CN102608324B - 基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法，包括以下步骤：将ZEN半抗原与OVA偶联，得到偶联物ZEN-OVA，再与biotin偶联，得到偶联物OVA-ZEN-biotin；将抗ZEN单克隆抗体与免疫磁珠结合；将抗体-磁珠结合物加入EP管中，洗涤，将待侧样品的萃取液加入上述EP管中，震荡，去除上清液，洗涤，再加入OVA-ZEN-biotin，震荡，去除上清液，洗涤，再加入SA-HRP，震荡，去除上清液，洗涤，最后加入发光底物，震荡，测定发光值；制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的ZEN浓度。本发明采用抗ZEN单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，特异性强，减少了假阳性率。

Description

基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法

技术领域

本发明涉及一种生物检测工程技术领域的方法，具体是一种快速检测谷物类、谷物类相关产品、饲料中玉米赤霉烯酮的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone，ZEN)是镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物。玉米赤霉烯酮毒素可存在于玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦等谷物，也可存在于食用含ZEN饲料的动物组织中，包括牛奶、鸡蛋等。玉米赤霉烯酮毒素与自发性乳腺癌，输卵管和子宫水肿、增生，精细胞畸变、凋亡等疾病有关。玉米赤霉烯酮毒素具有分布广泛、残留时间长、难处理、和其他毒素一起有增强毒性的现象。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种快速简便的玉米赤霉烯酮毒素检测方法。

化学发光(Chemiluminescence，CL)早在19世纪80年代就得到证实，即在化学反应过程中瞬间以释放光子的形式放出能量。后发展出放射免疫分析技(Radioimmunoassay，RIA)，因其高灵敏度和高特异性而受到普遍应用。CLIA是在RIA基本理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。近年来发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，显著优于放射免疫分析和酶联免疫分析。

化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay，CLEIA)属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免疫分析完全相同：以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。在酶促化学发光免疫分析中可供标记的酶有很多，目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。

免疫磁酶技术是将IgG标记在标记有Protein A的磁珠上，进行酶联免疫方法的技术。其优势是利用磁珠的富集作用，检测较大体积溶液中的微量抗原。链霉亲和素-生物素系统在方法中使用，是由于链霉亲和素可以和4个生物素稳固结合，因此在信号放大方面被广泛使用。

关于玉米赤霉烯酮毒素检测，国内外已建立了多种方法。目前检测ZEN的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，液谱和质谱联用法(LC-MS)和ELISA方法。然而，这些方法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。已有的检测玉米赤霉烯酮毒素的ELISA试剂盒，在检测灵敏度上不及本发明的超灵敏化学发光ELISA方法，因此本方法对保障谷物类食品的安全具有更重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法，本发明检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高。并且由于本发明采用抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，将ZEN半抗原与OVA偶联，得到偶联物ZEN-OVA，再与biotin偶联，得到偶联物OVA-ZEN-biotin；

步骤二，将抗ZEN单克隆抗体与免疫磁珠结合，得到抗体-磁珠结合物；

步骤三，将所述抗体-磁珠结合物加入EP管中，用洗涤液洗涤，对待侧样品进行萃取，将待侧样品的萃取液稀释后加入上述管中，震荡；

步骤四，去除上清液，用洗涤液洗涤，再加入所述OVA-ZEN-biotin，震荡；

步骤五，去除上清液，用洗涤液洗涤，再加入SA-HRP，震荡；

步骤六，去除上清液，用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；

步骤七，根据已知不同浓度ZEN与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到样品中的ZEN浓度。

优选地，在所述步骤一中，所述ZEN半抗原与所述OVA的偶联通过活泼酯法完成。

优选地，在所述步骤一中，所述偶联物ZEN-OVA与所述biotin的偶联通过活泼酯法完成。

优选地，在所述步骤三中，所述洗涤液为pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液。

优选地，在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。

优选地，在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1∶10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。

进一步优选地，所述稀释液为pH 8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。

优选地，在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡30分钟。

优选地，在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡1分钟。

优选地，在所述步骤七中，所述标准曲线的做法为：以加入ZEN浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度ZEN所得到的不同发光值除以不加入ZEN所得到的发光值为纵坐标，通过Microsoft Excel软件，做出散点图并添加趋势线公式和R²；

本发明具有如下的有益效果：本发明是鉴于待测样品若有ZEN毒素，由于ZEN和免疫磁珠上的抗ZEN单克隆抗体特异性结合，而卵清蛋白(OVA)与ZEN和生物素(biotin)的偶联物OVA-ZEN-biotin加入反应体系中后，可以和未被ZEN结合的单克隆抗体结合。而且在加入链霉亲和素(SA)偶联的辣根过氧化物酶(HRP)后，HRP再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。由于待测样品中含有的ZEN的量与发光检测结果有线性关系，因此可以通过标准曲线算出待测样品中含有的ZEN的量。本发明检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高。并且由于本发明采用抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。

附图说明

图1为本发明实施例原理的示意图；

图2为本发明实施例检测的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

步骤一，玉米赤霉烯酮包被抗原(OVA-ZEN)的制备

取0.33ml(3mg/ml)ZEN，混合于1.2ml吡啶中，加入2mg O-羧甲基羟胺，室温搅拌反应24h。真空干燥后，加入4ml蒸馏水，并使其溶解，调整pH至8.0。未反应的ZEN用苯抽提除去(3ml苯，共抽提3次)，除去苯相，保留水相。水相调pH至3.0，用乙酸乙酯抽提(10ml乙酸乙酯，共抽提4次)，抽出酯相，弃水相。酯相用无水硫酸钠滤过后吹干。吹干后的结晶物溶于0.5ml碱性氧化铝处理过的二氧六环中。称取10mg OVA溶于0.7ml 0.05mol/L(pH7.2)的PBS中，将两溶液于4℃缓慢混合。1mg N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)和2mg N、N’-二环己碳二亚胺(DCC)溶于0.2ml二氧六环中，并缓慢滴加此溶液。将混合后的溶液放置室温搅拌反应16h。调pH至6.0，通风橱中吹干，缓慢滴加DCC溶液(2mg DCC溶于0.2ml二氧六环中)。室温搅拌反应48h。最后用PBS透析2～3d，-20℃保存。

步骤二，OVA-ZEN-biotin的制备

0.1mg NHS-biotin加入至含有1mg/ml OVA-ZEN的0.01mol/L碳酸氢钠缓冲液中，搅拌混匀后，缓慢加入0.2mg DCC溶液(溶于0.2ml二氧六环中)，将混合后的溶液放置室温搅拌反应48h。最后用PBS透析2～3d，-20℃保存。

步骤三，抗ZEN单克隆抗体与免疫磁珠结合

取免疫磁珠50μl，使用洗涤液(0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7.4)洗涤3次后，加入含5μg抗ZEN单克隆抗体的结合缓冲液(0.1M磷酸缓冲液，pH 8.2，含0.01％Tween-20)200μl，室温震荡反应30分钟。再使用洗涤液洗涤3次，最后加入结合缓冲液，-4℃保存。

步骤四，化学发光ELISA检测待测样品萃取液

(1)将抗体-磁珠结合物稀释至一定浓度后取50μl加入EP管中，使用洗涤液洗涤3次。取0.3g样品，加入3ml 70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min。上清液通过快速定性滤纸过滤，使用结合缓冲液(0.1M磷酸缓冲液，pH 8.2，含0.01％Tween-20)稀释5倍后，取1ml加入含有抗体-磁珠的管中，室温震荡反应30分钟，其中在标准曲线孔中依次加入1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.001、0ng/ml的ZEN纯品1ml，并做3次重复；在待测孔中加制备的待测样品萃取液1ml，并做3次重复，空白孔中不加入抗体-磁珠结合物，如图2所示。

(2)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤3次后，将OVA-ZEN-biotin使用结合缓冲液稀释至一定浓度后，取200μl加入EP管中，室温震荡反应30分钟。

(3)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤3次后，将SA-HRP使用结合缓冲液稀释至一定浓度后，取200μl加入EP管中，室温震荡反应30分钟。

(4)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤后加入发光底物(鲁米诺+对碘酚)200μl，室温震荡反应1分钟后吸出，加入96孔板中，用发光信号测定仪进行发光测定，得到结果。

如图1所示，磁珠1与Protein A 2结合，抗ZEN单克隆抗体3分别与Protein A 2和SA-HRP 5结合，OVA-ZEN-biotin 4与SA-HRP 5结合。

步骤五，检测ZEN的标准曲线的制作与结果判定

(1)根据已知不同浓度ZEN与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入后，得到的发光值，绘制标准曲线，具体做法为：以加入ZEN浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度ZEN所得到的不同发光值的平均数，除以不加入ZEN(空白)所得到的发光值为纵坐标，通过Microsoft Excel软件，绘制散点图并添加趋势线公式和R²。

(2)根据待测样品的发光值的平均值，通过标准曲线所得到的趋势线公式计算，得到对应的ZEN浓度。

Claims (6)

1.一种基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，将ZEN半抗原与OVA偶联，得到偶联物ZEN-OVA，再与biotin偶联，得到偶联物OVA-ZEN-biotin；

步骤二，将抗ZEN单克隆抗体与免疫磁珠结合，得到抗体-磁珠结合物；

步骤三，将所述抗体-磁珠结合物加入EP管中，用洗涤液洗涤，对待测样品进行萃取，将待测样品的萃取液稀释后加入上述管中，震荡；所述洗涤液为pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液；所述震荡步骤为室温震荡30分钟；

步骤四，去除上清液，用洗涤液洗涤，再加入所述OVA-ZEN-biotin，震荡；

步骤五，去除上清液，用洗涤液洗涤，再加入SA-HRP，震荡；

步骤六，去除上清液，用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；所述震荡步骤为室温震荡1分钟；

步骤七，根据已知不同浓度ZEN与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到样品中的ZEN浓度；所述标准曲线的做法为：以加入ZEN浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度ZEN所得到的不同发光值除以不加入ZEN所得到的发光值为纵坐标，通过Microsoft Excel软件，做出散点图并添加趋势线公式和R²。

2.如权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述ZEN半抗原与所述OVA的偶联通过活泼酯法完成。

3.如权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述偶联物ZEN-OVA与所述biotin的偶联通过活泼酯法完成。

4.如权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。

5.如权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1：10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。

6.如权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，所述稀释采用的稀释液为pH8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。