JP5683543B2 - クロマトグラフキット及びクロマトグラフ方法 - Google Patents

Description

本発明は、検出感度を高めるためのシグナル増幅操作を行うクロマトグラフキット及びクロマトグラフ方法に関する。

免疫測定方法の中でもイムノクロマトグラフ法は、操作が簡便であり、短時間で測定可能であることから、一般的によく利用されている。イムノクロマトグラフ法で用いられている免疫反応としては、競合的反応又はサンドイッチ型反応が広く使われている。その中でも、イムノクロマトグラフ法ではサンドイッチ型反応が主流であり、その典型例においては、試料中の抗原よりなる被検物質を検出するために、以下のような操作が行われる。まず、被検物質である抗原に対する抗体により感作させた微粒子を固相微粒子としてクロマトグラフ担体に固定化することにより、あるいはこの抗体そのものをクロマトグラフ担体に直接固定化することにより、反応部位を有するクロマトグラフ担体を調製する。一方、標識微粒子に被検物質と特異的に結合可能な抗体を感作させて感作標識微粒子を調製する。この感作標識微粒子を試料と共に、クロマトグラフ担体上でクロマトグラフ的に移動させる。以上の操作により、クロマトグラフ担体に形成された反応部位において、固定化された抗体が固定化試薬となり、これに被検物質である抗原を介して感作標識微粒子が特異的に結合する。その結果、感作標識微粒子が反応部位に捕捉されることになり、それにより生ずるシグナルの有無または程度を目視で判定することにより、試料中の被検物質の存在の有無または量を測定することができる。

イムノクロマトグラフ法の中には、感度が低いために抗原が検出されない(偽陰性)問題を回避するために、検出シグナルを増幅させる方法が行われる場合がある。シグナル増幅の方法として、標識としてアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素を用いる場合があるが、金属コロイド標識及び金属硫化物標識からなる群から選んだ標識に銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感すること(銀増幅)によって検出を行う場合もある。上記のような増幅を用いたイムノクロマトグラフは、特許文献１から３及び非特許文献１などに記載されており、特に特許文献２及び特許文献３には、２液の増幅液を用いて増幅を行うことが記載されている。しかし、特許文献２及び特許文献３には、２液の増幅液を用いて増幅を行う際に、２液目の添加を開始するタイミングを判断するための手段については記載がない。

特開２００２−２０２３０７号公報 特開２０１０−７１８２７号公報 特開２０１１−９９７２４号公報

Journal of Chromatography, 878 (2010) 271-277

上記の通り、クロマトグラフ法においては、増幅を触媒する液と増幅を行う液の２液を用いて増幅を行う場合がある。この場合、クロマトグラフ担体上の増幅させたい部位が第１番目の液で満たされていなければならないが、支持体の長さやフローレート及び外部環境の温度などにより第１番目の液（還元剤など）の流れる速度が変化してしまう。そのため、第２番目の液の添加時期を時間で指定すると、第１番目の液で満たされる前に第２番目の液を添加して、増幅不良が生じたり、増幅不良の発生を防ぐために第２番目の液の添加時期を必要以上に遅く設定する必要が生じるという問題があった。また、屋外での測定や、大量の検体を短期間に測定する場合など、必要な数の時計が準備できない状況も想定される。

即ち、本発明は、クロマトグラフ担体上の増幅させたい部位が第１番目の液で満たされていることを容易に確認でき、第１番目の液で満たされる前に第２番目の液を添加することによる増幅不良が生じることを防止できるような、クロマトグラフキット及びクロマトグラフ方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、増幅を触媒する液と増幅を行う液の２液を用いて増幅を行うクロマトグラフキット及びクロマトグラフ方法において、増幅を行う液を添加するタイミングを視覚的に知らしめるための手段を設けることによって、増幅不良の発生を防止することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、
（１）被検物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質を有する標識物質保持領域と、
（２）被検物質に対する第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質を有する標識物質捕捉領域とを、
被検物質を含む被検試料の展開方向に対して上流方向から下流方向にこの順番で有し、さらに
（３）上記標識物質を検出する際に標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうちの第１の増幅試薬を検出するための発色試薬を有する領域とを、
有する、クロマトグラフキットが提供される。

好ましくは、発色試薬を有する領域は、上記標識物質捕捉領域より下流に位置している。
好ましくは、上記発色試薬は、イオンに反応して発色する化合物である。
好ましくは、上記発色試薬は、Fe²⁺イオンと反応して発色する化合物である。
好ましくは、上記発色試薬は、フェナントロリン骨格を有する化合物である。
好ましくは、上記発色試薬は、H⁺イオンと反応して発色する化合物である。
好ましくは、上記標識物質は金属コロイドである。
好ましくは、上記金属コロイドは金コロイドである。
好ましくは、本発明のクロマトグラフキットは、標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬を内蔵している。

好ましくは、第１の増幅試薬は、銀イオンのための還元剤であり、第２の増幅試薬が、銀を含む化合物である。
好ましくは、第１の増幅試薬は、２価の鉄イオンを含む試薬である。
好ましくは、クロマトグラフキットは、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド、標識物質捕捉領域を有する結合物質固定化メンブレン、及び吸水パッドを少なくとも含み、上記発色試薬が、結合物質固定化メンブレンに担持されている。
好ましくは、上記発色試薬は、被検試料を含む水溶液または第１の増幅試薬を含む水溶液のいずれかを展開した際に、結合物質固定化メンブレン中を実質的に移動しない発色試薬である。

更に本発明によれば、
（１）被検物質と、
上記被検物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質と
の複合体を形成させた状態で展開し、上記被検物質に対する第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質、を有する標識物質捕捉領域において標識物質を捕捉する工程；
（２）上記標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうちの第１の増幅試薬を、標識物質捕捉領域の上流方向から標識物質捕捉領域の下流方向に展開する工程；
（３）発色試薬を有する領域における物理又は化学的変化を検出することによって、標識物質捕捉領域が第１の増幅試薬で満たされていることを確認する工程；及び
（４）標識物質捕捉領域が第１の増幅試薬で満たされていることを確認した後に、上記２種の増幅試薬のうちの第２の増幅試薬が標識物質捕捉領域を満たす工程；
を含む、クロマトグラフ方法が提供される。

好ましくは、第１の増幅試薬は、銀イオンのための還元剤であり、第２の増幅試薬が、銀を含む化合物である。
好ましくは、第１の増幅試薬は、２価の鉄イオンを含む試薬である。

本発明のクロマトグラフキット及びクロマトグラフ方法によれば、増幅を行う液を添加するタイミングを視覚的に知らしめるための手段を設けることによって、増幅不良の発生を防止することができる。

図１は、実施例１で使用したキットの実施態様を示す。本発明のキットの外部を構成する上部の部材には、第２の増幅試薬である銀イオン溶液充填孔が設けられている。下部の部材には、第１の増幅試薬である還元剤溶液を送液するためのパッド、標識物質保持領域である金コロイド保持パッド、標識物質捕捉領域である抗体固定化ラインを有する抗体固定化メンブレン、及び発色試薬を有する領域である吸水パッドが、粘着シート上にこの順に配置されている。図１に示されているように、被検物質を含む被検試料の展開方向に対して、上流、下流と定義する。 図２は、実施例２及び実施例３で使用したキットの実施態様を示す。本発明のキットの外部を構成する上部の部材には、第２の増幅試薬である銀イオン溶液充填孔、及び第１の増幅試薬である還元剤溶液添加孔、が設けられている。下部の部材には、第１の増幅試薬である還元剤溶液を送液するためのパッド、標識物質保持領域である金コロイド保持パッド、標識物質捕捉領域である抗体固定化ラインと発色試薬を有する領域である発色試薬固定化ラインとを有する抗体固定化メンブレン、及び吸水パッドが、粘着シート上にこの順に配置されている。図１と同様に、被検物質を含む被検試料の展開方向に対して、上流、下流と定義する。

本発明のクロマトグラフキット及びクロマトグラフ方法においては、被検物質の検出感度を高めることを目的として増幅操作を行う際に使用する２種の増幅試薬を添加するタイミングを視覚的に判断することが可能である。

１．第１の増幅試薬を検出するための発色試薬
本発明のクロマトグラフキットは、標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうち、第１の増幅試薬を検出するための発色試薬、を有する領域を有している。

本発明において、第１の増幅試薬を検出するための発色試薬としては、例えば、イオンに反応して発色する化合物を使用することが好ましい。第１の増幅試薬については本明細書中で後記するが、例えば、第１の増幅試薬が、２価の鉄イオン（Fe²⁺）を含む試薬である場合には、その発色試薬としては、Fe²⁺イオンと反応して発色する化合物を使用することができる。Fe²⁺イオンと反応して発色する化合物としては、Fe²⁺イオンと錯形成することで発色できる化合物を使用することができる。Fe²⁺イオンと反応して発色する化合物の具体例としては、フェナントロリン骨格を有する化合物［例えば、1,10-フェナントロリン、5-メチルフェナントロリン、5-ニトロフェナントロリン、バソフェナントロリン（4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン）、又はバソフェナントロリンジスルホン酸など］、あるいは-ビピリジン骨格を有する化合物［例えば、2,2'-ビピリジンなど］を使用することができ、好ましくはフェナントロリン骨格を有する化合物を使用することができる。また、被検試料を含む水溶液と第１の増幅試薬を含む水溶液のｐＨが異なる場合には、第１の増幅試薬を検出するために、プロトンにより構造変化が起こって色味が変化する試薬を好ましく使用することができる。特に第１の増幅試薬を含む水溶液が酸性(ｐＨ７より小さい、プロトン濃度が高い)である場合には、酸性領域用のｐＨ指示薬として公知の発色試薬であるH+イオンと反応して発色する化合物(例えば、メチルオレンジ、メチルレッド、コンゴーレッド及びメチルイエローなどのジアゾ系の発色試薬、並びに、チモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル及びブロモチモールブルーなどのサルトン系の発色試薬)等を、増幅試薬を含む水溶液のｐＨに合わせて適宜選択して使用することが好ましい。上記の中でも、1,10-フェナントロリン、バソフェナントロリン又はブロモクレゾールグリーンをより好ましく使用できる。

被検試料を含む水溶液または第１の増幅試薬を含む水溶液を展開した際に、結合物質固定化メンブレン上を、発色試薬が移動しないことが好ましいことから、発色試薬のＬｏｇＰ（水とオクタノール中での分配係数）が４．０以上であることが好ましく、５．０以上であることがより好ましい。ＬｏｇＰとしては実測値を用いてもよいが、簡便に判断する方法として、化学構造等から得られる計算値を用いることもできる。ＬｏｇＰを計算する方法としては、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ社のＣｈｅｍＤｒａｗＰｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ １２で使用されている計算方法が好ましい。代表的な発色試薬の応答性及びＬｏｇＰ（ＣｈｅｍＤｒａｗＰｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ １２による）を以下の表１に示した。

発色試薬をクロマトグラフキット内に保持する方法としては、後述する吸水パッドを発色試薬溶液に浸し減圧乾燥する方法、結合物質固定化メンブレンの標識物質補足領域よりも下流方向にライン状に塗布する方法などがある。
被検試料を含む水溶液または第１の増幅試薬を含む水溶液のいずれかを展開した際に、発色試薬が結合物質固定化メンブレン中を実質的に移動する場合には、発色試薬を吸水パッドに含有させて使用することが好ましい。
被検試料を含む水溶液または第１の増幅試薬を含む水溶液のいずれかを展開した際に、発色試薬が結合物質固定化メンブレン中を実質的に移動しない場合には、標識物質捕捉領域を有する結合物質固定化メンブレンに発色試薬を担持させることが好ましい。
標識物質補足領域に第１の増幅試薬が到達したことをより小さいタイムラグで表示することを可能とするため、本発明においては発色試薬を結合物質固定化メンブレンに担持させる態様がより好ましい。

本発明において、標識物質保持領域を上流方向、標識物質補足領域を下流方向に有する、とは、被検試料を毛管現象や、吸水パッドを使用した場合の吸引力等を利用して展開させる場合に、被検物質を含む被検試料の展開方向に対して、上流方向、下流方向と定義する。本発明の具体的な態様では、図１、及び図２に示したように、標識物質保持領域から標識物質補足領域に向かって被検試料等を展開した場合に、標識物質保持領域の方向を上流方向、標識物質補足領域の方向を下流方向と定義する。

本発明においては、標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうちの第１の増幅試薬を、標識物質捕捉領域の上流方向から標識物質捕捉領域の下流方向に展開し、発色試薬を有する領域における物理又は化学的変化を検出することによって、標識物質捕捉領域が第１の増幅試薬で満たされていることを確認する。発色試薬を有する領域における物理又は化学的変化としては、第１の増幅試薬と発色試薬との反応によって生じる発色や蛍光の変化等を検出することができる。好ましくは発色を検出することができる。このような物理又は化学的変化は、視覚的に検出してもよいし、検出機器を利用して検出してもよい。

２．クロマトグラフ
一般に、クロマトグラフ方法とは以下のような手法で被検物質を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被検物質と結合可能な固定化試薬（被検物質に対する第二の結合物質、又は下記の第一の結合物質に対する結合物質に相当するもの；具体的には抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの標識物質捕捉領域を有することが可能な結合物質固定化メンブレンを固定相として用いる。この結合物質固定化メンブレン上で、被検物質に対する第一の結合物質によって修飾された標識物質を含む液を移動層として結合物質固定化メンブレン中をクロマトグラフ的に移動させると共に、被検物質と標識物質とが特異的に結合しながら、標識物質捕捉領域まで到達する。標識物質捕捉領域において、被検物質と標識物質の複合体が固定化された第二の結合物質又は第一の結合物質に対する結合物質に特異的結合することにより、被検試料中に被検物質が存在する場合にのみ、第二の結合物質又は第一の結合物質に対する結合物質に標識物質が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被検試料中に被検物質が存在することを定性及び定量的に分析する手法である。

本発明におけるクロマトグラフ方法を行うキットは、標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬、例えば、好ましくは銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤、を内蔵していてもよく、標識物質捕捉領域上の固定化試薬に結合した被検物質と標識物質の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度クロマトグラフを行うことができる。

３．被検試料
本発明のクロマトグラフキットを用いて分析することのできる被検試料としては、被検物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。被検物質としては、例えば、天然物、毒素、ホルモン、農薬等の生理活性物質、環境汚染物質、ウイルス、抗原、抗体などが挙げられる。

４．被検試料の前処理
本発明のクロマトグラフキットを用いて測定する方法では、被検試料をそのままで、あるいは、被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。本発明で用いられる抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、かかる溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。

５．構成
本発明のクロマトグラフキットにおいては、クロマトグラフ用ストリップを組み込み使用することができる。使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。
本発明において使用することができるクロマトグラフ用ストリップとしては、被検物質を含む被検試料の展開方向の上流方向から下流方向に向かって、標識物質保持領域、標識物質補足領域を有しており、更に、発色試薬を有する領域を有している。本発明において、より好ましい態様としては、発色試薬を有する領域は、標識物質補足領域の下流方向に位置している態様であり、更には、試料添加パッド、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）、結合物質固定化メンブレン（例えば、標識物質捕捉領域を有する抗体固定化メンブレン）、及び吸水パッドをこの順に、粘着シート上に配置する態様が好ましく用いられる。結合物質固定化メンブレンとしては、被検物質と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域などである標識物質捕捉領域を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン（コントロール領域と記載することもある）を更に有していてもよい。

本発明で用いることができる標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドは、標識物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。

５−１．標識物質
本発明で用いられる標識物質としては、通常のクロマトグラフ方法に用いることができる金属硫化物、免疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することができ、好ましくは金属コロイド、色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセルを着色粒子として使用することができ、より好ましくは金属コロイドを用いることができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができ、例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、特に、適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましく、そのなかで金コロイドが最も好ましい。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Nature Physical Science，241(1973)20等）により金コロイド粒子を調製することができる。

金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、１〜５０ｎｍがさらに好ましく、１〜１５ｎｍが特に好ましい。本発明に用いられる金属コロイドの平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。

粒径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を好ましく用いることができる。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。

本発明によれば、検出用の標識物質として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるクロマトグラフにおいて、金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、被検物質と検出用標識物の複合体の形成後に、無機銀塩や有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび銀イオンのための還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が金属系標識を核として金属系標識上に沈着するので、金属系標識が増幅され、被検物質の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。

５−２．結合物質
本発明では、標識物質は、被検物質に対する第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば被検物質（抗原）に対する抗体、被検物質（抗体）に対する抗原、被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、被検物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。

本発明のクロマトグラフキットは、（ａ）被検物質に対する第二の結合物質、又は（ｂ）第一の結合物質に対する結合物質を標識物質捕捉領域に有している。被検物質に対する第二の結合物質とは、例えば被検物質（抗原）に対する抗体、被検物質（抗体）に対する抗原、被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、被検物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでも良いし、同一のものでもよい。第一の結合物質に対する結合物質とは、被検物質そのものでも良いし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被検物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などがそれにあたる。

好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／又は第二の結合物質が抗体である。より好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、第二の結合物質が第一の結合物質と結合する抗体である。
本発明のクロマトグラフ方法においては、被検物質に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。

本発明において、第一の結合物質を用いて標識物質を修飾する方法としては、例えば、金属コロイドと特異結合物質との結合の場合は、以下に記載されている従来公知の方法（例えばThe Journal of Histochemistry and Cytochemistry，30,7 (1982)691-696）に従い、行うことができる。具体例としては、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。

５−３．結合物質固定化メンブレン
本発明で用いることができる結合物質固定化メンブレンとしては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。

本発明においては、結合物質固定化メンブレンの一部に、被検物質に対する第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質を固定化させた標識物質捕捉領域を有することが好ましい。被検物質に対する第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質は、結合物質固定化メンブレンの一部に物理的または化学的結合により直接固定化させて標識物質捕捉領域を形成させてもいいし、あるいはラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子を結合物質固定化メンブレンの一部にトラップさせて固定化させ、標識物質捕捉領域を形成してもいい。なお、結合物質固定化メンブレンは、第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質を固定化した後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理を施して使用することが好ましい。

５−４．標識物質保持パッド
本発明においては、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッドをクロマトグラフキットに組み込んで使用する態様が好ましい。標識物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等を好ましく使用することができ、前述のように調製した標識物質を一定量含浸し、乾燥させて標識物質保持領域とすることができる。

５−５．試料添加パッド
本発明のクロマトグラフキットは更に、試料添加パッドを組み込み使用することが好ましい。試料添加パッドは、添加された被検物質を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる態様が好ましい。試料添加パッドの材質としては、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられる。また、分析の際、試料中の被検物質が試料添加パッドの材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもできる。試料添加パッドは、５−４で述べた標識物質保持領域を有する標識物質保持パットを兼ねていてもよい。

５−６．吸水パッド
本発明においては、吸水パッドをクロマトグラフキットに好ましく組み込んで用いることができる。吸水パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸水パッドに届いてからのクロマトの速度は、吸水パッドの材質、大きさなどにより異なるので、その選定により被検物質の測定に合った速度を設定することができる。

６．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法及び競合法について説明する。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質の分析を実施することができる。まず、被検物質（抗原）に対して特異性を有する第一の結合物質（例えば、第１抗体）及び第二の結合物質を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第一の結合物質で、予め標識物質を修飾しておく。第二の結合物質を、適当な結合物質固定化メンブレン（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定して標識物質捕捉領域とし、被検物質（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に被検物質が存在する場合には、第二の結合物質との結合（例えば、第二抗体との抗原抗体反応）が起こる。被検物質と第二の結合物質との結合と同時又は結合後に、更に第一の結合物質で修飾した標識物質を過剰量接触させると、被検試料中に被検物質が存在する場合には、固定化された第二の結合物質と被検物質（抗原）と第一の結合物質で修飾した標識物質とからなる複合体が形成される。

サンドイッチ法では、固定化された第二の結合物質と被検物質（抗原）、及び被検物質と標識物質を修飾した第一の結合物質との反応が終了した後、免疫複合体を形成しなかった標識物質を除去し、続いて、例えば、結合物質固定化メンブレンの標識物質捕捉領域をそのまま観察しその標識物質を検出、または定量し、被検試料中の被検物質の有無判定または量を測定することができる。本発明においては、例えば、還元剤及び銀イオン含有化合物を供給することにより、かかる複合体を形成した標識物質からの信号を増幅し検出する。

競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質の分析を実施することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として知られている。まず、被検物質（抗原）に対して特異性を有する第一の結合物質を予め調製しておく。また、第一の結合物質で、予め標識物質を修飾しておく。第一の結合物質に対する結合物質である、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持つ被検物質の類似化合物を、適当な結合物質固定化メンブレン（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定して標識物質捕捉領域とする。被検物質（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）及び、予め第一の結合物質で修飾した標識物質とを接触させると、その被検試料中に被検物質が存在しない場合には、標識物質を修飾した第一の結合物質と、標識物質捕捉領域上に固定化された、第一の結合物質に対して結合性を有する、被検物質そのものまたは被検物質の類似化合物、とにより複合体が形成される。一方、被検試料中に被検物質が存在する場合には、標識物質を修飾した第一の結合物質に被検物質（抗原）が結合するため、その後の第一の結合物質に対して結合性を有する、標識物質捕捉領域に固定化された被検物質そのもの、または被験物質の類似化合物との結合、が阻害され、複合体が形成されない。

第二の結合物質に固定化された、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持つ被検物質との類似化合物と、標識物質を修飾した第一の結合物質との反応が終了した後、結合しなかった標識物質を修飾した第一の結合物質を除去し、続いて、標識物質捕捉領域の、第一の結合物質で修飾した標識物質の量を検出、または定量し、被検試料中の被検物質の有無判定または量を測定することができる。本発明においては、固定した領域に、例えば、還元剤及び銀イオン含有化合物を供給することにより、かかる複合体を形成した標識物質からの信号を増幅して検出する。

７．増幅液
増幅液は、含まれる薬剤が標識物質や被検物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる溶液である。例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。

詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を用いることができ、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅溶液として用いることができる。

本発明では、２種の増幅試薬を用いる。標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうち、第１の増幅試薬を第１液に、第２の増幅試薬を第２液に含有させておき、第１液および第２液を順次、添加することにより増幅を行うことが好ましい。第１液は、標識物質保持パッドおよび試料添加パッドよりも上流方向に位置する、還元剤溶液を送液するためのパッドに添加することが好ましい。

増幅液の具体例としては、銀イオンのための還元剤を含む第１液、及び、銀イオンを含む化合物を含む第２液の組み合わせを用いることができる。
以下、第１液に含まれる銀イオンのための還元剤と第２液に含まれる銀イオンを含む化合物等について説明する。

７−１．銀イオンを含む化合物
銀イオン含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。

無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に0.001モル／ｍ²〜0.2モル／ｍ²、好ましくは0.01モル／ｍ²〜0.05モル／ｍ²含有されることが好ましい。

７−２．銀イオンのための還元剤
銀イオンのための還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe²⁺、V²⁺、Ti³⁺、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe²⁺を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe³⁺の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe²⁺の金属塩が好ましい。

なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。

還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（又はＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩又は当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。

８．その他の助剤
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ₉Ｈ₁₉-Ｃ₆Ｈ₄-Ｏ-（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₅₀Ｈである。

増幅試薬をクロマトキットに点着する方法としては、還元剤溶液を送液するためのパッドに、第１液としての還元剤溶液を点着し、第２液としての銀イオン溶液を標識物質捕捉領域に上から点着する方法が好ましい。
２種の増幅試薬をクロマトキットに内蔵する方法としては、各増幅試薬を含む溶液を含むポットを、各増幅試薬を点着する部位の上部に配置する方法が挙げられる。還元剤溶液(第１液)を、還元剤溶液を送液するためのパッドの上部に置き、銀イオン溶液（第２液）を含むポットを銀イオン溶液充填孔のすぐ上部に設置することが好ましい。このように配置することにより、それぞれのポットを押すことで液が流れ、所定の部位に点着することができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

(１）インフルエンザウィルス抗原検出イムノクロマトキットの作製
（１−１）抗インフルエンザA型モノクローナル抗体修飾金コロイド（被検物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質）の作製
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mM KH2PO4バッファー（pH 7.5）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、160 μg / mLの抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社）溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1質量％ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬社製）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10質量 ％牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA社製）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立社製）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05質量 ％ PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 質量％ BSA）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。

（１−２）金コロイド保持パッド（標識物質保持領域）の作製
（１−１）で作成した抗インフルエンザA型モノクローナル抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05質量 ％ PEG（Mw.20000）, 5質量％ スクロース）及び水で希釈し、520 nmの光学濃度（OD）が0.1となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、１２時間減圧乾燥した後、5 mmに裁断することで抗インフルエンザA型モノクローナル抗体修飾金コロイド保持パッドを得た。金コロイド抗体を保持する部分が、標識物質保持領域に相当する。

（１−３−１）抗体固定化メンブレン−１（結合物質固定化メンブレン−１）の作製
60 mm×300 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から15 mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社製）溶液をライン状に塗布し、抗体固定化ラインとした。さらに下から11 mmの位置に、0.2 mg / mLとなるように調製した抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬社製）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5質量％カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬社製）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5質量％スクロースおよび0.05 質量％コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で１２時間乾燥し、5 mm幅に裁断したものを抗体固定化メンブレン−１とした。抗インフルエンザA型モノクローナル抗体を固定化した部分が、標識物質捕捉領域に相当し、抗マウスIgG抗体固定化した部分は、ポジティブコントロール領域に相当する。なお、本実施例で使用する抗インフルエンザA型モノクローナル抗体が認識するタンパク質は同一ユニットの3量体であるため、標識された抗体と固定化された抗体が同じものであってもサンドイッチ法によるアッセイが可能である。

（１−３−２）抗体固定化メンブレン−２（結合物質固定化メンブレン−２）の作製
60 mm×300 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社製）に関し以下のような方法により抗体及び発色試薬を固定し、抗体固定化メンブレン−２を作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から15mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社製）溶液をライン状に塗布し、抗体固定化ラインとした。さらに下から11 mmの位置に、0.2 mg / mLとなるように調製した抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬社製）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 質量％カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬社製）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 質量%スクロースおよび0.05質量％コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で１２時間乾燥した。下から9 mmの位置に、20 mMに調整したバソフェナントロリン(同仁化学社製)をライン状に塗布し、発色試薬固定化ラインとした。5 mm幅に裁断したものを抗体固定化メンブレン−２とした。抗インフルエンザA型ノモクローナル抗体を固定化した部分が、標識物質捕捉領域に相当し、抗マウスIgG抗体固定化した部分は、ポジティブコントロール領域に相当する。

（１−３−３）抗体固定化メンブレン−３（結合物質固定化メンブレン−３）の作製
60 mm×300 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社製）に関し以下のような方法により抗体及び発色試薬を固定し、抗体固定化メンブレン−３を作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から15mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社製）溶液をライン状に塗布し、抗体固定化ラインとした。さらに下から11 mmの位置に、0.2 mg / mLとなるように調製した抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬社製）溶液をライン状に塗布した。さらに下から9 mmの位置に、30 mMに調整したブロモクレゾールグリーン(和光純薬社製)をライン状に塗布し、発色試薬固定化ラインとした。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 質量％カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬社製）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 質量％スクロースおよび0.05 質量%コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で１２時間乾燥し、5 mm幅に裁断したものを抗体固定化メンブレン−３とした。抗インフルエンザA型モノクローナル抗体を固定化した部分が、標識物質捕捉領域に相当し、抗マウスIgG抗体固定化した部分は、ポジティブコントロール領域に相当する。

（１−４）銀増幅液の作製
（１−４−１）還元剤溶液（第１の増幅試薬）の作製
水290gに、硝酸鉄(III)九水和物（和光純薬社製、095-00995）を水に溶解して作製した１mol/lの硝酸鉄水溶液23.6ml、クエン酸（和光純薬社製、038-06925）13.1gを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10質量％）を36ml加え、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬社製、091-00855）を60.8g加えこれを還元剤溶液とした。

（１−４−２）銀イオン溶液（第２の増幅試薬）の作製
水66ｇに、硝酸銀溶液８ｍl（10ｇの硝酸銀を含む）と１mol/lの硝酸鉄水溶液24mlを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（10質量％）5.9ml、ドデシルアミン（和光純薬社製、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ₁₂Ｈ₂₅-Ｃ₆Ｈ₄-Ｏ-（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₅₀Ｈ 0.1gをあらかじめ47.6ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを銀イオン溶液とした。

（１−５） 1,10-フェナントロリン含有吸水パッド（発色試薬を有する領域）の作製
吸水パッド(GB-140, ADVANTEC)を100 mm×150 mmに裁断し、1,10-フェナントロリン溶液 (21 mM) に浸した。1,10-フェナントロリン溶液から取り出した後に１２時間減圧乾燥することでフェナントロリン含有吸水パッドを得た。フェナントロリンを含有する領域が、発色試薬を有する領域に相当する。

（１−６−１）アッセイ用キット−１の作製
図１にアッセイ用キット部品の模式図を示した。キットの外部を構成する上部及び下部の材質は、ポリプロピレン製で射出成形により作製した。図１で示すように（１−３−１）で作製した抗体固定化メンブレン−１（抗インフルエンザA型抗体及び抗マウスIgG抗体固定化メンブレン)、発色試薬に浸していない吸水パッド（GB-140, ADVANTEC製、100 mm×150 mmに裁断）、還元剤溶液を送液するためのパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製)、及び中央に金コロイド保持パッドとして、（１−２）で作製した抗インフルエンザA型モノクローナル抗体修飾金コロイド保持パッドを図１のように装填し、アッセイ用キット−１（比較例−１）を作製した。

（１−６−２） アッセイ用キット−２の作製
（１−６−１）のアッセイ用キット−１の作製において、発色試薬に浸していない吸水パッドに変えて、（１−５）で作製した1,10-フェナントロリン含有吸水パッドを装填した以外は同様にして、アッセイ用キット−２（実施例−１）を作製した。

（１−６−３） アッセイ用キット−３の作製
図２にアッセイ用キット部品の模式図を示した。キットの外部を構成する上部及び下部の材質は、ポリプロピレン製で射出成形により作製した。図２で示すように（１−３−２）で作製した抗体固定化メンブレン−２(発色試薬、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体及び抗マウスIgG抗体固定化メンブレン)、発色試薬を含有しない吸水パッド(GB-140, ADVANTEC社製、100 mm×150 mmに裁断)、還元剤溶液を送液するためのパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社製)、及び中央に金コロイド保持パッドとして、（１−２）で作製した抗インフルエンザA型モノクローナル抗体修飾金コロイド保持パッド、を配置することでアッセイ用キット−３（実施例−２）を作製した。

（１−６−４） アッセイ用キット−４の作製
（１−６−３）のアッセイ用キット−３の作製において、（１−３−２）で作製した抗体固定化メンブレン−２に変えて、（１−３−３）で作製した抗体固定化メンブレン−３(発色試薬、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体及び抗マウスIgG抗体固定化メンブレン)を装填した以外は同様にして、アッセイ用キット−４（実施例―３）を作製した。

（２）評価
（２−１）被検試料液の展開
模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B- (ベクトン・ディッキンソン社製))を抽出液(1質量％ BIGCHAP含有1質量％ BSA-PBS)で128倍希釈して被検試料液を準備した。この被検試料液30 μLを、（１−６−１）から（１−６−４）で作製したアッセイ用キット−１〜４の、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体修飾金コロイド保持パッドに点着し、それぞれ被検試料液を展開した。

（２−２）還元剤溶液の展開
（２−１）において、被検試料液を点着した後即座に、アッセイ用キット−１〜４の還元剤溶液を送液するためのパッドに、（１−４−１）で作製した還元剤溶液を200 μL点着することで還元剤溶液を展開した。

（３） 銀増幅
（３−１）銀増幅開始シグナルなし（比較例１）
還元剤溶液を（２−２）に記載の方法で点着した後、任意のタイミングでアッセイ用デバイス−１〜４の銀イオン溶液充填孔から（１−４−２）で作製した銀イオン溶液95 μLを添加して銀増幅を行い、点着４分後に標識物質補足領域の黒化を観察した。この試行を１０人の異なる実験者がそれぞれ行い、増幅された黒色ラインが認められたら成功とし、成功率を算出した。結果を表２に示す。

（３−２）銀増幅開始シグナルあり（実施例１）
1,10-フェナントロリンを含有する吸水パッドを用いたアッセイ用キット−２に対して還元剤液を（２−２）に記載の方法で点着した後、1,10-フェナントロリンを含有する吸水パッドに赤色のシグナルが観察された後即座に（３−１）と同様にして銀イオン溶液を添加して増幅を行った。この試行を１０人の異なる実験者がそれぞれ行い増幅された黒色ラインが認められたら成功とし、成功率を算出した。結果を表２に示す。

（３−３）銀増幅開始シグナルあり（実施例２）
（１−６−３）で作製した発色試薬バソフェナントロリンを固定化したアッセイ用キット−３に対して還元剤液を（２−２）と同様にして点着した後、発色試薬バソフェナントロリンを塗布したラインが赤色に発色した後即座に、（３−１）と同様にして銀イオン溶液を添加して増幅を行った。この試行を複数人の異なる実験者がそれぞれ行い増幅された黒色ラインが認められたら成功とし、成功率を算出した。結果を表２に示す。

（３−４）銀増幅開始シグナルあり（実施例３）
（１−６−４）で作製した発色試薬ブロモクレゾールグリーンを固定化したアッセイ用キット−４に対して還元剤液を（２−２）と同様にして点着した後、発色試薬ブロモクレゾールグリーンを塗布したラインが深緑色からオレンジ色に変化した後即座に、（３−１）と同様にして銀イオン溶液を添加して増幅を行った。この試行を複数人の異なる実験者がそれぞれ行い増幅された黒色ラインが認められたら成功とし、成功率を算出した。結果を表２に示す。

表２の結果より、増幅を行うタイミングを視覚的に判断可能とすることにより、増幅の失敗をなくすことに成功した。本発明の効果はこの結果より明らかとなった。

Claims (13)

1. （１）被検物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質を有する標識物質保持領域と、
   （２）上記被検物質に対する第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質を有する標識物質捕捉領域とを、
   被検物質を含む被検試料の展開方向に対して上流方向から下流方向にこの順番で有し、さらに、
   （３）上記標識物質を検出する際に標識物質のシグナルを増幅するために使用する銀イオンのための還元剤を検出するための発色試薬を有する領域が、上記標識物質捕捉領域より下流に位置している、
   クロマトグラフキット。
2. 上記発色試薬が、イオンに反応して発色する化合物である、請求項１に記載のクロマトグラフキット。
3. 上記発色試薬が、Fe²⁺イオンと反応して発色する化合物である、請求項１又は２に記載のクロマトグラフキット。
4. 上記発色試薬が、フェナントロリン骨格を有する化合物である、請求項１から３の何れか１項に記載のクロマトグラフキット。
5. 上記発色試薬が、H⁺イオンと反応して発色する化合物である、請求項１又は２に記載のクロマトグラフキット。
6. 上記標識物質が金属コロイドである、請求項１から５の何れか１項に記載のクロマトグラフキット。
7. 上記金属コロイドが金コロイドである、請求項６に記載のクロマトグラフキット。
8. 銀イオンのための還元剤及び銀を含む化合物を内蔵している、請求項１から７の何れか１項に記載のクロマトグラフキット。
9. 上記銀イオンのための還元剤が、２価の鉄イオンを含む試薬である、請求項８に記載のクロマトグラフキット。
10. 標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド、標識物質捕捉領域を有する結合物質固定化メンブレン、及び吸水パッドを少なくとも含み、上記発色試薬が、結合物質固定化メンブレンに担持されている、請求項１から９の何れか1項に記載のクロマトグラフキット。
11. 上記発色試薬が、被検試料を含む水溶液または上記銀イオンのための還元剤を含む水溶液のいずれかを展開した際に、結合物質固定化メンブレン中を実質的に移動しない発色試薬である、請求項１０に記載のクロマトグラフキット。
12. （１）被検物質と、
    被検物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質と、
    の複合体を形成させた状態で展開し、上記被検物質に対する第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質、を有する標識物質捕捉領域において上記標識物質を捕捉する工程；
    （２）上記標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する銀イオンのための還元剤を、標識物質捕捉領域の上流側から標識物質捕捉領域の下流側に展開する工程；
    （３）上記標識物質捕捉領域より下流に位置している発色試薬を有する領域における物理又は化学的変化を検出することによって、上記標識物質捕捉領域が銀イオンのための還元剤で満たされていることを確認する工程；及び
    （４）上記標識物質捕捉領域が銀イオンのための還元剤で満たされていることを確認した後に、銀を含む化合物が標識物質捕捉領域を満たす工程；
    を含む、クロマトグラフ方法。
13. 銀イオンのための還元剤が、２価の鉄イオンを含む試薬である、請求項１２に記載のクロマトグラフ方法。

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