CN101509919A

CN101509919A - 可用于squid检测的水溶性磁性纳米粒子的制备方法

Info

Publication number: CN101509919A
Application number: CNA2009100428545A
Authority: CN
Inventors: 贺全国; 曾蕾; 吴朝辉
Original assignee: Hunan University of Technology
Current assignee: Hunan University of Technology
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2009-08-19

Abstract

本发明公开了一种SQUID检测水溶性磁性纳米粒子的制备新方法。其特征在于通过在非磁性基片表面(如多孔板，凝胶玻片或膜片，微阵列玻片或膜片)修饰和有序组装O157抗原的抗体(或目标DNA)，利用生物识别结合二次捕获生物修饰后的超顺磁磁性纳米颗粒，实现了SQUID检测。没有与磁性纳米粒子结合的抗体(或目标DNA)基片检测不到磁信号(如图5曲线②所示)；而结合抗体(或目标DNA)的基片会产生一个缓慢衰减的磁信号(如图5曲线①所示)，通过SQUID采集磁信号即可分析出待检测物质量。因其衰减时间与有效结合抗原的抗体(或目标DNA)的超顺磁磁性纳米颗粒浓度相关。即可对磁性纳米粒子定量，此方法灵敏、准确，是一种操作简单、快速的新型检测方法。

Description

可用于SQUID检测的水溶性磁性纳米粒子的制备方法

所属技术领域

本发明涉及一种SQUID检测的水溶性磁性纳米粒子的制备新方法。

背景技术

超顺磁性纳米粒子是在近年发展起来的一种新型材料，由于磁性纳米粒子具有特殊的磁导向性、超顺磁性，以及表面可连接生化活性功能基团等特性，使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、细胞分离和酶固定化等领域的应用得到了广泛的发展，将这些性质应用到生物传感器中，可以显著提高生物传感器检测的灵敏度，缩短生化反应的时间，提高检测的通量，为生物传感器领域开辟了广阔的前景。近年来，由于金磁复合纳米颗粒具有制备简单、光学性能突出以及易于修饰等特点，以及成核材料所具有的磁学性质，使该类型复合材料在生物医学和分子生物学研究领域成为研究的热点。磁性纳米粒子越来越多的被用于生物医学领域，而其定量定性分析手段也备受关注。超导量子干涉仪(SQUID)以其较高的灵敏度、操作方便直观等优点迅速介入磁性纳米粒子的定性定量分析的领域。

SQUID的主要功能是测量磁场，它是利用测量相应的最大超导电流I_max的变化达到测量外界磁通量φ_外的微小变化的目的，从而测量出外界磁场。其实质是一种将磁通转化为电压的磁通传感器，是基于超导约瑟夫森效应和磁通量子化现象。原则上它可以测量出非常微弱的磁场，适用于能转换成磁信号的所有物理量的测量。可以检测最低限达10^-15T磁信号(如磁通量、电信号)。以SQUID为基础派生出各种传感器和测量仪器，可以用于测量磁场，电压，磁化率等物理量。它的应用范围十分广泛，包括用于超高灵敏磁强计、近磁场天线、极微弱电流或电压的测量等相关方面的地矿、物探、无损探测、天文、生物医学与临床诊断等领域。

2000年，Chenla等人发明了一种化学均相免疫分析检测新方法，他们采用超顺磁性纳米粒子负载抗体，通过SQUID检测磁滞信号，从而实现生物分子的定量检测。Weitschies等采用SQUID作为磁场感应器，发明了一种磁驰豫/剩磁免疫分析检测方法。

本发明中，采用SQUID的原理在于，由于磁性粒子的个数或浓度与病毒、抗体(生物分子)作用后，与被基片捕获组装后放大的磁信号相关，而且磁强范围落于SQUID检测的范围。基于磁性纳米粒子分离、磁性放大与SQUID检测的这种思路，我们可以实现磁性纳米粒子的超灵敏识别与定量分析。

发明目的

本发明的目的是为了提供一种SQUID检测水溶性磁性纳米粒子制备的新方法，以便定量检测磁性纳米粒子，实现磁性纳米粒子的用量检测，并且具有检测灵敏度高，时间短，操作简便等优点。

发明内容

本发明的目的通过下述方案实现：

1.金包覆的磁性纳米颗粒(Fe₃O₄)的制备：

(a)以共沉淀法制备Fe₃O₄。利用三价铁离子和二价铁离子的混合溶液，在碱(NaOH)的作用下，通过共沉淀法制得Fe₃O₄纳米粒子；然后，用氨基硅烷将所得的磁性粒子氨基化；再在金离子(Au³⁺)存在的条件下，利用超声化学法合成金包覆的Fe₃O₄纳米粒子。

2.金包覆磁粒表面生物功能化：

(b)利用巯基乙胺使得金磁粒表面修饰上巯基，在其表面形成巯基键(-SH)；然后，在戊二醛的作用下，使得金磁粒表面修饰上醛基，因为醛基易于键合吸附单抗，且便于金磁粒进行生物分子功能化。在此基础上，对其进行生物素-亲和素修饰。

3.金包覆磁粒负载抗原抗体(或DNA)与基片结合：

(c)将上述磁粒进行单抗化后，对大肠杆菌进行特异性吸附，捕获抗原后再与修饰有抗体的微小基片(基片可采用多孔板，凝胶玻片或膜片，微阵列玻片或膜片)组装，得到夹心锚定结构，使得基片上的磁性纳米粒子组装放大磁信号；即可得到SQUID检测体系A。

(d)或将上述生物素-亲和素修饰的磁粒，进行DNA连接，再与修饰有目标DNA的基片(基片可采用多孔板，凝胶玻片或膜片，微阵列玻片或膜片)组装，即可得到SQUID检测体系B。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明在整个实验过程中，都可以采用SQUID实现对磁性纳米粒子的检测，灵敏度高，操作精确，便捷。

2、通过磁性纳米颗粒富集分离、放大与SQUID检测的综合应用，实现病毒/病菌分子的超灵敏识别，方法简单，实用性强；课题原创思想新颖独特。

3、本发明采用超顺磁纳米粒子与抗原-抗体(DNA)之间的特异性结合，实现磁性纳米颗粒与致病菌/病毒粒子(DNA)之间的连接；采用基片表面功能化，实现纳米磁性颗粒在基片上的捕获、组装、富集，实现磁性信号的显著放大。

4、本发明涉及的超顺磁纳米粒子的SQUID检测，可以识别修饰或未修饰的磁性纳米粒子，检测灵敏，可以定量检测出参与反应的磁性纳米粒子。

具体实施方式

图1为实施方案I的流程图。

图2为实施方案II的流程图。

图3为实施方案III(A)的流程图。

图4为实施方案III(B)的流程图。

图5为SQUID检测磁信号与衰减时间之间的关系曲线(①抗体(或DNA)修饰磁性纳米粒子结合多孔膜片；②：未修饰结合磁性纳米粒子膜片；③：空白对照膜片)

实施方案I：

本发明涉及一种SQUID检测水溶性磁性纳米粒子的制备方法。具体如下：1)分别取2gFeCl₂·4H₂O和5.2g FeCl₃·6H₂O以及12.1mol/L的浓盐酸0.85mL溶解于200mL H₂O中，超声脱氧；然后将以上溶液滴加到250mL，0.75mol/LNaOH溶液中，所有反应在温度为80℃，搅拌，N₂保护下进行。随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀。反应结束后，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，可得到Fe₃O₄磁性纳米粒子。2)然后滴加0.4mLAPTES到以上混合溶液中，室温下搅拌7h；进行磁分离，得到APTES修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子。3)将15mL以上制备的溶液(1g/L，Fe₃O₄)、0.6mmol/L AuCl₃·HCl·4H₂O水溶液14mL分散到100mL去离子水中，搅拌均匀；滴加0.2mol/L柠檬酸纳溶液0.3mL，在一定的频率下，室温下超声直到反应溶液颜色由浅黄色逐渐变成黑色。得到金包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子。

实验方案II：

1)取20mg上述已经制备好的金磁粒子，置于一试管中，加入20mg/mL的半胱胺溶液，在室温条件下，通氩气保护，反应48h。2)再将10mL、12％的戊二醛水溶液添加到上述混合液中，在室温下，振荡均匀，孵化12h后，修饰上醛基的金磁粒被磁分离，使用PB缓冲液清洗3次。3)取100μL上述已经制备好的醛基化的磁性纳米粒子，加入20μL、2mg/mL的亲和素，孵育2h，亲和素因为共价耦合作用与醛基结合，使得磁性粒子表面修饰上亲和素。再缓慢加入0.5mg/ml的生物素溶液10mL，室温下，振荡反应2h，这样生物素被标记到磁性纳米粒子表面，形成亲和素-生物素系统的超顺磁磁性纳米粒子。

实施方案III：

A：1)取100μg上述金磁粒加入到2.5mL、10％的第一抗体的磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffer，PB，pH＝7.4)中，40℃下孵化2h，并将该溶液不断振荡混匀。通过醛基与单抗分子中的胺基官能团反应将后者连接到颗粒表面。取上述单抗化的金磁粒溶液25mL，置于一试管中，将其与10％的人工大肠杆菌菌液充分混合，在40℃温度下孵育2h，进行磁分离，用PB缓冲液清洗3次后，得到第一抗体-抗原-金磁粒复合体。3)向含有2.5mL，10％的第二抗体磷酸盐缓冲液的基材加入20mL上述磁粒，在室温下孵化1h，利用免疫夹心方式，捕获第二抗体，形成特殊的夹心锚定结构。由于修饰前后的磁场变化，即得到SQUID检测体系A，检测限为10^-5T磁信号。

B：1)将上述磁珠30mL加入到15mL细胞裂解液中(3mol/L NaI；5mol/L尿素；40g/L Triton X-100；10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl，pH＝6.5)，振荡后静置2min；然后加入15mL异丙醇，轻微的振荡混合；室温静置2min以形成磁珠-DNA的复合物；用磁力架固定磁珠，弃液体；加入10mLTris-EDTA溶液(10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HCl，pH＝8.0)室温放置10min洗脱DNA，然后用磁力架将磁珠固定，分离DNA洗脱液。2)再将磁珠-DNA的复合物20mL加入到修饰有目标DNA的微小基片中，进行识别捕获，即得到SQUID检测体系B，检测限为10^-5T磁信号。

Claims

1、一种SQUID检测水溶性磁性纳米粒子的制备新方法，包括下述步骤：

(a)以共沉淀法制备超顺磁性金包覆的Fe₃O₄。采用三价铁离子和二价铁离子的混合溶液，在碱(NaOH)的作用下，通过共沉淀法制得超顺磁Fe₃O₄纳米粒子；随后在氨基硅烷的作用下，将所得磁性粒子氨基化；再在金离子(Au³⁺)存在的条件下，利用超声化学法合成金包覆的Fe₃O₄纳米粒子。

(b)利用巯基乙胺使得金磁粒(Fe₃O₄)表面修饰上巯基，在其表面形成巯基键(-SH)；然后，在戊二醛的作用下，使得金磁粒表面修饰上醛基，因为醛基易于吸附键合单抗且和生物分子具有很好的相容性。再对其进行生物素-亲和素修饰。

(c)将上述磁粒进行单抗化后，对大肠杆菌进行特异性吸附，捕获抗原后再与经修饰有抗体的微小基片有序组装，使得基片上的磁性纳米粒子组装放大磁信号；即可得到SQUID检测体系A。

(d)或将生物素-亲和素修饰的磁粒，进行DNA连接，再与修饰有目标DNA的基片识别进行有序组装，即可得到SQUID检测体系B。

2、根据权利要求1所述的SQUID检测磁粒制备的方法，其特征在于采用化学共沉淀法制备的超顺磁金包覆磁性纳米粒子，有利于病菌抗原等生物分子的生物识别，改进了传统的方法。

3、根据权利要求1、2所述的SQUID检测的新方法，其特征在于，利用SQUID检测磁性纳米粒子在基片上经有序组装前后磁场变化，没有结合O157抗原的抗体(或目标DNA)基片检测不到磁信号；而结合O157抗原(或目标DNA)的磁性纳米粒子基片会产生一个缓慢衰减的磁信号，实现磁性纳米粒子的定性检测。

4、根据权利要求1、2、3中所述一种SQUID检测水溶性磁性纳米粒子的新方法，其特征在于通过SQUID采集的磁信号即可分析出待检测物质。因其磁信号衰减时间与有效结合抗原的抗体(或目标DNA)修饰的超顺磁磁性纳米颗粒浓度相关，实现了磁性纳米粒子的定量检测。