CN116008524A

CN116008524A - 一种无蛋白通用型保护液及其制备方法和在真菌毒素定量检测试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN116008524A
Application number: CN202310019419.0A
Authority: CN
Inventors: 刘洪美; 王松雪; 叶金; 倪保霞; 轩志宏
Original assignee: Academy of National Food and Strategic Reserves Administration
Current assignee: Academy of National Food and Strategic Reserves Administration
Priority date: 2023-01-06
Filing date: 2023-01-06
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明公开了一种无蛋白通用型保护液及其制备方法和在真菌毒素定量检测试剂盒中的应用，其中，该无蛋白通用型保护液除不含蛋白成分以外，包括如下组分：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸溶液、水溶性高分子化合物、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、表面活性剂、防腐剂、还原剂、海藻糖、甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、甘油和超纯水。本发明提供的无蛋白通用型保护液，通过组分间配合可最大限度地延长真菌毒素检测试剂盒中各种生物分子的保存期，进一步增加生物大分子的稳定性；同时消除非特异蛋白的相互作用，降低背景，凸显特异性信号，提高灵敏度。可用作免疫分析中各种生物大分子的保护液，缓冲液和稀释剂，具有优越的通用性。

Description

一种无蛋白通用型保护液及其制备方法和在真菌毒素定量检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域。更具体地，涉及一种无蛋白通用型保护液及其及其制备方法和在真菌毒素定量检测试剂盒中的应用。

背景技术

目前，许多基于色谱的分析技术已经发展成为测定真菌毒素的标准方法，例如，高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法等，这些检测方法具有灵敏高、准确性好的优点。然而，这些方法通常需要大型的实验设备、复杂的样品前处理、繁琐的操作过程和熟练的专业技术人员才能完成，这大大限制了大量实际样品中真菌毒素检测的效率。酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金层析法是现行快速检测中最常用的方法，但是这两种方法均为基于抗体、抗原特异性结合反应的免疫分析法，在检测试剂盒的生产中，需要使用保护液对抗体和抗原等进行相关保护，以使商品化试剂盒拥有更长的货架期。目前的保护液通常含有牛血清白蛋白、血清、卵白蛋白和酪蛋白等蛋白成分，且不可避免的代入IgG、IgY等免疫球蛋白，相关研究表明牛血清白蛋白，卵白蛋白等蛋白成分与部分真菌毒素抗原，尤其是赭曲霉毒素A(OTA)抗原之间存在交叉反应，产生高背景，使得本底水平增高，导致真菌毒素的检测灵敏度无法满足实际需求。

针对以上问题，开发一种新型无蛋白通用型保护液，避免真菌毒素抗原与蛋白成分之间的交互作用，对提高免疫分析检测的灵敏度和准确性具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于真菌毒素检测试剂盒的无蛋白通用型保护液。该无蛋白通用型保护液可广泛用于各种基于抗体、抗原特异性结合反应的免疫分析中生物大分子的保护，能最大限度地延长真菌毒素检测试剂盒中生物分子的保存期，同时由于该保护液不含蛋白成分，可以消除非特异蛋白的相互作用，降低背景，凸显特异性信号，进而提高真菌毒素检测试剂盒的检测灵敏度和准确性。

本发明的第二个目的在于提供一种上述无蛋白通用型保护液的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种包含上述无蛋白通用型保护液的真菌毒素检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

第一方面，本发明提供一种无蛋白通用型保护液，该保护液不含蛋白成分，包括如下组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液、水溶性高分子化合物、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO₄)、表面活性剂、防腐剂、还原剂、海藻糖、甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、甘油和超纯水。

优选地，在上述无蛋白通用型保护液中，各组分的浓度如下：4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液0.5mol/L-5mol/L、水溶性高分子化合物10mg/mL-80mg/mL、氯化钠1mg/mL-10mg/mL、氯化钾0.5mg/mL-5mg/mL、硫酸镁0.1mg/mL-1mg/mL、表面活性剂2.5mg/mL-10mg/mL、防腐剂0.1mg/mL-2mg/mL、还原剂0.01mg/mL-0.1mg/mL、海藻糖5mg/mL-30mg/mL、甘氨酸1mg/mL-20mg/mL、聚乙烯吡咯烷酮3mg/mL-6mg/mL、甘油4mg/mL-50mg/mL。

优选地，所述水溶性高分子化合物为末端连接寡氨短链的PEG分子。

优选地，所述无蛋白通用型保护液的pH值在6.5-8.2范围内。

优选地，所述表面活性剂为吐温20(Tween 20)、吐温80(Tween 80)、聚氧乙烯月桂醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、Tritonx-100、泊洛沙姆188和甘油脂肪酸酯中的一种或多种的组合。

优选地，所述防腐剂为叠氮化钠、Procline 200、Proclin300和BND-10中的一种或多种的组合。

优选地，所述还原剂为亚硫酸钠、维生素C、二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸钠和β-巯基乙醇中的一种或多种的组合。

第二方面，本发明提供了一种上述无蛋白通用型保护液的制备方法，包括以下步骤：将各组分混合均匀，调节pH值，随后使用滤膜进行过滤，即得。

优选地，所述滤膜的孔径为0.22μm。

第三方面，本发明提供了一种真菌毒素检测试剂盒，包括有上述无蛋白通用型保护液。

优选地，所述真菌毒素检测试剂盒中包括有：碱性磷酸酶(ALP)标记的真菌毒素抗体溶液、生物素标记的真菌毒素抗原溶液、链霉亲和素标记的磁微粒溶液、清洗液和发光底物；其中，所述碱性磷酸酶标记的真菌毒素抗体溶液、生物素标记的真菌毒素抗原溶液和链霉亲和素标记的磁微粒溶液以上述无蛋白通用型保护液为保护液。

需要说明的是，本发明提供的真菌毒素检测试剂盒采用竞争法测定食品、农产品及饲料等样本中真菌毒素的含量。赭曲霉毒素A(OTA)为例，其检测过程具体为：样本中真菌毒素和生物素标记的真菌毒素抗原竞争数量有限的ALP标记的真菌毒素抗体，通过链霉亲和素和生物素的亲和反应以及抗原抗体反应，分别形成磁微粒-链霉亲和素-生物素标记的真菌毒素抗原-ALP标记的真菌毒素抗体复合物和真菌毒素-ALP标记的真菌毒素抗体复合物。经洗涤，在复合物中加入发光底物，发光底物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，产生的光子数与样本中真菌毒素的浓度成负相关(机理图可参见图1)。

优选地，上述真菌毒素检测试剂盒，还包括测读孔位、反应孔位、清洗孔位、磁棒套和吸头。

优选地，所述发光底物为碱性磷酸酶催化的发光底物。

另需注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。本发明中制备方法如无特殊说明则均为常规方法，所用的原料如无特别说明均可从公开的商业途径获得或根据现有技术制得，所述百分比如无特殊说明均为体积百分比，所述溶液若无特殊说明均为水溶液。

本发明的有益效果

1、本发明开发的新型无蛋白通用型保护液成分简单明确，成本低廉，无哺乳动物蛋白，避免了缓冲液与待测样本之间的交互作用，解决了现有保护溶液因自身含有蛋白成分(如血清白蛋白)导致其无法适用于真菌毒素免疫分析的问题。

2、本发明提供的无蛋白通用型保护液，可最大限度地延长真菌毒素检测试剂盒中各种生物分子的保存期，进一步增加生物大分子的稳定性；同时消除非特异蛋白的相互作用，降低背景，凸显特异性信号，提高灵敏度，可用作免疫分析中各种生物大分子的保护液，缓冲液和稀释剂，具有优越的通用性。

3、本发明提供的无蛋白通用型保护液对生物素标记的抗原缓冲液具有较好的保护作用，液体状态下15天37℃静置环境下能保持近100％活性。

4、本发明提供的真菌毒素检测试剂盒结合化学发光免疫分析仪用于真菌毒素检测时，与其他的方法学相比，灵敏度更高、线性更宽、反应时间更短、准确率更高；具体对真菌毒素检测的灵敏度可高达0.01ng/mL。

附图说明

图1示出本发明提供的真菌毒素检测试剂盒的反应原理图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据以上发明的内容做出一些非本质的改进和调整。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下实施例中使用的原料和试剂除非另有说明，均为市售商品或者可以通过已知方法制备。

实施例1

本例提供一种无蛋白通用型保护液，包括如下组分：1mol/L HEPES溶液、10mg/mL水溶性高分子化合物、5mg/mL氯化钠、0.5mg/mL氯化钾、0.5mg/mL硫酸镁、5mg/mL Tween20、1mg/mL procline 300、0.05mg/mL维生素C、25mg/mL海藻糖、2mg/mL甘氨酸、5mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、10mg/mL甘油。其中，水溶性高分子化合物购买于日本JSR公司，具体为N6-PEG(5k)(CE510；Mw1/45000)和N6-PEG(2k)(CE210；Mw1/42000)的混合物，比例为1:10-10:1。

其制备方法包括以下步骤：将各组分按比例加入超纯水中，混合均匀后，用饱和氢氧化钠溶液调pH至7.4，然后使用0.22μm的滤膜过滤、除菌分装。

对比例1

本例提供一种常规含蛋白的保护液，包括如下组分：1mol/L HEPES溶液、20mg/mL牛血清白蛋白、5mg/mL Tween 20、1mg/mL procline 300、0.05mg/mL维生素C，其余量为超纯水。

对比例2

本例提供一种常规无蛋白的保护液，包括如下组分：HEPES溶液、5mg/mL氯化钠、0.5mg/mL氯化钾、0.5mg/mL硫酸镁、5mg/mL Tween 20、1mg/mL procline 300、0.05mg/mL维生素C、25mg/mL海藻糖、2mg/mL甘氨酸、10mg/mL甘油。

相关探究

1.1提供一种赭曲霉毒素A(OTA)检测试剂盒，包括以下成分：碱性磷酸酶(ALP)标记的OTA抗体溶液、生物素标记的OTA抗原溶液、链霉亲和素标记的磁微粒溶液、清洗液、孵育缓冲液、洗涤缓冲液和发光底物((4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐)；

其中，(1)孵育缓冲液的制备如下：

称取十二水合磷酸氢二钠5.9g、磷酸二氢钠0.60g、氯化钠5g、蔗糖135g和吐温201g加入到纯化水中，搅拌至完全溶解，调试PH值至7.3-7.6之间并定容至1000mL，用0.22μm的滤膜进行过滤。

(2)洗涤缓冲液的制备如下：

称取Tris 6.0g、NaCl 9.0g、吐温20 1g加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调试PH值至6.4-8.5之间并定容至1000mL，用0.22μm的滤膜进行过滤。

(3)ALP标记的OTA抗体溶液的制备如下：

(a)抗体的活化：称取4mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用15g/L乙醇胺水溶液溶解至13.76mg/mL。按2-IT与赭曲霉毒素A抗体摩尔比15:1的比例将2IT溶液加入抗体溶液中进行活化(即：1mg抗体加入10μL的2-IT溶液)。震荡混匀后在室温下反应30分钟，得到活化抗体预产物溶液。然后，按1mg抗体加入5μL 75g/L甘氨酸水溶液的比例，将甘氨酸水溶液加入活化抗体预产物溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体，将其加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1mg/ml之间，得到浓缩的活化抗体；

(b)ALP的活化：称取2mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比15:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液(即：1mg ALP加入8.5μL SMCC溶液)。震荡混匀后，室温下反应30分钟，得到ALP活化预产物的溶液。然后，按1mg ALP活化预产物加入10μL 75g/L甘氨酸水溶液的比例，将甘氨酸水溶液加入ALP活化预产物的溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP，将活化后的ALP加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1mg/mL之间，得到浓缩的活化ALP；

(c)活化抗体和活化ALP的偶联：按活化后抗体与活化ALP按质量比1:1的比例(即：1.0mg抗体加入1.0mg ALP)，震荡混匀后，在4℃环境中反应12小时，即得ALP-OTA抗体偶联物预产物；

(d)ALP-OTA抗体偶联物预产物的终止和纯化：称取1mg马来酰亚胺，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解至9.7mg/mL；按1/10比例，用15g/L乙醇胺水溶液稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液；按1mg ALP-OTA偶联物预产物加入10μL 0.97mg/mL的马来酰亚胺溶液中，在室温下反应15分钟；准确量取6μL乙醇胺，在乙醇胺中加入994μL超纯水获得乙醇胺溶液；将上述反应后的ALP-OTA偶联物预产物与乙醇胺溶液按照1mg：10μL的比例进行混合，震荡混匀，获得待纯化的ALP-OTA抗体偶联物；使用超滤浓缩管将待纯化的ALP-OTA抗体偶联物浓缩至0.5mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行纯化，洗脱液为75g/L甘氨酸水溶液，纯化后的液体为ALP标记的OTA抗体；

(e)装入检测试剂盒前，使用保护液进行稀释。

(4)生物素化OTA抗原溶液的制备如下：

(a)完全抗原的制备：准确称取OTA标准品2mg，使其溶解于2mL四氢呋喃(THF)中，加入2mg NHS和3mg EDC，避光搅拌反应4h，用真空干燥箱进行干燥，去除溶剂THF，之后用二甲基甲酰胺将反应产物溶解，从而得到OTA活化产物；然后准确称取15mg BSA，将其溶解于2mL NaHCO₃(0.13mol/L)溶液中，放于4℃预冷2h，把OTA活化产物加入到BSA溶液中，边滴边加边搅拌，室温条件下，避光反应4h；反应产物用NaHCO₃(0.05mol/L)，透析3天，每天更换两次透析液，透析后收集样品，得到OTA-BSA复合物；

(b)生物素标记的OTA抗原的制备：用0.02M PBS配制10mM的生物素溶液，OTA-BSA复合物与10mM生物素溶液按摩尔比1:20的比例混合，震荡混匀后，将混合物在室温环境中反应1小时；将反应后的溶液加入脱盐柱中，在溶液完全进入柱料前，使用0.02M PBS缓冲液补足柱料体积，柱内液体完全进入柱料时，加入等体积的0.02MPBS缓冲液开始洗脱，收集等体积蛋白洗脱液并测试浓度，洗脱获得的溶液即为生物素化OTA抗原；

(c)装检测试剂盒前，使用通用型保护液进行稀释。

(5)链霉亲和素标记的磁微粒溶液的制备如下：

(a)磁微粒的分散：将10mg羧基化的磁微粒用10mL 0.1M 2-吗啉乙磺酸溶液(MES缓冲液)分散，使磁微粒的终浓度为1mg/mL；

(b)磁微粒的清洗：将步骤(a)的磁微粒用3倍体积的MES缓冲液清洗后，再用MES缓冲液重新分散，使磁微粒的终浓度为1mg/mL；

(c)磁微粒的活化与链接：将3mg链霉亲和素和3.5μL 10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液依次加入步骤(b)所得的磁微粒分散液中，室温下搅拌反应2小时；

(d)磁微粒的封闭：将步骤(c)的磁微粒与反应体系分离后，用MES缓冲液洗涤磁微粒2次，再用MES缓冲液重新分散磁微粒，磁微粒的终浓度为2-30mg/mL；然后加入2％甘氨酸封闭液，室温下搅拌反应2小时；

(e)磁微粒的清洗：将步骤(d)的磁微粒与反应体系分离，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗磁微粒两次，获得链霉亲和素标记的磁微粒；

(f)装检测试剂盒前，使用保护液进行稀释。

1.2OTA检测试剂盒的检测流程，包括以下步骤：

采用全自动化学发光免疫分析仪进行检测。反应所需样本量为40μL，自动检验流程为：

A.免疫反应：将20μL待测样品、50μL生物素标记的OTA抗原溶液、50μL ALP标记的OTA抗体溶液、100μL链霉亲和素磁微粒溶液、300μL孵育缓冲液依次加入反应孔位，在37℃条件下反应20min，获得磁微粒免疫复合物；

B.磁分离及清洗：将磁微粒免疫复合物用300μL洗涤缓冲液洗涤3次；

C.读值：在测读孔位加入150uL发光底物，将洗涤后的磁微粒免疫复合物在测读孔位脱磁；ALP催化的发光底物发光后检测其相对发光强度。

1.3保护液的比较

使用1.1的OTA检测试剂盒，将生物素标记的OTA抗原和ALP标记的OTA抗体分别用实施例1制备的无蛋白通用型保护液和对比例1制备的含蛋白的保护液进行稀释，其中，生物素标记的OTA抗原的稀释倍数分别为1:2000、1:3000、1:4000、1:5000，ALP标记的OTA抗体的稀释倍数分别为1:4000、1:6000、1:8000、1:10000，采用棋盘优化法优化生物素化OTA抗原和ALP标记OTA抗体的最佳稀释倍数，利用1.2的检测流程分别测定甲醇-水(50:50，V/V)的发光强度B₀和0.01ng/mL OTA标准品溶液的发光强度B。对比不同稀释条件下的B0/B的比值，结果见表1和表2。其中，B₀/B的比值越大，表明检测灵敏度越高，结合表1-2的数据可知，与对比例1的保护液相比较，实施例1的保护液为稀释液时，OTA检测试剂盒的检测灵敏度更高，且生物素化OTA抗原和ALP标记OTA抗体的稀释倍数分别为2000倍和4000倍时，检测灵敏度最高。

表1.生物素化OTA抗原和ALP标记OTA抗体棋盘滴定分布表

表2.生物素化OTA抗原和ALP标记OTA抗体棋盘滴定分布表

1.4稳定性实验

将1.1的OTA检测试剂盒中生物素化OTA抗原和ALP标记OTA抗体分别用实施例1和对比例2制备的无蛋白通用型保护液稀释2000倍和4000倍，分装成8瓶，然后放置于37度恒温培养箱中保存，分别在第1天，3天、5天、7天、9天、11天、13天、15天取出1瓶，然后利用1.2的检测流程依次测定甲醇-水(50:50，V/V)的发光强度B₀和0.01ng/mL OTA标准品溶液的发光强度B，并计算B₀/B的。B₀、B及B₀/B的平均值、重复性CV，结果见表3-4所示，表中数据显示：实施例1制备的无蛋白通用型保护液对生物素化OTA抗原和ALP标记OTA抗体均具有良好的保护作用，而表4数据显示，随着保存时间的增长，信号值逐渐减低，表明对比例2的保护液体系对生物素化OTA抗原和ALP标记OTA抗体的保护作用较小。

表3实施例1保护液稀释后的生物素标记的OTA抗原和ALP标记的OTA抗体的稳定性

取样时间	<![CDATA[B<sub>0</sub>]]>	B	<![CDATA[B<sub>0</sub>/B]]>
				第1天	723470	404640	1.788
第3天	737349	405139	1.820
				第5天	845376	460676	1.835
第7天	754781	403732	1.870
				第9天	774894	430971	1.798
第11天	754781	403732	1.870
				第13天	863663	449966	1.919
第15天	782313	415257	1.884
				平均值	779578	421764	1.848
CV	6.43	5.42	2.45

表4.对比例2保护液稀释后的生物素标记的OTA抗原和ALP标记的OTA抗体的稳定性

1.5磁化学发光免疫分析法检测OTA的方法学考察

1.5.1灵敏度分析

利用1.1的检测流程对20个独立的玉米阴性样品(经高效液相色谱法验证不含OTA)进行测定，计算其平均值

和标准差(SD)。该方法检出限(LOD)以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差

计算，结果为0.04μg/kg，定量限(LOQ)以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差

计算，结果为1.0μg/kg。

1.5.2线性关系考察

根据一系列OTA标准品溶液的浓度-对应发光值进行四参数拟合，获得基于的浓度-发光值标准曲线，四参数拟合方程为Y＝(346030-0.92835)/[1+(x/3.70941)^1.05364]+0.92835，R²＝0.99843，表明OTA的浓度与发光值的相关性良好。

1.5.3特异性考察

将常见真菌毒素黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂(AFB₁，AFB₂，AFG₁和AFG₂)，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON；3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3-ADON；T-2毒素(T-2)；雪腐镰刀菌烯醇，NIV)分别配置成系列标准溶液，并使用1.1的检测试剂盒按照1.2检测流程分别测定其发光值，拟合各自的标准曲线，计算得出每种真菌毒素的半数抑制浓度(IC₅₀)。根据下列公式计算每种方法的交叉反应率(cross-reaction rate，CR)评价每种方法的特异性。CR(％)＝IC_50靶标/IC_{50其他毒素}*100，其中IC_50靶标是待测靶标的50％抑制浓度，IC_{50其他毒素}是交叉反应物的50％抑制浓度(ng/mL)，结果见表5所示，由表5可知，本发明提供的OTA检测试剂盒与常见真菌毒素的交叉反应率小于1％，特异性良好。

表5.赭曲霉毒素A磁化学发光免疫分析试剂盒特异性考察

1.5.4准确性和重复性

具体方法如下：

(1)准备待测样品：准备不含OTA的阴性糙米、大米和小麦样品，粉碎后，分别加入不同量的OTA标准品，分别设置7个平行组；

(2)前处理：称取5.0g步骤(1)获得的待测样品于50mL离心管中，加入25.0mL乙醇/水(50:50)溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液。

(3)准备工作：

物理检查：1.1提供的OTA检测试剂盒液体组分应澄清，无沉淀或絮状物，其他组分应无包装破损(其中，生物素标记的OTA抗原溶液是生物素标记的OTA抗原经实施例1的无蛋白通用保护液稀释4000倍获得的、50μL ALP标记的OTA抗体溶液是ALP标记的OTA抗体经实施例1的无蛋白通用保护液稀释4000倍获得的，100μL链霉亲和素磁微粒溶液是链霉亲和素磁微粒经实施例1的无蛋白通用保护液稀释10倍获得的)。将试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min。

(3)检测流程

A.免疫反应：将20μL待测样品提取液、50μL生物素标记的OTA抗原溶液、50μLALP标记的OTA抗体溶液、100μL链霉亲和素磁微粒溶液、300μL孵育缓冲液依次加入反应孔位，在37℃条件下反应20min，获得磁微粒免疫复合物；

B.磁分离及清洗：将磁微粒免疫复合物用洗涤缓冲液洗涤3次；

C.读值：在测读孔位加入150uL发光底物，将洗涤后的磁微粒免疫复合物在测读孔位脱磁；ALP催化的发光底物发光后检测相对发光强度；

D.根据加入OTA标准品的量可获得一条OTA浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合；

E.将样本的检测值与OTA浓度发光值标准曲线上唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。

7个平行回收率的均值、极差及RSD如表6-表8所示，结合表中数据可知：利用本发明提供的OTA检测试剂盒检测不同样本的OTA，其OTA回收率在87.8％-110.8％之间，极差在2.0％-22.3％，RSD小于10％，具有良好的准确度和精密度。

表6.测定玉米中OTA的回收率和重复性

表7.测定大米中OTA的回收率和重复性

表8.测定小麦中OTA的回收率和重复性

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种无蛋白通用型保护液，其特征在于，包括如下组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液、水溶性高分子化合物、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、表面活性剂、防腐剂、还原剂、海藻糖、甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、甘油和超纯水。

2.如权利要求1所述的无蛋白通用型保护液，其特征在于，各组分的浓度如下：4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液0.5mol/L-5mol/L、水溶性高分子化合物10mg/mL-80mg/mL、氯化钠1mg/mL-10mg/mL、氯化钾0.5mg/mL-5mg/mL、硫酸镁0.1mg/mL-1mg/mL、表面活性剂2.5mg/mL-10mg/mL、防腐剂0.1mg/mL-2mg/mL、还原剂0.01mg/mL-0.1mg/mL、海藻糖5mg/mL-30mg/mL、甘氨酸1mg/mL-20mg/mL、聚乙烯吡咯烷酮3mg/mL-6mg/mL、甘油4mg/mL-50mg/mL。

3.如权利要求1或2所述的无蛋白通用型保护液，其特征在于，所述水溶性高分子化合物为末端连接寡氨短链的PEG分子。

4.如权利要求1或2所述的无蛋白通用型保护液，其特征在于，所述无蛋白通用型保护液的pH值在6.5-8.2范围内。

5.如权利要求1或2述的无蛋白通用型保护液，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、聚氧乙烯月桂醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、Tritonx-100、泊洛沙姆188和甘油脂肪酸酯中的一种或多种的组合；

优选地，所述防腐剂为叠氮化钠、Procline 200、Proclin300和BND-10中的一种或多种的组合；

优选地，所述还原剂为亚硫酸钠、维生素C、二硫苏糖醇、硫代硫酸钠和β-巯基乙醇中的一种或多种的组合。

6.一种如权利要求1-5任一所述的无蛋白通用型保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将各组分混合均匀，调节pH值，随后使用滤膜进行过滤，即得；

优选地，所述滤膜的孔径为0.22μm。

7.一种真菌毒素检测试剂盒，其特征在于，包括有权利要求1-5任一所述的无蛋白通用型保护液。

8.如权利要求7所述的真菌毒素检测试剂盒，其特征在于，包括：碱性磷酸酶标记的真菌毒素抗体溶液、生物素标记的真菌毒素抗原溶液、链霉亲和素标记的磁微粒溶液、清洗液和发光底物；

其中，所述碱性磷酸酶标记的真菌毒素抗体溶液、生物素标记的真菌毒素抗原溶液和链霉亲和素标记的磁微粒溶液中包含权利要求1-5任一所述的无蛋白通用型保护液。

9.如权利要求7所述的真菌毒素检测试剂盒，其特征在于，还包括测读孔位、反应孔位、清洗孔位、磁棒套和吸头。

10.如权利要求8所述的真菌毒素检测试剂盒，其特征在于，所述发光底物为碱性磷酸酶催化的发光底物。