CN101165490A - 用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法 - Google Patents

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CN101165490A CNA2006101047528A CN200610104752A CN101165490A CN 101165490 A CN101165490 A CN 101165490A CN A2006101047528 A CNA2006101047528 A CN A2006101047528A CN 200610104752 A CN200610104752 A CN 200610104752A CN 101165490 A CN101165490 A CN 101165490A
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崔亚丽
陈超
付强
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Abstract

一种用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其以金磁微粒作为反应和分离的固相载体，将抗体或抗原偶联在金磁微粒的表面，使包被于磁微粒表面的抗体或抗原与血清中特异性抗原或抗体结合，形成抗原－抗体复合物，再将金磁微粒表面的抗原－抗体复合物与标记物标记的特异性抗原或抗体结合，通过相应的检测系统，即可对待测生物分子进行定性或定量检测。本发明以金磁微粒替代酶标板作为固相载体，解决了背景技术中固定容量较小、灵敏度相对较低、偶联的生物分子的活性易受损的技术问题，具有无污染、检测速度快、特异性高、重复性好等特点，将纳米、微米级金磁微粒合成技术与磁分离技术相结合，大大提高了传统酶联免疫反应的敏感性和方便性。

Description

用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法
技术领域
本发明属免疫学检测领域，具体涉及一种以金磁微粒为载体对体液中生物分子进行免疫学检测的方法。
背景技术
传统的检测体液中生物分子的方法大多采用以聚苯乙烯等材料为载体的酶联免疫检测法，比种方法较为简便，但它的不足之处在于检测的灵敏度较差，反应时间较长。
磁性微粒，又称磁性微球或磁珠，是由超顺磁性纳米粒子，包括磁性金属如Fe、Co、Ni或其金属氧化物等，与高分子或无机材料等形成的一种胶态液体复合物，它除具有纳米颗粒的特征外，还可以通过表面的功能基团进行各种表面的功能化修饰；而且，它具有顺磁性，可在外加磁场的作用下快速移动和分离。基于以上特点，磁性微粒已广泛应用于生物学、医学等领域。
磁性复合微粒应用于传统的免疫学检测方法中，以磁生微粒作为载体，磁性微粒提供巨大的表面积和磁分离性，而结合于磁性微粒表面的蛋白质能提供特异性的亲和特性，所以在外加磁场的定向控制下，通过吸附、清洗、解吸等操作，可以一步从复杂的生物体系中分离得到目标生物分子，具有磁性分离简便、亲和吸附高特异性以及巨大表面积的高敏感性等众多优点。
磁性微粒大多以磁性金属氧化物作为核心，在其表面包覆一层有机聚合物等，通过有机聚合物表面的功能基团与相应的生物分子进行共价偶联，然后用于免疫学检测。但此种方法会使得偶联的生物分子的活性受损，且偶联的条件较苛刻，限制了其在检测系统中的应用。中国专利ZL 03124061.5和ZL 03153486.4分别公开了一种组装型结构及核/壳型结构的磁性复合微粒的制备和应用。由于其表面包覆着纳米级的金、银等贵金属颗粒，可以使得蛋白质或抗体等分子通过半胱氨酸的-SH、表面疏水相互作用或电荷作用等牢固的固定在其表面，条件温和、对生物分子的固定容量较大，并且可以最大限度地保持偶联后生物分子的活性，这样可以大大提高检测的灵敏度。但其检测时间一般在12小时以上，检测方法也有局限性。
传统的酶联免疫检测方法是把所需的蛋白质标记于面积有限的固相载体上，限制了此种方法的敏感性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其解决了背景技术中检测所用时间长以及固定容量较小、灵敏度相对较低、偶联的生物分子的活性易受损的技术问题。
本发明的技术解决方案如下：
一种用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其实现步骤包括：
(1)固定：以金磁微粒为反应和分离的固相载体，将抗原或抗体偶联在金磁微粒的表面；所述将抗原或抗体偶联在金磁微粒表面的方法包括：
(1.1)预处理：取金磁微粒，用偶联缓冲液清洗1～3次；
(1.2)偶联：将需要偶联的抗原或抗体溶解于偶联缓冲液中，混匀，加入到经预处理的金磁微粒中，置于摇床中，在20～40℃，170～190rpm条件下充分反应；反应完毕，磁性分离，弃上清；
(1.3)平衡：用平衡缓冲液清洗1～2次，磁性分离，弃上清；
(2)封闭：用封闭液，在20～40℃，170～190rpm条件下，在摇床中封闭反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与抗原或抗体偶联的空余位；磁性分离，弃上清；用清洗缓冲液清洗2～4次，悬于保存缓冲液中保存备用；
(3)与待测物结合：使包被在金磁微粒表面的抗原或抗体与体液中特异性的抗原或抗体结合，形成特异性抗原-抗体复合物；
(4)磁性分离：通过外加磁场将分离出特异性抗原-抗体复合物；
(5)与标记物结合：将金磁微粒表面的特异性抗原-抗体复合物与带标记物的特异性抗原或抗体相结合；
(6)检测：根据待测物及标记物用相应的检测方式检测。
上述预处理是取金磁微粒，先加入偶联缓冲液平衡1～2min，弃上清，再用偶联缓冲液清洗1～3次。
上述用封闭液封闭金磁微粒表面未与抗原或抗体偶联的空余位，在摇床中的反应时间，经反复实验、对比、分析，1小时是确保最佳效果的最短时间。
上述检测方式可采用酶联免疫吸附实验、化学发光检测法或荧光免疫分析法。其中，化学发光检测法灵敏度较高，荧光免疫分析法的灵敏度更高。
上述保存缓冲液可选自pH7.0～9.0 0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.00.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～11 0.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.60.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.0 0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.00.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.0 0.005M～1M的TBS缓冲液之任一种。
上述保存缓冲液可含有防腐剂和保护剂的偶联缓冲液。
上述防腐剂以选用对金磁微粒磁性无影响的0.01～0.1％的叠氮钠或0.01～0.1％的硫柳汞为佳，所述的保护剂以选用对金磁微粒磁性无影响的0.05～1％BSA、0.05～1％的动物血清或蛋白酶抑制剂为佳。
上述清洗缓冲液可选自pH7.0～9.0 0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.00.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～11 0.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.60.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.0 0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.00.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.0 0.005M～1M的TBS缓冲液之任一种；或再加入0.02～0.2％的吐温偶联缓冲液。吐温偶联缓冲液以0.05％为最佳。
上述封闭液可选自牛血清白蛋白、赖氨酸、脱脂奶粉、乙醇胺或动物血清之任一种，或其任2～3种的混合物；所述封闭液的浓度为1～10％；上述偶联缓冲液可选自pH7.0～9.0 0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0 0.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～11、0.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.6 0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.00.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.0 0.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.00.005M～1M的TBS缓冲液之任一种；上述平衡缓冲液可选自0.5×～10×的PBS缓冲液或0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液。
本发明具有如下优点：
1.本发明具有检测速度快，特异性高，稳定、重复性好，无放射性污染的特点。
2.金磁微粒作为免疫学检测载体时，可以明显提高检测的灵敏度、稳定性等：(1)在没有磁场存在的情况下，金磁微粒稳定悬浮在液体中，使得抗原抗体反应类似于均相反应，可以加速抗原-抗体复合物的形成。(2)金磁微粒内部含有纳米级超顺磁性粒子，在外加磁场的作用下可方便地分离，因此洗涤快速、简便；(3)金磁微粒具有较大的比表面积，可以包被较大量的抗原或抗体，检测的灵敏度高、范围宽。在需要宽范围定量的测定中，即使高浓度的标本亦无需稀释，可直接测定结果，简化操作，避免稀释误差和基质效应。
3.金磁微粒兼具超顺磁性在磁场作用下易于分离、金、银表面极易与巯基化寡核苷酸、蛋白质、多糖等生物活性物质结合而易被修饰的优点，而且对生物分子的固定条件温和，固定容量较大，可以最大限度的保持偶联后生物分子的活性，因此，大大提高了检测方法的敏感性和方便性，易于实现大规模、自动化检测。
附图说明
图1为本发明金磁微粒偶联乙肝病毒表面抗原的特异性抗体前后的紫外吸收曲线。
图2为本发明检测人白细胞介素-8(IL-8)的标准曲线。
图3为本发明与传统ELISA法在检测梅毒螺旋体抗体时的灵敏度比较。
具体实施方式
本发明的金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。磁性纳米粒子包括Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子，单质Fe、Co、Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质Fe、Co、Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。
本发明的实现步骤如下：
(1)固定：以金磁微粒为反应和分离的固相载体，将抗原或抗体偶联在金磁微粒的表面。将抗原或抗体偶联在金磁微粒表面的方法包括：
(1.1)预处理：取金磁微粒，用偶联缓冲液清洗1～3次。预处理也可取金磁微粒，先加入偶联缓冲液平衡1～2min，弃上清，再用偶联缓冲液清洗1～3次。偶联缓冲液可选自pH7.0～9.0 0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0 0.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～11、0.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.6 0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.0 0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.0 0.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.0 0.005M～1M的TBS缓冲液之任一种。
(1.2)偶联：将需要偶联的抗原或抗体溶解于偶联缓冲液中，混匀，加入到经预处理的金磁微粒中，置于摇床中，在20～40℃，180rpm条件下充分反应。反应完毕，磁性分离，弃上清。
(1.3)平衡：用平衡缓冲液清洗1～2次，磁性分离，弃上清。平衡缓冲液可选用0.5×～10×的PBS缓冲液或0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液。
(2)封闭：用封闭液，在20～40℃，180rpm条件下，在摇床中封闭反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与抗原或抗体偶联的空余位。磁性分离，弃上清。用清洗缓冲液清洗2～4次，悬于保存缓冲液中保存备用。经反复实验、对比、分析，在摇床中封闭反应1小时是确保最佳效果的最短时间。
封闭液可选自牛血清白蛋白、赖氨酸、脱脂奶粉、乙醇胺或动物血清之任一种，或其任2～3种的混合物。封闭液的浓度为1～10％。动物血清一般取小牛血清或山羊血清等。清洗缓冲液可选自pH7.0～9.0 0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.00.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～11 0.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.60.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.0 0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.00.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.0 0.005M～1M的TBS缓冲液之任一种；或还含有0.02～0.2％的吐温偶联缓冲液。含0.02～0.2％的吐温偶联缓冲液，清洗更彻底，可使检测灵敏度更高。吐温偶联缓冲液以0.05％为最佳。保存缓冲液可选自pH7.0～9.00.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0 0.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～110.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.6 0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.00.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.0 0.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.00.005M～1M的TBS缓冲液之任一种。长时间保存，保存缓冲液中应加入防腐剂和保护剂。防腐剂以选用对金磁微粒磁性无影响的0.01～0.1％的叠氮钠或0.01～0.1％的硫柳汞为佳，保护剂以选用对金磁微粒磁性无影响的0.05～1％BSA、0.05～1％的动物血清或蛋白酶抑制剂为佳。
(3)与待测物结合：使包被在金磁微粒表面的抗原或抗体与体液中特异性的抗原或抗体结合，形成特异性抗原-抗体复合物。
(4)磁性分离：通过外加磁场将分离出特异性抗原-抗体复合物。
(5)与标记物结合：将金磁微粒表面的特异性抗原-抗体复合物与带标记物的特异性抗原或抗体相结合。
(6)检测：根据待测物及标记物用相应的检测方式检测。酶联免疫吸附实验(ELISA)的标记物为酶，可以分为：①双抗体夹心法测抗原，②双抗原夹心法测抗体，③间接法测抗体，④竞争法测抗体或抗原，⑤捕获包被法测抗体，⑥运用亲和素-生物素系统的ELISA法等。化学发光检测法的标记物为酶，灵敏度较高。荧光免疫分析法的标记物为荧光物质，灵敏度更高。
本发明抗原或抗体可取自血液、唾液或尿液等。
实施例1：乙肝病毒表面抗原的特异性抗体的固定。
(1)预处理：取5mg/ml的金磁微粒200μl，用pH7.4的Tris-HCl偶联缓冲液清洗2次，每次用量0.4ml。
(2)偶联：将10μg需要偶联的抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗体溶解于400μl偶联缓冲液中，混匀后加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，于37℃ 180rpm的条件充分反应20min。反应完毕，磁性分离，弃上清。
(3)平衡：加入400μl 1×PBS平衡缓冲液，磁性分离，弃上清。
(4)封闭：加入1ml封闭液，以37℃，180rpm的条件在摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用3ml磷酸盐清洗缓冲液加0.05％的吐温20清洗3次，最后悬于1ml保存缓冲液中，4℃保存备用。固定化前后的紫外吸收曲线见图1。
实施例2：检测血清/浆中梅毒螺旋体抗体。
(1)固定、封闭：取100μl、5mg/ml的金磁微粒置于磁性分离架上，加入0.02M、pH＝7.4、200μl Tris-HCl偶联缓冲液平衡2min，弃上清。加入400μl Tris-HCl偶联缓冲液洗涤磁粒，磁性分离，弃上清，重复两次。加入TPN15、TPN17及TPN47三种抗原，用Tris-HCl偶联缓冲液定容至200μl，将装有金磁微粒和抗原的离心管置于摇床，于37℃、180rpm充分反应30min，反应完毕，取出置磁性分离架上，磁性分离弃上清，400μl Tris-HCl平衡缓冲液洗涤两次，弃上清。加入1ml含20％小牛血清、4％脱脂奶粉、溶于Tris-HCl的封闭液，在摇床中37℃、180rpm反应1h以封闭金磁微粒表面的空位点，磁性分离，弃上清，在金磁微粒中加入1ml Tris-HCl清洗缓冲液清洗两次后，用保存缓冲液于4℃保存。
(2)与待测物结合、进行检测：取30μl包被含TP包被抗原400ng的金磁微粒分别加入各反应管中，磁性分离弃上清，在相应孔内加入阳性血清，阴性血清各50μl，每孔各加入稀释的HRP标记抗原，空白孔不加任何液体，振荡混匀，37℃孵育30min，用PBS-T洗涤五遍，磁性分离弃上清，加入显色液A和显色液B各50μl，显色10min，加入100μl终止液，磁性分离后移取100μl上清至酶标条中，用酶标仪检测各管溶液在450nm处的吸光度值。本发明检测灵敏度与传统ELISA法的比较见表1。
实施例3：检测血清/浆中人白细胞介素-8(IL-8)。
(1)预处理：将抗IL-8单克隆抗体的腹水经45％硫酸胺初步纯化、透析后直接包被于金磁微粒表面。取0.4ml金磁微粒，磁性分离，弃上清，用0.4ml的0.02M、pH7.4的Tris-HCl偶联缓冲液清洗2次，以平衡磁粒的pH。
(2)偶联：取70μg抗体溶液，溶于Tris-HC偶联缓冲液中，加入磁粒中，放入摇床上反应，170rpm、37℃、20min。
(3)平衡：包被有抗体的磁粒分别用含0.001M的EDTA·2Na pH7.4的0.01M的Tris-HCl清洗缓冲液、0.5×的PBS平衡缓冲液清洗一次。
(4)封闭：取溶于PBS的5％脱脂奶粉1ml加入磁粒中，放入摇床反应，170rpm，37℃，2h，以封闭磁粒；用含0.05％吐温20的PBS清洗缓冲液清洗3次；最后，将磁粒保存在2ml含0.2％BSA的PBS保存缓冲液中，4℃保存。
(5)与待测物结合、进行检测：取40μl包被有抗IL-8单克隆抗体的磁粒于各反应管中，用PBS-T清洗一次。加入100μl各浓度梯度的IL-8待测标准品，于37℃温育，PBS-T清洗磁粒3次；加入50μl酶标抗体，于37℃温育。PBS-T清洗6次，
(6)进行检测：以底物TMB显色，2M H2SO4终止反应，用酶标仪测定450nm/630nm下各孔吸光度值。以IL-8待测标准品测定所得的标准曲线见图2。

Claims (9)

1.一种用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，它的实现步骤包括：
(1)固定：以金磁微粒为反应和分离的固相载体，将抗原或抗体偶联在金磁微粒的表面；所述将抗原或抗体偶联在金磁微粒表面的方法包括：
(1.1)预处理：取金磁微粒，用偶联缓冲液清洗1～3次；
(1.2)偶联：将需要偶联的抗原或抗体溶解于偶联缓冲液中，混匀，加入到经预处理的金磁微粒中，置于摇床中，在20～40℃，170～190rpm条件下充分反应；反应完毕，磁性分离，弃上清；
(1.3)平衡：用平衡缓冲液清洗1～2次，磁性分离，弃上清；
(2)封闭：用封闭液，在20～40℃，170～190rpm条件下，在摇床中封闭反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与抗原或抗体偶联的空余位；磁性分离，弃上清；用清洗缓冲液清洗2～4次，于保存缓冲液中保存备用；
(3)与待测物结合：使包被在金磁微粒表面的抗原或抗体与体液中特异性的抗原或抗体结合，形成特异性抗原-抗体复合物；
(4)磁性分离：通过外加磁场将分离出特异性抗原-抗体复合物；
(5)与标记物结合：将金磁微粒表面的特异性抗原-抗体复合物与带标记物的特异性抗原或抗体相结合；
(6)检测：根据待测物及标记物用相应的检测方式检测。
2.根据权利要求1所述的用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，所述的预处理是取金磁微粒，先加入偶联缓冲液平衡1～2min，弃上清，再用偶联缓冲液清洗1～3次。
3.根据权利要求1或2所述的用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，所述的用封闭液封闭金磁微粒表面未与抗原或抗体偶联的空余位，在摇床中的反应时间为1小时。
4.根据权利要求3所述的用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，所述的检测方式为酶联免疫吸附实验、化学发光检测法或荧光免疫分析法。
5.根据权利要求4所述的用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，所述的保存缓冲液选自pH7.0～9.0  0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0  0.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～11  0.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.60.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.0  0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.00.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.0  0.005M～1M的TBS缓冲液之任一种。
6.根据权利要求5所述的用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，所述的保存缓冲液是含有防腐剂和保护剂的偶联缓冲液。
7.根据权利要求6所述的用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，所述的防腐剂选自0.01～0.1％的叠氮钠或0.01～0.1％的硫柳汞，所述的保护剂选自0.05～1％BSA、0.05～1％的动物血清或蛋白酶抑制剂。
8.根据权利要求5所述的用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，所述的清洗缓冲液选自pH7.0～9.0  0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0  0.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～11  0.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.60.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.0  0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.00.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.0  0.005M～1M的TBS缓冲液之任一种；或还含有0.02～0.2％的吐温偶联缓冲液。
9.根据权利要求8所述的用金磁微粒对体液中生物分子进行免疫学检测的方法，其特征在于，所述的封闭液选自牛血清白蛋白、赖氨酸、脱脂奶粉、乙醇胺或动物血清之任一种，或其任2～3种的混合物；所述封闭液的浓度为1～10％；所述的偶联缓冲液选自pH7.0～9.0  0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0  0.5×～10×的PBS缓冲液、pH9.0～11、0.005M～1M的CBS缓冲液、pH3.6～5.6  0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH3.0～7.0  0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.0  0.005M～1M的TE缓冲液或pH7.0～9.0  0.005M～1M的TBS缓冲液之任一种；所述的平衡缓冲液选自0.5×～10×的PBS缓冲液或0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液。
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