CN103713134B

CN103713134B - 一种可视化检测病毒的检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103713134B
Application number: CN201310691989.0A
Authority: CN
Inventors: 张志凌; 周川华; 赵静雅; 庞代文
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2033-12-17
Also published as: CN103713134A

Abstract

本发明涉及一种检测流感病毒的检测试剂盒及其检测方法。采用免疫磁球作为固相载体，利用生物素化的抗体和链霉亲和素标记的碱性磷酸酶（SA-ALP）作为信号标记物，在免疫磁球表面形成磁性免疫夹心复合物，最后利用磁性免疫夹心复合物表面的碱性磷酸酶（ALP）催化底物水解产生强还原性的物质将Ag⁺还原成Ag⁰沉积到纳米金表面形成Au/Ag纳米颗粒，从而利用胶体金溶液的颜色及紫外可见吸收光谱的变化实现对目标病原体的定性和定量的检测。本发明还提供了用于该方法的检测试剂盒。该检测方法将磁免疫分析和基于酶促金属化的比色法相结合，是一种灵敏、快速、可视化检测病毒的方法。

Description

一种可视化检测病毒的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法，本发明还涉及应用于该方法的检测试剂盒，属于分析检测领域。

背景技术

病毒的快速检测对于食品安全、疾病防控与有效诊治及控制病毒的扩散和传染等方面至关重要。然而，目前病毒检测的方法：如病毒的分离、血清学检测方法和ELISA操作繁琐、费时、灵敏度低；PCR需要昂贵的仪器和样品预处理等，从而不适用于病毒的快速检测和鉴定。免疫磁分离技术是近年来随着纳米材料的进步而发展起来的一种新型的免疫分离技术，由于磁珠具有大的比表面积、快速的反应动力学和好的分离富集能力，且易于操控，使得它在细胞分离、病原体检测等方面得到了越来越广泛的应用。

可视化检测由于其对仪器要求低、操作简单，作为一种快速检测的有效方法而在临床诊断方面被广泛应用。基于金属纳米颗粒的比色分析法由于其简单、方便以及金属纳米颗粒独特的光学性质而受到人们的广泛关注。但是基于金属纳米颗粒聚集的比色法在实际应用中仍然存在一些缺陷，例如：灵敏度不够，非特异性聚集等等。

因此我们将免疫磁分离和高灵敏的非聚集的金属纳米颗粒比色法相结合，建立了一种可视化检测病毒的方法，该方法结合了免疫磁分离、酶促金属化反应的放大性及金属纳米颗粒独特的光学性质等优点，大大增加了检测的灵敏度，缩短了检测时间，且该方法不需要复杂的仪器，适用于病毒的快速检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种简单、快速、高灵敏的可视化检测病毒的方法，以克服现有技术检测步骤繁琐、耗时较长且需要复杂仪器的问题。该方法包括如下步骤：

1) 将抗目标病毒表面蛋白的单克隆抗体连接到磁球表面，并用牛血清白蛋白 (BSA)进行封闭，得到免疫磁球；

2）利用免疫磁球捕获样品中的目标病毒，采用磁分离并洗涤，得到磁球病毒复合物；

3）将生物素化目标病毒的抗体与磁球病毒复合物孵育，再与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶孵育，采用磁分离并洗涤，得到磁球-病毒-碱性磷酸酶复合物；

4）将含对氨基磷酸酚的二乙醇胺溶液加入到磁球-病毒-碱性磷酸酶的复合物中孵育，用磁力架分离，取出上清液加入到含有纳米金及硝酸银的检测液中，观察颜色变化或者利用紫外可见光谱仪进行定量检测。

步骤1）中，磁球是表面经过修饰的能够与蛋白偶联的磁性微球，例如表面带有-COOH基团，采用EDC/NHS活化法将抗目标病毒表面蛋白的单克隆抗体共价偶联到磁球上。所用磁球粒径均一，在本发明实施例中，磁性微球直径都为500nm。

上述病毒一般是指内部具有核酸，外面具有衣壳的蛋白，包括但不限于，例如流感病毒、肠道病毒等等。

基于上述方法的本发明实施例还进一步提供检测H9N2禽流感病毒的方法，该方法用商品化的磁球共价偶联抗H9N2外膜糖蛋白HA的单克隆抗体分离富集目标H9N2病毒，并分别与生物素（biotin）化的抗H9N2外膜糖蛋白HA的抗体及偶联了链酶亲和素（SA）的碱性磷酸酶（ALP）相互作用，最后通过ALP催化底物水解产生强还原性的物质将Ag⁺还原成Ag⁰沉积到纳米金表面形成Au/Ag纳米颗粒，从而利用检测液的颜色及紫外可见吸收光谱的变化实现对病毒定性和定量的检测。具体地，其包括如下步骤：

①制备免疫磁球：利用EDC/NHS活化法将抗H9N2外膜HA的单克隆抗体连接到表面带-COOH的磁性纳米球表面，并用BSA对偶联了抗体后的免疫磁球进行封闭；

②制备生物素化抗体：利用蛋白生物素标记试剂对抗H9N2外膜的糖蛋白HA的抗体进行生物素化标记，并用脱盐柱进行分离纯化，得到生物素化的抗体；

③制备纳米金：所用的纳米金是利用氯金酸作为前体，谷胱甘肽作为配体，还原型辅酶Ⅱ作为还原剂制备而成的，所制备的纳米金具有非常高的稳定性，即使在1mol/L的盐溶液中也能够保持稳定。

④以磁球作为固相载体进行免疫反应：将步骤①中制备的免疫磁球加入到待测病毒溶液中，37℃下孵育20分钟，用磁力架吸附磁球除去溶液中未反应的病毒及其它复杂基质，得到磁球-病毒的复合物；将生物素化的抗体与磁球-病毒复合物在溶液中于37℃下孵育20min，用磁力架吸附磁球，去除溶液中未反应的生物素化的抗体，再往磁球-病毒复合物溶液中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，37℃下反应10min，磁力架分离并洗涤，除去未反应的碱性磷酸酶，形成磁球-病毒-碱性磷酸酶的复合物；

⑤显色及检测：将含有对氨基磷酸酚的二乙醇胺溶液加入到上述磁球-病毒-碱性磷酸酶的复合物中，37℃下孵育30分钟，用磁力架分离，取出上清液加入到含有纳米金及硝酸银的检测液中，2分钟后观察颜色变化或者利用紫外可见光谱仪进行定量检测。

本发明还进一步提供了一种用于病毒检测的检测试剂盒，其包括：

1）免疫磁性纳米微球，所述微球表面偶联有目标病毒外膜的糖蛋白HA的单克隆抗体；

2）生物素化目标病毒外膜的糖蛋白HA的抗体；

3）链霉亲和素标记的碱性磷酸酶；

4）对氨基磷酸酚作为碱性磷酸酶的底物；

5）含有纳米金的硝酸银溶液作为显色液。

本发明建立了一种可视化检测病毒的方法及检测试剂盒。该方法结合了磁免疫分析的高特异性、强可操纵性，及酶促金属化的高灵敏度等优点，是一种灵敏、快速、可视化检测病毒的方法，该方法具有易操作，无需对样品进行预处理，灵敏度高，特异性强，且不需要复杂仪器等特点，为病毒的快速检测提供了强有力的工具。

附图说明

图1 为本发明检测H9N2禽流感病毒的流程示意图。

图2为本发明检测H9N2禽流感病毒的颜色变化照片（A），紫外可见光谱图（B），及370nm处吸光强度与病毒浓度的线性拟合 (C)。随着H9N2禽流感病毒浓度的增大，检测液的颜色从纳米金的红色逐渐变成纳米银的黄色，再进一步变成棕色甚至灰黑色。

图3为本发明检测H9N2禽流感病毒的特异性柱状图，插图为其对应的紫外可见吸收光谱图。对照病毒的信号均在阴性域值的范围内，只有含有H9N2禽流感病毒的样品存在下才会在370nm处产生大的吸收峰。

图4显示的是模拟实际环境样品检测的结果：为了更好的运用该方法，本发明模拟了实际检测环境中的禽类组织（鸡心，鸡粪）及鸡血清样本，在存在复杂禽类组织环境的情况下，用该方法对H9N2禽流感病毒进行检测。

具体实施方式

以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1 H9N2禽流感病毒的检测

下面以H9N2禽流感病毒为例，对本发明方法进行详细的说明。

一、方法

1、免疫磁球的制备

取8μL表面为羧基功能团的超顺磁性球（Master Beads Carboxylic Acid 0215, 500 nm diameter），用0.1 mol/L pH 6.0 的PBS洗两次。然后将磁球分散在含0.1 mol/L EDC 和 0.1 mol/L NHS的PBS（0.1 mol/L pH 6.0）溶液中，活化30 min。接着用0.1 mol/L pH 7.2 的 PBS洗三次后，将其分散在200 μL 0.1 mol/L pH 7.2 的PBS溶液中，然后加入10 μL 0.59 mg/mL的抗H9N2表面HA的单抗溶液，摇床上孵育反应4 h。反应后用0.1 mol/L pH 7.2 的PBS洗三次，除去多余的抗体，然后将其分散在200 μL 1%的 BSA中，封闭30 min。最后将其分散在200 μL含0.05 %叠氮化钠和1% BSA的0.1 mol/L pH 7.2 PBS中，4 ℃储存备用。

2、生物素化的抗特定病原体表面蛋白单抗的制备

利用生物素化试剂Sulfo-NHS-LC-Biotin（Thermo）与抗H9N2外膜的糖蛋白HA抗体的氨基反应，将生物素连接到该抗体上。具体操作如下：首先用0.1 mol/L pH 7.2 的PBS配置1mg/mL生物素化试剂Sulfo-NHS-LC-Biotin，然后在100 μL 1mg/mL抗H9N2外膜的糖蛋白HA抗体中加入11 μL新配置的生物素化试剂，在摇床上孵育2h。多余的生物素化试剂利用NAP-5（GE Healthcare）的脱盐柱除掉，然后在得到的生物素化抗体中加入一定量的BSA和叠氮化钠，在4 ℃储存备用。

3、H9N2禽流感病毒的检测

（1）取步骤1中制备的免疫磁球20μL加入到含有不同浓度的待测病毒溶液中，37℃下孵育20分钟，用磁力架吸附磁球除去溶液中未反应的病毒及其它复杂基质，得到磁球-病毒的复合物；

（2）将上述复合物分散到200 μL含有0.1% Skim Milk-0.05% Tween 20的0.1 mol/L pH 7.2 PBS缓冲液中，加入步骤2中制备的生物素化的抗体0.5 μg，于37℃下孵育20min，用磁力架吸附磁球，去除溶液中未反应的生物素化的抗体。

（3）将上述复合物分散到200 μL含有0.1% Skim Milk-0.05% Tween 20的0.1 mol/L pH 7.2 PBS缓冲液中，再加入1 μg链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，37℃下反应10min，磁力架分离并洗涤，除去未反应的碱性磷酸酶，形成磁球-病毒-碱性磷酸酶的复合物；

（4）将含对氨基磷酸酚的二乙醇胺溶液加入到上述磁球-病毒-碱性磷酸酶的复合物中，37℃下孵育30分钟，用磁力架分离，取出上清液加入到含有纳米金及硝酸银的检测液中，2分钟后观察颜色变化或者利用紫外可见光谱仪进行定量检测。

4. 特异性实验

将步骤3中的H9N2禽流感病毒替换成高温灭活的新城疫病毒（NDV），H1N1和H5N1禽流感病毒作为阴性样品进行检测，记录370nm处的吸光度并与步骤3中的阳性样品进行比较。

5. 人工模拟样本检测

取健康的鸡心和鸡粪，用研钵捣碎，离心取上清，然后将H9N2病毒加入所得到的上清液中或者直接将病毒加入到鸡血清中，用免疫磁球按步骤3对上述溶液进行检测，用没有加入病毒的鸡心和鸡粪上清液或血清样品作为对照，比较检测结果。

二、结果

1、H9N2禽流感病毒的检测

检测H9N2禽流感病毒的原理如图1所示，采用免疫磁球作为固相载体捕获样品中的目标病毒，再分别与生物素化的目标病毒的抗体及链霉亲和素标记的碱性磷酸酶（SA-ALP）孵育，得到磁球-病毒-碱性磷酸酶复合物，最后利用磁性免疫夹心复合物表面的ALP催化Ag⁺在纳米金表面沉积形成Au/Ag纳米颗粒，从而通过检测液的颜色及紫外可见吸收光谱的变化实现对病毒定性和定量的检测。

如图2A所示，随着H9N2禽流感病毒浓度的增大，检测液的颜色从纳米金的红色逐渐变成纳米银的黄色，再进一步变成棕色甚至灰黑色。图2B所示的是紫外可见吸收光谱随着H9N2禽流感病毒的浓度变化的关系图，随着检测液中病毒浓度的增大，纳米银370nm处的表面等离子体共振吸收峰逐渐增加。并且370nm处的吸光度与病毒浓度在0.02 ng/mL ~ 20 ng/mL之间呈线性相关 (R²=0.998)，当病毒浓度超过20 ng/mL以后，检测液在370nm处的吸光度超过紫外可见光谱仪的量程。该方法所用时间约为1.5小时，检测限为17.5 pg/mL。

2、特异性

以几种禽类的常见的病毒作为对照进行检测，结果如图3所示，对照组的信号均在阴性域值的范围内，只有在H9N2禽流感病毒的存在下才会在370nm处产生大的吸收峰，证明该方法具有比较好的特异性。

3、人工模拟样本检测

在实际检测中，样品环境通常比较复杂，为了考察该检测方法在复杂体系中的应用，我们设计人工模拟样本，然后用该法进行检测，检测结果如图4，说明该法有望应用于复杂实际样品。

通过以上各项检测，证明本发明方法可以应用于禽流感病毒的检测，该方法灵敏度高、选择性好，而且不需要复杂的仪器。本发明方法还可以推广到其他的病原体检测。

Claims

1.一种非疾病诊断目的检测病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1) 将抗目标病毒表面蛋白的单克隆抗体连接到磁球表面，并用牛血清白蛋白进行封闭，得到免疫磁球；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，磁球表面有羧基功能团，采用EDC/NHS活化法将抗目标病毒表面蛋白的单克隆抗体共价偶联到磁球上。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所用磁球粒径均一，都为500nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒为H9N2禽流感病毒，所述单克隆抗体为H9N2禽流感病毒外膜的糖蛋白HA的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

③制备纳米金：所用的纳米金是利用氯金酸作为前体，谷胱甘肽作为配体，还原型辅酶Ⅱ作为还原剂制备而成的；

6.一种病毒检测试剂盒，包括：

2）生物素化目标病毒外膜的糖蛋白HA的抗体；

3）链霉亲和素标记的碱性磷酸酶；

4）对氨基磷酸酚作为碱性磷酸酶的底物；

5）含有纳米金的硝酸银溶液作为显色液。