンザA型抗体修飾金コロイドの作製
直径50nm金コロイド溶液(EM.GC50、BBI社)9mlに50mM KH2PO4バッファー(pH 7.5)1mlを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、90μg/mlの抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社)溶液1mlを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール(PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬)水溶液を550μl加え攪拌し、続いて10%牛血清アルブミン(BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA)水溶液を1.1ml加え攪拌した。この溶液を8000×g、4℃、30分間遠心(himacCF16RX、日立)した後、1ml程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20mlの金コロイド保存液(20mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG(Mw.20000), 150mM NaCl, 1% BSA, 0.1%NaN3)に分散し、再び8000×g、4℃、30分間遠心した後、1ml程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド(50nm)溶液を得た。
直径50nm金コロイド溶液(EM.GC50、BBI社)9mlに50mM KH2PO4バッファー(pH 8.0 )1mlを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、80μg/mlの抗インフルエンザB型モノクローナル抗体(MONOTOPE aby Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.)溶液1mlを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール(PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬)水溶液を550μl加え攪拌し、続いて10%牛血清アルブミン(BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA)水溶液を1.1ml加え攪拌した。この溶液を8000×g、4℃、30分間遠心(himacCF16RX、日立)した後、1ml程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20mlの金コロイド保存液(20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG(Mw.20000), 150mM NaCl,1%BSA, 0.1 % NaN3)に分散し、再び8000×g、4℃、30分間遠心した後、1ml程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド(50nm)溶液を得た。
(1-1)で作製したインフルエンザA型、B型抗体修飾金コロイドを、1:1で混合し、金コロイド塗布液(20mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG(Mw.20000), 5%スクロース)及び水により希釈し、520nmのOD(optical density)が3.0となるように希釈した。この溶液を、8mm×150mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社)1枚あたり0.8mlずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
25mm×200mmに切断したニトロセルロースメンブレン(プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社)に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にし、下から7mmの位置に、1.5mg/mlとなるように調製した固定化用抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社)溶液をインクジェット方式の塗布機(BioDot社)を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から10mmの位置に、1.5mg/mlとなるように調製した固定化用抗インフルエンザB型モノクローナル抗体(MONOTOPE aby Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.)溶液を幅0.7mm程度のライン状に塗布した。さらに同様に、下から13 mmの位置に、0.5mg/mlとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体(抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬)溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液(0.5 w%カゼイン(乳由来、品番030-01505、和光純薬)含有50mMホウ酸バッファー(pH 8.5))500mlをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液(0.5w%スクロースおよび0.05w%コール酸ナトリウムを含む50mM Tris-HCl(pH 7.5)バッファー)500mlに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレン(ライン塗布)とした。
バック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)に、(1-3)で作製した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗インフルエンザA型抗体ライン側を下側とした。抗体固定化メンブレンの下側に約2mm重なるように(1-2)で作製した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約4mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド(18mm×150mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5mm重なるように吸収パッド(80 mm×150 mmに切ったセルロース・グラス膜(CF6、ワットマン社))を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材(イムノクロマト本体部材)を、部材の長辺側を15mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター(CM4000、ニップンテクノクラスタ社)で切断していくことで、15mm×55mmのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
(1-5-1)還元剤溶液の作製
水290gに、硝酸鉄(III)九水和物(和光純薬、095-00995)を水に溶解して作製した1mol/lの硝酸鉄水溶液23.6ml、クエン酸(和光純薬、038-06925)13.1gを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸(10重量%)を36ml加え、硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物(和光純薬、091-00855)を60.8g加えこれを還元剤溶液とした。
水66gに、硝酸銀溶液8ml(10gの硝酸銀を含む)と1mol/lの硝酸鉄水溶液24mlを加えた。さらに、この溶液と、硝酸(10重量%)5.9ml、ドデシルアミン(和光純薬、123-00246)0.1g、界面活性剤C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50H 0.1gをあらかじめ47.6gの水に溶解した溶液を混合し、これを銀イオン溶液とした。
4-クロロナフトールが0.6mM、過酸化水素が200mM、下記構造で表す化合物が1.2mMとなるようにpH9.3に調整したリン酸水素2ナトリウム-NaOHバッファー水溶液で希釈し、10mlとなるように混合液を作製した。その際4-クロロナフトールの溶解を促すために100μlのアセトニトリルを滴下し、これを色素増幅溶液とした。
(デバイスのセッティング)
図1に示したイムノクロマトグラフキットを用いて実験を行った。図1の第1のデバイス部品11に(1-4)で作製したイムノクロマトグラフストリップを取り付け、第2のデバイス部品12に、送液用不溶性担体2(18 mm×8mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社)に13mm×8mmのバック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)を貼ったもの、および吸収用不溶性担体3(25mm×8mmに切ったセルロースメンブレン(CF6、ワットマン社)に20mm×8mmに切ったバック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)を貼ったものをそれぞれ取り付けた。
検体液として、クイックS-インフルA・B「生研」陰性/陽性コントロール(品番322968、デンカ生研)を使用した。1質量%BSAを含むPBSバッファーでこの陽性コントロール液を希釈した。市販イムノクロマト検出キット「キャピリアFluA・B」(アルフレッサファーマ)によるクイックS-インフルA・B「生研」の検出限界はA型B型ともに1/40であったが、ここでは1質量%BSAを含むPBSバッファーで、この陽性コントロールを1/200に希釈し、これを検体液として用いた。(1-4)で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに、検体液300μlを均一になるように滴下し、10分静置した。
抗原液を10分間展開した後、図1に示した第1のデバイス部品11の液体貯蔵ポッド13に(1-5-1)で作製した還元剤溶液500μlを入れた。第1のデバイス部品11を第2のデバイス部品13に向かい合わせて閉じて、送液用不溶性担体2の端を液体貯蔵ポッド13の還元剤溶液に浸すとともに、送液用不溶性担体2及び吸収用不溶性担体3をイムノクロマトグラフストリップ1に長手方向横から装着した。こうして還元剤溶液をイムノクロマトグラフストリップ1に展開させ3分間送液した。この工程によりイムノクロマトグラフストリップ1が還元剤溶液に浸され、さらに特異的に吸着していない材料が洗浄された。
第2のデバイス部品12に設けられた点着孔15から(1-5-2)で作製した銀イオン溶液を滴下し、検出ラインに吸着された金コロイド標識を1分間増幅した。増幅後、イムノクロマトグラフストリップ1を取り出し、3分間水洗した。
(洗浄)までは実施例1と同様に操作し、(増幅溶液によるシグナル増幅)において、第1のデバイス部品11に設けられた液体貯蔵ポッド13の還元剤溶液の残液を廃却し、空になった液体貯蔵ポッド13に(1-5-2)で作製した銀イオン溶液を500μl入れ、送液用不溶性担体2から吸収用不溶性担体3に向けて送液し、検出ラインに吸着された金コロイド標識を1分間増幅した。増幅後、イムノクロマトグラフストリップ1を取り出し、3分間水洗した。
(洗浄)までは実施例1と同様に操作し、(増幅溶液によるシグナル増幅)において、第1のデバイス部品11に設けられた液体貯蔵ポッド13の還元剤溶液の残液を廃却し、空になった液体貯蔵ポッド13に(1-5-2)で作製した銀イオン溶液と還元剤溶液を1対4の割合で混合し作製した増幅溶液を500μl入れ、送液用不溶性担体2から吸収用不溶性担体3に向けて送液し、検出ラインに吸着された金コロイド標識を1分間増幅した。増幅後、イムノクロマトグラフストリップ1を取り出し、3分間水洗した。
水洗後のイムノクロマトグラフストリップ1をルミノイメージアナライザー(LAS-4000富士フイルム社製)のDigitzeEPIモードで撮影し、検出ラインの光学濃度(ピークのバックグラウンドとのΔAbs.)を、イムノクロマトグラフストリップの呈色していない部分に相当する位置の出力信号強度T0、検出ラインの出力信号強度Tiとして、下記式に基づいて吸光度ABSを算出し、予め作成した検量特性線を参照して検体中に含まれる披験物質の濃度を求めた。
ABS=log(T0/Ti)
また、目視により、増幅の濃淡のムラを評価した。送液の方向と評価結果をまとめたものを表1に示す。なお、表中のA、B、Cの方向は図4に示す送液方向である。また、表中の濃度(mABS)はミリABS(1000×ABS)である。
(抗原液の点着・展開)
検体液として、クイックS-インフルA・B「生研」陰性/陽性コントロール(品番322968、デンカ生研)を使用した。1質量%BSAを含むPBSバッファーでこの陽性コントロール液を1/80に希釈し検体液とした。実施例1と同様に、デバイスをセッティングし、図1に示した第1のデバイス部品11の液体貯蔵ポッド13に上記検体液500μlを入れた。第2のデバイス部品12を第1のデバイス部品11に向かい合わせて閉じ、送液用不溶性担体2の端を液体貯蔵ポッド13の端を液体貯蔵ポッド13の検体液に浸すとともに、送液用不溶性担体2及び吸収用不溶性担体3をイムノクロマトグラフストリップに長手方向横から装着した。こうして検体液をイムノクロマトグラフストリップ1に展開させ10分間送液した。
(1-4)で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに、1質量%BSAを含むPBSバッファーを300μl均一になるように滴下し、金コロイド抗体指示パッドに固定化されている金コロイド標識抗体を展開し、10分間静置した。
第2のデバイス部品12の点着孔15から(1-6)で作製した色素増幅溶液を滴下し、検出ラインに吸着された金コロイド標識を1分間増幅した。増幅後、イムノクロマトグラフ用ストリップを取り出し、3分間水洗した。
実施例2において、抗原希釈液の倍率を1/120、1/140、1/160とした以外は実施例2と同様にしてイムノクロマトグラフ用ストリップを得た。
実施例2の(抗原液の点着・展開)の代わりに、(1-4)で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに、実施例2で準備した検体液を300μl均一になるように滴下し、20分間静置した他は、実施例2と同様にしてイムノクロマトグラフ用ストリップを得た。
比較例3において、抗原希釈液の倍率を1/120、1/140、1/160とした以外は比較例3と同様にしてイムノクロマトグラフ用ストリップを得た。
2 送液用不溶性担体
3 吸収用不溶性担体
4 試料添加パッド
5 標識物質保持パッド
6 クロマトグラフ担体
6a 検出ライン
7 吸収パッド
8 粘着シ−ト
10 イムノクロマトグラフキット
11 第1のデバイス部品
12 第2のデバイス部品
13 液体貯蔵ポッド
14 位置決め部材
15 点着孔
Claims (7)
- 少なくとも1以上の被験物質を含有する検体溶液と、
洗浄液、増幅溶液または検出溶液のいずれか2種類以上の液体とを含む、
3種類以上の複数の液体を、前記被験物質に対する特異的結合物質を含有する検出部位に送液することによって、前記検体溶液中に含まれる前記被験物質の定性または定量を行うアッセイ方法であって、
前記複数の液体全ての送液方向が異なっており、かつ前記複数の液体を前記検出部位上で交差させることを特徴とし、
さらに、前記披験物質または前記特異的結合物質のいずれか一方と結合可能な物質で修飾した標識物質の複合体からの標識物質シグナルを検出するものであり、
前記複数の液体が増幅溶液を含み、該増幅溶液の送液によって増幅された前記標識物質の複合体からの標識物質シグナルを検出することを特徴とするアッセイ方法。 - 前記検出部位が不溶性担体上に形成されており、前記送液が前記不溶性担体による毛細管力により行われることを特徴とする請求項1記載のアッセイ方法。
- 前記複数の液体が、前記検体溶液、前記洗浄液、前記増幅溶液および前記検出溶液であって、
前記検体溶液を前記不溶性担体に送液し、
前記洗浄液を送液するための送液用不溶性担体および前記洗浄液を吸収するための吸収用不溶性担体をそれぞれ前記不溶性担体に接触させ、
前記洗浄液を送液することによって、前記不溶性担体上の検出部位に特異的に結合した前記標識物質以外を洗浄し、
前記増幅溶液および前記検出溶液を、前記検体溶液および前記洗浄液の交差部位に送液することを特徴とする請求項1記載のアッセイ方法。 - 前記不溶性担体が帯状であって、該不溶性担体の主面に対して前記増幅溶液の送液方向が垂直方向であることを特徴とする請求項3記載のアッセイ方法。
- 前記標識物質が金属微粒子を含む物質からなることを特徴とする請求項1〜4いずれか1項記載のアッセイ方法。
- 前記増幅溶液が銀イオンを含む液体であることを特徴とする請求項5記載のアッセイ方法。
- 前記洗浄液として、前記増幅溶液に含まれる銀イオンの還元剤を含む液体を用いることを特徴とする請求項6記載のアッセイ方法。
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